DE2263289A1 - Verfahren zur herstellung traegergebundener polypeptide - Google Patents

Description

föhm

GmbH Darmstadt
Pat/Dr.Hfc/Voi/9 2263289

Verfahren zur Herstellung trägergebundener Polypeptide

Die Anwendung trägergebundener Eiweißkörper gewinnt in Wissenschaft und Technik immer größere Bedeutung, da sie es auf die einfachste und sicherste Art gestatten, Wirkstoffe und Substrate nach ihrer Umsetzung wieder zu trennen. Aus diesem Grunde haben sich zahlreiche Entwicklungslaboratorien zum Ziel gesetzt, Trägerkörper für proteinartige Wirkstoffe zu entwickeln, die Eiweißstoffe aus wäßriger Lösung möglichst rasch und vollständig unter größtmöglicher Erhaltung ihrer biologischen Wirksamkeit aufnehmen und den Wirkstoff bei der Anwendung nicht wieder freisetzen. Nach der ansatzweisen Einwirkung auf ein Substrat soll der trägergebundene Wirkstoff durch Filtration schnell und restlos von der Substratlösung abtrennbar sein und eine Schüttung des Materials soll eine hohe Durchflußgeschwindigkeit bei kontinuierlichem Betrieb gestatten. Nachdem erste Präparate, die an synthetische oder vorbehandelte natürliche Makromoleküle gebundene Wirkstoffe, z.Bo Enzyme, enthielten, noch als recht unvollkommen anzusehen waren, liegen als Ergebnis jahrelanger Entwicklungsarbeiten nun Produkte mit hohem Gehalt an aktiven Wirkstoffen und guter Filtrierbarkeit vorο

Bestimmte Nachteile dieser Produkte wurden bisher als grundsätzlich unvermeidbar angesehen. Die Trägerstoffe enthalten Gruppierungen, die gegenüber Polypeptiden, insbesondere deren end- und seitenständigen Aminogruppen, reaktiv sind und damit unter Bildung einer Arnidgruppe zu reagieren vermögen. Diese Gruppen, wie z.B. Carbonsäureanhydrid-, Carbonsäurechlorid- oder Phenylester-Gruppierungen, sind wasserempfind-

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lieh und werden zu einem beträchtlichen Teil hydrolysiert, bevor sie mit dem Eiweißkörper in Reaktion treten. Durch die Hydrolyse entstehen Carboxylgruppen, deren negative Ladungen bei der späteren Umsetzung mit ebenfalls negativ geladenen Substratmolekülen hinderlich sein können und außerdem die Matrixeigenschaften des Trägers erheblich verändern. Andere funktioneile Gruppen, bei deren Hydrolyse keine Carboxylgruppen, sondern Amino- oder Hydroxylgruppen entstehen, reagieren so träge, daß es zur Bindung von Proteinen außerordentlich langer Reaktionszeiten oder aktivitätsschädigender Reaktionsbedingungen bedarf. Weiterhin geht bei der Überführung der häufig funktionswiohtigen basischen Aminogruppen eines Eiweißkörpers in nicht-basische Amidgruppen die biologische Wirksamkeit in vielen Fällen verloren, so daß stets nur derjenige Anteil des Wirkstoffes im gebundenen Zustand aktiv bleibt, bei dem die Bindung - mehr oder weniger zufällig an einer nicht funkt.ionswesentlichen Aminogruppe stattgefunden hat.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Polypeptide unter schonenden Bedingungen an Trägerstoffe zu binden, wobei insbesondere niedrige Temperaturen und solche pH-Werte herrschen sollen, unter denen die biologische Aktivität der Polypeptide nicht beeinträchtigt wird. In dem Trägerstoff sollen während oder nach dem Bindungsprozeß keine neuen polaren oder gar ionischen Gruppen durch Hydrolyse oder andere Nebenreaktionen entstehen, so daß die Matrix-Struktur des Trägerstoffes unverändert bleibt. Weiterhin wird von den Tmger-Polypeptid-Verbindungen gefordert, daß die biologische Aktivität des gebundenen Polypeptids möglichst weitgehend erhalten bleibt und daß die Verbindungen je nach dem vorgesehenen Verwendungszweck wasserlöslich oder wasserquellbar sind und im letztgenannten

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Fall gut filtrierbar und auswaschbar sind« Es wurde gefunden, daß die photo ehe mi sehe Bindung der Polypeptide an "Träger stoffe diese zahlreichen Forderungen erfüllt«

Durch Arbeiten von D. Elad und seiner Mitarbeiter (z»B_o D.Elad UoJ.Sperling, Journ.Amer.Chem.Soco93, Seite 967 971; I97I) am Weizmann-Institut (Rehovoth, Israel) ist es bekannt, an Glycin oder glycinhaltige Polypeptide durch photochemische Reaktion Toluol oder niedrige Olefine wie 1-Buten, anzulagern. Dabei gehen die Glycineinheiten in solche des Phenylalanins bzw. Norleucins über« Bei einer typischen Umsetzung dieser Art (J. Sperling, J.Amer.Chera., Soc, 1969, Band 9I, Seite 5389-90) wird ein aus 90$ DL-Alanin und lo$? Glycin aufgebautes Polypeptid vom Molekulargewicht 48oo in einer Lösung in Wasser,' tert« Butylalkohol und Aceton (als Sensibilisator) mit 1-Buten bzw» Toluol unter 72-stündiger Einwirkung von UV-Licht bei Raumtemperatur umgesetzt. Dabei wurden Polypeptide erhalten, die z.T. löslich, z«T, unlöslich waren und 0,5 bis 1% an Norleucin-Einheiten bzw. 2 bis ~3% Phenylalanin-Einheiten enthielten. Das entspricht einer Umwandlung der vorhandenen Glycin-Einheiten von 5 bis lo$ im Falle des Butens und von 2o bis Jo% im Falle des ToluolSo Elad (European Biophysical Congress Proceedings, 1971 II S. 75 -78) fand weiterhin eine schwerwiegende Beeinträchtigung der biologischen Aktivität durch photochemische Reaktionen« Durch Umsetzung mit Toluol oder Buten wurde Lysozym vollständig, RNase zu 9o$ inaktiviert.

Aus zahlreichen Arbeiten verschiedener Forschergruppen ist eine Vielzahl von weiteren photochemischeη Reaktionen bekannt, von denen zusammenfassend gesagt werden kann, daß sie in unspezifischer Weise und mit niedrigen Ausbeuten ablaufen«

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Es war deshalb keineswegs naheliegend, photochemische Reaktionen zur Bindung von Polypeptiden an Trägerstoffe heranzuziehen, denn es ist ein allgemeiner Erfahrungssatz, daß Reaktionen zwischen Makromolekülen weniger leicht ablaufen als Reaktionen zwischen Makromolekülen und niedermolekularen Verbindungen. Ran hat zur Bindung von Polypeptiden an Trägerstoffe daher bisher nur solche Reaktionen herangezogen, die im niedermolekularen Bereich quantitativ ablaufen. Aber auch damit hat man nur die Bindung geringer Mengen von Polypeptiden erreichen können. Aus diesem Grunde erschien die photochemische Addition zur Bindung zwischen Polypeptiden und Trägerstoffen zunächst als aussichtslose Darüber hinaus war bei jeder Bindung zwischen Polypeptiden und Trägerstoffen mit einer nur geringen Erhaltung der biologischen Aktivität zu rechnen. So wird die Wirksamkeit von Trypsin durch Acylierung mit Polyacrylsäure-Abkömmlingen auf einen Bruchteil des ursprünglichen Wertes herabgesetzt, wogegen Acetylierung die Aktivität von Trypsin nur unwesentlich beeinträchtigt. Die gleiche Beobachtung läßt sich an Insulin und vielen anderen biologisch aktiven Proteinen machen.

Es war daher völlig überraschend, daß Polypeptide auf photochemischem Wege an Trägerstoffe der verschiedensten Art unter schonendsten Bedingungen quantitativ unter weitgehender Erhaltung ihrer biologischen Aktivität gebunden werden können. Der Umstand, daß die photoehemiscne Reaktion nicht grundsätzlich an bestimmte reaktive organische Gruppen gebunden ist - wenn auch, wie später zu erörtern ist, einige bestimmte Gruppen recht förderlich sind - gestattet es, die Trägerstoffe weitgehend nach den anwendungstechnischen Erfordernissen auszuwählen. Man kann wasserlösliche Träger ebenso verwenden, wie wasserunlösliche quellbare Gele oder

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Perlpolymerisate oder sogar mit organischen Verbindungen modifizierte anorganische Träger₀

Der Umsetzung von Polypeptiden mit makromolekularen Trägerstoffen sollte es in jedem Falle zustatten kommen, daß eine kovalente Bindung schon durch die Reaktion von jeweils einer einzigen reaktiven Gruppierung des Polypeptids und des Trägermoleküls zustande kommt. Eine quantitative Reaktion aller reaktiven Gruppen beider Komponenten ist also gar nicht erforderliche Wenn trotzdem in den meisten Fällen eine schlechtere Ausbeute bei der Umsetzung von Polypeptiden mit Makromolekülen erreicht wird, als bei analogen Umsetzungen mit niedermolekularen Verbindungen, so läßt sich daran erkennen, in welch erheblichem Maße Reaktionen zwischen Makromolekülen gegenüber niedermolekularen Reaktionen benachteiligt sind. Es war deshalb nicht vorhersehbar, daß gerade bei der photochemischen Reaktion die Umsetzung makromolekularer Partner vollständiger abläuft als die Umsetzung von Polypeptiden mit niedermolekularen Verbindungeno Dieser überraschende Effekt kann - ohne damit die Erfindung auf eine bestimmte Theorie festlegen zu wollen - ' dahingehend gedeutet werden, daß bei den photochemischeη Reaktionen, soweit ihr. Mechanismus bisher bekannt ist, vorwiegend hydrophobe Molekülteile miteinander reagieren, z.B. die Methylengruppe des Glycinrestes mit Buten oder Toluol. Da die Polypeptide als Ganzes eher hydrophil und chemischen Umsetzungen nur in wäßrigen oder anderen stark polaren Reaktionsmedien zugänglich sind, dürften die photochemisch reaktiven unpolaren Gruppen durch die stark solvatisierten polaren Gruppen des Polypeptids stark abgeschirmt und für kleine hydrophobe Moleküle nur schlecht zugänglich sein. Die im Verfahren der Erfindung verwendeten Trägerstoffe sind dagegen in der Regel hydrophil, so daß es zu einer Wechselwirkung und Aneinander-

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lagerung mit den hydrophilen Gruppen des Polypeptids kommt. Dadurch werden zwangsläufig auch die hydrophoben, photochemisch aktivierbaren Gruppen beider Makromoleküle in räumliche Nähe gebracht und ihre Umsetzung erleichtert»

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung trägergebundener Polypeptide, bei dem man die wäßrige Lösung eines Polypeptids in Gegenwart einer nicht peptidartigen makromolekularen Trägerverbindung und eines an sich bekannten Photosensibilisators in Abwesenheit von Sauerstoff mit ultraviolettem Licht oder - bei zusätzlicher Anwesenheit eines organischen Peroxyds - mit sichtbarem Licht bestrahlt»

Der Begriff "Polypeptid" ist weit zu fassen. Es fallen nicht nur wasserlösliche natürliche Eiweißkörper darunter, wie Enzyme, Antikörper, Hormone mit Proteinstruktur, Inhibitoren, sondern auch aus wenigen Aminosäureeinheiten aufgebaute natürliche oder synthetische Polypeptide, wie Dipeptide, oder Verbindungen, die nur teilweise peptidartig aufgebaut sind, wie Penicilline. Ferner kann man auch Substanzen, die keine Peptidstruktür haben, mit oligomeren Peptiden umsetzen und sie über diese Gruppe an Trägermoleküle binden.

Der Begriff "Träger" ist hier umfassender gebraucht worden, als in der biochemischen Literatur sonst üblich« Er umfaßt nicht nur unlösliche Feststoffe, sondern auch wasserlösliche Verbindungen, die als Vehikel für das gebundene Polypeptid fungieren und z.B. seinen Transport an bestimmte Stellen eines biologischen Systems, seine Permeabilität durch Grenzschichten oder Membranen, seine Verteilung auf unterschiedliche Phasen und dergleichen beeinflussen.

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Als makromolekulare Trägerverbindung kommt dank der geringen " Spezifität der photochemischen Reaktion eine große Vielzahl von nicht peptidartigen Verbindungen in Betrachte Es handelt sich in der überwiegenden Mehrzahl der Falle um natürliche oder synthetische organische Polymere, jedoch können auch anorganische Träger verwendet werden, sofern sie für die aktivierende Strahlung genügend durchlässig sind, eine ausreichende innere Oberfläche haben und an dieser Oberfläche photochemisch aktivierbare organische Gruppen tragen,. Als Beispiele für anorganische Träger dieser Art seien poröses Glas, quellbare Silikate, insbesondere Tonmineralien, oder hochdisperse Kieselsäure genannt, die mit solchen Siloxanen modifiziert sind, die Alkenyl-,Toluyl- oder andere, der photochemischen Addition zugängliche Gruppen enthaltene

Die in der Mehrzahl der Fälle verwendeten organischen Trägerverbindungen haben ein Molekulargewicht über looo und vorzugsweise über Io ooo₀ Sie können wasserlöslich sein, jedoch werden für die meisten Anwendungsfälle wasserunlösliche Trägerstoffe verwendet, und zwar vorzugsweise solche, die überwiegend aus hydrophilen Monomereinheiten aufgebaut sind und ihre Wasserunlöslichkeit allein ihrer vernetzten Struktur verdanken· Für Trägerstoffe dieser Art lassen sich bekanntlich keine Molekulargewichte angeben. Die Vernetzung ist vorzugsweise so gering, daß die Stoffe in Wasser quellbar sindo Durch eine Quellbarkeit auf wenigstens das Doppelte des Trockenvolumens wird bereits eine große "innere Oberfläche" zur Bindung von Polypeptiden freigesetzt. Um jedoch auch das Eindringen sehr großer Proteinmoleküle und nach deren photochemischer Bindung auch das Ein- und Ausdiffundieren großer Substratmoleküle zu gestatten, 1st eine stärkere Quellbarkeit in Wasser, beispielsweise auf das 5-fache, vorzugsweise auf das lo- bis 2oο-fache des Trockenvolumens von Vorteile

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Wenn Trägerstoffe verwendet werden, die in der Lösung des Polypeptids nicht anquellen, so müssen sie, um eine hinreichende Menge an Polypeptiden binden zu können, in Form äußerst feiner Teilchen, z.B. Latex-Partikeln, vorliegen. An eine Vielzahl der bekannten natürlichen oder synthetischen Polymerlatices können Polypeptide photoehemisch angelagert werden. Solche beladenen Latexteilchen können dann ähnlich wie Blutkörperchen als Träger für biologisch aktive Substanzen dienen.

Unter den für das Verfahren der Erfindung grundsätzlich geeigneten wasserlöslichen oder in Wasser quellbaren Trägerstoffen zeichnen sich solche durch eine hohe photochemische Reaktionsfähigkeit aus, die ganz oder teilweise aus möglichst hydrophilen, zur Radikalbildung neigenden Monomereinheiten aufgebaut sind. Dies trifft für makromolekulare Verbindungen mit Carbonsäureamid-, Carbonsäureester-, Lacton-, Halbacetal- und cyclischen Äthergruppen zu. Als sehr reaktiv haben sich Homo- und Mischpolymerisate des Acrylamids oder des Vinylpyrrolidons sowie Polysaccharide erwiesen· Unter den Polysacchariden werden wiederum die ohnehin in der Biochemie viel benutzten Trägermaterialien, wie Sepharose, Polydextrangele, Agarose-Gele, Cellulose in Form von Pulvern, Fasern, Vliesen (Filterpapier) oder Regeneratfolie usw., bevorzugt. Die Hydroxylgruppen der Polysaccharide können, beispielsweise, um die biologische Abbaubarkeit herabzusetzen, teilweise veräthert oder verestert sein. Die radikalisehe Reaktion greift im Falle der Polysaccharide wahrscheinlich an der dem Ringsauerstoffatorn benachbarten C-H-3indung an, wobei ein Wasserstoffatom abgespalten und ein Kohlenstoffradikal gebildet wird (vgl. I. Rosenthal u.D.Elad, Tetrahedron Letters I967, Band 23, S. 3193 bis 32o4).

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— O —

In analoger Weise wird in carbonamidgruppenhaltigen Polymeren eine C-H-Bindung in _a-Steilung zur Carbonamidgruppe unter Ausbildung eines C-Radikals gespalten (vgl. IoRosenthal in "The Chemistry of Amides" ν, S.Patai und Jo Zabricky; Intercience, New York 197o, S. ^ορ)_ο Homo- und Mischpolymerisate des Methacrylamids, die kein cc-C-Wasserstoffatom haben, sind daher weniger reaktiv und weniger bevorzugt als Homo- und Mischpolymerisate des Acrylamide oder Vinylpyrrolidons. Da diese Monomereinheiten zugleich stark hydrophil sind, kommt es auf die Hydrophilie und photochemische Reaktionsfähigkeit eventueller weiterer Comonomerer nicht entscheidend an, wenn auch hydrophile Comonomere' grundsätzlich bevorzugt sind, wie z.Bo Methacrylamid, Acryl- und Methacrylsäure sowie ihre wasserlöslichen Salze, Vinylpyrrolidon, Hydroxyalkylester der Acryl- oder Methacrylsäure, wie ZoBo Hydroxyäthylacrylat, 2-Hydroxypropyl-acrylat, Butandiol-l,2-acrylat, Butandiol-1,4-acrylat oder die entsprechenden Methacrylate, weiterhin Aminoalky!ester oder Aminoalkylamide der Acryl- oder Methacrylsäure sowie deren Salze oder Quaternisierungsprodukte, wie Dimethylaminoäthylmethacrylat oder dessen Hydrochlorid oder Hydroacetat, Methacryloxyäthyltr irne thylamnoniumchlor id.

Die Polymeren können durch geringe Anteile von Comonomeren mit zwei oder mehl'' polymer is ierbaren Doppelbindungen, wie Divinylbenzol, Glycoldiacrylat oder -dimethacrylat oder Triallylcyanurat vernetzt sein»

Neben den genannten hydrophilen bzw= wasserlöslichen Monomeren können am Aufbau der Trägermoleküle auch dann, wenn sie wasserlöslich oder stark quellbar sein sollen, nicht wasserlösliche Monomere beteiligt sein_o Die Trägerstoffe sind dann wasserlöslich oder gut quellbar, wenn sie

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- Io -

aus einem Vinylpolymerisat bestehen, das - ggf. neben einem vernetzenden Monomeren -

a) zu wenigstens 80 Mo1$ aus einem Hydroxyalkylester der Acryl- oder Methacrylsäure oder

b) zu wenigstens 60 MoI^ aus Acryl- oder Methacrylamid oder aus Vinylpyrrolidon oder

c) zu wenigstens ho MoI^ aus Acryl- oder Methacrylsäure oder aus deren Dialkylaminoalkylestern oder

d) zu wenigstens 2o ΙΊοΙ',ά aus wasserlöslichen Salzen der Acryl- oder Methacrylsäure oder aus Salzen oder Quaternisierungsprodukten von Dialkylaminoalkylestern der Acryl- oder Methacrylsäure

und zum übrigen Teil aus nicht wasserlöslichen Monomeren aufgebaut ist.

Wasserlösliche Trägerstoffe, die leicht umsetzbare funktionelle Gruppen, wie Hydroxyl- oder Carboxylgruppen, enthalten, lassen sich gewünschtenfalls auch nachträglich durch Umsetzung mit mehrfunktionellen Vernetzungsmitteln, wie Diisocyanaten, Bis-epoxyden, Harnstoff-Pormaldehyd-Kondensaten usw., auf jeden gewünschten Vernetzungs- bzw. Quellbarkeitsgrad einstellen.

Ein besonders vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung wasserunlöslicher Trägerstoffe ist in der deutschen Offenlegungsschrift 2 009 218 beschrieben. Man erhält nach diesem Verfahren quellbare vernetzte Trägerpolymere in Form von Perlen von z.B« o,l bis 1 mm Durchmesser durch Polymerisation einer wäßrigen Lösung eines Vinylmonomeren und eines Vernetzungsmittels in einer organischen Phase. Eine sehr hohe Quellbarkeit wird bei diesen Polymeren dadurch erreicht, daß

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das Polymerisat von vornherein in Gegenwart einer großen Menge Wasser, d„ho im gequollenem Zustand, polymerisiert wird ο

Obwohl die vorstehend beschriebenen makromolekularen Stoffe Gruppen enthalten, die einer photochemischen Verknüpfung mit Polypeptiden zugänglich sind, kann es vorkommen daß nur nach langer und starker Bestrahlung eine ausreichende Zähl von Bindungen zwischen einem Polypeptid und einem Träger entsteht. Um eine Schädigung des Polypeptids durch überlange Bestrahlung und einen hohen Aufwand an Strahlungsenergie zu vermeiden, hat es sich in derartigen Fällen bewährt, in die Trägerstoffe solche organischen Gruppen einzubringen, die einer photochemischen Reaktion besonders leicht zugänglich sind«, Solche Gruppen sind seitenständige Alkenylgruppen, besonders'solche mit einer endständigen Doppelbindung^ oder Alkylphenylgruppen, hierunter vor allem der Toluyl-Rest» Diese Gruppen lassen sich in vielen Fällen durch Umsetzung des Trägerstoffes mit Toluyl-Carbonsäurechlorid, Toloylsulfochlorid, Allylchlorid, Acrylsäurechlorid usw. einführen* Auf diese Weise kann man die photochemische Reaktivität aller OH-gruppen- oder aminogruppenhaltigen Trägermaterialien, seien sie per se photochemisch inert oder reaktiv, verbessern«, Dies gilt vorzugsweise für Träger mit Polysaccharidstruktur, also Agarose, Polydextran und Cellulose, sowie für hydroxyalkylsubstituierte Polyvinyl verbindungen, wie Homo- oder Mischpolymerisate der Hydroxyalkylester oder N-Hydroxyalkylamide der.Acryl- oder Methacrylsäure. Bei der Verwendung von Vinylpolymeren als Träger ist es vorteilhafter,, schon bei ihrem Aufbau Monomere mit entsprechenden Seitengruppen mitzuverwenden, z_eB. Vinyltoluol oder Allylacrylat- oder methacrylate Der Anteil dieser Monomeren kann von Bruchteilen eines Prozents bis zu

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oder mehr, bezogen auf das Gesamtgewicht der Monomeren, betragen.

Obwohl auch Polypeptide untereinander photochemisch verbundden bzw· vernetzt werden Können, spielen Polypeptide als Trägerstoffe im vorliegenden Verfahren keine Rolle und gehören deshalb nicht zum Umfang der Erfindung.

Die photochemische Reaktion zwischen dem Polypeptid und dem Trägerstoff findet in einer wäßrigen Lösurg des Polypeptids statt. Hierunter werden auch Lösungen von Polypeptiden in Gemischen von V/asser mit niederen Alkoholen, wie z.B. Methanol, Äthanol, Propanol oder Butanol; oder mit Aceton u.ä, verstanden. Die Konzentration des Polypeptids in der verwendeten Lösung sollte zweckmäßig im Bereich von loo /Ug/ml bis Io mg/ml liegen. Der Trägerstoff wird im allgemeinen in einer solchen Menge eingesetzt, daß das Polypeptid bei vollständiger Bindung an den Träger einen Anteil von 1 bis 50 Gew.-i'o, vorzugsweise Io Gew.-% bildet, jedoch kann man auch von diesen Mengen abweichen.

Die eigentliche photochemische Reaktion wird durch Photosensibilisation ausgelöst. Photosensibilisatoren sind seit langem bekannt. Die Grundlagen auf diesem Gebiet wurden von G.O.Schenck u. Mitarbeitern erarbeitet und sind z.B. in "Organic Photochemistry", R.O.Kan, New York: Mac Graw-Hill 1966, S. 14 - 17, beschrieben.

Man versteht unter Photosensibilisierung die energetische Anregung eines Akzeptormoleküls (A) durch ein Donormolekül (D), welches die Strahlungsenergie ( \\'μ) primär absorbiert. Im vorliegenden Fall fungieren Sensibilisatoren als Donormoleküle, d.ho sie werden durch ultraviolettes Licht zunächst in ihren niedrigst angeregten Singlettzustand (Si) gebracht, wonach sie

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durch Intersystemcrossing in den niedrigsten Triplettzustand (T₁) übergehen. Dieser Zustand ist verhältnismäßig langlebig und daher in der Lage, durch diffusionskontrollierte Energieübertragung andere Moleküle zu Triplettzuständen anzuregen, aus welchen diese Moleküle radikalisch reagieren können. Diese Reaktionsfolge läßt sich so darstellen:

D (S₁)
D (T₁)

D ₊ A (T₁)

Das Akzeptormolekül A kann z.B« das Polypeptid oder das Trägermolekül sein«

Nach Hammond und Mitarbeitern [J.Am<,Soc. 86, ^537 (1964)J sollen gute Photosensibilisatoren (Donoren) eine hohe. Absorption der eingestrahlten Energie haben, wobei das UV-Spektrum des Sensibilisators (Donors) möglichst nicht mit dem des Akzeptors überlappen und im längerwelligen Bereich liegen soll_e Sie müssen ferner eine höhere Triplettenenergie besitzen als der Akzeptor und außerdem ein möglichst effizientes Intersystemarossing aufweisen« Schließlich sollte der Photosensibilisator selbst keine photοehemiseheη Reaktionen eingehen, d.h. photochemisch möglichst inert seinol Calvert und Pitts haben nach Daten von Hammond et. al« und Ermolaev et. al. eine Anzahl von Verbindungen zusammengestellt, die als Photosensibilisatoren wirksam sind und sich für das Verfahren der Erfindung eignen (J.Go Galvert und J₀N.Pitts Jr., "Photochemistry", John Wiley et Sons, Inc, New York, London, Sidney 1966, S₀ 298)0 Dazu gehören, nach abnehmender Energie des angelegten Triplett-Zustandes geordnet, Propiophenon,

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Xanthon, Acetophenon, Triacetylbenzol, Isobut,,rophenon, Dephenylpropanon, Benzaldehyd, Triphen;> lmethylketon, Carbazol, Diphenylenoxyd, Triphenylamin, Dibenzothiophen, o-Dibenzoylbenzol, Benzophenon, Dichlorbenzophenon, Diacetylbenzol, Fluoren und viele andere« Ketone haben sich als gut wirksam erwiesen,, Außer den schon genannten Ketonen sind Aceton, Methyläthylketon und Methylisοbutylketon zu erwähnen. Acetophenon und Propiophenon sind besonders bevorzugt, da sie aufgrund ihres Absorptionsspektrums einen großen Teil der von einer Quecksilberhochdrucklampe ausgestrahlten Energie, namentlich im Bereich der ^>66 nm— sowie JJlJ nm— Emissionslinien des Quecksilbers, absorbieren.

Der angeregte Photosensibilisator erzeugt durch Wechselwirkung mit dem Polypeptid oder dem Trägermolekül ein Kohlenstoff-Radikal. Typische Reaktionen dieser Art sind nachfolgend für die Glycingruppe (I) eines Polypeptids, für eine Glucoseeinheit (II) eines Polysaccharids, für eine Acrylamideinheit (III) eines Vinylpolymeren und für ein Toluylgruppen (IV) enthaltendes Tragerpolyrneres formelmäßig dargestellt (C* bezeichnet ein Kohlenstoffradikal)

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-NH-C

-CO

;CH, -NH CO

-CONH^-

TJ

CHO-HOCH

I \

KOQH . CH

CHO-

CH OH

II,

■ CHO-

HOCII 0

HOCH -

CIiO -

CH OH

- CH

C ——

com.

C —-

CONH,-

vJri-> 3

rv^-\y

III.

CI-L

IV.

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- ie -

Eine Vielzahl weiterer analoger Reaktionen an anderen Gruppen des Polypeptids, s«B₀ an Einheiten des Cysteins, Cystins, Methionine oder Tryptophans, oder des Trägermoleküls kann auftreten. Radikale dieser Art reagieren untereinander durch Rekombination: -CONH^ ^CONH -

CH' -NHCO * * \

-CH₂-C- > -CE₂-— C

"^C0NH 2 CONH₂

oder mit olefinischen Seitengruppen des Trägerpolymeren durch Addition und nachfolgende Radikalübertragung mit einem beliebigen Übertrager (AH):

-NHCO *

J^CH + -CH₂ -CH-

~^C0NH ι CO-O-CH₂-CH = CH₂

-CH₂ - CH - CONH

CO-O- CH₂ - CH — CH₂ — CH

^NHCO + AH

- A*

- CH -CH-

f CONH

CO - O- CH₂- CH₂ - CH₂ - CH^

Die bevorzugte Reaktionsfähigkeit des Glycinrestes vor anderen Aminosäureresten wirkt sich auf das Verfahren der Erfindung vorteilhaft aus, da Glycinreste in fast allen natürlichen Eiweißkörpern vorkommen, aber oft nicht funktionswichtig sind. Die photochemische Reaktion am Glycinrest hat daher häufig keinen oder nur geringen Einfluß auf

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die biologische Wirksamkeit des gebundenen Polypeptids.

Grundsätzlich ist die Auslösung von photochemischen Reaktionen nicht von der Anwesenheit eines Photosensibilisators abhängig. Es ist durchaus möglich, durch eine hinreichend energiereiche Strahlung das Polypeptid bzw« das Trägermolekül unmittelbar anzuregen, d_eh. in ein Radikal überzuführen. Wie aus Arbeiten von K. Dose und Mitarbeitern (Photochemistry and Photobiology 1968, VoI₀ 7, S«, 671 - 673) bekannt ist, tritt bei der unmittelbaren Anregung des Polypeptids häufig Inaktivierung ein, d„h. die Molekülstruktur wird irreversibel zerstört. Das Verfahren der Erfindung wird daher vorzugsweise mit einer Strahlung durchgeführt, deren Energie zur unmittelbaren Aktivierung des Polypeptids nicht ausreicht, die jedoch den Photosensibllisator anzuregen vermag _β Eine für das Verfahren der Erfindung gut geeignete Strahlung ist ultraviolettes Licht einer Wellenlänge von mehr als 290 nm. Übliche Quecksilber-Hochdrucklampen senden neben einer Strahlung in dem angegebenen Bereich auch härtere Strahlungen im Bereich von 24o bis 280 nm aus. Dieser Strahlenanteil wird zweckmäßig durch Pyrexglas herausgefiltert. Die Dauer der Bestrahlung richtet sich nach der Stärke der Strahlungsquelle und der Wirksamkeit des Photosensibilisators und kann im Bereich von Io min bis 50 Stunden liegen. Bei Verwendung der gebräuchlichen Quecksilber-Hochdruck-Tauchlampen liegen die Bestrahlungszeiten im allgemeinen zwischen 1 und 30 Stunden,, Nach Abschalten der Strahlenquelle ist die Reaktion sofort beendetj nicht umgesetztes Trägermaterial, Protein und die Protein-Träger-Verbindungen sind stabil und es besteht - im Gegensatz zu anderen Bindungsverfahren - keine Gefahr der hydrolytischen Spaltung der photochemisch erzeugten Bindungen.

d.h. Lampen mit einer Leistung von iq

I₂₅ MS 500 Watt _409829/0411

Die pnotocnemisciie Reaktion kann aucn mit einer Licntstranlung im sicntbaren Bereicn ausgelöst werden, wenn neben einem durcn sicntbares Licnt anregbaren Pnotosensibilisator, wie Biacet^l, ein Peroxyd, wie z.B. Di-tert.Butylperoxid, verwendet wird.

Einer der wesentlichen Vorteile des pnotocnemischen Bindungsverfanens _oegenüber der rein cnemiscnen Bindung ist die freie Wärilbarkeit von Temperatur und pH-Wert. Man kann bei beliebig tiefen und - soweit es die Temperaturbeständigkeit des PoIypeptids zuläßt - beliebig nonen Temperaturen, beispielsweise zwiscnen -5 und 7o°C, sowie im neutralen, sauren oder alkaliscnen Milieu arbeiten. Dadurcn läßt sicn das Verfanren den Stabilitätsbedingungen des Polypeptide optmimal anpassen» Auch äußerst temperatureinpfindliche Proteine lassen sich unter scnonendsten Bedingungen verarbeiten₀

Eine wichtige Voraussetzung für die Bindung des Polypeptids an den Träger ist die Abwesenneit von Sauerstoff. Sauerstoff wird bekanntlicn senr leicnt in Gegenwart von Sensibilisatoren priotocnemiscii angeregt und löst eine Vielzanl unerwünsonter Nebenreaktionen aus. Es ist daner erforderlicn, die Reaktion in einer sauerstofffreien Schutzgasatmospnäre, beispielsweise in Stickstoff oder Argon, durcnzufUnren. Um aucn in der Peptidlösung entnaltenen Sauerstoff vollständig zu entfernen, läßt man vor Einwirkung der Stranlung ein sauerstofffreies Inertgas durcn die Lösun^, perlene

Nach Abscnluß der Bestranlung und Bindung des Polypeptids an den Träger kann die Reaktionslösung ggf. als solcne für den vorgesenenen Verwendungszweck eingesetzt werden« An gelöste Träger gebundene biologiscn wirksame Proteine können z.B. als pnarmazeutiscne Präparate von verringerter Abbaubarkeit oder

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Resorbierbarkeit im Körper verwendet werden,, Man kann die anlöslicne Träger gebundenen Polypeptide aber auch in Substanz gewinnen, indem man Fällungsmittel, wie anorganische Salze oder Alkohole, zusetzt., Das ausgefallene Produkt kann darn abfiltriert und mit Salzlösungen oder Alkohol-Wasser-Gemischen ausgewascnen werden. In fester Form vorliegende Produkte können unmittelbar abfiltriert und mit Wasser gewaschen werden,, ·

In der bevorzugten Ausführungsform eines an ein quellbares Perlpolymerisat gebunden Polypeptids kann das Produkt unmittelbar in einer Substratlösung verteilt werden, wobei das Substrat mit dem gebundenen Polypeptide beispielsweise einem Enzym, in Wechselwirkung tritt. Nach der Umsetzung des Substrats kann das trägergebundene Enzym durcn einfacne Filtration vollständig abgetrennt werden» Man kann aucn das Perlpolymerisat in dicnter Schüttung als Säulenfüllung verwenden und die Substratlösung durcn die Säule fHessen lassen,, Bei Verwendung eines Perlpolymerisats von einheitlicher Teilchengröße ist eine hohe Strömungsgeschwindigkeit in einer solchen Reaktionssäule zu erreichen.

Das Verfahren der Erfindung kann in einer großen Vielfalt von Ausfünrungsformen verwirklicht werden, die. sicn nier nicnt erschöpfend darstellen lassen» Selbstverständlicn ist es aucn möglich, naciieinander oder gleicnzeitig verschiedene Proteine an denselben Träger zu binden» weitere Ausfünrungsformen der Erfindung und inre Ergebnisse sind den nachfolgenden Beispielen zu entnenmen»

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In manchen Fällen, z.B. bei der Äffinitätschromatograpnie nocninolekular.er Verbindungen an trägergebunden η affinen Proteinen, muß das Protein in ausreichendem Abstand von der Hauptkette des Trägerpol;nieren gebunden sein. Man verv/endet für solche Fälle Trägerverbindun^en, die photochemiscn besonders aktive Gruppen an längeren, ζ.Β» 6 bis 12 C-Atome enthaltenden Seitenketten tragen. Beispiele für solche Träger sind Vinvlpolyrnere mit Einheiten von Acryl- oder Methacrylsaureestern von höheren ungesättigten Alkoholen. Polysaccharide können mit entsprechend langkettigen ungesättigten Verbindungen modifiziert werden.

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Beispiele Beispiel 1

Durch Aceton photosensibilisierte Bindung von Trypsin an Agarose

Agarose-Perlen (Handelsbezeichnung Bio-Gel A-I50, 100-200 mesh, Agarose Beads for Gel Filtration, Pa. Bio-Rad) wurden mehrfach in Wasser suspendiert, gewaschen und abzentrifugiert. 10 g des erhaltenen Peuchtgels (entsprechend 100 mg Agarose) wurden in Wasser-Aceton-Gemisch (90/IQ), enthaltend 50 mg gelöstes Trypsin (Pa. Novo, krist. 4220 NF/mg), suspendiert und in einer Schenk'sehen Belichtungsapparatur, bestehend aus einem Tauchschacht, Kühlschacht (beides aus Pyrex) und dem Reaktionsgefäß mit sauerstofffreiem Stickstoff (Fa. Osram), welcher durch 10 % wässr. Aceton geleitet wurde, 1 Stunde lang begast, und anschließend mit einer Quecksilbepifcehdrucklampe (Philips-HPK-125 Watt, Typ 57203B/00) 18 Stunden lang unter gutem Rühren und bei Wasserkühlung belichtet. Bei der Belichtung war die Apparatur mit Aluminiumfolie umwickelt.

Nach der Belichtung wurde das Material durch Abzentrifugieren gewonnen, mehrfach mit Wasser und 1 N NaCl-Lösung gewaschen und zentrifugiert.

Proteinbestimmung; Das Feuchtgel wurde noch weitere 5 mal

Wasser gewaschen und lyophylisiert. Der Stickstoffgehalt wurde nach K^eldahl bestimmt und hieraus der Proteingehalt berechnet. Proteingehalt: 21 %, Ausbeute¹ an gebundenem Protein: 65 %·

Enzymatisehe Aktivität: 5 g Feuchtgel wurde mehrfach mit 0,05 M Phosphatpuffer, pH 7·5» gewaschen und das durch Zentrifugation gewonnene Feuchtgel mit 20 ml Casein-Substratlösung ( 4 % Casein nach Hammarsten in verdünnter Natronlauge; pH 8,0) unter gutem Rühren bei 37°C inkubiert, wobei der pH-Wert durch Titration mit einer durch eine Glaselektrode gesteuerten automatischen Bürette

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JJ263289¹

konstant gehalten wurde.

Nach j5- bis 4-maliger Wiederbenutzung des Enzympräparates in der angegebenen Weise wird eine enzymatische Aktivität von 270 E pro 100 mg Trockenprodukt, bzw. 12,9 E pro mg gebundenes Protein ermittelt. Als 1 Einheit (E) wird diejenige Enzymmenge bezeichnet, die innerhalb 60 min 1 u A'q. Peptidbindungen spaltet.

Wiederholte Verwendung als Kriterium für kovalente Bindung

Nach 5-maliger Wiederverwendung wird keine Aktivitätsabnahme festgestellt. Dies stellt ein wichtiges Kriterium für das Vorliegen einer kovalenten Bindung zwischen Trypsin und Agarose dar. Nur wenn die Aktivität nach beliebig häufiger Verwendung mit einem hydrophilen, hochmolekularen Substrat (hier: Casein bei pH 8) nicht abnimmt, kann von kovalenter Bindung gesprochen werden, da solche Substrate sehr gut geeignet sind, unspezifisch an den Träger adsorbiertes Protein auszuwaschen.

Beispiel 2

Tfß'-y.-h Durch Aceton photosensibilisierte Bindung von Trypsin an Cellulose

1 g Cellulose (Avicel , mikrokristallin 20-100 um) wurde mehrfach mit Wasser gewaschen und in einem Gesamtvolumen von 50 ml Wasser-Aceton-Gemisch (90/10), enthaltend 100 mg Trypsin, in der für Beispiel 1 beschriebenen Weise belichtet. Belichtungszeit: 40 Stunden.

Aufarbeitung: Waschen mit Wasser und 1 N NaCl-Lösung, wobei das Produkt über eine Glasfritte abgesaugt wurde.

Proteingehalt: 4,8 %

Ausbeute an gebundenem Protein: 53 %, bezogen auf eingesetztes Protein.

Enzymatische Aktivität pro 100 mg Trockenprodukt: 27,8 E bzw. 5,8 E pro mg gebundenes Protein.

Nach 5-mal wiederholter Verwendung wird keine Abnahme der Aktivität festgestellt.

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Beispiel 5

Durch Aceton photosensibilisierte Bindung von Trypsin an toluylgruppenhaltige Cellulose

Cellulose (Avicel , wie in Beispiel 2) wurde mit 4-Methylbenzoyl· chlorid zu einem 3,5 Gew.'-% Toluylgruppen enthaltenden Produkt verestert.

1 g dieses Produktes wurde mit .Wasser mehrfach gewaschen und in der für Beispiel 2 beschriebenen Weise mit Trypsin umgesetzt.

Belichtungszeit: 15 Stunden.

Proteingehalt: 7*2 %

Ausbeute an gebundenem Protein: 83 %

Enzym. Aktivität pro 100 mg Trockenprodukt: 49 E bzw. 6,9 E pro mg gebundenes Protein

Beispiel 4 Durch Aceton photosensibilisierte Bindung von Trypsin an Polyacrylamid-Perlen

1 g Polyacrylamidperlen, hergestellt nach Beispiel 12, wurden in Wasser gequollen, mehrfach mit Wasser gewaschen und über eine Glasfritte abgesaugt: 9*4 g Feuchtgel.

Das gesamte Peuchtgel wurde in der für Beispiel 2 beschriebenen Weise mit 100 mg Trypsin umgesetzt und gewaschen.

Belichtungszeit: 35 Stunden

Proteingehalt: 6,5 % (UV-spektrometrisch nach alkal.Hydrolyse) Ausbeute an gebundenem Protein: 73 %

Enzymat. Aktivität pro 100 mg Trockenprodukt: 52>8 E Enzym. Aktivität pro mg gebundenes Protein: 8,1 E.

Beispiel 5

Durch Aceton photosensibilisierte Bindung von Trypsin an ein Perlpolymerisat aus Acrylamid und Allylmethacrylat,

1 g des Perlpolymerisats nach Beispiel 10 wurde in Wasser ge-

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quollen und mehrfach mit Wasser gewaschen und abgesaugt (9,8 g Feuchtprodukt).

Das gesamte Feuchtprodukt wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 4 mit 100 mg Trypsin umgesetzt.

Belichtungszeit: 12 Stunden

Ausbeute an gebundenem Protein: 91 % Proteingehalt (u.v.spektrometrisen nach alkalischer Hydrolyse):

Enzymat. Aktivität pro 100 mg Trockenprodukt: 87 E Enzymat. Aktivität pro mg gebundenes Protein: 11 E.

Beispiel 6

Durch Acetophenon photosensibilisierte Bindung von Trypsin an ein Perlpolymerisat aus Acrylamid und Allylmethacrylat

Das Verfahren von Beispiel 5 wird wiederholt mit dem Unterschied, daß in 50 ml wässrig gesättigter Acetophenonlösung (Gehalt UV-spektrometrisch: 0,00J Mol/l) lediglich 2 Stunden lang belichtet wurde.

Ausbeute an gebundenem Protein: 87 % Proteingehalt: 7,5 %

Enzymat.Aktivität 103 E/100 mg Trockenprodukt; 13,4 E/mg gebundenes Protein.

Beispiel ¹J ₊\

Durch Propiophenon photosensibilisierte Bindung von Trypsin ea-

Beispiel 6 wird mit dem Unterschied wiederholt, daß die wäßrige Phase 5 % Methanol fctil und 0,005/Proplophenon enthielt. Ausbeute an gebundenem Protein: 96 % Proteingehalt: 8,1 %

Enzymat. Aktivität 98 E/100 mg Trockenprodukt; 12,1 E/mg gebundenes Protein.

+) an ein Perlpolymerisat aus Acrylamid und Allylmethacrylat

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Beispiel 8 Durch Acetophenon photosensibilisierte Bindung von Trypsin

an ein mit p-Toluylsulfoehlorid modifiziertes Mischpolymerisat aus Acrylamid und 2-Hydroxyäthylmethacrylat (1 ; l)

Das Perlpolymerisat von Beispiel 11 wurde zu einem 3>,5 Gew-# Toluylgruppen enthaltenden Produkt tosyliert und wie in Beispiel 6 mit Trypsin in Gegenwart von Acetophenon umgesetzt und anschließend aufgearbeitet.
Belichtungszeit: 2 Stunden.
Ausbeute an gebundenem Protein: 78 %
Proteingehalt im Produkt! 6,8 %

Enzymat.Aktivität pro 100 mg Trockenprodukt: 84 E Enzymat.Aktivität pro mg gebundenes Protein: 12,5 E.

Beispiel 9

Durch Acetophenon photosensibllisierte Bindung von Trypsin an ein Mischpolymerisat des Acrylamids mit 2-Hydroxyäthy!methacrylamid nach dessen chemischer Modifizierung mit 4-Methylphenylessigsäure-Chlorid

Das Perlpolymerisat von Beispiel Ij5 wurde durch Umsetzung mit 4-Methylphenylessigsäurechlorid zu einem 1,2 % Toluylgruppen enthaltenden Produkt modifiziert.

1 g des modifizierten Produkts wurden in der im Beispiel 6 beschriebenen Weise mit Trypsin in Gegenwart von Acetophenon umgesetzt.

Belichtungszeit: 4 Stunden.
Ausbeute an gebundenem Proteins 85 %
Proteingehalt im Produkts 7,4 Ji

Enzymat.Aktivität pro 100 mg Trockenproduktg 81,5 E Enzymat. Aktivität pro mg gebundenes Trypsin% 11 E.

Beispiel 10

Herstellung eines quellbaren Perlpolymerisats aus Acrylamid und

Allylmethacrylat

In einem Rundkolben (§00 ml) versehen mit Thermometer^ Rührer,

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Rückflußkühler und COp-Einleitungsrohr werden 87 S n-Heptan und 55 & Perchloräthylen vorgelegt. Darin werden 0,25 g Benzoylperoxid und 0,01 g eines Stabilisators (Handelsbezeichnung Bayer 4010 Na) gelöst. Nach Entfernung von Sauerstoff mit ca. 2 g Trockeneis wfd bei 25⁰C eine Monomerlösung zugegeben, bestehend aus:

12 g Acrylamid
3 g Allylmethacrylat
0,375 g Glykoldimethacrylat

17*5 g Formamid

0,044 g Verdickungsmittel (Handelsbezeichnung

Plex 4807 P, Röhm GmbHl in Formamid gelöst

0,1 g Emulgator (statist.Copolymerisat n-Butylmethacrylat/Methacryloylcholin-chlorld = 90/10)

Die Monomerphase wird durch konstantes Rühren in der organischen Phase verteilt. Die Polymerisation wird durch Zugabe von 0,25 g Dirnethylanün ausgelöst. Die Polymerisation dauert 8 Sunden bei einer Temperatur unter 30⁰C und andauerndem Durchleiten von COp.

Die erhaltenen feinen Perlen werden durch Dekantieren und Absaugen

in,
von der organischen Phase befreit,/Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Durch Bromtitration wurde ein Gehalt von 3*5 Gew.-Ji Allylmethacrylat ermittelt.

Beispiel 11 Herstellung eines quellbaren Perlpolymerisats aus Acrylamid und Glykolmonoacrylat

In einem 500 ml-Rundkolben, ausgerüstet wie in Beispiel 10, werden

70 g n-Heptan

70 g Perchloräthylen

vorgelegt. Nach Entfernen des Sauerstoffs mittels 2 g Trockeneis wird unter Rühren eine Monomerlösung zugegeben, bestehend aus:

9 g Acrylamid

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9 g 2-Hydroxyäthylmethacrylat
0,2 g N,N¹-Methylenbis(methacrylamid) 0,9 g Emulgator (wie Beispiel 10)

10 g Wasser ^ .

1 g 0,1 ^ige wäßrige Lösung von Ammoniumperoxydisulfat 1 g 0,1 $ige wäßrige Lösung von Fe-^^-sulfat.

Die Monomerphase wird durch konst. Rühren in der organischen Phase verteilt. Der Reaktionsstart erfolgt durch Zugabe von 0,4 g l#igerwäßriger Schwefligsäure. Bei einer Reaktionsdauer von 8 Stunden wird die Temperatur auf -30⁰C gehalten. Während der gesamten Reaktionsdauer wird COpeingeleitet. Die erhaltenen feinen Perlen werden durch Dekantieren und kurzes Absaugen von der organischen Phase befreit, in Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Beispiel 12 Herstellung eines quellbaren Acrylamid-Perlpolymerisats

15 g Acrylamid werden in der in Beispiel 10 angegebenen Weise in Suspension polymerisiert.

Beispiel Herstellung eines quellbaren Perlpolymerisats aus Acrylamid und Glykolmonomethacrylat

Ein Gemisch aus 14,25 g Acrylamid und 0,75 g 2-Hydroxyäthylmethacrylat wird in der in Beispiel 10 angegebenen Weise in Suspension polymerisiert.

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Beispiel 14

Darstellung eines wasserlöslichen Mischpolymerisats von Acrylamid und Vinyltoluol

4,68 g Vinyltoluol und 17*06 g Acrylamid wurden in 216 ml absolutem Tetrahydrofuran gelöst und 0,216 g Azoisobuttersäure-dinitril zugegeben. Die Luft wurde aus dem Reaktionsgefäß durch Stickstoff verdrängt. Nach 2 Stunden bei 65⁰C war die Polymerisation beendet. Das Fällungspolymerisat wurde abfiltriert und mit Tetrahydrofuran mehrfach gewaschen und getrocknet.
Ausbeute: 9,58 g
Gehalt an Toluylgruppen (u.v. spektrometrisch bestimmt) 9 Gew.-%

Das Produkt wurde in Wasser gelöst und durch Gelfiltration an Sephadex G 100 in Fraktionen unterschiedlichen Molekulargewichts getrennt. Der mit dem Ausschlußvolumen eluierte Anteil (MW größer als lOO.OOO) wurde lyophylisiert und ergab 2

Durch kombinierte Gelchromatographie des Anteils mit einem Molekulargewicht unter 100.000 konnten 530 mg des Polymerisats vom Molekulargewicht 5.000 bis 10.000 gewonnen werden, indem oinädist durch Gelfiltration an Sephadex G 50 der Anteil mit einem Molekulargewicht unter 10.000 und durch Gelfiltration dieses Anteils an Sephadex G 25 der Anteil mit einem Molekulargewicht über 5-000 gewonnen wurde.

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Beispiel 15 . "

Durch Acetophenon photosensibilisierte Bindung von Ribonuolease an ein Mischpolymerisat von Acrylamid und Vinyltoluol vom MW über 100.000 . .

500 mg des löslichen Polymeren nach Beispiel 14 und 40 mg Ribonuclease A (chromatographisch einheitlich, 50 E/mg; Pa. Serva) wurden in 50 ml mit Acetophenon gesättigtem. Wasser gelöst und wie in Beispiel 6 zwei Stunden belichtet.

Das Produkt wurde lyophylisiert und zur Befreiung von Spuren

-enon ...
Acetoph/mit Äther gewaschen. Ein Aliqout wurde in 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7*5) gelöst und an Sephadex"G 100 getrennt. Die mit dem Ausschlußvolumen eluierten Fraktionen wurden vereinigt, gegen Wasser dialysiert und lyophylisiert.

Der nichtgebundene Anteil (freie RNase) wurde ebenfalls vereinigt lyophylisiert, in 10 ml Wasser gelöst und die Extinktion bei 280 nm gemessen, sie entsprach einer Gesamtmenge von 8,5 mg nichtgebundener RNase. Hieraus wurde der an den löslichen Träger gebundene Anteil zu 79 %■ des eingesetzten Enzyms berechnet.

Die enzymatische Aktivität wilde alkalimetrisch im Autotäfrator bei pH 7*5 und 37°C mit Hefenucleinsäure (Boehringer) als Substrat bestimmt. Sie betrug 35 %> bezogen auf nichtgebundene . RNase und den RNasegehalt des/frrägers.

Bei einem Vergleichsversuch ohne Belichtung konnte keine Bindung von RNase an den Träger gefunden werden.

Beispiel l6 Durch Acetophenon photosensibilisierte Bindung von Insulin

an ein Mischpolymerisat von Acrylamid und Vinyltoluol vom MW 5.OOO bis 10.000

50 ml Wasser wurden mit Acetophenon gesättigt und 100 mg Insulin sowie 400 mg des in Beispiel 14 erhaltenen Mischpolymerisats vom MW 5.OOO bis 10.000 darin gelöst. Die Lösung wurde mit 1 ml 0,1 N Salzsäure versetzt und wie in Beispiel 15 zwei Stundente-

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lichtet. Durch Chromatographie an Sephadex G 50 wurde nicht gebundenes Insulin von trägergebundenem,Insulin getrennt. Es wurden 380 mg eines Produkts mit einem Molekulargewicht über 10.000 mit einem Proteingehalt von l6Gew.-# gewonnen. Gelfiltration dieses Produkts an Sephadex 100 ergab ein MW > 100.000 für den größten Teil des Produktes.

Bei einem Vergleichsversuch ohne Belichtung wurde keine Bindung von Insulin an den Träger gefunden.

Beispiel 17 Durch Acetophenon photosensibilisierte Bindung von Insulin an

Dextran

1000 mg Dextran I50 (MW I50.000) der Pa. Pharmacia AB und 100 mg Insulin wurden in 50 ml mit Acetophenon gesättigtem Wasser gelöst und die Lösung mit 0,5 ml 0,1 N Salzsäure auf pH 4,0 gebracht. Belichtung wie bei Beispiel l6.

Durch Gelfiltration an Sephadex G 100 wurden ein Produkt mit einem Insulingehalt von 5,8 % gewonnen, was etwa einer Ausbeute von 55 $>, bezogen auf eingesetztes Insulin, entspricht.

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Claims (8)

2263288 Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung trägergebundener Polypeptide

dadurch gekennzeichnet,

daß man die wäßrige Lösung eines Polypeptide in Gegenwarteiner nicht peptidartigen makromolekularen Trägerverbindung und eines an sich bekannten Photosensibilisätors in Abwesenheit von Sauerstoff mit ultraviolettem Licht oder - bei zusätzlicher Anwesenheit eines organischen Peroxyds - mit sichtbarem Licht bestrahlt.

2. Verfahren nach. Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lichtstrahlung mit einer Wellenlänge über 290 nm einwirken läßt.

J. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die makromolekulare Trägerverbindung ein Molekulargewicht über 1000, vorzugsweise über 10.000 hat,

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3* dadurch gekennzeichnet, daß die makromolekulare Trägerverbindung wasserlöslich oder wasserquellbar ist.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die makromolekulare Trägerverbindung eine wasserunlösliche, vernetzte Verbindung ist. , ·

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die. makromolekulare Trägerverbildung seitenständige Alkenyl- und/oder Alkylphenyl-Gruppen enthält.

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7· Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die makromolekulare Trägerverbindung ein Polysaccharid oder Homo- oder Mischpolymerisat des Acrylamids oder des Vinylpyrrolidons ist.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die makromolekulare Trägerverbindung ein vernetztes Perlpolymerisat von einem überwiegenden Anteil Acrylamid, Vinylpyrrolidon oder Hydroxyalkylacrylat oder -methacrylatuad ggf. einem geringeren Anteil Vinyl toluol, Allylacrylat oder -rnethacrylat oder eines Polyallylester einer mehrbasischen Säure ist.

9· Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das gelöste Protein ein Enzym, Enzyminhibitor, Antikörper oder Hormon ist.

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