DE2263289B2

DE2263289B2 - Verfahren zur Herstellung trägergebundener Polypeptide

Info

Publication number: DE2263289B2
Application number: DE2263289A
Authority: DE
Inventors: Dieter Dipl.-Chem. Dr. 6500 Mainz Kraemer; Klaus Dr. 6101 Rossdorf Lehmann; Hermann Dipl.- Chem. Dr. 6100 Darmstadt Pleiner
Original assignee: Roehm GmbH Darmstadt
Current assignee: Roehm GmbH Darmstadt
Priority date: 1972-12-23
Filing date: 1972-12-23
Publication date: 1975-12-11
Also published as: SE415261B; FR2211470A1; JPS579791B2; DE2263289A1; CH593992A5; FR2211470B1; GB1421488A; JPS49100293A; US4039413A

Description

Die Anwendung trägergebundener Eiweißkörper ewinnt in Wissenschaft und Technik immer größere ledcutung, da sie es auf die einfachste und sicherste \x\ gestatten. Wirkstoffe und Substrate nach ihrer Jmselzung wieder zu trennen. Aus diesem Grunde laben sich zahlreiche Entwickhmgslaboratoricn zum liel gesetzt, Tragerkörper für proteinartige Wirktoffc zu entwickeln, die Eiweißstoffe aus wäßriger lösung möglichst rasch und vollständig unter größtnöglichcr Erhaltung ihrer biologischen Wirksamkeit lufnehinen und den Wirkstoff bei der Anwendung licht wieder freisetzen. Nach der ansatzweisen Einivirkung auf ein Substrat soll der trägergebundene Wirkstoff durch Filtration schnell und restlos von der Substratlösung abtrennbar sein, und eine Schüttung des Materials soll eine hohe Durchflußgeschwindigkeit bei kontinuierlichem Betrieb gestatten. Nachdem erste Präparate, die an synthetische oder vorbehandelte S natürliche Makromoleküle gebundene Wirkstoffe, z. B. Enzyme, enthielten, noch als recht unvollkommen anzusehen waren, liegen als Ergebnis jahrelanger Entwicklungsarbeiten nun Produkte mit hohem Gehalt an aktiven Wirkstoffen und guter Filtrierbarkeit vor.

ίο Bestimmte Nachteile dieser Produkte wurden bisher als grundsätzlich unvermeidbar angesehen. Die Trägerstoffe enthalten Gruppierungen, die gegenüber Polypeptiden, insbesondere deren end- und seitenständigen Aminogruppen, reaktiv sind und damit unter Bildung

einer Amidgruppe zu reagieren vermögen. Diese Gruppen, wie z. B. Carbonsäureanhydrid-, Carbonsäurechlorid- oder Phenylester-Gruppierungen, sind wasserempfindlich und werden zu einem beträchtlichen Teil hydrolysiert, bevor sie mit dem Eiweißkörper

ϊο in Reaktion treten. Durch die Hydrolyse entstehen Carboxylgruppen, deren negative Ladungen bei der späteren Umsetzung mit ebenfalls negativ geladenen Substratmolekülen hinderlich sein können und außerdem die Matrixeigenschaften des Trägers erheblich verändern. Andere funktioneile Gruppen, bei deren Hydrolyse keine Carboxylgruppen, sondern Amino- oder Hydroxylgruppen entstehen, reagieren so träge, daß es zur Bindung von Proteinen außerordentlich langer Reaktionszeiten oder aktivitätschädigender Reaktionsbedingungen bedarf. Weiterhin geht bei der überführung der häufig funktionswichtigen basischen Aminogruppen eines Eiweißkörpers in nichtbasischc Amidgruppsn die biologische Wirksamkeit in vielen Fällen verloren, so daß stets nur derjenige Anteil des Wirkstoffes im gebundenen Zustand aktiv bleibt, bei dem die Bindung — mehr oder wenig zufällig an einer nicht funktionswesentlichen Aminogruppe stattgefunden hat.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Polypeptide unter schonenden Bedingungen an solche Träger-Stoffe zu binden, die einfach herzustellen sind und keine Gruppen enthalten, die durch Hydrolyse oder Nebenreaktionen neue polare oder gar ionische Gruppen bilden. Die Bindung der Polypeptide soll bei Temperaturen und pH-Werten möglich sein, bei denen die biologische Aktivität der Polypeptide nicht beeinträchtigt wird, und soll zu einer möglichst weitgehenden Erhaltung der biologischen Aktivität des gebundenen Proteins führen. Das Reaktionsprodukt soll je nach dem vorgesehenen Verwendungszweck wasserlöslich oder wasserquellbar sein und im letztgenannten Fall gut filtrierbar und auswaschbar sein. Es wurde gefunden, daß die photochemische Bindung der Polypeptide an TrägerstofTe diese zahlreichen Forderungen erfüllt.

Durch Arbeiten von D. E I a d und seiner Mitarbeiter (z. B. D. E 1 a d und .1. Sperling, Journ. Amer. Chem.Soc. 93. S.967 bis 971; 1971) am Weizmann-Institut (Rehovoth, Israel) ist es bekannt, an Glycin oder glycinhaltige Polypeptide durch photochemische Reaktion Toluol oder niedrige Olefine wie 1-Buten, anzulagern. Dabei gehen die Glycineinheitcn in solche des Phenylalanine bzw. Norleucins über. Bei einer typischen Umsetzung dieser Art (J. S perl in»,

J. Amer.Chem.Soc., 1969, Bd.91, S. 5389 und.5390) wird ein aus 90% UL-Alanin und 10% Glycin aufgebautes Polypcptid vom Molekulargewicht 4S00 in einer Lösung in Wasser, tcrt.-Butylalkohol und Aceton

(als Sensibilisator) mit 1-Buten bzw. Toluol unter 72stündiger Einwirkung von UV-Licht bei Raumtemperatur umgesetzt. Dabei wurden Polypeptide erhalten, die zum Teil löslich, zum Teil unlöslich waren und 0,5 bis 1 % an Norleucin-Einheiten bzw. 2 bis 3% Phenylalanin-Einheiten enthielten. Das entspricht einer Umwandlung der vorhandenen Glycin-Einheiten von 5 bis 10% im Falle des Butens und von 20 bis 30% im Falle des Toluols. El ad (European Biophysical Confess Proceedings, 1971II — S. 75 bis 78) fand weiterhin eine schwerwiegende Beeinträchtigung der biologischen Aktivität durch photochemische Reaktionen. Durch Umsetzung mit Toluol oder Buten wurde Lysozym vollständig, RNase zu 90% inaktiviert. Aus zahlreichen Arbeiten verschiedener Forschergruppen ist eine Vielzahl von weiteren photochemischen Reaktionen bekannt, von denen zusammenfassend gesagt werden kann, daß sie in unspezifischer Weise und mit niedrigen Ausbeuten ablaufen. Es war deshalb keineswegs naheliegend, photochemische Reaktionen zur Bindung von Polypeptiden an Trägerstoffe heranzuziehen, denn es ist ein allgemeiner Erfahrungssatz, daß Reaktionen zwischen Makromolekülen weniger leicht ablaufen als Reaktionen zwischen Makromolekülen und niedermolekularen Verbindungen. Man hat zur Bindung von Polypeptiden an Trägerstoffe daher bisher nur solche Reaktionen herangezogen, die im niedermolekularen Bereich quantitativ ablaufen. Aber auch damit hat man nur die Bindung geringer Mengen von Polypeptiden erreichen können. Aus diesem Grunde erschien die photochemische Addition zur Bindung zwischen Polypeptiden und Trägerstoffen zunächst als aussichtslos. Darüber hinaus war bei jeder Bindung zwischen Polypeptiden und Trägerstoffen mit einer nur geringen Erhaltung der biologischen Aktivität zu rechnen. So wird die Wirksamkeit von Trypsin durch Acylierung mit Polyacrylsäure-Abkömmlingen auf einen Bruchteil des ursprünglichen Wertes herabgesetzt, wogegen Acetylierung die Aktivität von Trypsin nur unwesentlich beeinträchtigt. Die gleiche Beobachtung läßt sich an Insulin und vielen anderen biologisch aktiven Proteinen machen.

Es war daher völlig überraschend, daß Polypeptide auf photochemischem Wege an Trägerstoffe der verschiedensten Art unter schonendsten Bedingungen quantitativ unter weitgehender Erhaltung ihrer biloeischen Aktivität gebunden werden können. Der Umstand, daß die photochemische Reaktion nicht grundsätzlich an bestimmte reaktive organische Gruppen gebunden ist — wenn auch, wie später zu erörtern ist, einige bestimmte Gruppen recht förderlich sind — gestattet es, die Trägerstoffe weitgehend nach den anwendungstechnischen Erfordernissen auszuwählen. Man kann wasserlösliche Träger ebenso verwenden, wie wasserunlösliche quellbare Gele oder Perlpolymerisate oder sogar mit organischen Verbindungen modifizierte anorganische Träger.

Der Umsetzung von Polypeptiden mit makromolekularen Trägerstoffen sollte es in jedem Falle zustatten kommen, daß eine kovalente Bindung schon durch die Reaktion von jeweils einer einzigen reaktiven Gruppierung des Polypeptids und des Trügermoleküls zustande kommt. Eine quantitative Reaktion aller reaktiven Gruppen beider Komponenten ist also gar nicht erforderlich. Wenn trotzdem in den meisten Fällen eine schlechtere Ausbeute bei der Umsetzung von Polvoerjliden mit Makromolekülen erreicht wird.

als bei analogen Umsetzungen mit niedermolekularen Verbindungen, so läßt sich daran erkennen, in welch erheblichem Maße Reaktionen zwischen Makromolekülen gegenüber niedermolekularen Reaktionen benachteiligt sind. Es war deshalb nicht vorhersehbar, daß gerade bei der photochemischen Reaktion die Umsetzung makromolekularer Partner vollständiger abläuft als die Umsetzung von Polypeptiden mit niedermolekularen Verbindungen. Dieser überraschende Effekt kann — ohne damit die Erfindung auf eine bestimmte Theorie festlegen zu wollen — dahingehend gedeutet werden, daß bei den photochemischen Reaktionen, soweit ihr Mechanismus bisher bekannt ist, vorwiegend hydrophobe Molekülteile miteinander reagieren, z. B. die Methylengruppe des Glycinrestes mit Buten oder Toluol. Da die Polypeptide als Ganzes eher hydrophil und chemischen Umsetzungen nur in wäßrigen oder anderen stark polaren Reaktionsmedien zugänglich sind, dürften die photochemisch reaktiven unpolaren Gruppen durch die stark solvatisierten polaren Gruppen des Polypeptids stark abgeschirmt und für kleine hydrophobe Moleküle nur schlecht zugänglich sein. Die im Verfahren der Erfindung verwendeten Trägerstoffe 2s sind dagegen in der Regel hydrophil, so daß es zu einer Wechselwirkung und Aneinanderlagerung mit den hydrophilen Gruppen des Polypeptids kommt. Dadurch werden zwangsläufig auch die hydrophoben, photochemisch aktivierbaren Gruppen beider Makromoleküle in räumliche Nähe gebracht und ihre Umsetzung erleichtert.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung trägergebundener Polypeptide, bei dem man die wäßrige Lösung eines Polypeptids in Gegenwart einer nicht peptidartigen makromolekularen Trägerverbindung und eines an sich bekannten Photosensibilisators in Abwesenheit von Sauerstoff mit ultraviolettem Licht oder — bei zusätzlichen Anwesenheit, eines organischen Peroxyds ■- mit sichtbarem Licht bestrahlt.

Der Begriff »Polypeptid« ist weit zu fassen. Es fallen nicht nur wasserlösliche natürliche Eiweißkörper darunter, wie Enzyme, Antikörper, Hormone mit Proteinstruktur, Inhibitoren, sondern auch aus wenigen Aminosäureinheiten aufgebaute natürliche oder synthetische Polypeptide, wie Dipeptide, oder Verbindungen, die nur teilweise peptidartig aufgebaut sind, wie Penicilline. Ferner kann man auch Substanzen, die keine Peptidstruktur haben, mit oligomeren Peptiden umsetzen und sie über diese Gruppe an Trägermoleküle binden.

Der Begriff »Träger« ist hier umfassender gebraucht

worden, als in der biochemischen Literatur sonst üblich. Er umfaßt nicht nur unlösliche Feststoffe.

sondern auch wasserlösliche Verbindungen, die als

Vehikel für das gebundene Polypeptid fungieren und

z. B. seinen Transport an bestimmte Stellen eines

biologischen Systems, seine Permeabilität durch

Grenzschichten oder Membranen, seine Verteilung auf unterschiedliche Phasen u. dgl. beeinflussen.

Als makromolekulare Trägerverbindung kommt dank der geringen Spezifität der photochemischen Reaktion eine große Vielzahl von nicht peptidartigen Verbindungen in Betracht. Es handelt sich in der überwiegenden Mehrzahl der Fälle um natürliche oder synthetische organische Polymere, jedoch können auch anorganische Träger verwendet werden, sofern sie für die aktivierende Strahlung genügend

durchlässig sind, eine ausreichende innere Oberfläche haben und an dieser Oberfläche photochemisch aktivierbare organische Gruppe tragen. Als Beispiele für anorganische Träger dieser Art seien poröses Glas, quellbare Silikate, insbesondere Tonmineralien, oder hochdisperse Kieselsäure genannt, die mit solchen Siloxanen modifiziert sind, die Alkenyl-, Tnluyl- oder andere, der photochemischen Addition zugängliche Gruppen enthalten.

Die in derMehrzahl der Fälle verwendeten organisehen Trägerve-bindungen haben ein Molekulargewicht über 1000 und vorzugsweise über 10000. Sie können wasserlöslich sein, jedoch werden für die meisten Anwendungsfälle wasserunlsöliche Trägerstoffe verwendet, und zwar vorzugsweise solche, die überwiegend aus hydrophilen Monomereinheiten aufgebaut sind und ihre Wasserunlöshchkeit allein ihrer vernetzten Struktur verdanken. Für Trägerstoffe dieser Art lassen sich bekanntlich keine Molekulargewichte angeben. Die Vernetzung ist vorzugsweise so gering, daß die Stoffe in Wasser quellbar sind. Durch eine Quellbarkeit auf wenigstens das Doppelte des Trockenvolumens wird bereits eine große »innere Oberfläche« zur Bindung von Polypeptiden freigesetzt. Um jedoch auch das Eindringen sehr großer Protein moleküle und nach deren photochemischer Bindung auch das Ein- und Ausdiffundieren großer Substratmoleküle zu gestatten, ist eine stärkere Quellbarkeit in Wasser, beispielsweise auf das 5fache, vorzugsweise auf das 10- bis 200fache des Trockenvolumens von Vorteil.

Wenn Trägerstoffe verwendet werden, die in der Lösung des Polypeptids nicht anquellen, so müssen sie, um eine hinreichende Menge an Polypeptiden binden zu können, in Form äußerst feiner Teilchen, z. B. Latex-Partikeln, vorliegen. An eine Vielzahl der bekannten natürlichen oder synthetischen Polymerlatices können Polypeptide photochemisch angelagert werden. Solche beladenen Latexteilchen können dann ähnlich wie Blutkörperchen als Träger Tür biologisch aktive Substanzen dienen.

Unter den für das Verfahren der Erfindung grundsätzlich geeigneten wasserlöslichen oder in Wasser quellbaren Trägerstoffen zeichnen sich solche durch eine hohe photochemische Reaktionsfähigkeit aus, die ganz oder teilweise aus möglichst hydrophilen, zur Radikalbildung neigenden Monomereinheiten aufgebaut sind. Dies trifft für makromolekulare Verbindungen mit Carbonsäureamide Carbonsäureester-, Lacton-. Halbacetal- und cyclischen Äthergruppen zu. Als sehr reaktiv haben sich Homo- und Mischpolymerisate des Acrylamide oder des Vinylpyrrolidon sowie Polysaccharide erwiesen. Unter den Polysacchariden werden wiederum die ohnehin in der Biochemie viel benutzten Trägermaterialien, wie Sepharose, Polydextrangele, Agarose-Gele, Cellulose in Form von Pulvern, Fasern. Vliesen (Filterpapier) oder Regeneratfolie usw., bevorzugt. Die Hydroxylgruppen der Polysaccharide können, beispielsweise, um die biologische Abbaubarkeit herabzusetzen, teilweise veräthert oder verestert sein. Die radikalische Reaktion greift im Falle der Polysaccharide wahrscheinlich an der dem Ringsauerstoffatom benachbarten C — Η-Bindung an, wobei ein Wasserstoffatom abgespalten und ein Kohlenstoffradikal gebildet wird (vgl. I. R ο sen thai und D. E lad. Tetrahedron Letters 1967. Bd. 23. S. 3193 bis 3204).

In analoger Weise wird in carboniimidgruppenhaltieen Polymeren eine C — Η-Bindung m α-Stellung zur Carbonämidgruppe unter Ausbildung eines C-Radikals gespalten (vgl. I. Rosenthal in »The Chemistry of Amides« von S. P a t a 1 und J. Z a b r 1 c k y; Intercience. New York 1970, S. 303). Homo- und Mischpolymerisate des Methacrylamide die kein u-C-Wasserstoffatom haben, sind daher weniger reaktiv und weniger bevorzugt als Homo- und Mischpolymerisate des Acrylamids oder Vinylpyrrolidon. Da diese Monomereinheiten zugleich stark hydrophil sind kommt es auf die Hydrophilie und photochemische Reaktionsfähigkeit eventueller weiterer Comonomerer nicht entscheidend an, wenn auch hydrophile Comonomere grundsätzlich bevorzugt sind, wie ζ Β Methacrylamid, Acryl- und Methacrylsäure sowie ihre wasserlöslichen Salze, Vinylpyrrolidon. Hydroxyalkylester der Acryl- oder Methacrylsäure, wie ζ B Hydroxyäthylacrylat, 2-Hydroxypropyl-acrylat, Butandiol-l,2-acrylat, Butandiol-l,4-acrylat oder die entsprechenden Methacrylate, weiterhin Aminoalkylester oder Aminoalkylamide der Acryl- oder Methacrylsäure sowie deren Salze oder Quaternisierungsprodukte. wie Dimethylaniinoäthylmethacrylat oder dessen Hydrochlorid oder Hydroacetat. Methacryloxyäthyltrimethylammoniumchlorid.

Die Polymere können durch geringe Anteile von Comonomeren mit zwei oder mehr polymerisierbaren Doppelbindungen, wie Divinylbenzoi, Glycoldiacrylat oder -dimethacrylat oder Triallylcyaniirat vernetzt

Neben den genannten hydrophilen bzw. wasserlöslichen Monomeren können am Aufbau der Trügermoleküle auch dann, wenn sie wasserlöslich oder stark quellbar sein sollen, nicht wasserlösliche Monomere beteiligt sein. Die Trägerstoffe sind dann wasserlöslich oder eut quellbar, wenn sie aus einem Vin\ !polymerisat bestehen, das — gegebenenfalls neben einem vernetzenden Monomeren —

a) zu wenigstens 80 Molprozent aus einem Hydniw alkylester der Acryl- oder Methacrylsäure oder

b) zu wenigstens 60 Molprozent aus Acryl- oder Methacrylamid oder aus Vinylpyrrolidon oder

c) zu wenigstens 40 Molprozent aus Acryl- oder Methacrylsäure oder aus deren Dialkylaminoalkylestern oder

d) zu wenigstens 20 Molprozent aus wasserlöslichen Salzen der Acryl- oder Methacrylsäure oder aus Salzen oder Quaternisierungsprodukten von Dialkylaminoalkylestern der Acryl- oder Methacrylsäure

und zum übrigen Teil aus nicht wasserlöslichen Monomeren aufgebaut ist.

Wasserlösliche Trägerstoffe, die leicht umsetzbare funktionelle Gruppen, wie Hydroxyl- oder Carboxylgruppen, enthalten, lassen sich gewünschtenfalls auch nachträglich durch Umsetzung mit mehrfunktionellen Vernetzungsmitteln, wie Diisocyanaten, Bis-epoxyden. Harnstoff - Formaldehyd - Kondensaten usw.. auf jeden gewünschten Vernetzungs- bzw. Quellbarkeitsgrad einstellen.

Ein besonders vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung wasserunlöslicher Trägerstoffe ist in der deutschen Offenlegungsschrift 20 09 218 beschrieben. Man erhiilt nach diesem Verfahren quellbare vernetzte Trägerpolymere in Form von Perlen von z. B. 0.1 bis

1 mm Durchmesser durch Polymerisation einer wäßringen Lösung eines Vinylmonomeren und eines Vernetziingsmittels in einer organischen Phase. Eine sehr hohe Quellburkeit wird bei diesen Polymeren dadurch erreicht. daB das Polymerisat von vornherein in Gegenwart einer großen Menge Wasser, d. h. im gequollenem Zustand, polymerisiert wird.

Obwohl die vorstehend beschriebenen makromolekularen Stoffe Gruppen enthalten, die einer photochemischen Verknüpfung mit Polypeptiden zugang- ίο lieh sind, kann es vorkommen, daß nur nach langer und starker Bestrahlung eine ausreichende Zahl von Bindungen zwischen einem Polypeptid und einem Träger entsteht. Um eine Schädigung des Polypeptids durch überlange Bestrahlung und einen hohen Aufwand an Strahlungsenergie zu vermeiden, hat es sich in derartigen Fällen bewährt, in die Trägerstoffe solche organischen Gruppen einzubringen, die einer photochemischen Reaktion besonders leicht zugänglich sind. Solche Gruppen sind seitenständige Alkenylgruppen, besonders solche mit einer endständigen Doppelbindung, oder Alkylphenylgruppen, hierunter vor allem der Toluyl-Rest. Diese Gruppen lassen sich in vielen Fällen durch Umsetzung des Trägerstoffes mit Toluyl-Carbonsäurechlorid. Toloylsulfochlorid. Allylchlorid, Acrylsüurechlorid usw. einführen. Auf diese Weise kann man die photochemische Reaktivität aller OH-gruppen- oder aminogruppenhaltigen Trägermaterialien, seien sie per se photochemisch inert oder reaktiv. verbessern. Dies gilt vorzugsweise Tür Träger mit Poh saccharidstruktur, also Agarose. Polydextran und ■Cellulose, sowie für hydroxyalkylsubstituierte PoIyvinylverbindungen, wie Homo- oder Mischpolymerisate der Hydroxyalkylester oder N-Hydroxyalkylamidc der Acryl- oder Methacrylsäure. Bei der Ver-Wendung von Vinylpolymeren als Träger ist es vorteilhafter, schon bei ihrem Aufbau Monomere mit entsprechenden Seitengruppen mitzuverwenden. z. B. Vinyltoluol oder Allylacrylat- oder methacrylat. Der Anteil dieser Monomeren kann von Bruchteilen eines Prozents bis zu 50% oder mehr, bezogen auf das Gesamtgewicht der Monomeren, betragen.

Obwohl auch Polypeptide untereinander photochemisch verbunden bzw. vernetzt werden können, spielen Polypeptide als Trägerstoffe im vorliegenden Verfahren keine Rolle und gehören deshalb nicht zum Umfang der Erfindung.

Die photochemische Reaktion zwischen dem Polypeptid und dem Trägerstoff findet in einer wäßrigen Losung des Polypeptids statt. Hierunter werden auch Lösungen von Polypeptiden in Gemischen von Wasser mit niederen Alkoholen, wie z. B. Methanol. Äthanol, Propanol oder Butanol, oder mit Aceton u. ä. verstanden. Die Konzentration des Polypeptids in der verwendeten Lösuna sollte zweckmäßig im Bereich von 100 ug/ml bis 10 mg/ml liegen. Der Trägerstoffwird im allgemeinen in einer solchen Menge eingesetzt, daß das Polypeptid bei vollständiger Bindung an den Trager einen Anteil von 1 bis 50 Gewichtsprozent, vorzugsweise 10 Gewichtsprozent bildet, jedoch kann man auch von diesen Mengen abweichen.

Die eigentliche photochemische Reaktion wird durch Photosensibilisation ausgelöst. Photosensibilisatoren sind seit langem bekannt. Die Grundlagen auf diesem Gebiet wurden von G. O. Schenck und Mitarbeitern erarbeitet und sind z. B. in «Organic Photochemistry«. R.O.Kar. New York: Mac Graw-HiIl 1966. S. 14 bis 17. beschrieben.

Man versteht unter Photosensibilisierung die energetische Anregung eines Akzeptormoleküls(A) durch ein Donormolekül (D). welches die Strahlungsenergie (/ic) primär absorbiert. Im vorliegenden Fall fungieren Sensibilisatoren als Donormoleküle, d. h., sie werden durch ultraviolettes Licht zunächst in ihren niedrigst angeregten Singlettzustand (S₁) gebracht, wonach sie durch Intersystemcrossing in den niedrigsten Triplett?ustand(T,) übergehen. Dieser Zustand ist verhältnismäßig langlebig und daher in der Lage, durch diffusionskontrollierte Energieübertragung andere Moleküle zu Triplettzuständen anzuregen, aus welchen diese Moleküle radikalisch reagieren können. Diese Reaktionsfolge läßt sich so darstellen:

D(S,

D(S₁)

D(T₁) + A

D(T₁)

D + A(T₁)

Das Akzeptormolekül A kann z. B. das Polypeptid oder das Trägermolekiil sein.

Nach Hammond und Mitarbeitern (J. Am. Soc. 86. 4537 [1964]) sollen gute Photosensibilisatoren (Donoren) eine hohe Absorption der eingestrahlten Energie haben, wobei das UV-Spektrum des Sensibilisators (Donors) möglichst nicht mit dem des Akzeptors überlappen und in längerwelligen Bereich liegen soll. Sie müssen ferner eine höhere Triplettenenergie besitzen als der Akzeptor und außerdem ein möglichst effizientes Intersystemcrossing aufweisen. Schließlich sollte der Photosensibilisator selbst keine photochemischen Reaktionen eingehen, d. h. photochemisch möglichst inert sein. Calvert und Pitts haben nach Daten von Hammondetal und E r m ο 1 a e v et al eine Anzahl von Verbindungen zusammengestellt, die als Photosensibilisatoren wirksam sind und sich für das Verfahren der Erfindung eignen (J. G. Calvert und J. N. Pitts Jr., »Photochemistry«. John Wiley et Sons, Inc.. New York, London, Sidney 1966, S. 298). Dazu gehören, nach abnehmender Energie des angeregten Tripletts-Zustandes geordnet Propiophenon, Xanthon, Acetophenon. Triacetyibenzol, Isobutyrophenon. Diphenylpropanon, Benzaldehyd. Triphenylmethylketon. Carbazol, Diphenylenoxyd, Triphenylamin, Dibenzothiophen, o-Dibenzoylbenzol. Benzophenon, Dichlorbenzophenon, Diacetylbenzol. Fluoren und viele andere. Ketone haben sich als gut wirksam erwiesen. Außer den schon genannten Ketonen sind Aceton. Methylethylketon und Methylisobutylketon zu erwähnen. Acetophenon und Propiophenon sind besonders bevorzugt, da sie auf Grund ihres Absorptionsspektrums einen großen Teil der von einer Quecksilberhochdrucklampe ausgestrahlten Energie, namentlich im Bereich der 366 nm- sow ie 313 nm-Emissionslinien des Quecksilbers, absorbieren.

Der angeregte Photosensibilisator erzeugt durch Wechselwirkung mit dem Polypeptid oder dem Trägermolekül ein Kohlenstoff-Radikal. Typische Reaktionen dieser Art sind nachfolgend für die Glycingruppe(l) eines Polypeptids. für eine Ghicoseeinheit (II) eines Polysaccharide, für eine Acrylamideinheit(lll) eines Vinylpolymeren und für ein Toluylgruppen(lV) enthaltendes Trägerpolymeres formel-

509 550/399

ίο

mäßig dargestellt (C* bezeichnet ein Kohlenstoff- polymeren durch Addition und nachfolgende Radikalradikal), übertragung mit einem beliebigen übertrager (AH)

NH-CO

CONH

CH,

— NH-CO

— CONH

CH

(1)

-NHCO

-CONH

CH + -CH₂-CH-

CO-O-CH₂-CH=CH₂

CHO-		CHO-	'5	-CH₂-CH-
/\ HOCH O	(H)	/\ HOCH O j I		CO-O-CH₂-C
HOCH CH-CH₂OH \ /	HOCH C-CH₂OH \/	20
\/ CHO-	CHO-

CONH-

NHCO-

+ AH

-A*

H
-CH₇-C-

-CH₇-C-

CONH₂

(HI)

CONH,

-CH₂-CH- CONH-

CO-O-CH₂-CH₂-CH₂-CH

^XNHC0-

CH₃	CH ι
λ Ii Ί	-Λ
V"	V

(IV)

Eine Vielzahl weiterer analoger Reaktionen an anderen Gruppen des Polypeptids. z. B. an Einheiten des Cysteins. Cystins, Methionins oder Tryptophans oder des Trägermoleküls kann auftreten. Radikale dieser Art reagieren untereinander durch Rekombination:

-NHCO

— CONH

CH + -CH₇-C—

CONH,

— CONH CONH —

oder mit olefinischen Seitengruppen des Träger-Die bevorzugte Reaktionsfähigkeit des Glycinreste; vor anderen Aminsäureresten wirkt sich auf das Ver fahren der Erfindung vorteilhaft aus, da GlycinresU

in fast allen natürlichen Eiweißkörpern vorkommen aber oft nicht funktionswichtig sind. Die photo chemische Reaktion am Glycinrest hat daher häufi; keinen oder nur geringen Einfluß auf die biologiscl Wirksamkeit des gebundenen Polypeptids.

Grundsätzlich ist die Auslösung von photochcmi sehen Reaktionen nicht von der Anwesenheit eine: Photosensibilisators abhängig. Es ist durchaus mög lieh, durch eine hinreichend energiereiche Strahlunj das Polypeptid bzw. das Trägermolekül unmittelba

anzuregen, d. h,in ein Radikal überzuführen. Wie au Arbeiten von K. Dose und Mitarbeitern (Photo chemistry and Photobiology 1968. Vol. 7. S. 671 bi 673) bekannt ist, tritt bei der unmittelbaren An regung des Polypeptids häufig Inaktivierung ein

d. h.. die Molekülstruktur wird irreveribel zerstör) Das Verfahren der Erfindun« wird daher Vorzugs weise mit einer Strahlung durchgeführt, deren Energi zur unmittelbaren Aktivieruna des Polypeptids nich ausreicht, die jedoch den Photosensibilisator anzu regen vermag. Eine Tür das Verfahren der Erfindunj gut geeignete Strahlung ist ultraviolettes Licht eine Wellenlänge von mehr als 290 nm. übliche Queck silber-Hochdrucklampen senden neben einer Strah lung in dem angegebenen Bereich auch härten

Strahlungen im Bereich von 240 bis 280 nm aus Dieser Strahlenanteil wird zweckmäßig durch Pyrex glas herausgefiltert. Die Dauer der Bestrahlung richte u/, ^{nach der Sti}""ke der Strahlungsquelle und de Wirksamkeit des Photosensibilisators und kann in

Bereich von 10 Minuten bis 50 Stunden lieaen. Be Verwendung der gebräuchlichen Quccksilbcr-Hoch druck-Tauchlampen, d. h. Lampen mit einer Leistung von 125 bis 500 Watt, liegen die Bestrahlungszeitei

im allgemeinen zwischen I und 30 Stunden. Nach Abschalten der Strahlenquelle ist die Reaktion sofort beendet; nicht umgesetztes Trägermaterial. Protein und die Protein-Träger-Verbindungen sind stabil, und es besteht -- im Gegensatz zu anderen Bindungsverfahren keine Gefahr der hydrolytischen Spaltung der photochemisch erzeugten Bindungen.

Die photochemische Reaktion kann auch mit einer Lichtstrahlung im sichtbaren Bereich ausgelöst werden, wenn neben einem durch sichtbares Licht anregbaren Photosensibilisator, wie Biacefyl, ein Peroxyd, wie z. B. Di-tert.-Butylperoxid, verwendet wird.

Einer der wesentlichen Vorteile des photochemischen Bindungsverfahrens gegenüber der rein chemischen Bindung ist die freie Wählbarkeit von Temperatur und pH-Wert. Man kann bei beliebig tiefen und — soweit es die Temperaturbeständigkeit des Polypeptide zuläßt beliebig hohen Temperaturen, beispielsweise zwischen —5 und 70⁰C, sowie im neutralen, sauren oder alkalischen Milieu arbeiten. Dadurch läßt sich das Verfahren den Stabilitätsbedingungen des Polypeptids optimal anpassen. Auch äußerst temperaturempfindliche Proteine lassen sich unter schonendsten Bedingungen verarbeiten.

Eine wichtige Voraussetzung fur die Bindung des Polypeptids an den Träger ist die Abwesenheit von Sauerstoff. Sauerstoff wird bekanntlich sehr leicht in Gegenwart von Sensibilisatoren photochemisch angeregt und löst eine Vielzahl unerwünschter Nebenreaktionen aus. Es ist daher erforderlich, die Reaktion in einer sauerstofffreien Schutzgasatmosphäre, beispielsweise in Stickstoff oder Argon, durchzuführen. Um auch in der Peptidlösung enthaltenen Sauerstoff vollständig zu entfernen, läßt man vor Einwirkung der Strahlung ein sauerstofffreies Inertgas durch die Lösung perlen.

Nach Abschluß der Bestrahlung und Bindung des Polypeptids an den Träger kann die Reaktionslösung gegebenenfalls als solche für den vorgesehenen Verwendungszweck eingesetzt werden. An gelöste Träger gebundene biologisch wirksame Proteine kennen z. B. als pharmazeutische Präparate von verringerter Abbaubarkeit oder Resorbierbarkeit im Körper verwendet werden. Man kann die an lösliche Träger gebundenen Polypeptide aber auch in Substanz gewinnen, indem man Fällungsmittel, wie anorganische Salze oder Alkohole, zusetzt. Das ausgefallene Produkt kann dann abfiltriert und mit Salzlösungen oder Alkohol-Wasser-Gemischen ausgewaschen werden. In fester Form vorliegende Produkte können unmittelbar abfiltriert und mit Wasser gewaschen werden.

In der bevorzugten Ausführungsform eines an ein quellbares Perlpolymerisat gebundenen Polypeptids kann das Produkt unmittelbar in einer Substratlösung verteilt werden, wobei das Substrat mit dem gebundenen Polypeptid, beispielsweise einem Enzym, in Wechselwirkung tritt. Nach der Umsetzung des Substrats kann das trägergebundene Enzym durch einfache Filtration vollständig abgetrennt werden. Man kann auch das Perlpolymerisat in dichter Schüttung als Säulenfüllung verwenden und die Substratlösung durch die Säule fließen lassen. Bei Verwendung eines Perlpolymerisats von einheitlicher Teilchengröße ist eine hohe Strömungsgeschwindigkeit in einer solchen Reaktionssäule zu erreichen.

Das Verfahren der Erfindung kann in einer großen Vielfalt von Ausführungsformen verwirklicht werden, die sich hier nicht erschöpfend darstellen lassen.

Selbstverständlich ist es auch möglich, nacheinander oder gleichzeitig verschiedene Proteine an denselben Träger zu binden. Weitere Ausführungsformen der Erfindung und ihre Ergebnisse sind den nachfolgenden Beispielen zu entnehmen.

In manchen Fällen, z. B. bei der Affinitätschromatographie hochmolekularer Verbindungen an trägergebundenen affinen Proteinen, muß das Protein in ausreichendem Abstand von der Hauptkette des Trägerpolymeren gebunden sein. Man verwendet für solche Fälle Trägerverbindungen, die photochemisch besonders aktive Gruppen an längeren, z. B. 6 bis 12 C-Atome enthaltenden Seitenketten tragen. Beispiele für solche Träger sind Vinylpolymere mit Einheiten von Acryl- oder Methacrylsäureestern von höheren ungesättigten Alkoholen. Polysaccharide können mit entsprechend langkettigen ungesättigten Verbindungen modifiziert werden.

Herstellung der Trägersubstanzen

A. Herstellung eines quellbaren Perlpolymerisats aus Acrylamid und Allylmethacrylat

In einem Rundkolben (5(X) ml) versehen mit Thermometer, Rührer, Rückflußkühler und CO₂-Einleitungsrohr werden 87 g n-Heptan und 55 g Perchloräthylen vorgelegt. Darin werden 0,25 g Benzoylperoxid und 0,01 g eines Stabilisators gelöst. Nach Entfernung von Sauerstoff mit etwa 2 g Trockeneis wird bei 25^CC eine Monomerlösung zugegeben, bestehend aus

12 g Acrylamid,
3 g Allylmethacrylat.
0,375 g Glykoldimethacrylat,

17,5 g Formamid,
0,044 g Poly-methacrylylcholin-chlorid, gelöst ir

Formamid als Verdickungsmittel, 0,1 g Emulgator (statist. Copolymerisatn-Butyl methacrylat/Methacryloylcholin - chloric = 90/10).

Die Monomerphase wird durch konstantes Rührer in der organischen Phase verteilt. Die Polymerisatior wird durch Zugabe von 0.25 g Dimethylanilin ausge löst. Die Polymerisation dauert 8 Stunden bei einei Temperatur unter 30⁰C und andauerndem Durchleiter von CO₂. Die erhaltenen feinen Perlen werden durcl Dekantieren und Absaugen von der organischer Phase befreit, in Aceton gewaschen und im Vakuun getrocknet.

Durch Bromtitration wurde ein Gehalt von 3,5 Ge wichtsprozent Allylmethacrylat ermittelt.

B. Herstellung eines quellbaren Perlpolymerisats au Acrylamid und Glykolmonoacrylat

In einem 500-ml-Rundkolben, ausgerüstet wie in A werden

70 g n-Heptan,

70 g Perchloräthylen

vorgelegt. Nach Entfernen des Sauerstoffes mittel 2 g Trockeneis wird unter Rühren eine Monomer lösung zugegeben, bestehend aus

9 g Acrylamid,

9 g 2-Hydroxyäthylmethacrylat, 0.2 g N.N'-Methylenbislmethacrylamid),

0,9 g Emulgator (wie in A),
10g Wasser,

Ig 0,l%ige wäßrige Lösung von Ammoniumperoxydisulfat,

1 g 0,l%ige wäßrige Lösung von Fe'"-sulfal.

Die Monomerphase wird durch konsl. Rühren in der organischen Phase verteilt. Der Reaktionsstart erfolgt durch Zugabe von 0,4 g 1 %iger wäßriger Schwefligsäure. Bei einer Reaktionsdauer von 8 Stunden wird die Temperatur auf 30 C gehalten. Während der gesamten Reaktionsdauer wird CO₂ eingeleitet. Die erhaltenen feinen Perlen werden durch Dekantieren und kurzes Absaugen von der organischen Phase befreit, in Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet.

C. Herstellung eines quellbaren Acrylamid-Perlpolymerisats

15 g Acrylamid werden in der in A angegebenen Weise in Suspension polymerisiert.

D. Herstellung eines quellbaren Perlpolymerisats aus Acrylamid und Glykolmonomethacrylat

Ein Gemisch aus 14,25 g Acrylamid und 0.75 g 2-Hydroxyuthyimethacryiat vwid in dei in A angegebenen Weise in Suspension polymerisiert.

E. Herstellung eines wasserlöslichen Mischpolymerisats von Acrylamid und Vinyltoluol

4.68 g Vinyltoluol und 17.06 g Acrylamid wurden in 216 ml absolutem Tetrahydrofuran gelöst und 0.216 g Azoisobuttersäure-dinitril zugegeben. Die Luft wurde aus dem Reaktionsgefäß durch Stickstoff verdrängt. Nach 2 Stunden bei 65 C war die Polymerisation beendet. Das Fällungspolymerisat wurde abnitriert und mit Telrahydorfuran mehrfach gewaschen und getrocknet.

Ausbeute: 9,58 g.

Gehalt an Toluylgruppen (L'V-spektrometrisch bestimmt) 9 Gewichtsprozent.

Das Produkt wurde in Wasser gelöst und durch Gelfiltration an einem mit Epichlorhydrin vernetzten Dextrangel mit einer Wasseraufnahme von 100 g je 10 g Trockensubstanz in Fraktionen unterschiedlichen Molekulargewichts getrennt. Der mit dem Ausschiußvolumen eluierte Anteil (MW größer als 100000) wurde lyophylisiert und ergab 2,8 g.

Durch kombinierte Gelchromatographie des Anteils mit einem Molekulargewicht unter 100 000 konnten 530 mg des Polymerisats vom Molekulargewicht 5000 bis 10000 gewonnen werden, indem zunächst durch Gelfiltration an einem mit Epichlorhydrin vernetzten Dextrangel mit einer Wasseraufnahme von 50 g je 10 g Trockensubstanz der Anteil mit einem Molekulargewicht unter 10 000 und durch Gelfiltration dieses Anteils an einem Dextrangel (Wasseraufnahme 25 g je 10 g Trockensubstanz), der Anteil mit einem Molekulargewicht über 5000 gewonnen wurde.

Herstellung trägergebundener Polypeptide Beispiel 1

Durch Aceton photosensibilisierte Bindung von Trypsin an Agarose

Agarose-Perlen wurden mehrfach in Wasser suspendiert, gewaschen und abzcntrifugiert. 10 g des erhaltenen Feuchtgels (entsprechend KK) mg Agarose) wurden in Wasser-Aceton-Gcmisch (90/10), enthaltend 50 mg gelöstes Trypsin, suspendiert und in einer Schenckschen Celichtungsapparatur, bestehend aus einem Tauchschacht, Kühlschacht und dem Keaklionsgefäß mit sauerstofffreiem Stickstoff, welcher durch 10% wäßr. Aceton geleitet wurde. I Stunde lang begast und anschließend mil einer Quecksilbcr-Hochdrucklampe (125 Watt) 18 Stunden lang unter

ίο gutem Rühren und bei Wasserkühlung belichtet. Bei der Belichtung war die Apparatur mit Aluminiumfolie umwickelt.

Nach der Belichtung wurde das Materia! durch Abzentrifugieren gewonnen, mehrfach mit Wasser und 1 N-NaCl-Lösung gewaschen und zentrifugiert.

Proteinbestimmung

Das Feuchtgel wurde noch weitere 5mal mit Wasser gewaschen und lyophylisiert. Der StickstolT-gehalt wurde nach K j e 1 d a h 1 bestimmt und hieraus der Proteingehalt berechnet. Proteingehall: 21%. Ausbeute an gebundenem Prolein: 63%.

Enzymatischc Aktivität

5 g Feuchlgel wurde mehrfach mit 0.05-M Phosphatpuffer. pH 7,5. gewaschen und das durch Zcntrifugation gewonnene Fcuchtgel mit 20ml Casein-Substratlösung (4% Casein nach Hammarsten in verdünnter Natronlauge; pH 8,0) unier üulem Rühren bei 37 C inkubiert, wobei der pH-Wert durch Titration mit einer durch eine Glaselektrode gesteuerten automatischen Bürette konstant gehalten wurde Nach 3- bis 4maliger Wiederbenutzung des En/ympraparates in der angegebenen Weise wird eine en/vmatische Aktivität von 270 E pro 100 mg Trockenprodukt bzw. 12.9 E pro Milligramm gebundene? Protein ermitteil. Als i Einheil(E) wird diejenige inzymmenge bezeichnet, die innerhalb 60 Minuten 1 μ Aq. Peptidbindungen spaltet.

Wiederholte Verwendung als Kriterium für kovaienU

Bindung

Nach 5maliger Wiederverwendung wird keine Aktivitätsabnahme festgestellt. Dies stellt ein wichtige; Kriterium für das Vorliegen einer kovalenten Bindung zwischen Trypsin und Agarose dar. Nur wenr die Aktivität nach beliebig häufiger Verwendung mii einem hydrophilen, hochmolekularen Substrat Ihier Casein bei pH 8) nicht abnimmt, kann von ko%a!entei Bindung gesprochen werden, da solche Substrat« sehr gut geeignet sind, unspezifisch an den Trägei adsorbiertes Protein auszuwaschen.

Beispiel 2

Durch Aceton photosensibilisierte Bindung
von Trypsin an Cellulose

1 g Cellulose (mikrokristallin 20 bis 100 μπι) wurdi mehrfach mit Wasser gewaschen und in einem Ge sarntvolumen von 50 ml Wasser-Aceton-Gemiscl (90/10), enthaltend 100 mg Trypsin, in der für Beispiel
beschriebenen Weise belichtet. Belichtungszeit 40 Stunden.

_b. Aufarbeitung

Waschen mit Wasser und 1 N-NaCl-Lösung. wöbe das Produkt über eine Glasfritte abgesaugt wurde.
Proieins;ehall:4.8%.

Ausheute an gebundenen· Protein: 53%, bezogen auf eingesetztes Protein.

Enzymatische Aktivität pro 100 mg Trockenprodukt: 27.8 E bzw. 5,8 E pro Milligramm gebundenes Protein.

Nach 5mal wiederholter Verwendung wird keine Abnahme der Aktivität festgestellt.

Beispiel 3

Durch Aceton photosensibilisierte Bindung
von Trypsin an toluylgruppenhaltige Cellulose

Cellulose (wie im Beispiel 2) wurde mit 4-Methylbenzoylchlorid zu einem 3,5 Gewichtsprozent Toluylgruppen enthaltenden Produki: verestert.

1 g dieses Produktes wurde mit Wasser mehrfach gewaschen und in der für Beispiel 2 beschriebenen Weise mit Trypsin umgesetzt.

Belichtungszeit: 15 Stunden.

Proteingehalt: 7,2%.

Ausbeute an gebundenem Protein: 83%.

Enzym. Aktivität pro 100 mg Trockenprodukt: 49 E bzw. 6,9 E pro Milligramm gebundenes Protein.

Beispiel 4

Durch Aceton photosensibilisierte Bindung
von Trypsin an Polyacrylamid-Perlen

1 g Polyacrylamidperlen, hergestellt nach C, wurden in Wasser gequollen, mehrfach mit Wasser gewaschen und über eine Glasfritte abgesaugt: 9,4g Feuchtgel.

Das gesamte Feuchtgel wurde in der für Beispiel 2 beschriebenen Weise mit 100 mg Trypsin umgesetzt und gewaschen.

Belichtungszeit: 35 Stunden.

Proteingehalt: 6,5% (UV-spektrometrisch nach alkal. Hydrolyse).

Ausbeute an gebundenem Protein: 73%.

Enzymat. Aktivität pro 100 mg Trocken produkt: 52,8 E.

Enzym. Aktivität pro Milligramm gebundenes Protein: 8,1 E-

Beispiel 6

Durch Acetophenon photosensibilisierte Bindung von Trypsin an ein Perlpolymerisat aus Acrylamid und Allylmethacrylat

Das Verfahren vom Beispiel 5 wird wiederholt mit dem Unterschied, daß in 50 ml wäßrig gesättigter ίο Acetophenonlösung (Gehalt UV-spektrometrisch: 0,003 Mol/l) lediglich 2 Stunden lang belichtet wurde. Ausbeute an gebundenem Protein: 87%. Proteingehalt: 7,5%.

Enzymat. Aktivität 103 E/100 mg Trockenprodukt; 13,4 E/mg gebundenes Protein.

Beispiel 7

Durch Propiophenon photosensibilisierte Bindung von Trypsin an ein Perlpolymerisat aus Acrylamid und Allylmethacrylat

Beispiel 6 wirde mit dem Unterschied wiederholt. daß die wäßrige Phase 5% Methanol und 0,005 Mol/I Propionphenon enthielt.

Ausbeute an gebundenem Protein: 96%.

Proteingehalt: 8,1%.

Enzymat. Aktivität 98 E/100 mg Trockenprodukt: 12,1 E/mg gebundenes Protein.

Beispiel 5

Durch Aceton photosensibilisierte Bindung

von Trypsin an ein Perlpolymerisat aus Acrylamid

und AllylmeEhacrylat

Beispiel 8

Durch Acetophenon photosensibilisierte Bindung von Trypsin an ein mit p-Toluylsulfochlorid

modifiziertes Mischpolymerisat aus Acrylamid und

2-Hydroxyäthylmethacrylat (1:1)

Das Perlpolymerisat von A wurde zu einem 3,5 Gewichtsprozent Toluylgruppen enthaltenden Produkt tosyliert und wie im Beispiel 6 mit Trypsin in Gegenwart von Acetophenon umgesetzt und anschließend aufgearbeitet.
Belichtungszeit: 2 Stunden.

Ausbeute an gebundenem Protein: 78%. Proteingehalt im Produkt: 6,8%. Enzymat. Aktivität pro 100 mg Trockenprodukl: E.

Enzymat. Aktivität pro Milligramm gebundenes Protein: 12,3 E.

1 g des Perlpolymerisats nach A wurde in Wasser gequollen und mehrfach mit Wasser gewaschen und abgesaugt (9,8 g Feuchtprodukt).

Das gesamte Feuchtprodukt wurde in gleicher Weise wie im Beispiel 4 mit: 100 mg Trypsin umgesetzt.

Belichtungszeit: 12 Stunden.

Ausbeute an gebundenem Protein: 91 %.

Proteingehalt (UV-spektrometrisch nach alkalischer Hydrolyse) :7,9%.

Enzymat. Aktivität pro 100mg Trockenprodukt: 6s E.

Enzymat. Aktivität pro Milligramm gebundenes Prolein: 11 E.

Beispiel 9

Durch Acetophenon photosensibilisierte Bindung

von Trypsin an ein Mischpolymerisat des Acrylamide mit 2-Hydroxyathylmethacrylamid nach dessen chemischer Modifizierung mit 4-Methylphenyl-

essigsäure-Chlorid

Das Perlpolymerisat von D wurde durch Umsetzung mit 4-Methylphenylessigsiiurechlorid zu einem 1,2% Toluylgruppen enthaltenden Produkt modifiziert.

1 g des modifizierten Produkts wurde in der im Beispiel 6 beschriebenen Weise mit Trypsin in Gegenwart von Acetophenon umgesetzt.

Belichtungszeit: 4 Stunden.

17
Ausbeute an gebundenem Protein: 85%.

/θ

Wascneii. cm nnijuui wu.uv. ... „,—

puffer (pH 7,5) gelöst und an Dextrangel (10Og HiO-Aufn.iOg Trockensubstanz) getrennt. Die mit dem Ausschlußvoiumen eluierten Fraktionen wurden vereinigt, gegen Wasser dialysiert und lyophylisiert. Der nicht gebundene Anteil (freie RNase) wurden ebenfalls vereinigt lyophylisiert, in 10 ml Wasser gelöst und die Extinktion bei 280 nm gemessen, sie entsprach einer Gesamtmenge von 8,5 mg nichtgebundener

RNase. Hieraus wurde der an den löslichen Träger gebundene Anteil zu 79% des eingesetzten Enzyms berechnet.

Die enzymalische Aktivität wurde alkalimetrisch

im Autotitrator bei pH 7.5 und 37 C mit Hefc-

nucleinsiiure als Substrat bestimmt. Sie betrug 35%.

bezogen auf nichtgebundene RNase und den RNase-

gehalt des Trägers.
Bei einem Vergleichsversuch ohne Belichtung konnte

keine Bindung von RNase an den Träger gefunden werden.

B e i s ρ i e 1 Π

&«. AtMU. pro MÜHgra.m gebundenes

Trypsin: 11 E.

B e i s ρ i e 1 10

Durch Acetophenon photosensibil.sierte Bindung

von Ribonuclease an ein Mischpolymerisat von

Acry,amid und Vinyltoluol von MW über K)CKK)

50Om₂ des löslichen Polymeren nach E und 40mg Ribonuclease A (chromatography einheit hch, 50E/mg) wurden in 50ml mit Acetophenon gesattig-

20

25 V.nJlSo! «on? Jw 5000 bis ,0 000

_{50ml Wasse}r %vurde mit Acetophenon gesatt.gl _nH inom« Insulin sowie 400 mg des in E erhaltenen MischPoWmeHsats vom MW 5000 bis 10 000 darin _sdöst ^H _Die Lösung wurde mit 1ml ^-Sdzsaure _{Wsetzt und wie} .in Beispiel 101 2 Stundenflh

Uc _träoereebundenem Insulin getrennt. Es η süh von jx _e ^^ _{mit dnem Mo},_eku]ar.

wurden J»um. _{einem Proteingehalt von}

^100000f ^ε

^^ Veraieichsversuch ohne Belichtung wurde b«^e _t - ,_{nsu]in an den Träge}r gefunden,

keine Binaun_c

Beispiel 12

_Durch Acetophenon photosensibilisierte Bindung von Insulin an Dextran

_{in00 Dex}tran 150 (MW 150000) und 100mg

'«« - _χ _{mh Acetop}henon gesättigtem

Insulin ^aen^ _{die Lösung mU} _Q5 _m, 0,1 N-SaIz-

säu^auf pH ^gebracht

"h ^Kation an Dextrangel (100 g H₂O-Trockensubstanz) wurden ein Produkt mit ,_nsulingehalt von 5,8% gewonnen, was etwa

. _Ausbcute _Von 55%. bezogen auf eingesetztes einer -^sj"ue

Insulin,

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung trägergebundener Polypeptide, dadurch gekennzeichnet, daß man die wäßrige Lösung eines Polypeptids in Gegenwart einer nicht peptidartigen makromolekularen Trägerverbindung und eines an sich bekannten Photosensibilisators in Abwesenheit von Sauerstoff mit ultraviolettem Licht oder — bei zusätzlicher Anwesenheit eines organischen Peroxyds — mit sichtbarem Licht bestrahlt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lichtstrahlung mit einer Wellenlänge über 290 nm einwirken läßt.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die makromolekulare Trägerverbindung ein Molekulargewicht über 1000, vorzugsweise über 10000 hat.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die makromolekulare Trägerverbindung wasserlöslich oder wasserquellbar ist.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die makromolekulare Trägerverbindung eine wasserunlösliche, vernetzte Verbindung ist.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die makromolekulare Trägerverbindung seitenständige Alkenyl- und/ oder Alkylphenyl-Gruppen enthält.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die makromolekulare Trägerverbindung ein Polysaccharid oder Homo- oder Mischpolymerisat des Acrylamide oder des Vinylpyrrolidons ist.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die makromolekulare Trägerverbindung ein vernetztes Perlpolymerisat von einem überwiegenden Anteil Acrylamid, Vinylpyrrolidon oder Hydroxyalkylacrylat oder -methacrylat und gegebenenfalls einem geringeren Anteil Vinyltoluol, Allylacrylat oder -methacrylat oder eines Polyallylester einer mehrbasischen Säure ist.

9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das gelöste Protein ein Enzym, Enzyminhibitor, Antikörper oder Hormon ist.