NO763975L

NO763975L -

Info

Publication number: NO763975L
Application number: NO763975A
Authority: NO
Inventors: H Huemer; R Schmidtberger; T Toth
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1975-11-22
Filing date: 1976-11-19
Publication date: 1977-05-24
Also published as: LU76243A1; IT1121742B; BE848601A; SE7612998L; FR2332287B1; FI763314A; ATA863176A; AT358275B; IL50940A0; DE2552510C3; DE2552510A1; DE2552510B2; IL50940A; CA1069070A; FR2332287A1; DK522976A; JPS6048524B2; GB1571182A; SE430066B; ZA766942B

Description

Biologisk aktive forbindelser og

fremgangsmåte til deres fremstilling.

Oppfinnelsen vedrører nye forbindelser av biologisk aktive stoffer og vannuoppløselige høymolekylære forbindelser, fremgangsmåte til deres fremstilling og deres anvendelse fortrinnsvis ved affinitetskromatografi.

I de siste år har en ny teknikk innen-de biokjemiske arbeidsmetoder mer og mer slått igjennom og hvis primære trekk består i å anvende affiniteten av bærerbundne biologisk aktive stoffer til reaksjoner som skal gjennomføres selektivt.

Over en spesifikk kompleksdannelse av det bærerbundne stoff med et annet, som foreligger i en blanding, kan angjeldende stoff fjernes fra blandingen og hvis ønsket deretter isoleres ved desorpsjon.

Bærerbundne enzymer byr den fordel å gjennomføre stoffomdannelser i preparative, kontinuerlige prosesser og å

få reaksjonsproduktene enzymfrie'.

I den biokjemiske, enzymatiske analytikk står bærerbundne hydrogenuoppløselige enzymer til disposisjon som flere gangers anvendbare reagenser.

På grunn av enzymenes egenskap til å ha affini-teter ikke bare overfor substratene, men også overfor de spesifikke inhibitorer har utvinning av enzyminhibitorer ved hjelp av affinitetskromatografi på bærerbundne enzymer vist seg spesielt gunstige. På den. annen side muliggjør bindingen av inhibitorer til vannuoppløselige matriser den preparative utvinning av de tilsvarende enzymer.

Som såkalte immunadsorbenter bindes antigener eller antilegemer til vannuoppløselige matriser og muliggjør deretter isolering av de tilsvarende antilegemer resp. antigener.

Som biologisk aktive stoffer forstås tilsvarende de overnevnte anførsler in vivo og in vitro virksomme naturlige og kunstige fremstilte stoffer som i videste omfang kan betegnes som enzymer, aktivatorer, inhibitorer, antigener eller antilegemer, vitaminer og hormoner. For disse biologisk aktive stoffer har det seg da de danner virksomme prinsipper av de vannoppløselige systemer innført betegnelsen effektorer.

De fleste av de hittil omtalte bærerbundne effektorer er vesentlig mere stabile enn de tilsvarende biologisk aktive stoffer i oppløsning.

Som bærermaterialer, såkalte matriser, er å anvende fortrinnsvi-s1 slike stoffer som ved siden av .uoppløselighet i vandige systemer har en lavest mulig uspesifikk adsorpsjon. Hermed må det mest mulig underbindes hydrofob, hydrofil og ionisk. vekselvirkning mellom matrise og effektorens reaksjons-partner. Med stoffer, hvis binding er uønsket til effektoren, f.eks. slike som ikke er spesifikke reaksjonspartnere av effektoren bør en binding være utelukket.

De hittil anvendte matriser som bærere for biologisk aktive stoffer kan oppdeles i de som binder effektorene ved fysikalsk.adsorpsjon, hertil hører eksempelvis polystyren, aktivkull og glassperler og de som er sammenknyttet med effektorene over en kovalént binding. De sistnevnte omfatter vinyl-polymere som homo- og kopolymerisater, f.eks. polyakrylsyrer, polyakrylsyreamider og amino-, karboksy- eller sulfonylsubstitu-erte polystyren, videre cellulose og deres derivater og endelig naturlige og syntetiske polypeptider og proteiner. På grunn av 'den utlignede vekselvirkning mellom matrise og effektor har anvendelsen av kullhydrater, spesielt cellulose av dekstran, av stivelse, av agar resp. deres derivater, funnet den høyeste ut-bredelse som matriser i vandige systemer, enskjønt de i disse na.turstof f er hyppig' inneholdte karboksylgrupper på grunn ,av deres'uspesifikke affinitet finnes som«forstyrrende. Dessuten har disse stoffer en relativt liten termisk og kjemisk stabilitet.

Mange av disse ulemper kunne fjernes mest mulig ved anvendelse av polyvinylenglykol, en syntetisk polymer som matrise. Polyvinylenglykol, også kalt polyhydroksymetylen, fremstilles ved sur•eller basisk hydrolyse av polyvinylenkarbonat. Hvert karbdnatom har en hydroksylgruppe og et hydrogenatom. Den gjennomgående -C-C-binding gir bæreren en spesiell høy stabilitet.

Det er nå funnet at man istederifor polyvinylenglykol fordelaktig kan anvendes '^inylenglykol-kopolymere som bærermatriks. Ved innpolymerisering av egnede komonomere i polyvinylenkarbonat kan de fysikalske og kjemiske egenskaper av de herav fremstilte polyvinylenglykol sterkt varieres.

Således kan f.eks. "hydrofilien" resp. "svellingen" av polyvinylenglykol endres ved innpolymerisering av.hydrofobe monomere som etylen, vinylklorid eller styren i polyvinylkarbo-. nat. Ved kopolymerisasjon av vinylacetat erstattes i det■ forsåpede sluttprodukt en vinylenglykolgruppe med en vinyl-alkoholgruppe, hvilket har til følge en øket svellbarhet i vandig, medium..

Det er mulig ved hjelp av komonomere, som f.eks. ■ dietylenglykoldivinyleter og divinylbenzen å oppnå en nett-dannelse og derved en forbedring av bærerens mekaniske egenskaper. Ved'innpolymerisering av elektrofile funksjoner, f.eks. oksirangrupper (epoksygrupper) av vinylglycidyleter-komonomere er det mulig en direkte omsetning av matrisen med nukleofile funksjoner (-N^j-0H osv). Karboksylgrupper kan innføres ved acylsyreester-komonomere. Etter foretatt kopolymerisasjon forsåper estergruppen til karboksylgrupper. Innføringen av -NH2- eller -COOH-grupper muliggjør aktivering, ved hjelp av karbodiimider, isoksazoliumsalter, glutaraldehyd osv. Kopolymerisatet-vinylenglykol/vinylalkohol har en høyere spesifikk overflate og dermed en høyere bindingskapasitet, f.eks. proteiner til overflaten av polymerpulveret sammenlignet til vinylenglykol-homopolymerisat.

Oppfinnelsens gjenstand er følgelig biologisk aktive forbindelser av et fortrinnsvis vannuoppløselig kopolymerisat av polyvinylenglykol og et dertil under bibehold, av dets biologiske aktivitet bundet biologisk aktivt stoff. I disse forbindelser er bærermatrisen en polyvinylenglykol-kopolymerisat inneholdende inntil H5% > fortrinnsvis 5-20% av en komonomer.

De biologisk aktive stoffer er stoffer som enzymer, aktivatorer, inhibitorer, antigener eller antilegemer, andre plasmaproteiner, blodgruppestoffer, fythemagglutininer, antibiotika, vitaminer eller hormoner, peptider eller aminosyrer eller syntetisk fremstilte effektorer. Den polymere bærer og det biologisk aktive stoff er enten sammenknyttet k.ovalent med hverandre direkte eller over en sidekjede (Spacer).

Å binde de biologisk aktive forbindelser over en sidekjede (Spacer) er av fordel, når molekylvekten av deres affine partnere er meget forskjellige, eller.når ved anvendelse i en biospesifikk prosess deltar meget høymolekylær eller av flere underenheter oppbyggede proteiner. Spacere er til den polymere matriks forankrede sidekjede av bestemt lengde, som kan fåes ved innpolymerisering ved på- og innbygning (binding av bi- eller polyfunksjonelle forbindelser - f.eks. et tripep-' tid - til matriksen) eller ved innbygning av funksjonelle grupper og trinnvis forlengelse på disse.

Oppfinnelsens gjenstand er videre fremgangsmåter til kovalent forbindelse av de biologisk aktive stoffer med bæreren.

Hertil står det til disposisjon en rekke av generelt

kjente reaksjoner.

De vedrører i første rekke fremgangsmåten til fremstilling av polyvinylglykol-kopolymeren. De erkarakterisert vedat vinylenkarbonat polymeriseres med komonomere med de generelle formler:

hvori R-j^ betyr hydrogen, metyl, etyl, R^betyr metyl, etyl, propyl og n betyr et helt tall mellom 1 og<*>J.

Poiymerisasjonen av polyvinylenkarbonatet foregår

med inntil ^ 5% komonomere, fortrinnsvis med 5- 20%.

Fremstillingen av den biologisk aktive forbindelse er eksempelvis mulig ved at en elektrofil gruppe innføres enten i det biologisk aktive stoff eller i polvvinylenglykolkopoly-meren og over denne omsettes det biologisk aktive stoff med polyvinylenglykolkopolymeren.

Innføringen av de elektrofile grupper i bærermatriksen foregår enten ved 'kopolymerisering av vinylenkarbonat med elektrofile g^iippeholdige komonomere eller ved omsetning av bærermatriksen med aktiverende elektrofile gruppeholdige, lavmolekylære forbindelser.

Generelt er den kjemiske kopling av en reaksjons-partner til bærermatriksen enkel, når det på den ene side er tilstede nukleofile og på den andre elektrofile funksjoner.

Som reaktive nukleofile funksjoner kommer det fremfor alt i betraktning amino-, sulfhydryl- og hydroksylgrupper, som vanligvis enten allerede er inneholdt i matriksen eller i reak-s j onspartneren. Elektrofile funksjoner må først innføres.'Hertil kan karboksylgrupper overføres i syrehalogenider, syreazider, syreanhydrider, imidazolider eller direkte aktiveres méd karbodiimider. Som reaktive elektrofile grupper benyttes også iso.cya-nat-, isotiocyanat-, diazoniumgrupper eller cykliske imidokarbo-natestere. Spesielt gunstig er innføringen av reaktive grupper ved hjelp av kopolymerisasjon.

Ved innpolymerisering av. monomere med epoksygrupper, f.eks. med epoksyalkylvinyletere i polyvinylkarbonatet og ved den meget store forskjell i forsåpningshastighet mellom cyklisk karbonat- og epoksygrupper, får man lett en polyvinylenglykol-matriks med reaktive epoksygrupper, som kan omsettes med nukleofile funksjoner. Således er det mulig .den direkte binding av et biologisk aktivt stoff og/eller innføring (forlengelse) av en sidekjede (Spacer).

En ytterligere fordel er følgelig ved anvendelsen av kopolymere også muligheten med den direkte innføring (innpolymerisering) av elektrofile funksjoner, som muliggjør omset-ningen etter kjente metoder.

Ved kopolymerisering av vinylenkarbonat.med etyl-akrylat og etterfølgende forsåpning av det polymere får man en matriks med -0H- og -COOH-funksjoner. KarboksyIgruppene kan aktiveres ved hjelp av karbodiimider og deretter inngå en araid-binding med aminogruppene av effektoren. Karboksylgrupper tillater videre dannelsen av imidbindinger ved hjelp av de av. Woodward innførte isoksazoliumsalter.

En ytterligere metode til kopling av biologisk aktive forbindelser til karboksylgruppeholdige polymere utføres ved hjelp av N-etoksykarbonyl-2-etoksy-l,2-dihydrokinolin (EEDQ).

Karboksylgruppene kan forestres etter kjente metoder, deretter overføres esteren i hydrazidet og endelig sammenknyttes det som resultat -f-remkomne azid med aminogruppen av effek.tor-proteinet med polyvinylenglykol-matriksen.

Har den i matriksen innpolymeriserte komonomer ved etterfølgende omsetninger frie disponible aminogrupper, så er det med arylaminogruppeholdige vinylsulfonderivater eller svo-velsyreestere av 6-hydroksyetylsulfoner, mulig innføring av arylaminogrupper, idet arylaminogruppene deretter etter kjente metoder diazoteres og deretter kan forbindes med tilsvarende reaktive grupper 'av en effektor, f. eks.

På denne måte kan det også foretas en "forlengelse" av en spacer.

En annen måte til binding av proteiner over aminogruppen foregår ved hjelp av glutardialdehyd.

Enkel er sammenknytningen 'av effektoren til matriks etter en aktivering av hydroksyl- eller aminogruppen av polyvinylenglykol-kopolymeren ved hjelp av cyanhalogenider, fortrinnsvis med bromcyan og en etterfølgende omsetning av de aminogruppe-holdige biologisk aktive effektorer over disse aktiverte grupper.

En ytterligere mulighet til sammenknytning av effektoren med en polyvinylenglykol- eller polyvinylenglykol-kopolymerisat-matriks består i acylering av hydroksylgruppene med bromacetylbromid, etterfulgt av alkylering av aminogruppen av effektoren.

Tilsvarende reaksjonsforløp er eksempelvis å oppnå ved omsetning av hydroksylgruppen av bæreren med reaktive tri-aziner, idet en del av de reaktive grupper av triazinet trer i reaksjon med polyvinylenglykol-forbindelsen, en annen med aminogruppen av effektoren.

Diazoterbare aromatiske aminer, som over en ytterligere reaktiv gruppe kan tre i forbindelse med hydroksylgruppen av bæreren på den ene side, muliggjør på den annen side koplingen ved dertil egnede aktiverte aminosyrer, eksempelvis tyrosin- eller hist.idinresten av proteineffektoren.

Arylaminogruppeholdige vinylsulfonderivater og svovelsyrehalvestere av 8-hydroksyety.lsulfoner kan bringes til reaksjon med hydroksylgruppen av bæreren. De muliggjør binding av effektoren etter den overnevnte diazoteringsreaksjon.

Spesielt stabile eterbindinger oppstår ved omset-ningen av hydroksylgruppene av polyvinylenglykol-kopolymerisatet med ikke ionedannende epoksyder, som minst inneholder 2 reaktive grupper, som epihalohydrinene eller polyepoksydene, eksempelvis epiklorhydrin eller bisepoksyder.

En annen type'av modifisering er innpolymerisasjon av komonomere i polyvinylenkarbonatkjeden (som f.eks. av vinyl-pyrrolidon) med etterfølgende partiell omsetning av cyklokarbonat-ringer av polyvinylenkarbonat med et amin, f.eks. méd heksametylendiamin, til et over en uretanbinding med en spacer eller ef-fektorsubstituert polyvinylenkarbonat-kopolymerisat. De rest-erende cyklokarbonatgrupper forsåpes deretter til hydroksylgrupper:

Polyvinylkarbonat

Ved siden av de her eksempelvis anførte fremgangsmåter til fremstilling av den koValente forbindelse mellom bærermatriks og proteineffektoren eller andre effektorerjeksi-sterer dessuten ytterligere metoder, som fører til reaksjon av hydroksylgruppene eller bestemte grupper av den kopolymere med en effektor og derved danner den koValente forbindelse mellom begge, således den kjente omsetning med kompleksdannende metall-forbindelser, f.eks. titanforbindelser. Alle disse metoder er kjent for fagfolk.

Ved-bindingen av lavmolekylære biologisk aktive forbindelser er det ofte fordelaktig ikke å aktivere bæreren,

men effektoren.

Prinsippielt kan det anvendes alle fremgangsmåter som er kjent i den makromolekylære kjemi ved modifisering av syntetiske eller naturlige makromolekylære forbindelser.

Polyvinylenglykol-kopolymerisatene utmerker seg

ved siden av den kjemiske og termiske stabilitet ved fordelak-tige forarbeidelsestekniske egenskaper og fører dermed til en overlegenhet overfor de hittil som optimalt fundne bærermatriser på basis av naturlige kullhydrater. De er f.eks. fremstillbare i form av fibre, tråder,, folier eller sfæriske partikler,, således at alt etter anvendelsesformål av effektoren som skal bindes dertil kan det velges den mest egnede form. Fortrinnsvis anvendes disse kopolymerisater i form av findelte pulvere med høy spesifikk overflate.

Ved den produksjonstekniske styrbare størrelse av den for bindingen av effektorene resp. spacerne tilgjengelige overflate viser det. seg et ytterligere fortrinn ved polyvinylenglykol-kopolymerisatene overfor de kjente bærematerialer.

De biologisk aktive forbindelser ifølge oppfinnelsen egner seg for de fleste anvendelsesfreragangsmåter som hittil har vært kjent for andre til hydrofile, vannuoppløselige bærere bundne effektorer. Følgelig kan enzymer gjøres vannuoppløselige. De uoppløselige enzymer anvendes i økende grad til bestemmelse

av substrater i analyseautomater og som såkalte enzymelektroder. På grunn av den økéde stabilitet egner det seg en rekke bærerbundne enzymer for gjennomføring av tekniske enzymatiske omsetninger .

Bærerbundne, biologisk aktive stoffer har på grunn av deres egenskap som spesifikke adsorbenter funnet en bred an vendelse i affinitetskromatografien. Ved hjelp av bærerbundne naturlige' eller syntetiske enzyminhibitorer lykkes høyrensning av enzymer, mens enzymer som effektorer spesielt ble funnet fremragende egnet til fremstilling av naturlige enzyminhibitorer fra råekstrakter. Bærerbundne vannuoppløselige antigener anvendes til isolering av de tilhørende antilegemer,

som på denne måte fåes fri for andre serumbestanddeler og fri for andre antigener. Affinitetskromatografisk kan også ikke utfellbare antilegemer såvel slike, som på grunn av deres lille konsentrasjon i s-erum ikke er utfellbare, isoleres og også bestemmes kvantitativt.

Eksempler. Fremstilling av vinylenkarbonat- ko<p>ol<y>mere.

Det ved fremstilling av det kopolymere (CP) anvendte vinylenkarbonat ble før anvendelsen kokt en time over natriumbor-hydrid (100 vektdeler vinylenkarbonat på 2 vektdeler NaBHj|) ved et trykk på 33 mm under tilbakeløp, deretter iflestillert ved 75°C7 33 mm Hg over en 50 cm lang, med Raschig-glassringer fylt sølv-mantelkolonne og anvendt mest mulig omgående for kopolymeriser-ingen. Likeledes ble de anvendte komonomere på forhånd renset ved destillering. 1.) Kopolymerisat-vinylenglykol/vinylalkohol av forsåpet kopoly-me ri s at- vinylenkarbonat/ viny lac et at.. a) 19 vektdeler vinylenkarbonat og 1 vektdel vinylacetat opp-løses 0,05 vektdeler azobisisobutyronitril under nitrogen.

Monomerblandingen ifylles under nitrogen i en flattrykket

(4 mm tykt, 60 mm bredt, 150 mm langt) aluminiumrtfSr med skruelukke (samlet fyllvolum ca. 35 ml), lukket under N2og innhengt 48 timer i et 50°C varmt vannbad. Det fåes harde, sprø kunststoffplater, som knuses i en slagmølle. Deretter oppvarmes granulatet ved 1-2 mm trykk i 5 timer ved 120°C for å adskille ikke polymeriserte rest-monomere.

Det avmonomeriserte granulat males videre i en mølle til en kornstørrelse under 0,1 mm, innføres i 500 vektdeler 0,5 N natronlut, blandes ved 20°C med en hurtiggående rører i 1 time, idet karbonat- og acetylgruppene forsåpes. Den vannuoppløselige CP-vinylenglykol/vinylalkohol suges fra, vaskes med vann fritt for uorganiske salter og

frysetørkes. Utbytte: 4,7 vektdeler CP-vinylenglykol/vinyl-alkohol med en spesifikk overflate målt ifølge BET på 34 m 2 g-i

b) Som under punkt 1.) a), bare at det på 3 vektdeler vinylenkarbonat anvendes 3 vektdeler vinylacetat. Utbytte: 4,1 vektdeler CP-vinylenglykol/vinylalkohol med en spesifikk overflate av det frysetørkede polymerpulver på 62,5 m2g 1. c) Sammenligningsforsøk som under punkt li) a), bare at det anvendes 10 vektdeler vinylenkarbonat og ingen komonomer.

Utbytte: 4,7 vektdeler homopolymerisat-vinylenglykol med en spesifikk overflate av det frysetørkéde polymerpulver

på. 20,5 m^/g } ;>

2.) Kopolymerisat- vinylenglykol/ vinylglycldyleter.

En blanding av 7 vektdeler vinylenkarbonat, 3 vektdeler vinylglycidyleter og 0,1,vektdel azobisisobutyronitril oppvarmes som omtalt under punkt l.)a) i flate aluminiumrør under i 3 dager ved50°C. De dannede kunststoffplater knuses som omtalt under punkt l.)a), avmonomeriseres, males til en kornstørrelse under 0,1 mm, suspenderes i 500 vektdeler iskald, 0,5 N NaOH med en hurtiggående rører i 30 minutter, deretter avsentrifugeres det forsåpede polymer med en gang, oppslemmes i isvann, nøytraliseres under isavkjøling med 2 N H2S0[| til pH 7>frasuges, utvaskes med isvann og fryse-tørkes.

Utbytte: 359vektdeler CP-vinylenglykol/vinylglycidyleter inneholdende 1,3 milliekvivalente oksirangrupper/gram (bestemt ifølge: "Praktikum der makromolekularen organischen Chemie", side 221, av Braun, D., Cherdron, H., Kern, W.,'

Hiithig Verlag, Heidelberg 1966).

3..) Aminosubstituert kopolymerisat- bærermaterial.

3,9 vektdeler. CP-vinylenglykol/vinylglycidyleter (fra eksempel 2).) suspenderes med en ultra-turrax-rører i 100 vektdeler H20 og blandes med IQ ml 30%-ig ammoniakk. Med en liten magnetrører omrøres deretter ennu ytterligere 10 timer ved 50°C, endelig frasuges og utvaskes godt med

vann og frysetørkes.

Utbytte: 3,5 vektdeler kopolymerisat-bærermaterial inneholdende 0,9 m ekvivalenter aminogrupper pr. gram, i form av 3-amino-2-hydroksy-propy1-grupper (dannet fra omsetning

av ammoniakk med glycidylgruppene).

4.) CP- vinylenglykol/ akryIsyre.

9 vektdeler vinylenkarbonat, 1. vektdel akrylsyre- etylester og 0,05 vektdeler azobisisobutyronitril polymeriseres under Ng som angitt i eksempel l.)a), knuses, avmonomeriseres og males til en kornstørrelse under 0,1

mm, forsåpes, frasuges, utvaskes og frysetørkes.

Utbytte: 5j0 vektdeler hydrofilt polymerpulver, inneholdende 1,1 milliekvivalente karboksylgrupper pr. gram bærer

■ ? -1

med en spesifikk overflate ifølge BET på 27,2 mg .

5. ) 0)- aminoheksy 1- gruppe- substituert polyvinylenglykol.

5 vektdeler CP-vinylenglykol/akrylsyre fra eksempel 4.) suspenderes med ultra-turrax i 100 ml HgOjavkjøles til

5°C, blandes med 2,5 g N-cykloheksyl-N'-(N-metylmorfolino)-etyl)-karbodiimid-p-toluen-sulfonat, omrøres 30 minutter ved pH 5 og 5°C, frafiltreres og vaskes hurtig med isvann. Den aktiverte bærer suspenderes deretter i en med 2 N

HC1 på pH 7j5 innstillet og til 5°C avkjølet .oppløsning av

5 g heksametylendiamin i 100 ml vann og omrøres ennu.videre .

i 24 timer under disse betingelser med en magnetrører, frasuges, vaskes godt ut med vann og frysetørkes. Utbytte: 4,5 vektdeler w-aminoheksyl-gruppe-substituert polyvinylenglykol med 0,7 milliekvivalenter aminogrupp pr.

gram bærer.

6. ) Omsetning av CP-vinylenglykol/vinylalkohol- fra eksempel l.)a)

med en spesifikk overflate ifølge BET på 34 m 2 g-1

a) Med epiklorhydrin.

50 g av en CP-vinylenglykol/vinylalkohol fremstillet

ifølge eksempel l.)a) suspenderes i 1 liter 2 N MaOH, blandes med 250 ml epiklorhydrin og omrøres 2 timer ved 55-60°C. Suspensjonens pH-verdi synker etter kort tid til 10-11. Ved tilsetning av NaOH holdes ennu 1 time denne

pH-verdi. Etter 2 timers reaksjonstid frasuges det faste stoff, vaskes med vann, aceton og .til slutt igjen med vann.

b) Med heksametylendiamin.

50 g heksametylendiamin oppløses i 1,5 liter vann

og blandes med HC1 til pH 10. Til oppløsningen haes det ifølge eksempel 6.)a) aktiverte CP-vinylenglykol/vinyl-alkohol og omrøres ved 50-55°C i 6 timer. Deretter frasuges produktet og vaskes med vann fritt for heksametylendiamin.

c) Med l-aminobenzen-4-B-hydroksyetylsulfonsvovelsyreester.

Det under eksempel 6.)b) dannede produkt omrøres med 50 g l-aminobenzen-4-g-hydroksyetylsulfonsvovelsyre-ester ved 55°C og pH 10 i en time. Deretter frafiltreres

det faste stoff, vaskes med vann, aceton, og igjen med vann.

d) Diazotering.

10 g av det under eksempel 6.)c) dannede produkt

vaskes på en nutsch med 200 ml 0,1 N HC1 og suspenderes deretter i 300 ml 0,5 N HC1. Suspensjonen blandes under omrøring medrO,l N NaN02-oppløsning ved 0-4°C, inntil ved diazotering med KJ-stivelsespapir er å fastslå et lite nitritoverskudd. Etter 10 minutter frafiltreres over en nutsch og residuet vaskes med 'isvann og deretter med

0. 15 molar natriumfosfatpuffer pH 7,5 av 0-4°C.

e) Kovalent binding med protein.

0,8 albumin oppløses i 350 ml.fosfatpuffer pH 7,5,

avkjøles til 4°C og det under punkt 6.)d) fremstilte produkt tilsettes. Suspensjonen omrøres 20 timer ved 4°C, frafiltreres deretter og det faste stoff vaskes med 1 molar NaCl og fosfatpufret koksaltoppløsning (PBS) (vandig 0,9%-ig NaCl-oppløsning med et innhold av 1/15 mol Na2HP0[j-KH2P0^-puffer av pH 7,2). Filtrat og vaskelut undersøkes etter metoder for radial immundiffusjon på albumin. Det bindes 60 mg albumin til 1 g av den således, fremstilte

bærer.

7. ) Omsetning av CP-vinylenglykol/vinylalkohol fra eksempel 1. ) b) med en spesifikk overflate ifølge BET på' 62, 5' iri g ' . Etter analoge omsetninger som under punkt 6.)a) til e) kan til 1 g aktivert bærer bindes 80 mg albumin kvantitativt.

8. ) Omsetning av homopolymerisat-vinyl-englykol fra eksempel l.) c) med en spesifikk overflate ifølge BET på 20, 5 m 2 g-1

Etter analoge omsetninger som under eksempel 6.)a) til e) kan det til 1 g aktivert bærer kvantitativt bindes

45 mg albumin.

9-) w-aminoheksylgruppe-substituert vinylenglykol/vinylpyrroli-don- kopolymeris at.

I 9 vektdeler vinylenkarbonat og 1 vektdel vinyl-pyrrolidon oppløses under nitrogen 0,05 vektdeler azobis-isobutyrolnitril og polymeriseres og opparbeides analogt

eksempel 1 )a) .

Etter avmonomerisering oppløses granulatet til en 12 vekt%-ig dimetylformamid-oppløsning og med et trykk

på 15 ato inndyses denne oppløsning i et metanol-utfellings-bad. Man får en finfibret utfelling vinylenkarbonat/vinyl-pyrrolidon-kopolymerisat, som frasuges, ettervaskes med metanol og resuspenderes i 200 vektdeler metanol. Det tilsettes 6 vektdeler heksametylendiamin, oppløst i 50 vektdeler metanol, suspensjonen omrøres 2 dager ved vær-elsestemperartur, frasuges og utvaskes med metanol.'Det vaskede filterresiduet suspenderes nå i en oppløsning av 10 vektdeler natriummetylat i 300 vektdeler 96%-ig metanol i 4 timer ved værelsestemperatur, utvaskes med metanol og deretter meget intenst med vann og frysetørkes.

Utbytte: 5>0 vektdeler av et over uretanbindinger med co-aminoheksylgrupper substituert vinylengiykol/vinyl-pyrrolidon-kopolymerisat inneholdende 1,6 m ekvivalent

■ NHg-grupper/g bærer.

10. ) Binding av IgG til u-aminoheksyl-grupper substituert kopolymerisat fra eksempel 9-) ved hjelp av ravsyreanhydrid og vannoppløselig karbodiimid. 5 vektdeler av ifølge eksempel 9-) fremstillet w-aminoheksylsubstituert bærer sukksinoyleres ved 10°C og pH 6 med 2,5 vektdeler ravsyreanhydrid, som er suspendert i 200 vektdeler vann i 4 timer. pH-verdien innreguleres med 2 N NaOH. Etter vasking av det faste stoff med vann om-røres produktet med 1,25 vektdeler N-cykloheksy1-N'-(M-metylmorfolino)-etyl)-karbodiimid-p-toluen-sulfonat ved pH 5 og 5°C i 30 minutter, frafiltreres og vaskes hurtig med isvann.

0,5 vektdeler IgG oppløses 'i 150 vektdeler fosfatpuffer pH 7,5. og omrøres med den aktiverte bærer i 24 timer ved 4°C. Etter filtrering vaskes produktet med 1 molar kokesalt og med PBS.

På 1 gram av bæreren bindes kovalent 75 mg IgG.

11. ) Kopolymerisat- vinylenglykol/ dietylenglykoldivinyleter.

I 9 vektdeler vinylenkarbonat og 1 vektdel dietylenglykoldivinyleter oppløses 0,1 vektdeler azobisisobutyrol-nitril under nitrogen og oppvarmes som angitt under eksempel l.)a) i flate aluminiumrør under N2i 3 dager ved 50°C og polymeriseres. Etter opparbeidelse og forsåpning, som angitt under eksempel l.)a) fåes 3,5 vektdeler CP-vinylenglykol/dietylenglykol-divinyleter. 12. ) Kopolymerisat-vinylenglykol/N-akryloylaminoacet,aldehyd-dimety lacetal... a) 19 vektdeler vinylenkarbonat og 1 vektdel N-akryloylaminoacetaldehyddimetylacetal oppløses 0,05 vektdeler azobisisobutyronitril under nitrogen.- Monomerblandingen polymeriseres som omtalt under eksempel l.)a), opparbeides og forsåpes til 4,1 vektdeler N-akryloylaminoacetaldehyddimetylacetal/vinylenglykol-kopolymer. 10 vektdeler N-akryloylaminoacetaldehyddimetylacetal/ vinylenglykol-kopolymer omrøres i 100 vektdeler 1 N HC1 4-5 timer. Den aktiverte bærer ble vasket med vann og fosfatpuffer pH 7,5. b) 0,5 g albumin ble oppløst i 200 ml PBS og omrørt med det under punkt a) fremstilte produkt i 14 timer ved 4°C.

Etter filtrering ble det bærerbundne protein vasket med 1 molar koksalt og med PBS. 1 g av den således fremstilte bærer binder 40 mg albumin.

Claims

1. Forbindelse av et kopolymer av vinylenglykol og et dertil kjemisk bundet biologisk aktivt stoff.

2. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at den kopolymere minst inneholder 55% monomerenheter av vinylenglykol og maksimalt H5% monomerenheter av minst en forbindelse med de generelle formler:

hvori R-j_ betyr hydrogen, metyl, etyl, R^ betyr metyl, etyl, propyl og n betyr et helt tall mellom 1 og 4.

3« Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at det biologisk aktive stoff er et enzym, aktivator, inhibitor, antigen eller antilegeme, et plasmaprotein, et blod-gruppestoff, et fythemagglutinin, et antibiotikum, vitamin eller hormon, et peptid eller en aminosyre, en naturlig eller syntetisk fremstillet effektor.

4. Fremgangsmåte til fremstilling av en forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at ,(A) en kopolymer av vinylenkarbonat omsettes med et biologisk aktivt stoff og deretter overfører de ennu tilstedeværende cyklokarbonatgrupper i hydroksygrupper eller (B) cyklokarbonatgruppene av en kopolymer av vinylenkarbonat overføres i hydroksygrupper og a) i kopolymerisatet tilstedeværende eller i dette innførte elektrofile grupper omsettes med et biologisk aktivt stoff eller b) disse hydroksygrupper (1) omsettes enten først med en elektrofil gruppeholdig forbindelse og deretter med et biologisk aktivt stoff (2) eller omsettes umiddelbart med et elektro-filt gruppeholdig biologisk aktivt stoff.

5- Middel inneholdende en forbindelse ifølge krav 1.

6. Anvendelse av en forbindelse ifølge krav 1 til affinitetskromatografi, til gjennomføring av immunreaksjoner eller gjennomføring av enzymreaksjoner.