NO166188B - Fornettet, poroest, perleformet polymerisat, dets fremstilling og anvendelse. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fornettet, porøst, perleformet polymerisat som i det vesentlige består av vinylacylatenheter og enheter av et fornetningsmiddel.

Oppfinnelsen angår også en fremgangsmåte for fremstilling av dette polymerisat og polymerisatets anvendelse som adsorpsjonsmiddel ved kromatografi eller ved fremstilling av bærerbundne biologisk aktive stoffer.

Anvendelsen av polymergeler til gelpermeasjonskromatografi av polymeroppløsninger for stoffseparasjon henholdsvis stoff-rensning eller til bestemmelse av molekylvektsfordeling, har allerede vært kjent lenge. Polymergeler som er egnet for vandige systemer, betegnes som hydrofile, men slike som bare kan finne anvendelse i ikke-vandige systemer (organiske oppløsningsmidler) kalles hydrofobe. Hydrofobe geler er for eksempel fornettede polystyroler, hydrofile geler er derimot slike på basis av fornettede dekstraner, polyvinylpyrrolidon, polyakrylamid og polyvinylalkohol. En for sterk svelletendens for slike geler noe som for eksempel hindrer høye gjennom-strømningshastigheter i gelpermeasjonskromatografi, kan motvirkes ved en økning av fornetningsgraden.

Det er allerede kjent hydrofobe geler på basis av fornettet polyvinylacetat, hvorav det ved forsåpning av acetatgruppene kan fremstilles en hydrofil gel på basis av fornettet polyvinylalkohol. Viktig er her fremfor alt en høy hydrolysebestandighet av fornetningen.

Som fornetningsmidler er det for dette formål allerede omtalt en rekke forbindelser fra teknikkens stand. Således åpenbares i DE-PS 1 517 935 hertil ved siden av divinylalkylener, divinyl- og dialkylestre av dikarboksylsyrer, blant annet også divinyl- eller diallyletre av flerverdige alkoholer. Foretrukkede er derved butandioldivinyletre (se også "Makromol. Chemie", 176 side 657 ff (1975)). De ifølge dette oppnåelige fornettede polyvinylacetatet henholdsvis poly-vinylalkoholer, kan også foreligge i form av makroporøse perler. Fornetningen med butandioldivinyleter er riktignok hydrolysestabile,, imidlertid kopolymeriserer disse etre vanskelig med vinylacetat, således at det dermed lar seg oppnå bare relativt lav fornetningstetthet.

Andre kjente fornetningsmidler som etylenglykoldimetylakrylat eller glycidylmetakrylat (US-PS 4 104 208) gir ingen hydrolysestabile fornetninger, og bygges ikke jevnt inn. Således ligger kopolymerisasjonsparametre av vinylacetat (Ml )og metylmetakrylat (M2) ved r^ = 0,01 t% = 20. Tilsvarende kopolymerisasjonsparametre er å vente for de her nevnte metakrylater. Dette betyr at de to nevnte fornetningsmidler forbrukes ved reaksjonens begynnelse, en jevn innbygning er derfor ikke å vente.

Det hører likeledes allerede til teknikkens stand å anvende hydrofile polymergeler ved affinitetskromatografi for separering av biologisk aktive stoffer, henholdsvis til immobilisering av slike stoffer, og derved å omsette polymergelens reaktive grupper, for det meste OH-grupper, på forhånd med såkalte "spacere". Som spacer kan man derved blant annet også anvende epiklorhydrin (se DE-OS 2 102 514 og DE-PS 2 421 789).

Oppfinnelsens oppgave bestod nu i å tilveiebringe en fornettet polymer på basis av polyvinylestre og spesielt polyvinylalkohol uten ulempene i henhold til teknikkens stand, som spesielt er hydrolysebestandig og egner seg spesielt godt som adsorbens i gelkromatograflen eller som bærer for kjemisk kovalent-bundne biologisk aktive stoffer, påvirker lite aktiviteten av de kjemisk kovalente bundne biologisk aktive stoffer og sikrer en lett gjennomstrømning av substratene som skal behandles.

Oppfinnelsen vedrører følgelig et fornettet polymerisat som i det vesentlige består av vinylacylatenheter og enheter av et fornetningsmiddel, idet polymerisatet er karakterisert ved at fornetningsmidlet har de generelle formler: og/eller

der

Ri og R£ i formel I er like eller forskjellige og betyr vinyl-, 1-acyloksy-vinyl-, allyl- eller 2-acyloksyallyl-,

A betyr en toverdig C2_8-nydrokarbonrest,

B i formel (II) betyr en toverdig Ci_g-hydrokarbonrest og

X betyr acyloksy,

hvorved mengden av fornetningsmiddelenheter utgjør 1-60 vekt-56, beregnet på polymeren, og hvorved acyloksygruppene i vinylacylatenhetene foreligger som sådanne eller er delvis eller fullstendig erstattet av hydroksylgrupper ved forsåpning, og hvorved den midlere partikkelstørrelse for perlene er 20-800 pm og den midlere porediameter utgjør 2-10 000 pm.

Oppfinnelsen vedrører videre en fremgangsmåte til fremstilling av et slikt fornettet polymerisat ved kopolymerisa-sjon av vinylacylat med et fornetningsmiddel I nærvær av et dispersjonsmiddel, idet fremgangsmåten karakteriseres ved at man anvender et fornetningsmiddel med formel (I) og/eller (II) som beskrevet ovenfor.

Fortrinnsvis forsåpes det således dannede polymerisat derefter partielt eller fullstendig.

Endelig vedrører oppfinnelsen også anvendelsen av polymer!-satene ifølge oppfinnelsen som adsorpsjonsmiddel I kromatografi eller som bærer for biologisk aktive stoffer.

VInylacylatenhetene av polymerisatet ifølge oppfinnelsen inneholder fortrinnsvis 2 til 18 C-atomer, spesielt 2 til 6 C-atomer i acylatresten. Fortrinnsvis er dette acetat- eller propionatresten. Det kan også være til stede forskjellige acylatrester i polymerisatet, det vil si til dets fremstilling kan det også anvendes blandinger av de tilsvarende vlnylacylater.

I fornetningsmidlet ifølge formel (I) betyr A fortrinnsvis en forgrenet eller uforgrenet alifatisk Cg_5-hydrokarbonrest, spesielt en Cg_g-hydrokarbonrest. Spesielt foretrukket er dette etylen- eller propylenresten. Hvis R1/R2 av denne formel (I) betyr 1-acyloksy-vinyl- eller 2-acyloksy-allyl-, så inneholder acyloksygruppen deri fortrinnsvis 2 til 18 C-atomer, spesielt 2 til 6 C-atomer. Fortrinnsvis betyr acyloksy-, acetat- eller propionatresten. Fortrinnsvis har restene R1/R2 betydningen av vinyl-. En foretrukket fornet-ningsenhet i polymerisatet ifølge oppfinnelsen avledes følgelig fra N,N'-divinyl-etylen-urinstoff. Dette fornetningsmiddel bevirker spesielt hydrolysebestandig sammen-knytning. En ytterligere foretrukket representant er N,N'-divinylpropylenurinstoff.

Fremstillingen av slike forbindelser er kjent, og eksempelvis omtalt i US-PS 2 541 152 eller i Ullmann, "Encyklopadie der technischen Chemie", bind 23, 611 (4. opplag).

I f ornetningsmidlet i henhold til formel (II) har B fortrinnsvis betydningen av en toverdig hydrokarbonrest, spesielt en forgrenet eller uforgrenet Cg_^-alkylenrest, fortrinnsvis C2_4-alkylenrest. Acyloksygruppen har her fortrinnsvis samme betydning som omtalt ovenfor for resten R i formel (I). Et foretrukket fornetningsmiddel av denne type er for eksempel 3,3-dimetylpentadien-2,4-diacetat, som kopolymeriseres spesielt lett med vinylacetat. Fremstillingen av slike forbindelser kan eksempelvis foregå ved omsetning av det tilsvarende di-, tri- eller tetraketon med vinylacetat eller isopropylenacylat i nærvær av sure katalysatorer under dannelse av de tilsvarende enolacylater. Det samtidig dannede aceton må derved kontinuerlig fjernes ved destillering fra likevekten.

Mengden av enheter av fornetningsmidlet (II) utgjør vanligvis 0 til 1005É, spesielt 0 til 60% beregnet på den samlede mengde av fornetningsmiddelenheter i polymerisatet.

Den samlede mengde av fornetningsmiddelenheter i polymerisatet ifølge oppfinnelsen, ligger i de angitte områder, og avhenger av den for det tilsiktede anvendelsesformål ønskede fornetningstetthet. Således tilstrebes for eksempel ved gelkromatografi en høy formstabilitet, noe som forutsetter en høy fornetningstetthet, og dermed et høyere innhold av fornettende monomerenheter. Derimot kan i andre anvendelses-områder for eksempel som bærer for enzymreaksjoner, i rørekar eller for diagnostika, være fordelaktig en lavere fornetningstetthet. Fornetningsinnhold under 0,1 vekt-% fører i de fleste tilfeller ikke til mere anvendelige produkter. Fornetningsinnhold over 60 vekt-% er prinsipielt mulig; medfører vanligvis imidlertid ingen ytterligere fordeler.

Alt efter anvendelsesformen ligger mengden av fornetningsenheter fortrinnsvis ved 1 til 50 vekt-%, og spesielt ved 1 til 40 vekt-%, beregnet på polymeren. Ved anvendelse som bærer for biologisk aktive stoffer, ligger den nedre grense fortrinnsvis ved 2,5 vekt-% og spesielt foretrukket ved 10 vekt-%. Hvis bare fornetningsenheter ifølge formel (II) foreligger, så utgjør deres nedre grense spesielt foretrukket 2,5 vekt-%.

For mange anvendelsesformål kan det være av fordel at polymerisatet ifølge oppfinnelsen i tillegg dessuten inneholder monomerenheter av en med vinylacetat kopolymeriserbar monomer, idet deres mengde vanligvis ikke overskrider 10 vekt-% beregnet på samlet polymer, og fortrinnsvis ligger mellom 0,1 og 5 vekt-#. Eksempler på slike monomerer og som eventuelt kan anvendes i blanding er: N-vinylpyrrolidon, vinylenkarbonat, (met)akrylsyre, (met)akrylnitril, (met)-akrylamid, (met)akrylsyrealkylester, alle med 2 til 12 C-atomer, fortrinnsvis 2 til 4 C-atomer i alkylresten, hydroksyalkylester av (met)akrylsyre med 2 til 6 C-atomer I alkylgruppen, N-vinyl-N-alkylacetamid, styren, a-metylstyren og lignende.

Det ifølge oppfinnelsen fornettede polymerisat foreligger i form av perler som overveiende har kuleformet. form og hvis midlere partikkelstørrelse i tørr, usvellet tilstand er 20 til 800 pm, fortrinnsvis 50 til 300 pm, og som fortrinnsvis har en snever partlkkelstørrelsesfordeling. Optimum av partikkelstørrelse avhenger derved fremfor alt av det spesielle anvendelsesområdet. Ved en søylefremgangsmåte gjennomført uten trykk, ville man for eksempel velge partikkelstørrelsen innenfor ovennevnte grense tilsvarende større enn ved en trykkfremgangsmåte. Perlene av polymrisatet ifølge oppfinnelsen er overveiende utformet makroporøst. Den midlere porediameter ligger vanligvis i området fra 2 til 10 000 nm, fortrinnsvis 5 til 200 nm og spesielt 20 til 200 nm.

Bestemmelsen av porediameteren (porevolumet) kan foregå slik at i det i første rekke bestemmes porevolumet ifølge kapillartrykkmetoden (kvikksølvporosimetri) (se her "Ullmanns Encyklopådie der technischen Chemie", bind 5 (1980), sidene 751-752). Herav fremkommer da den midlere porediameter ved beregning efter den på side 752, venstre spalte øverst, i dette litteratursitat angitte ligning. Dessuten er en porestørrelsebestemmelse også mulig ved raster-elektron-mikroskopi.

Acylatgruppene i acylat-enhetene I polymerisatet ifølge oppfinnelsen er fortrinnsvis forsåpet til OH-grupper idet forsåpningsgraden vanligvis utgjør mer enn 50%, fortrinnsvis mer enn 70%, og helst 90 til 100%. Ved anvendelse som bærer for biologisk aktive stoffer, er i den ved forsåpning dannede fornettede polymer (polyvinylalkohol) fortrinnsvis i det minste en del av 0H-gruppene besatt med såkalte "spacer"-grupper (med hensyn til "spacer" se nedenfor). For mange formål av gelkromatografi kan det derimot være av fordel i det minste å belegge en del av OH-gruppene med hydrofoberende grupper som ikke lenger Inneholder reaktive rester.

Polymer!satene ifølge oppfinnelsen utmerker seg spesielt ved en høy hydrolysebestandighet ved høy fornetningstetthet. Denne høye hydrolysebestandighet er ikke bare av stor betydning i gelkromatograf!, men også ved anvendelse som bærer for biologisk aktive stoffer som enzymer. Enzymer fiksert på bærere anvendes ofte i årevis i sterkt alkalisk eller sterkt surt miljø. Dette er i spesiell grad tilfelle for de "uspesifikke hydrolaser" som spalter ester- og karboksylsyreamidbindinger. Forøvrig er den stabile for-netning også fordelaktig ved forsåpningen av acylatgruppene til OH-grupper i polymerisatene ifølge oppfinnelsen.

Polymerisatene ifølge oppfinnelsen egner seg blant annet som stasjonær fase i gelkromatografi og som bærer for biologisk aktive stoffer.

Fremstillingen av de fornettede polymerisatene ifølge oppfinnelsen foregår på kjent måte, fortrinnsvis under betingelsene for perlepolymerisasjon i nærvær av et dispersjonsmiddel, en dispersjonsstabilisator og eventuelt ytterligere tilsetningsstoffer samt eventuelt en radikal-virksom initiator, og fortrinnsvis et inert fortynningsmiddel samt under utelukkelse av oksygen.

Som dispersjonsmlddel til gjennomføring av perlepolymerisa-sjonen tjener fremfor alt slike forbindelser som er flytende under normal-betingelser, har et kokepunkt over 60°C, fortrinnsvis i området på 85-300°C, og som ikke eller kan i liten grad oppløse monomerene, polymeren og fortrinnsvis også initiatoren, under polymerisasjonsbetingelsene for å hindre emulsjonspolymerisasjon. Forholdet mellom monomerfase og dispersjonsmiddelfase kan variere innen vide grenser, fortrinnsvis mellom 0,5:1 til 1:50, fortrinnsvis 1:1 til 1:15 på vektbasis. Fortrinnsvis benyttes vann som dispersjonsmiddel. Fortrinnsvis inneholder dette en buffer som arbeider i det alkaliske området, og som oppfanger den syre som dannes ved hydrolyse av vinylacetat. Denne buffer består fortrinnsvis av Na2HP04/NaH2P04 henholdsvis NaHC03.

Som dispersjonsstabilisatorer som skal hindre en agglo-merering av perler under polymerisasjonen, tjener de hertil kjente forbindelser. Fortrinnsvis er dette en hydrofil polymer som polyvinylpyrrolidon, polyvinylalkohol, polyakrylamid, polyetylenglykol, metylcellulose eller etylenoksyd-propylenoksyd-kopolymerer.

Polyvinylpyrrolidon foretrekkes spesielt for dette formål. Disse dispersjonsstabilisatorer er virksomme allerede i mengder på 0,001 vekt-%, beregnet på den samlede mengde av monomer. Det anvendes minst mengder på 0,005 til 50 vekt-%, fortrinnsvis 0,01 til 20 vekt-% (beregnet på den samlede mengde av monomer).

Tilsetningen av en elektrolytt (i tilfelle vann som dispersjonsmiddel), for eksempel et salt som koksalt til den vandige fase, er vanligvis fordelaktig, da den bevirker den omtrent fullstendige fortrengning av monomerene fra den ytre fase og derved bevirker en omtrent fullstendig undertrykkelse av emulsjonsdannelse og dertil en økning av perleutbyttet. Elektrolytt-tilsetningen kan dessuten delvis også ha virkningen av et beskyttelseskolloid. For det meste anvendes denne elektrolytt i mengder inntil 50 vekt-%, fortrinnsvis inntil 30 vekt-%, beregnet på dispergeringsmidlet.

Som radikal-virksomme initiatorer kommer ifølge oppfinnelsen i betraktning slike som er godt oppløselige i monomerfasen og minst mulig oppløselige i det flytende dispergeringsmiddel. Eksempler er organiske peroksyder som di-tert.-butylperoksyd, dibenzoylperoksyd, cumolhydroperoksyd, cykloheksanonperoksyd eller alifatiske azo-forbindelser som a,a'-azodiisosmøresyre-nitril, azo-bis-cyanvaleriansyre, 1,1'-azo-cyklo-heksan-1,1'-dikarboksylsyredinitril og azodikarbonamid. Eventuelt kan også tilsvarende redoksysystemer finne anvendelse. Mengden av initiatorer utgjør for det meste 0,01 til 5 vekt-%, fortrinnsvis 0,1 til 2 vekt-% (beregnet på den samlede monomer-mengde). Mulig er også initieringen av polymerisasjonen ved hjelp av stråling, eventuelt ved samtidig nærvær av en initiator.

For å oppnå en høyest mulig porøsitet for perlepolymerisatene setter man bestemte inerte, flytende komponenter (fortynningsmidler) til polymeriseringssystemet eller fortrinnsvis til monomerene. Med dette menes slike stoffer der monomerene oppløses godt eller er godt blandbare, på den andre side imidlertid er praktisk talt uoppløselige i dispergeringsmidlet og dermed ikke er blandbare med dette. Slike fortynningsmidler og deres virkning er for eksempel omtalt i DE-PS 1 517 935 samt i "Makromol. Chemie", 176, side 657 ff

(1975).

Det optimale fortynningsmiddel henholdsvis fortynningsmiddel-blanding lar seg fastslå ved enkle rutineforsøk. Porestør-relsen påvirkes av type og sammensetning samt mengden av inertkomponentene, men også av mengden av fornettende komponent.

Fortynningsmidlene kan anvendes alene eller i blanding og være oppløsnings- eller fellingsmidler for polyvinylacetat. Som eksempler skal det nevnes: alkanoler som butanol, cykloheksanol, isooktanol, glykol eller estre som butyl-acetat, butylglykolacetat, glyceroltriacetat eller amider som dimetylformamid, dimetylacetamid, pyrrolidon eller ketoner som aceton, cykloheksanon eller etre, dialkyletre med minst 6 C-atomer som di-n-butyleter, di-n-amyleter, difenyleter eller hydrokarboner som heksan, benzen, isooktan, parafinolje. Fortrinnsvis anvendes i tilfellet av vann som dispergeringsmiddel, dialkyletre med minst 6 C-atomer som di-n-butyleter eller di-n-amyleter. Ytterligere foretrukne fortynningsmidler er polyglykoler som oppstår ved tilleiring av en blanding av etylenoksyd eller propylenoksyd, eller av propylenoksyd alene i en alkohol, for eksempel butanol som startmolekyl og som eventuelt har en statistisk etylenoksyd-propylenoksyd-fordeling, eller blokkpolymerer av etylenoksyd og propylenoksyd, hvor poly(oksyetylen)-enheter er addert på begge ender av poly(oksypropylen)-kjeden.

Mengden av tilsatt fortynningsmiddel er meget variabel. Den avhenger blant annet av monomersammensetningen, spesielt innholdet av fornetningsmiddel, den ønskede porøsitet (porestørrelse) samt av polymerens tilsiktede anvendelsesformål. Således anbefales ved en høy fornetningsgrad en tilsvarende stor mengde av fortynningsmiddel for å oppnå en bestemt porøsitet (porestørrelse). Ved en og samme fornetningsgrad vil porøsiteten (porestørrelsen) likeledes ære om så større, jo mere fortynningsmiddel som anvendes. Selvsagt lar dette seg bare øke innen bestemte grenser da ellers den mekaniske fasthet ville være for liten. I de fleste tilfeller vil et volum av fortynningsmiddel som tilsvarer 0,02 til 5 ganger, fortrinnsvis 0,04 til 3 ganger volumet av anvendt monomer, gi tilfredsstillende resultater.

Vinylacetatet samt fornetningsmiddel og den eller de ytterligere komonomerer anvendes I slike mengder at det fremkommer en polymer med en videre ovenfor angitt mengde av monomerenheter.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen gjennomføres hensiktsmessig i en med et røreverk utstyrt reaksjonsbeholder ved temperaturer på minst 20 til 150°C, fortrinnsvis 20 til 100°C og ved et trykk på 1 til 10 bar, fortrinnsvis 1 til 5 bar. Perlepolymerisatets partikkelstørrelse innstilles på kjent måte ved hjelp av rørehastighet og faseforholdet. Reaksjonsbeholderen er fortrinnsvis vakuumfast og kan utstyres med tilbakeløpskjøler, tilløpstrakt, gassinnføringsrør og temperaturmåleapparat. Beholderens oppvarming og avkjøling skjer vanligvis ved hjelp av et væskebad, for eksempel et oljebad eller vannbad.

Det er fordelaktig å gjennomføre fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen under utelukkelse av luftoksygen. Reaksjonsbeholderen spyles derfor før begynnelse med en inertgass, fortrinnsvis nitrogen.

Efter polymerisasjonsreaksjonens avslutning, fjernes de ikke omsatte monomerer fra reaksjonsbeholderen, for eksempel ved fordampning ved nedsatt trykk, fortrinnsvis ved trykk på 0,1 til 15 torr. Efter fjerning av restmonomerene separeres dispersjonsmidlet fra den faste polymeren, for eksempel ved hjelp av dekantering, filtrering eller avsugning av det ovenstående. Det eventuelt anvendte fortynningsmiddel kan på forhånd fjernes ved hjelp av vanndampdestillasjon. Derefter vaskes polymerisatet hvis nødvendig med lettkokende, organiske oppløsningsmidler, for eksempel et hydrokarbon, en lavere alkohol eller aceton, og endelig tørkes. Tørkningen av polymerisatet foregår ved en temperatur på minst 20 til 100°C, fortrinnsvis på 20 til 80"C, en tørkning under nedsatt trykk er derved å anbefale.

Den således dannede polyvinylacetatgel er Ikke hydrofil, for anvendelse i vann må estergruppene hydrolyseres. Det kan foregå på kjent måte alkalisk ved svell ing av produktet i en alkohol, for eksempel metanol og tilsetning av vandige alkalier som for eksempel natronlut eller ved omforestring av det alkoholavkjølte produkt med katalytiske mengder syre eller hase ved løpende, for eksempel destillativ fjerning av dannet ester (se DE-PS 1 517 935). Denne forsåpning kan avbrytes på et hvilket som helst ønskelig trinn, således at alt efter anvendelsesformål, kan gelens hydrofile grad innstilles.

Hvis den perleformede, fornettede polyvinylalkoholgel skal anvendes som bærer for biologisk aktive stoffer som skal fikseres ved hjelp av en kovalent binding til bæreren, så er det 1 mange tilfeller hensiktsmessig å modifisere gelen på forhånd med såkalte "spacere". Med "spacere" forstår man da forbindelser som reagerer både med bærerpolymeren og med det biologisk aktive stoff, og mellom begge til en viss grad danner en bro. Omsetningen av perlepolymerisatet med spaceren kan enten foregå direkte eller fortrinnsvis efter foregående forsåpning av acylatgruppene. Omsetningsgraden avhenger da blant annet av spacerens sperrethet og acylatgruppenes henholdsvis de derav dannede sekundære hydroksylgruppers tilgjengelighet. Som spacere kommer ifølge oppfinnelsen på tale de hertil kjente homo- og hetero-bifunksjonelle forbindelser hvis andre funksjonelle gruppe overtar koblingen med det biologisk aktive stoff som skal fikseres (se DE-PS 2 421 789 og 2 552 510, samt Ullmann "Encyklopadie der technischen Chemie", 4. oppi., bind 10, side 540 og "Characterization of Immobilized Biocatalystsn, Verlag Chemie, Weinheim, 1979, side 53).

Ved spacerne som anvendes ifølge oppfinnelsen dreier det seg for eksempel om slike som innfører de følgende grupper:

Foretrukne "spacere" er Ifølge oppfinnelsen slike som tilveiebringer hydrolysebestandig kjemiske bindinger som epiklorhydrin eller dets homologe (a, p-epoksy-to-hålogen-alkaner). Omsetningen av polyvinylalkoholene (polyvinyl-acylatene) foregår derved uten oppløsningsmiddel eller I nærvær av et oppløsningsmiddel, fortrinnsvis i nærvær av en katalysator. Omsetningsvarigheten ligger avhengig av temperaturen som ligger mellom værelsestemperatur og epiklorhydrinets tilbakeløpstemperatur (113-115"C ), vanligvis mellom 30 minutter og 24 timer. Som katalysatorer anvendes for eksempel NaOH (i pulverform) eller vandige alkalier, dimetylformamid, trietylamin og andre syreakseptorer.

Med biologisk aktive stoffer menes de kjente in vivo- eller in vitro-virksomme, naturlige eller kunstige stoffer som enzymer, „aktivatorer, inhibitorer, antigener, antilegemer, vitaminer, hormoner, effektorer, antibiotika, proteiner og lignende. Det siste begrep omfatter derved også proteiner med bestemte ikke-proteinsubstituenter som metallioner, poly-sakkarlder, porfyringrupper, adenindinukleotid, ribonuklein-syre, fosfolipider og så videre. Også polypeptidfragmenter for eksempel de aktive deler av enzymmolekylene, faller under begrepet biologisk aktive stoffer.

Av de ovenfor nevnte biologisk aktive stoffer, er ifølge oppfinnelsen enzymene foretrukket. Eksempler på enzymer er urease, penicillinacylase, D-aminosyreoksydase, adenyldes-aminase, alkohol-dehydrogenase, asparaginase, karboksypepti-dase, chymotrypsin, difosfoesterase, oc-glukosidase, glukose-isomerase, glukoseoksydase, glukose-6-fosfat-dehydrogenase, heksokinase, invertase, p-laktamase, laktase, laktatdehydro-genase, forskjellige lectiner, NAD-kinase, neuraminidase, papain, peroksydase, fosfataser (alkaliske og sure), 5'-fosfodiesterase, pyruvatkinase, ribonuklease, trypsin.

Eksempler på andre biologisk aktive stoffer er hormoner som Insulin og de forskjelligste hypofysehormoner, proteiner av

■y-globulinfraksjonen, for eksempel antilegemer av klassen G, M, A, D og E, andre blodfaktorer, for eksempel antihemofili-faktoren, blodkoaguleringsfaktorer, spesielle antistoffer, for eksempel hepatitis-, poliomyelitis-, finne-, kjertelbetennelse-, influensa- eller kaninantistoffer, antigener som heptitis-, poliomyelitis-, finne-, kjertelbetennelse-, influensa- eller kaninantigener til rensning eller stimu-lering av egnede antistoffreaksjoner, idet antigenet (efter uløseliggjøring) forblir i den uoppløselige form og følgelig ikke kan trenge inn i kroppen og beskadige denne, som generelle legemsproteiner som hemoglobin eller albumin.

Forankringsreaksjonen mellom det biologisk aktive stoff gjennomføres på kjent måte som for eksempel omtalt i DE-OS 2 407 340 eller DE-PS 2 215 687, 2 421 789 og 2 552 510. For det meste foregår omsetningen ved værelsestemperatur henholdsvis ved 40"C eller lavereliggende temperaturer, det siste spesielt når det biologiske, aktive stoff som skal forankres fra opprinnelsen, er ustabilt, i dette tilfellet ligger temperaturene under 10°C, fortrinnsvis ved 0 - 5°C.

Forankringsreaksjonen foregår fortrinnsvis nær en nøytral pH-verdi, for eksempel ved pH-verdier på 5 til 9, da her de fleste biologisk aktive stoffer er mest stabile. Vanligvis er det heller ikke nødvendig å overholde sterkere sure eller alkaliske betingelser, da de makroporøse perlepolymerlsater allerede i nøytralområdet reagerer hurtig med de fleste av de aktuelle stoffer. Den derved dannede binding gir tilstrekke-lig stabilitet for lang lagring og høy operasjonsstabilitet.

Oppfinnelsen skal forklares nærmere ved hjelp av noen eksempler.

Eksempel 1

I en kolbe med rører, termometer og tilbakeløpskjøler ble det under nitrogenatmosfaere suspendert en organisk fase bestående av en oppløsning av 97,5 g vinylacetat, 2,5 g divinyletylenurinstoff og 0,1 g azoisobutyronitril under omrøring i en vandig fase, bestående av 4,2 g Na2HP04, 0,25 g NaH2P04, 7,0 g polyvinylpyrrolidon og 700 ml H20. Ved oppvarming til 75'C ved hjelp av et varmebad, ble polymeriseringen startet. Efter to timer ble temperaturen øket til 85'C. Ytterligere to timer senere var polymeriseringen avsluttet. Den dannede suspensjon ble avkjølt ved innhelling i is, frafUtrert polymerisatet efter flere gangers dekantering av den findelte emulsjon og tørket. Det ble dannet 80 g tørt produkt.

Til hydrolyse ble 50 g av produktet svellet i metanol og blandet med en oppløsning av 50 g NaOH i H20 ved 25' C uten oppvarming eller motavkjøling. Efter 12 timer frafiltrerte man produktet, vasket det med mye vann inntil nøytralitet og tørket.

Produktet ble anvendt ved gelkromatograf1. For den uforsåpede gel ble det i tetrahydrofuran med polystyren funnet en sperre-molekylvekt på 1200. Det forsåpede produkt ga for polyetylenglykol i vann en sperre-molekylvekt på 1100.

Eksempel 2

Polymeriseringen ifølge eksempel 1 ble gjennomført under tilsetning av 140 g NaCl til den vandige fase. Efter reaksjonens avslutning ved innhelling i isvann, avsatte alt perlepolymerisat seg med en gang på bunnen, således at det omtrent ikke ble dannet noen emulsjonsdel. Det isolerbare utbyttet av perlepolymerisat lå over 90% (referert til den polymeriserbare fase).

Sperre-molekylvekten av gelen for polystyren i tetrahydrofuran øket til 1500; efter forsåpning fikk man i vann for polyetylenglykol en sperre-molekylvekt på 1300.

Eksempel 3

Polymeriseringen i eksempel 1 ble gjennomført analogt med det unntak at fornetningskomponenten bestod av 2,0 g divinyletylenurinstoff og 0,5 g 3,3-dimetylpentadien-2,4-diacetat.

De gelkromatogrfiske data tilsvarte de i eksempel 1.

Fremstillingen av 3,3-dimetylpentadien-2,4-diacetat foregikk som angitt nedenfor, ved acylering av 3-metyl-butanon-(2) med acetanhydrid i nærvær av en Lewis-syre og efterfølgende omsetning av det således dannede diketon med isopropenylacetat: 330 g (3,84 mol) nydestillert 3-metylen-butanon ble blandet med 500 g (5 mol) teknisk acetanhydrid (95%) i en kolbe og under omrøring og overføring av nitrogen tilsatt 160 g (1,15 mol) ZnCl2- Kolbeinnholdet ble oppvarmet 3 timer ved 120°C, og efter avkjøling destillert under vannstrålevakuum.

Det ble oppnådd 363 g av et råprodukt med et kokepunkt på 62'C (12 torr) 1 en GC-renhet på 86%.

Den gjentatte destillering av dette stoffet i vannstrålevakuum ga 289 g av et enhetlig produkt med kokepunkt 60'C (12 torr) som ved <1>H-NMR-analyse vist seg som 3,3-dimetylpentan-2,4-dion (singlett 1,3 ppm og 2,05 ppm).

110 g 3,3-dimetylpentan-2,4-dion ble under nitrogen blandet med 500 g tørr isopropenylacetat og tilsatt 5 g p-toluen-sulfonsyre. Blandingen ble på en kort fyll-legemekolonne oppvarmet til tilbakeløp og i tidsavstander på 12 timer over flere dager uttatt korttidige destillatfraksjoner mellom 54'C og 90"C. Reaksjonsblandingens sammensetning ble fulgt gasskromatografisk. Efter avslutning av reaksjonstiden på 6 dager, ble den sure katalysator nøytralisert ved karbonat-tilsetning og reaksjonsblandingen avdestillert hurtig under vannstrålevakuum. Ved gjentatt destillering ved normaltykk ble det fjernet Ikke omsatt isopropenylacetat. Under vannstrålevakuum ble det ved fornyet destillasjon oppnådd 39 g (87,5°C/12 torr) av et gasskromatografisk rent stoff. Ved dette produkt dreiet det seg om 3,3-dimetyl-pent-l-en-4-on-2-acetat (^^H-NMR: singlett 1,3 ppm og 2,1 ppm, dublett 4,9 ppm).

Den videre destillering av det resterende råprodukt under oljepumpevakuum ved 0,01 torr, førte til en produktblanding av monoenolacetat og en annen, høyere-kokende forbindelse. Herav ble det mellom 54"C og 65"C ved 0,01 torr i tillegg oppnådd 15 g av dienolacetatet i en renhet på 93% (GC).

Eksempel 4

For gjennomføring av en heterogen-fornettende perlekopoly-merisasjon ble en oppløsning av 80 g vinylacetat, 20 g divinyletylenurinstoff, 1 g azoisobutyronitril og 200 g n-heptanol dispergert i oppløsningen av 0,175 g NaHgPC^, 3 g Na2HPC"4 og 5 g polyvinylpyrrolidon i 500 ml vann og polymer I-sert. Temperaturforløpet tilsvarte eksempel 1. Efter fire timer ble fortynningsmiddel fjernet ved vanndampdestillasjon, og produktet isolert. Utbyttet utgjorde 77,7 g av helt, rent, klart perlepolymerisat. Den midlere partikkeldiameter lå ved ca. 30 pm (rørehastighet på 460 omdr./min.).

Produktet hadde et rystevolum på 1,55 ml/g. I tetrahydrofuran utgjorde dets gellagringsvolum 5,777 ml/g, sperre-molekylvekten for polystyren lå ved 80 000. Det forsåpede produkt hadde et rystevolum på 1,54 ml/g, det svellet i vann på 5 ml/g og viste en sperre-molekylvekt for polyetylenglykol på 20 000. 9 g av det hydrolyserte perlekopolymerisat lot man svelle i 200 ml epiklorhydrin i 24 timer ved værelsestemperatur. Derefter ble under langsom omrøring temperaturen øket til 113 til 115°C og holdt i fire timer. Efter avkjøling ble det filtrert over et sugefilter og kopolymerisatet ble utrørt flere ganger, hver gang en time i aceton. Det acetonfuktige kopolymerisat ble tørket til konstant vekt i vakuumskap ved 50° C. Epoksydekvivalenten utgjorde 244 (målt ifølge Axen, "Acta Chem. Scand.", B 29 (1975) nr. 4).

Eksempel 5

Polymeriseringen fra eksempel 4 ble gjennomført analogt med det unntak at fortynningsmidlet ble erstattet med en blanding av 80 g 2-etylheksanol og 20 g av en polyglykol av etylenoksyd og propylenoksyd (vektforhold 1:1, statistisk fordeling) med en molekylvekt på ca. 1200, og oppnådd ved tilleiring av etylenoksyd og propylenoksyd til butanol som starter. ("Polyglykol B 11/50" fra Hoechst AG).

Det ble isolert 76 g av et kalkhvitt, rundt perlepolymerisat hvis partikkelstørrelse utgjorde 50 til 200 pm, med en rørehastighet på 460 omdr./min.

Eksempel 6

Polymeriseringen fra eksempel 4 ble gjennomført analogt med det unntak at fortynningsmidlet ble erstattet med en blanding av 70 g 2-etylheksanol og 30 g polyglykol med molekylvekt fra ca. 700, oppnådd ved tilleiring av propylenoksyd til butanol som starter ("Polyglykol B 01/20" fra Hoechst AG).

Det ble isolert 82 g av et kalkhvitt, rundt perlepolymerisat hvis partikkelstørrelse utgjorde 50 til 200 pm ved en rørehastighet på 360 omdr./min.

Eksempel 7

Polymeriseringen ble gjennomført analogt med det unntak at fortynningsmidlet ble erstattet med en blanding av 80 g 2-etylenheksanol og 20 g av en polyglykol av etylenoksyd og propylenoksyd (vektforhold: 4:1; statistisk fordeling; molekylvekt: ca. 5 000), dannet ved tilleiring av etylenoksyd og propylenoksyd til butanol som starter. ("Polyglykol P41/300" fra Hoechst AG).

Det ble isolert 68 g av et kalkhvitt, rundt perlepolymerisat, hvis partikkelstørrelse lå i området 50 til 200 pm ved et røredreietall på 460 omdr./min.

Eksempel 8

Polymeriseringen fra eksempel 4 ble gjennomført med det unntak at fortynningsmidlet ble erstattet med en blanding av 80 g 2-etylheksanol og 20 g av en polyeterglykol av polyoksy-propylen, med 10 vekt-% polyoksyetylen i det samlede molekyl, idet polyoksyetylen-enhetene er addert på begge ender av polyoksypropylenkjeden (molekylvekt ca. 1750) ("Pluronic polyol 61").

Det ble isolert 72 g av et kalkhvitt, rundt perlepolymerisat hvis partikkelstørrelse lå i området 50 til 200 pm ved et røredreietall på 460 omdr./min.

Eksempel 9

Polymeriseringen fra eksempel 4 ble gjennomført med det unntak at fortynningsmidlet ble erstattet med en blanding av 100 g 2-etylheksanol og 100 g di-n-butyleter. Det ble isolert 83 g av et kalkhvitt, helt rundt perlepolymerisat, hvis partikkelstørrelse utgjorde 70 pm, ved en rørehastighet som i eksempel 4.

Rystevolumet av produktet utgjorde 2,81 ml/g, i tetrahydrofuran hadde gel-lagringsvolumet 7,48 ml/g og en sperre-molekylvekt for polystyren på 2 x 10^. Det hydrolyserte produkt hadde et rystevolum på 1,6 ml/g. Gel-lagringsvolumet i vannet utgjorde 12,8 ml/g og sperre-molekylvekten for polyetylenglykol var 2 x 10^.

Eksempel 10

Polymeriseringen fra eksempel 4 ble gjennomført med det unntak at den dispergerte fase bestod av 70 g vinylacetat, 30 g divinyletylenurinstoff, 1 g azoisobutylonitril og 158 g di-n-butyleter. Det ble dannet 77 g av et hvitt perlepolymerisat med en midlere diameter på 200 pm.

Hellevolumet utgjorde 2,9 ml/g, gel-lagringsvolumet i tetrahydrofuran lå ved 7,45 ml/g. Gel-kromatografisk kunne man ikke bestemme noen sperre-molekylvekt fo produktet: polystyren med M = 25 000 000, ble eluert med omtrent det indre volum. Rasterelektronmikroskopisk opptak viste porer på mer enn 100 000 Å diameter.

Det hydrolyserte produkt hadde et hellevolum på 6,5 ml/g, hvilket viste at skjelettstrukturen var bibeholdt fullstendig. Gel-lagringsvolumet i vann utgjorde 14,5 ml/g; i den gel-kromatografiske undersøkelse stod polyetylenglykol med molekylvekt 3,8 x 10^, omtrent det samlede indre volum til disposisjon. 10 g av det hydrolyserte kopolymerlsat ble efter 24 timers svelllng 1 100 g eplklorhydrln langsomt oppvarmet under omrøring til 110°C og holdt i 12 timer ved denne temperatur. Efter avkjøling til værelsestemperatur ble det frasuget og kopolymerisatet utrørt flere ganger, hver gang to timer langsomt i aceton. Tørkingen foregikk i vakuumskap ved 50°C. Epoksydekvivalenten utgjorde 105 pmol/g bærer.

Omsetning av de perleformede polvmerbærere ifølge oppfinnelsen med biologisk aktive stoffer.

Eksempel 11

Til 100 mg av en ifølge eksempel 4 fremstilt bærer ble det tilsatt 800 pl av en trypsinoppløsning (6,25 mg/ml, 345 U/ml). For innstilling av enzymoppløsningen på pH 7,8, ble tilsatt 1-molar kaliumfosfatbuffer, til stabilisering av det aktive sentrum av enzymet 1,6 x 10~^-molar benzamidino-oppløsning. Varigheten av enzymets fiksering på bæreren utgjorde 72 timer ved 25°C. Derefter ble det ikke kovalent til bæreren bundet trypsin frasuget over en glassfritte, og resten utvasket flere ganger med 1-molar natriumkloridoppløs-ning, derefter med bufferoppløsning. Utbyttet av fuktig materiale lå ved 324 mg. Målingen ble gjennomført med autotitrator ved 37"C og en pH-verdi på 7,8 med N'-benzoyl-L-argininetylesterhydroklorid (BAEE) og av en verdi på 227,5 U/g i fuktig tilstand eller 356 U/g, referert til tørrvekten. Balansering av utgangs- og vaskevannaktivitet ga et fikseringsutbytte på 20%.

Eksempel 12

Til 200 mg av en ifølge eksempel 10 fremstilt epoksydert bærer ble det satt 1500 pl av en urease-oppløsning (30 mg/ml, 51 U/ml), som med 1-molar kaliumfosfatbuffer ble innstilt på en pH-verdi på 8,0. Efter en fikseringsvarighet på 16 timer ved værelsestemperatur ble bæreren vasket med 1-molar natriumkloridoppløsning, derefter flere ganger med buffer-oppløsning. Utbyttet av fuktig bærer utgjorde 754 mg. Målingen med autotitrator ved 30 °C og véd pH 8,0 med urinstoff som substrat, ga en aktivitet på 100 U/g (fuktet) eller 377 U/g, beregnet på bærerens tørrvekt. Balansering av utgangs- og vaskevannaktivitet ga et fikseringsutbytte på 98%.

Claims (19)

1. Fornettet, porøst, perleformet polymerisat som i det vesentlige består av vinylacylat-enheter og enheter av et fornetningsmiddel, karakterisert ved at fornetningsmidlet har de generelle formler og/eller der Ri og R2 i formel (I) er like eller forskjellige og betyr vinyl-, 1-acyloksy-vinyl-, allyl- eller 2-acyloksyallyl-, A betyr en toverdig C2_8_nydrokarbonrest, B i formel (II) betyr en toverdig Ci_g-hydrokarbonrest og X betyr acyloksy, hvorved mengden av fornetningsmiddelenheter utgjør 1 til 60 vekt-%, beregnet på polymeren, og hvorved acyloksygruppene i vinylacylatenhetene foreligger som sådanne eller er delvis eller fullstendig erstattet av hydroksylgrupper ved forsåpning, og hvorved den midlere partikkelstørrelse for perlene er 20 til 800 pm og den midlere porediameter utgjør 2 til 10 000 pm.

2. Polymerisat ifølge krav 1, karakterisert ved at det som vinylacylatenheter inneholder vinylacetat-enheter.

3. Polymerisat ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at acyloksygruppene i restene R^ og R2 i formel (I) og acyloksyresten i formel (II) har 2 til 6 karhonatomer.

4. Polymerisat ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3, karakterisert ved at restene er R^ og R2 i formel (I) begge står for vinyl.

5. Polymerisat ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4, karakterisert ved at mengden fornetningsmiddel-enheter utgjør 1 til 50 vekt-%. (

6. Polymerisat ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5, karakterisert ved at mengden fornetningsmiddel-enheter utgjør 1 til 40 vekt-%.

7. Polymerisat ifølge et hvilket som helst av kravene 1-6, karakterisert ved at minst 10 vekt-% av acyloksygruppene i vinylacylatenhetene er erstattet av hydroksylgrupper.

8. Fremgangsmåte for fremstilling av et fornettet polymerisat ifølge kravene 1-7 ved kopolymerisering av vinylacylat med et fornetningsmiddel I nærvær av et dispergeringsmiddel og eventuelt partiell eller fullstendig forsåpning av det oppnådde polymerisat, karakterisert ved at det anvendes et fornetningsmiddel som har formelen (I) og/eller (II) ifølge krav 1.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at vinylacylatet er vinylacetat.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 8 eller 9, karakterisert ved at man arbeider I nærvær av ytterligere en med vinylacylat kopolymeriserbar monomer.

11. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 8-10, karakterisert ved at man gjennomfører polymeriseringen som perlepolymerisering.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at man som dispergeringsmiddel anvender en alkalisk vandig bufferoppløsning.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at man arbeider med et dispergeringsmiddel som inneholder 0 til 50 vekt-% av en elektrolytt.

14. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 11-13, karakterisert ved at man som dispergeringsmiddel anvender et som inneholder en ikke-Ionogen grense-flateaktiv forbindelse som dispergeringsstabilisator.

15. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 8-14, karakterisert ved at polymeriseringen gjennomføres i nærvær av en dialkyleter med minst 6 C-atomer som inert fortynningsmiddel.

16. Fremgangsmåte Ifølge krav 8 for fremstilling av det fornettede polymerisat ifølge krav 7, karakterisert ved at den vinylacylatgruppeholdige polymer underkastes en forsåpning slik at mer enn 70 % av acylatgruppene blir erstattet av OH-grupper.

17. Anvendelse av det fornettede polymerisat ifølge et eller flere av kravene 1-7 som adsorpsjonsmiddel ved kromatografi.

18. Anvendelse av det fornettede polymerisat ifølge et eller flere av kravene 1-7, eventuelt efter omsetning med forbindelser som reagerer både med en bærerpolymer og med et biologisk aktivt stoff, såkalte spacere, for fremstilling av bærerbundne biologisk aktive stoffer.

19. Anvendelse Ifølge krav 18, hvor spaceren er epiklorhydrln.