CH636628A5 - Process for the preparation of biologically active compounds, and the use thereof - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer auch die in diesen Naturstoffen häufig enthaltenen Carboxyl-

Verbindungen von biologisch aktiven Substanzen und wasser- gruppen wegen ihren unspezifischen Affinitäten als störend unlöslichen hochmolekularen Verbindungen, ihre Verwendung 10 empfunden werden. Daneben weisen diese Stoffe eine relativ zur Durchführung von Immunreaktionen in vitro und Mittel, die geringe thermische und chemische Stabilität auf.

diese Verbindungen enthalten. Viele dieser Nachteile konnten durch Verwendung von Po-

In den letzten Jahren hat sich eine neue Technik innerhalb lyvinylenglykol, einem synthetischen Polymeren, als Matrize der biochemischen Arbeitsmethoden mehr und mehr durchge- weitgehend beseitigt werden. Polyvinylenglykol, auch Polyhydr-

setzt, deren primäres Merkmal darin besteht, die Affinität von 15 oximethylen genannt, wird durch saure oder basische Hydrolyse trägergebundenen, biologisch aktiven Substanzen zu selektiv aus Polyvinylencarbonat hergestellt. Jedes Kohlenstoffatom durchzuführenden Reaktionen einzusezten. trägt eine Hydroxylgruppe und ein Wasserstoffatom. Die durch-

Über eine spezifische Komplexbildung der trägergebunde- gehende -C-C-Bindung verleiht dem Träger eine besondere nen Substanz mit einer zweiten, die in einem Gemisch vorliegt, hohe Stabilität.

kann die betreffende Substanz aus dem Gemisch entfernt und 20 Es wurde nun gefunden, dass man statt Polyvinylenglykol gewünschtenfalls anschliessend durch Desorption isoliert vorteilhaft Vinylenglykol-Copolymere als Trägermatrix ver-

werden. wenden kann. Durch Einpolymerisieren von geeigneten Como-

Trägergebundene Enzyme bieten den Vorteil, Stoffum- nomeren in Polyvinylencarbonat können die physikalischen und

Wandlungen in präparativen, kontinuierlichen Prozessen durch- chemischen Eigenschaften des daraus hergestellten Polyvinylen-

zuführen und die Reaktionsprodukte enzymfrei zu erhalten. 25 glykols weitgehend variiert werden.

In der biochemischen, enzymatischen Analytik stehen trä- So kann z.B. die «Hydrophilie» bzw. «Quellung» des Poly-gergebundene wasserunlösliche Enzyme als mehrfach verwend- vinylenglykols durch Einpolymerisieren von hydrophoben Mobare Reagenzien zur Verfügung. nomeren, wie Äthylen, Vinylchlorid oder Styrol in das Polyviny-Aufgrund der Eigenschaft der Enzyme, Affinitäten nicht lencarbonat verändert werden. Durch die Copolymerisation von nur gegenüber den Substraten, sondern auch gegenüber den 30 Vinylacetat wird im verseiften Endprodukt eine Vinylenglykol-spezifischen Inhibitoren aufzuweisen, hat sich die Gewinnung gruppe durch eine Vinylalkoholgruppe ersetzt, was eine erhöhte von Enzyminhibitoren mit Hilfe der Affinitätschromatographie Quellbarkeit in wässrigem Medium zur Folge hat. an trägergebundenen Enzymen besonders günstig erwiesen. Es ist möglich, mit Hilfe von Comonomeren, wie z.B. Di-Andererseits erlaubt die Bindung von Inhibitoren an wasserun- äthylenglykoldivinyläther und Divinylbenzol eine Vernetzung lösliche Matrizen die präparative Gewinnung der entsprechen- 35 und damit eine Verbesserung der mechanischen Eigenschaften den Enzyme. des Trägers zu erhalten. Durch Einpolymerisieren von elektro-Als sogennante Immunadsorbentien werden Antigene oder phüen Funktionen, z.B. Oxirangruppen (Epoxigruppen) aus Vi-Antikörper an wasserunlösliche Matrizen gebunden und erlau- nylglycidyläther-Comonomeren, ist eine direkte Umsetzung der ben danach die Isolierung der korrespondierenden Antikörper Matrix mit nucleophilen Funktionen (-NH2, -OH usw.) mög-bzw. Antigene. 40 lieh. Carboxylgruppen können durch Acrylsäureester-Comono-Als biologisch aktive Substanzen werden entsprechend den mere eingeführt werden. Nach erfolgter Copolymerisation wer-vorhergehenden Ausführungen in vivo und in vitro wirksame den die Estergruppen zu Carboxylgruppen verseift. Die Einfüh-natürliche und künstlich hergestellte Stoffe verstanden, die im rung von -NH2- oder -COOH-Gruppen erlaubt die Aktivie-weitesten Sinne als Enzyme, Aktivatoren, Inhibitoren, Antigene rung mit Hilfe von Carbodiimiden, Isoxazoliumsalzen, Glutaral-oder Antikörper, Vitamine und Hormone bezeichnet werden 45 dehyd usw. Copolymerisate-Vinylenglykol/Vinylalkohol haben können. Für diese biologisch aktiven Substanzen hat sich, da sie eine höhere spezifische Oberfläche und damit eine höhere Bin-die Wirkprinzipien der wasserunlöslichen Systeme darstellen, dungskapazität für z.B. Proteine an der Oberfläche des Poly-die Bezeichnung Effektoren eingeführt. merpulvers im Vergleich zu Vinylenglykol-Homopolymerisat.

Die meisten der bisher beschriebenen trägergebundenen Ef- Gegenstand der Erfindung sind demnach Verfahren zur fektoren sind wesentlich stabiler als die entsprechenden biolo- 50 Herstellung von biologisch aktiven, Verbindungen aus einem gisch aktiven Substanzen in Lösung. vorzugsweise wasserunlöslichen Copolymerisat des Polyvinylen-Als Trägermaterialien, sogenannte Matrizen, sind vorteil- glykols und einer daran chemisch unter Erhaltung ihrer biologi-haft solche Stoffe einzusetzen, die neben der Unlöslichkeit in sehen Aktivität gebundenen biologisch aktiven Substanz. In die-wässrigen Systemen eine möglichst niedrige unspezifische Ad- sen Verbindungen ist die Trägermatrix ein Polyvinylenglykol-sorption aufweisen. Dazu müssen hydrophobe, hydrophile und 55 Copolymerisat enthaltend bevorzugt bis zu 45 %, vorzugsweise ionische Wechselwirkungen zwischen Matrize und dem Reak- 5-20 %, eines Comonomeren. Die biologisch aktiven Substan-tionspartner des Effektors weitgehend unterbunden werden. zen sind Stoffe wie z.B. Enzyme, Aktivatoren, Inhibitoren, An-Mit Substanzen, deren Bindung an den Effektor unerwünscht tigene oder Antikörper, andere Plasmaproteine, Blutgruppenist, z.B. solchen, die keine spezifischen Reaktionspartner des substanzen, Phythämagglutinine, Antibiotika, Vitamine oder Effektors sind, sollte eine Bindung ausgeschlossen sein. 60 Hormone, Peptide oder Aminosäuren oder synthetisch herge-

Die bislang verwendeten Matrizen als Träger für biologisch stellte Effektoren.

aktive Substanzen können unterteilt werden in diejenigen, die Der polymere Träger und die biologisch aktive Substanz die Effektoren durch physikalische Adsorption binden, dazu ge- sind im allgemeinen entweder direkt oder über eine Seitenkette hören beispielsweise Polystyrol, Aktivkohle und Glasperlen und (Spacer) kovalent miteinander verknüpft.

diejenigen, die mit dem Effektoren über eine kovalente Bin- 65 Die biologisch aktiven Verbindungen über eine Seitenkette dung miteinander verknüpft sind. Die letztgenannten schliessen (Spacer) zu binden ist von Vorteil, wenn die Molekulargewichte

Vinylpolymere als Homo- und Copolymerisate, z.B. Polyacryl- ihrer affinen Partner sehr unterschiedliche sind, oder wenn bei säuren, Polyacrylsäureamide und Amino-, Carboxy- oder Sulfo- der Verwendung in einem biospezifischen Prozess sehr hochmo-

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lekulare oder aus mehreren Untereinheiten aufgebaute Proteine teilnehmen. Spacer sind an der polymeren Matrix verankerte Seitenketten bestimmter Länge, die durch Einpolymerisieren, durch An- oder Einbau (Bindung von bi- oder polyfunktionellen Verbindungen - z.B. einem Tripeptid — an die Matrix) oder durch Einbau von funktionellen Gruppen und schrittweise Verlängerung an diesen erhalten werden können.

Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur kovalenten Verbindung der biologisch aktiven Substanzen mit dem Träger.

Hierzu steht eine Reihe von allgemein bekannten Reaktionen zur Verfügung.

Ri „Ri

H?C=C"" H,C=C;'

3

Sie betreffen zunächst die Verfahren zur Herstellung des Polyvinylenglykol-Copolymeren. Sie sind z.B. dadurch gekennzeichnet, dass Vinylencarbonat mit Comonomeren der Formeln:

H,C=C.

R,

h2c=c:

H,C=C'

R]

COOR,

"D-CO-CH,

\

Cl

10

H2C=C.

Ri

(0CH2-CH2)n-0-CH = CH2

-CH = CH2

Ri /Ri h2c=c^ ch2 h2c=c/

\(CH2)„ \(CH2)n-CH-CH2

II \ /

oc ch2 °

Ri ^

h2c =c^ h2c=c;

0-CH-CH2 CH-CH2

V 1 1

u o o

\/

c

II

o in denen Rj Wasserstoff, Methyl, Äthyl, R3 Methyl, Äthyl, Pro- Durch Einpolymerisieren von Monomeren mit Epoxy-pyl und n eine ganze Zahl zwischen 1 und 4 bedeuten, polymeri- Gruppen, z.B. mit Epoxyalkylvinyläthern in das Polyvinylencar-siert wird. bonat und durch die sehr grossen Unterschiede in der Versei-

Die Polymerisation des Polyvinylencarbonats erfolgt bevor- fungsgeschwindigkeit zwischen cyclischen Carbonat- und Epo-zugt mit bis zu 45 % Comonomeren, besonders bevorzugt mit 5 4o xy-Gruppen, erhält man leicht eine Polyvinylenglykol-Matrix bis 20 %. mit reaktiven Epoxy-Gruppen, die mit nucleophilen Funktionen

Die Herstellung der biologisch aktiven Verbindung ist bei- umgesetzt werden können. So ist die direkte Bindung einer bio-spielsweise dadurch möglich, dass eine elektrophile Gruppe ent- logisch aktiven Substanz und/oder die Einführung (Verlänge-weder in die biologisch aktive Substanz oder in das Polyviny- rung) einer Seitenkette (Spacer) möglich.

lenglykolcopolymer eingeführt wird und über diese die biolo- 45 Ein weiterer Vorteü ist demnach bei der Verwendung von gisch aktive Substanz mit den Polyvinylenglykolcopolymeren Copolymeren auch die Möglichkeit der direkten Einführung umgesetzt wird. (Einpolymerisieren) von elektrophilen Funktionen, die eine

Die Einführung der elektrophilen Gruppen in die Träger- Umsetzung nach bekannten Methoden erlauben.

matrix erfolgt im allgemeinen entweder durch Copolymerisieren Durch Copolymerisieren von Vinylencarbonat mit Äthyl-von Vinylencarbonat mit elektrophile Gruppen enthaltenden so Acrylat und nachfolgender Verseifung der Polymeren erhält Comonomeren oder durch Umsetzung der Trägermatrix mit ak- man eine Matrix mit -OH- und -COOH-Funktionen. Die tivierenden, elektrophile Gruppen tragenden niedermolekula- Carboxylgruppen können mit Hilfe von Carbodümiden aktiviert ren Verbindungen. werden und sodann eine Amidbindung mit Aminogruppen des

Effektors eingehen. Carboxylgruppen lassen ferner die Ausbil-Allgemein ist die chemische Kupplung eines Reaktionspart- 55 dung von Amidbindungen mit Hilfe der von Woodward einge-ners an die Trägermatrix einfach, wenn auf der einen Seite nu- führten Isoxazoliumsalze zu.

cleophile und auf der anderen elektrophile Funktionen vorhan- Eine weitere Methode zur Kupplung von biologisch aktiven den sind. Als reaktive nucleophile Funktionen kommen vor al- Verbindungen an Carboxylgruppen-haltigen Polymeren wird lem Amino-Sulfhydryl- und Hydroxylgruppen in Betracht, die rnit Hilfe von N-Äthoxycarbonyl-2-äthoxy 1,2-Dihydrochinolin gewöhnlich entweder in der Matrix oder im Reaktionspartner 60 (EEDQ) ausgeführt.

bereits enthalten sind. Elektrophile Funktionen müssen erst ein- Die Carboxylgruppen können nach bekannten Methoden geführt werden. Dazu können Carboxalgruppen in Säurehalo- verestert, danach der Ester in das Hydrazid überführt und genide, Säureazide, Säureanhydride, Imidazolide übergeführt schliesslich das in der Folge resultierende Azid mit der Amioder direkt mit Carbodiimiden aktiviert werden. Als reaktive nogruppe des Effektorproteins mit der Polyvinylenglykol-Ma-elektrophile Gruppen werden auch Isocyanat-, Isothiocyanat-, 65 trjx verknüpft werden.

Diazonium-Gruppen oder cyclische Imidocarbonatester be- Besitzt das in die Matrix einpolymerisierte Comonomere nutzt. Besonders günstig ist die Einführung reaktiver Gruppen durch nachfolgende Umsetzungen frei verfügbare Aminogrup-mit Hilfe der Copolymerisation. pen, so ist mit Arylaminogruppen enthaltenden Vinylsulfonde-

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rivaten oder Schwefelsäureestern von ß-Hydroxyäthylsulfonen tiert und anschliessend mit entsprechend reaktiven Gruppen ei-

die Einführung von Arylaminogruppen möglich, wobei die nes Effektors verbunden werden können, z.B. Arylaminogruppen sodann nach bekannten Methoden diazo-

K

C —C

OH OH

H H

C — C — C-

K

n

OH H 0 H

CH.

HO-CH 1

CH.

d.

■NH-C CH2)6-NH-CH2-CH2-S02-

W //

•ivî.

Auf diese Weise kann auch eine «Verlängerung» eines Spa-cers vorgenommen werden.

Ein anderer Weg zur Bindung von Proteinen über die Ami-nogruppen erfolgt mit Hilfe von Glutardialdehyd.

Einfach ist die Verknüpfung des Effektors an die Matrix nach einer Aktivierung der Hydroxyl- oder Aminogruppen des Polyvinylenglykol-Copolymeren mittels Cyanhalogeniden, vorteilhaft mit Bromcyan und einer nachfolgenden Umsetzung der Aminogruppen enthaltenden biologisch aktiven Effektoren über diese aktivierten Gruppen.

Eine weitere Möglichkeit zur Verknüpfung des Effektors mit einer Polyvinylenglykol- oder Polyvinylenglykol-Copolyme-risat-Matrix besteht in der Acylierung der Hydroxylgruppen mit Bromacetylbromid, gefolgt von der Alkylierung der Ami-nogruppe des Effektors.

Ähnliche Reaktionsverläufe sind beispielsweise durch Umsetzung der Hydroxylgruppen des Trägers mit reaktiven Triazi-nen zu erreichen, wobei ein Teil der reaktiven Gruppen des Triazins mit der Polyvinylenglykol-Verbindung, ein anderer mit Aminogruppen des Effektors in Reaktion tritt.

Diazotierbare aromatische Amine, die über eine weitere reaktive Gruppe mit den Hydroxylgruppen des Trägers einerseits in Verbindung treten können, erlauben auf der anderen Seite 20 die Kupplung mit dazu befähigten, aktivierten Aminosäuren, beispielsweise den Tyrosin- oder Histidinresten des Proteineffektors.

Arylaminogruppen enthaltende Vinylsulfonderivate und Schwefelsäurehalbester von ß-Hydroxyäthylsulfonen können 25 mit den Hydroxylgruppen des Trägers zur Reaktion gebracht werden. Sie ermöglichen die Bindung des Effektors nach der vorbeschriebenen Diazotierungsreaktion.

Besonders stabile Ätherbindungen entstehen bei der Umsetzung der Hydroxylgruppen des Polyvinylenglykol-Copoly-30 merisats mit nicht ionenbildenden Epoxiden, die mindestens 2 reaktive Gruppen enthalten, wie die Epihalohydrine oder die Polyepoxide, beispielsweise Epichlorhydrin oder Bisepoxide.

Eine weitere Art der Modifizierung ist die Einpolymerisa-tion von Comonomeren in die Polyvinylencarbonat-Kette (wie 35 z.B. von Vinylpyrrolidon) mit anschliessender partieller Umsetzung der Zyklocarbonatringe des Polyvinylencarbonats mit einem Amin, z.B. mit Hexamethylendiamin, zu einem über eine Urethanbindung mit einem Spacer oder Effektor substituierten Polyvinylencarbonat-Copolymerisat. Die restlichen Zyklocar-40 bonatgruppen werden dann zu Hydroxylgruppen verseift:

Polyvinylencarbonat

H

.N

iX

OH OH

n-1

CH-CH —

I I

OH 0 I

C = 0 I

NH

i

R

-CH-

0 0

\ /

C II

0

— GH-

I

OH n-1

-CH —.

I

0

1

C = 0 I

NH I

R

Verseifung tor führen und dadurch die kovalente Verbindung zwischen beiden herstellen; so die bekannte Umsetzung mit komplexbilden-55 den Metallverbindungen, z.B. Titanverbindungen. Alle diese Methoden sind dem Fachmann bekannt.

Bei der Bindung niedermolekularer biologisch aktiver Verbindungen ist es oft von Vorteil, nicht den Träger, sondern den Effektor zu aktivieren.

fi0 Im Prinzip können alle Verfahren verwendet werden, die in der makromolekularen Chemie bei der Modifizierung von synthetischen oder natürlichen makromolekularen Verbindungen bekannt sind.

Die Polyvinylenglykol-Copolymerisate zeichnen sich neben

Neben den hier beispielhaft angeführten Verfahren zur Herstellung der kovalenten Verbindung zwischen der Trägermatrix 65 der chemischen und thermischen Stabilität durch vorteilhafte und dem Proteineffektor oder anderen Effektoren, existieren verarbeitungstechnische Eigenschaften aus und führen damit zu noch weitere Methoden, die zur Reaktion der Hydroxylgruppen einer Überlegenheit gegenüber den bisher als optimal gefunde-oder bestimmten Gruppen des Copolymeren mit einem Effek- nen Trägermatrizen auf der Basis von natürlichen Kohlenhydra-

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ten. Sie sind z.B. in Form von Fasern, Fäden, Folien oder sphärischen Partikeln herstellbar, so dass je nach dem Anwendungszweck des daran zu bindenden Effektors die geeignetste Form gewählt werden kann. Vorzugsweise werden diese Copolymeri-sate in Form von feinteiligen Pulvern mit hoher spezifischer 5 Oberfläche angewendet.

Durch die produktionstechnisch lenkbare Grösse der für die Bindung der Effektoren bzw. der Spacer zugänglichen Oberfläche zeigt sich ein weiterer Vorzug der Polyvinylenglykol-Copo-lymerisate gegenüber den bekannten Trägermaterialien. 10

Die neuen biologisch aktiven Verbindungen eignen sich für die meisten Anwendungsverfahren, die bisher für andere an hydrophile, wasserunlösliche Träger gebundene Effektoren bekannt geworden sind. Es können demnach Enzyme wasserunlöslich gemacht werden. Die unlöslichen Enzyme werden zu- 15 nehmend zur Bestimmung von Substraten in Analysenautomaten und als sogenannte Enzymelektroden verwendet. Wegen der erhöhten Stabilität eignet sich eine Reihe trägergebundener Enzyme für die Durchführung technisch enzymatischer Umsetzungen. 20

Trägergebundene, biologisch aktive Substanzen haben wegen ihrer Eigenschaft als spezifische Adsorbentien eine breite Anwendung in der Affinitätschromatographie gefunden. Mit Hilfe von trägergebundenen natürlichen oder synthetischen Enzyminhibitoren gelingt die Hochreinigung von Enzymen, wäh- 25 rend die Enzyme als Effektoren insbesondere zur Gewinnung natürlicher Enzyminhibitoren aus Rohextrakten hervorragend geeignet gefunden wurden. Trägergebundene wasserunlösliche Antigene können zur Isolierung der zugehörigen Antikörper verwendet werden, die auf diese Weise frei von anderen Serum- so bestandteilen und frei von anderen Antigenen erhalten werden. Affinitätschromatographisch können auch nicht präzipitierbare Antikörper sowie solche, die wegen ihrer geringen Konzentration im Serum nicht fällbar sind, isoliert und auch quantitativ bestimmt werden. 3S

Beispiele

Herstellung der Vinylencarbonat-Copolymeren

Das bei der Herstellung der Copolymeren (CP) eingesetzte Vinylencarbonat wurde vor dem Einsatz eine Stunde über Na- 40 triumborhydrid (100 Gewichtsteile Vinylencarbonat auf 2 Gewichtsteile NaBH4) bei einem Druck von 33 mm am Rückfluss gekocht, dann bei 75733 mm über eine 50 cm lange, mit Ra-schig-Glasringen gefüllte Silbermantel-Kolonne destilliert und möglichst umgehend für die Copolymerisation eingesetzt. 45 Ebenso wurden die eingesetzten Comonomeren zuvor noch durch Destillation gereinigt.

1. Copolymerisat-Vinylenglykol/Vinylalkoholaus verseiftem Copolymerisat- Vinylencarbonat/Vinylacetat 50

a) In 9 Gewichtsteilen Vinylencarbonat und 1 Gewichtsteil Vinylacetat werden 0,05 Gewichtsteile Azobisisobutyronitril unter Stickstoff gelöst. Das Monomerengemisch wird unter Stickstoff in eine flachgedrückte (4 mm dicke, 60 mm breite, 150 mm lange) Aluminiumtube mit Schraubverschluss einge- 55 füllt (Gesamtfüllvolumen etwa 35 ml), unter N2 verschlossen und 48 h in ein 50° warmes Wasserbad eingehängt. Es werden harte, spröde Kunststoffplatten erhalten, die in einer Schlagmühle vorzerkleinert werden. Anschliessend wird das Granulat bei 1—2 mm Druck 5 h lang auf 120° erwärmt, um das nicht 60 polymerisierte Rest-Monomere abzutrennen.

Das entmonomerisierte Granulat wird in einer Mühle weiter auf eine Korngrösse <0,1 mm gemahlen, in 500 Gewichtsteilen 0,5 N Natronlauge eingetragen, bei 20° mit einem schnell-lau-fenden Rührer eine Stunde lang gemischt, wobei die Carbonat- 65 und Acetyl-Gruppen verseift werden. Das wasserunlösliche CP-Vinylenglykol/Vinylalkohol wird abgesaugt, gut mit Wasser von anorganischen Salzen freigewaschen und gefriergetrocknet.

Ausbeute: 4,7 Gewichtsteile CP-Vinylenglykol/Vinylalko-hol mit einer spezifischen Oberfläche gemessen nach BET von 34m2g_1.

b) Wie unter 1. a) beschrieben, nur dass auf 7 Gewichtsteile Vinylencarbonat 3 Gewichtsteile Vinylacetat eingesetzt werden.

Ausbeute: 4,1 Gewichtsteile CP-Vinylenglykol/Vinylalko-hol mit einer spezifischen Oberfläche des gefriergetrockneten Polymerpulvers von 62,5 m2g_1.

c) Vergleichsversuch wie unter 1. a) beschrieben, nur dass 10 Gewichtsteile Vinylencarbonat und kein Comonomer eingesetzt werden.

Ausbeute: 4,7 Gewichtsteile Homopolymerisat-Vinylengly-kol mit einer spezifischen Oberfläche des gefriergetrockneten Polymerpulvers von 20,5 m2g_1.

2. Copolymerisat- Vinylenglykol/Vinylglycidyläther

Ein Gemisch von 7 Gewichtsteilen Vinylencarbonat, 3 Gewichtsteilen Vinylglycidyläther und 0,1 Gewichtsteil Azobisisobutyronitril wird wie unter 1.) a) beschrieben in flachen Aluminiumtuben unter N2 3 Tage auf 50 °C erwärmt. Die erhaltenen Kunststoffplatten werden wie unter 1.) a) beschrieben zerkleinert, entmonomerisiert, auf eine Korngrösse <0,1 mm gemahlen, in 500 Gewichtsteilen eiskalter, 0,5 n NaOH mit einem schnell-laufenden Rührer 30 Minuten suspendiert, anschliessend das verseifte Polymere sofort abzentrifugiert, in Eiswasser aufgeschlämmt, unter Eiskühlung mit 2n H2S04 auf pH 7 neutralisiert, abgesaugt, mit Eiswasser ausgewaschen und gefriergetrocknet.

Ausbeute: 3,9 Gewichtsteile CP-Vinylenglykol/Vinylglyci-dyläther enthaltend 1,3 Milliäquivalente Oxirangruppen/g (bestimmt nach: «Praktikum der makromolekularen organischen Chemie», S. 221, von Braun, D., Cherdron, H., Kern, W., Hü-thig Verlag, Heidelberg 1966).

3. Aminosubstituiertes Copolymerisat-Trägermaterial

3,9 Gewichtsteile CP-Vinylenglykol/Vinylglycidyläther (aus Beispiel 2.) werden mit einem Ultra-Turrax-Rührer in 100 Gewichtsteilen H20 suspendiert und mit 10 ml 30%igem Ammoniak versetzt. Mit einem kleinen Magnetrührer wird anschliessend noch weitere 10 h bei 50° gerührt, schliesslich abgesaugt und gut mit Wasser ausgewaschen und gefriergetrocknet.

Ausbeute: 3,5 Gewichtsteile Copolymerisat-Trägermaterial enthaltend 0,9 m äquivalente Aminogruppen pro Gramm, in Form von 3-Amino-2-hydroxy-propyl-Gruppen (aus der Umsetzung von Ammoniak mit Glycidylgruppen entstanden).

4. CP-Vinylenglykol/Acrylsäure

9 Gewichtsteile Vinylencarbonat, 1 Gewichtsteil Acrylsäu-reäthylester und 0,05 Gewichtsteile Azobisisobutyronitril werden unter N2 wie bei Beispiel 1. a) polymerisiert, zerkleinert, entmonomerisiert und auf eine Korngrösse <0,1 mm gemahlen, verseift, abgesaugt, ausgewaschen und gefriergetrocknet.

Ausbeute: 5,0 Gewichtsteile hydrophiles Polymerpulver, enthaltend 1,1 Milliäquivalente Carboxylgruppen pro Gramm Träger mit einer spezifischen Oberfläche nach BET von 27,2 mV1.

5. (O-Aminohexyl-Gruppen-substituiertes Poly- Vinylenglykol

5 Gewichtsteile CP-Vinylenglykol/Acrylsäure aus Beispiel 4. werden mit dem Ultra-Turrax in 100 ml H20 suspendiert, auf 5° gekühlt mit 2,5 g N-Cyclohexyl-N'-(N-methylmorpholino)-äthyl)- carbodiimid-p-toluol-sulfonat versetzt, 30 Minuten bei pH 5 und 5° gerührt, abfiltriert und schnell mit Eiswasser gewaschen. Der aktivierte Träger wird anschliessend sofort in eine mit 2 n HCl auf pH 7,5 gestellte und auf 5° gekühlte Lösung von 5 g Hexamethylendiamin in 100 ml Wasser suspendiert und noch weitere 24 Stunden unter diesen Bedingungen mit einem

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Magnetrührer gerührt, abgesaugt, gut mit Wasser ausgewaschen und gefriergetrocknet.

Ausbeute: 4,5 Gewichtsteile co-Aminohexyl-Gruppen-sub-stituiertes Poly-Vinylenglykol mit 0,7 Milliäquivalenten Aminogruppen pro Gramm Träger.

6. Umsetzung von CP- Vinylenglykol/Vinylalkohol aus Beispiel 1. a) mit einer spezifischen Oberfläche nach BET von 34 m2g~'

a) mit Epichlorhydrin

50 g eines CP-Vinylenglykol/Vinylalkohol, hergestellt nach Beispiel 1. a) werden in 1 Liter 2 n NaOH suspendiert, mit 250 ml Epichlorhydrin versetzt und 2 Stunden bei 55-60° gerührt. Der pH-Wert der Suspension sinkt nach kurzer Zeit auf 10-11. Durch Zugabe von NaOH wird noch 1 Stunde dieser pH-Wert gehalten. Nach 2 Stunden Reaktionszeit wird der Feststoff abgesaugt, mit Wasser, Aceton und zum Schluss wieder mit Wasser gewaschen.

b) mit Hexamethylendiamin

50 g Hexamethylendiamin werden in 1,5 1 Wasser gelöst und mit HCl bis pH 10 versetzt. Zu der Lösung wird das nach

6. a) aktivierte CP-Vinylenglykol/Vinylalkohol gegeben und bei 50-55° 6 Stunden gerührt. Danach wird das Produkt abgesaugt und mit Wasser frei von Hexamethylendiamin gewaschen.

c) mit l-Aminobenzol-4-ß-hydroxyäthylsulfonschwefel-saureester

Das unter Beispiel 6. b) erhaltene Produkt wird mit 50 g l-Aminobenzol-4-ß-hydroxyäthylsulfonschwefelsäureester bei 55° und pH 10 eine Stunde lang gerührt. Anschliessend wird der Feststoff abfiltriert, mit Wasser, Aceton und wieder mit Wasser gewaschen.

d) Diazotierung 10 g des unter Beispiel 6. c) erhaltenen Produktes werden auf einer Nutsche mit 200 ml 0,1 n HCl gewaschen und danach in 300 ml 0,5 n HCl suspendiert. Die Suspension wird unter Rühren mit 0,1 n NaN02-Lösung bei 0-4° versetzt, bis bei der Diazotierung mit KJ-Stärkepapier ein geringer Nitrit-Überschuss festzustellen ist. Nach 10 Min. wird über eine Nutsche abfiltriert und der Rückstand mit Eiswasser und anschliessend mit 0,15 M Natriumphosphat-Puffer pH 7,5 von 0-4° gewaschen.

e) Kovalente Bindung mit Protein

0,8 g Albumin werden in 350 ml Phosphatpuffer pH 7,5 gelöst, auf 4° abgekühlt und das unter 6. d) hergestellte Produkt zugegeben. Die Suspension wird 20 Stunden bei 4° gerührt, danach abfiltriert und der Feststoff mit 1 M NaCl und phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (wässrige 0,9%ige NaCl-Lö-sung mit einem Gehalt an Vis Mol Na2HP04-KH2P04-Puffer vom pH 7,2) gewaschen.

Filtrat und Waschanlagen werden nach der Methode der radialen Immundiffusion auf Albumin untersucht. Es werden 60 mg Albumin an 1 g des so hergestellten Trägers gebunden.

7. Umsetzung von CP-Vinylenglykol/Vinylalkohol aus Beispiel 1. b) mit einer spezifischen Oberflächenach BET von 62,5 rr?g~1

Nach analogen Umsetzungen wie unter 6. a) bis e) beschrieben können an 1 g aktivierten Träger 80 mg Albumin quantitativ gebunden werden.

8. Umsetzung von Homopolymerisat- Vinylenglykol aus Beispiel 1. c) mit einer spezifischen Oberfläche nach BET von 20,5 m?g'

Nach analogen Umsetzungen wie unter 6. a) bis e) beschrieben können an 1 g aktivierten Träger 45 mg Albumin quantitativ gebunden werden.

9. m-Aminohexylgruppen-substituiertes Vinylenglykol/ Vinyl-pyrrolidon- Copolymerisat

In 9 Gew.Tl. Vinylencarbonat und 1 Gew.Tl. Vinylpyrroli-don werden 0,05 Gew.Tl. Abzobisisobutyrolnitril unter Stickstoff gelöst und analog Beispiel 1. a) polymerisiert und aufgearbeitet.

Nach dem Entmonomerisieren wird das Granulat zu einer 12 Gew.-%igen Dimethylformanid-Lösung gelöst, und mit s einem Druck von 15 Atü wird diese Lösung in ein Methanol-Fällbad hineingedüst. Man erhält einen feinfaserigen Niederschlag Vinylencarbonat/Vinylpyrrolidon-Copolymerisat, der abgesaugt, mit Methanol nachgewaschen und in 200 Gew.Tl. Methanol resuspendiert wird. Es werden 6 Gew.Tl. Hexamethy-lo lendiamin, gelöst in 50 Gew.Tl. Methanol, zugegeben, die Suspension 2 Tage bei Raumtemperatur gerührt, abgesaugt und mit Methanol ausgewaschen. Der gewaschene Filterrückstand wird jetzt in einer Lösung von 10 Gew.Tl. Natriummethylat in 300 Gew.T. 96%igem Methanol 4 Tage bei Raumtemperatur sus-15 pendiert, mit Methanol und dann sehr intensiv mit Wasser ausgewaschen und gefriergetrocknet.

Ausbeute: 5,0 Gew.Tl. eines über Urethan-Bindungen mit to-Aminohexyl-Gruppen substituierten Vinylenglykol/Vinyl-pyrrolidon-Copolymerisates enthaltend 1,6 m Äquivalent NH2-20 Gruppen/g Träger.

10. Bindung von IgG an co-Aminohexyl-Gruppen-substituiertes Copolymerisat aus Beispiel 9 mit Hilfe von Bernsteinsäureanhydrid und wasserlöslichem Carbodiimid 25 5 Gew.Tl. von nach Beispiel 9 hergestelltem Cü-Aminohe-xylsubstituierten Träger werden bei 10° und pH 6 mit 2,5 Gew.Tl. Bernsteinsäureanhydrid, die in 200 Gew.Tl. Wasser suspendiert sind, 4 Stunden succinoyliert. Der pH-Wert wird mit 2 n NaOH einreguliert. Nach der Waschung des Feststoffes 30 mit Wasser wird das Produkt mit 1,25 Gew. Tl. N-Cyclohexyl-N' (N-methylmorpholino)-äthyl)-carbodiimid-p-toluol-sulfonat bei pH 5 und 5° 30 Min. gerührt, abfiltriert und schnell mit Eiswasser gewaschen.

0,5 Gew.Tl. IgG werden in 150 Gew.Tl. Phosphat-Puffer 35 pH 7,5 gelöst und mit dem aktivierten Träger 24 Stunden bei 4° gerührt. Nach Fütration wird das Produkt mit 1 M Kochsalz und mit PBS gewaschen.

An 1 g des Trägers werden 75 mg IgG kovalent gebunden.

40 11. Copolymerisat- Vinylenglykol/Diäthylenglykoldivinyläther

In 9 Gew.Tl. Vinylencarbonat und 1 Gew.Tl. Diäthylengly-koldivinyläther werden 0,1 Gew.Tl. Azobisisobutyrolnitril unter Stickstoff gelöst und wie unter 1. a) beschrieben in flachen Aluminiumtuben unter N2 3 Tage auf 50° erwärmt und polymeri-45 siert. Nach Aufarbeitung und Verseifung wie unter 1. a) beschrieben werden 3,5 Gew.Tl. CP-Vinylenglykol/Diäthylengly-koldivinyläther erhalten.

12. Copolymerisat- Vinylenglykol/N-Acryloylaminoacetaldehyd-50 dimethylacetal a) In 9 Gew.Tl. Vinylencarbonat und 1 Gew.Tl. N-Acryloyl-aminoacetaldehyddimethylacetal werden 0,05 Gew. Tl. Azobisisobutyrolnitril unter Stickstoff gelöst. Das Momomerenge-misch wird wie unter 1. a) beschrieben polymerisiert, aufgear-

55 beitet und verseift zu 4,1 Gew.Tl. N-Acryloylaminoacetalde-hyddimethylacetal/Vinylenglykol-Copolymer.

10 Gew.Tl. N-Acryloylaminoacetaldehyddimethylacetal/ Vinylenglykol-Copolymere wurden in 100 Gew.Tl. 1N HCl 4-5 Stunden gerührt. Der aktivierte Träger wurde mit Wasser 60 und Phosphat-Puffer pH 7,5 gewaschen.

b) 0,5 g Albumin wurden in 200 ml PBS gelöst und mit dem unter a) hergestellten Produkt 14 Stunden bei 4° gerührt. Nach Fütration wurde das trägergebundene Protein mit 1 M Kochsalz und mit PBS gewaschen. 1 g des so hergestellten Trägers bindet

65 40 mg Albumin.

C

Claims (5)

636 628

1. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung aus einem Copolymeren des Vinylenglykols und einer daran chemisch gebundenen biologisch aktiven Substanz, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Copolymeres des Vinylencarbonats mit einer 5 biologisch aktiven Substanz umsetzt und danach die noch vorhandenen Cyclocarbonatgruppen in Hydroxygruppen überführt.

2

Ri /Ri

H,C=C^ H2c=c^

O-CH—CH2 CH-CH2

\/ il

O O

\/

c

II

O

o

\ / o in denen R! Wasserstoff, Methyl, Äthyl, R3 Methyl, Äthyl, Pro- 9. Mittel, enthaltend eine Verbindung aus einem Copolyme-pyl und n eine ganze Zahl zwischen 1 und 4 bedeuten, ver- ren des Vinylenglykols und einer daran chemisch gebundenen,

wendet. biologisch aktiven Substanz als aktive Komponente.

636 628 4

10. Verfahren einer Verbindung aus einem Copolymeren nylsubstituiertes Polystyrol, ferner die Zellulose und ihre Ab-des Vinylenglykols und einer daran chemisch gebundenen, bio- kömmlinge und schliesslich natürliche und synthetische Polylogisch aktiven Substanz zur Durchführung von Immunreaktio- peptide und Proteine ein. Wegen der ausgeglichenen Wechseinen in vitro. Wirkung zwischen Matrize und Effektor hat die Verwendung

2. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung aus einem Copolymeren des Vinylenglykols und einer daran chemisch ge- 10 bundenen biologisch aktiven Substanz, dadurch gekennzeichnet, dass man die Cyclocarbonatgruppen eines Copolymeren des Vinylencarbonats in Hydroxygruppen überführt und elek-trophile Gruppen im Copolymerisat mit einer biologisch aktiven Substanz umsetzt. 15

2

PATENTANSPRÜCHE

3

636 628

Rj Rj in denen Rx Wasserstoff, Methyl, Äthyl, R3 Methyl, Äthyl, Pro-

H2C =C^ H2C=C/ pyl und n eine Zahl zwischen 1 und 4 bedeuten, verwendet.

^O-CH-CHs ^ CH-CH2 7- Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,

\ / | | dass man ein Copolymeres, enthaltend mindestens 55% Mono-

O O O 5 mereinheiten des Vinylenglykols und höchstens 45% Mono-

\ / mereinheiten, mindestens einer Verbindung der Formeln

C Rj R, R]

II H2C=C^ H2C=C^ H2C=C^

o xcoor3 o-co-ch, ci

10 J

R1 R, Ri

H-,C=C HiC=C H2C=C^

\ \ , (0CH2-CH2)n~0-CH = CH2

<_J> V_/-ch=CH2

Ri

H,C=Q

= r/

R,

CH->

OC-

H,C = C

^(CH2)n

I

ch2

\

(CH2)n-CH-CH2 O

Ri /R

H-.C =QT H2C=C'

o-ch-ch2 xch-ch2

V 1 1

u O O

\/

c II

O

in denen Rx Wasserstoff, Methyl, Äthyl, R3 Methyl, Äthyl, Pro- mereinheiten des Vinylenglykols und höchstens 45 % Mono-pyl und n eine ganze Zahl zwischen 1 und 4 bedeuten, ver- mereinheiten, mindestens einer Verbindung der Formeln wendet. R, JRi

8. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, r c-c H2C=C H2C=C

dass man ein Copolymeres, enthaltend mindestens 55 % Mono- 40 2 ^COOR 2 ^0-C0-CH3 ^Cl

Ri Ri /R>

H,C=C^ H,C=C/ H2C=C./

12V_ = L.

x (0CHi-CH2)n-0-CH=CH2

<^>-ch=CH>

R. ^

H,C=C/ CH2 H2C=C^

\(CH2)n (CH2)n-CH-CH2

OC CH

3. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung aus einem Copolymeren des Vinylenglykols und einer daran chemisch gebundenen biologisch aktiven Substanz, dadurch gekennzeichnet, dass man die Cyclocarbonatgruppen eines Copolymeren des Vinylencarbonats in Hydroxygruppen überführt und das Copolymere zuerst mit einer elektrophile Gruppen enthaltenden Verbindung und dann mit einer biologisch aktiven Substanz umsetzt.

4. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung aus einem Copolymeren des Vinylenglykols und einer daran chemisch gebundenen biologisch aktiven Substanz, dadurch gekennzeichnet, dass man die Cyclocarbonatgruppen eines Copolymeren des Vinylencarbonats in Hydroxygruppen überführt und das Copolymere mit einer elektrophile Gruppen tragenden biologisch aktiven Substanz umsetzt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Copolymeres, enthaltend mindestens 55 % Monomereinheiten des Vinylenglykols und höchstens 45 % Monomereinheiten, mindestens einer Verbindung der Formeln

H,C=C.

\

h2c=c:

COOR,

-Ri

"D-CO-CH,

H2C=C

Ri

Cl h2c=c:

Ri

(0CH2-CH2)n-0-CH=CH2

Ri Rt

H2c=qf ch2 H2C=C^

Nr \(CH2)n (CH2)n-CH-CH2

II \ /

OC CH2 O

ßl /R1

h2c =c^ H2c=ef o-ch-ch2 ^ch-ch2

V 1 I

u 00

\/

c II

o in denen Rx Wasserstoff, Methyl, Äthyl, R3 Methyl, Äthyl, Pro-pyl und n eine ganze Zahl zwischen 1 und 4 bedeuten, verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Copolymeres, enthaltend mindestens 55 % Mono-

5 mereinheiten des Vinylenglykols und höchstens 45 % Monomereinheiten, mindestens einer Verbindung der Formeln

JLi /Rl h2c=< h2c=< h2c=c^

COOR3 O-CO-CH3 C1

H2C=C^

(0CH2-CH2)n-0-CH = CH2

CH2

R, Ri

H2C=C/ CH2 H2C=Cf

\(CH2)n \(ch2)„-ch-ch2

II \ /

oc ch2 0

5 von Kohlehydraten, insbesondere der Zellulose, des Dextrans,

der Stärke, des Agars bzw. deren Abkömmlingen, als Matrize in wässrigen Systemen die höchste Verbreitung gefunden, wenn