DE1908290B2

DE1908290B2 - Acrylamid-mischpolymerisat

Info

Publication number: DE1908290B2
Application number: DE1908290A
Authority: DE
Inventors: Dr.rer.nat. Hans Ulrich 8132 Tutzing Bergmeyer; Dr.phil.nat. Wolfgang Garatshausen Gruber; Dr.phil.nat. Dieter 8132 Tutzing Jaworek
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1969-02-19
Filing date: 1969-02-19
Publication date: 1981-07-02
Also published as: GB1294591A; DE1908290A1; AT306239B; AT300344B; FR2032906A5; NL7001407A; JPS5121070B1; US3711574A; JPS4824513B1; SE377572B; US3775253A; DE1908290C3; CH536861A

Description

Die Erfindung betrifft das in den Patentansprüchen definierte Mischpolymerisat.

Als unlösliche, biologisch aktive Proteine haben die an Trägermaterialien fixierten Proteine Bedeutung, da sie definierte Materialien darstellen, die sich universell für Enzyme, Inhibitoren, Antigene bzw. Antikörper, für Eiweißstoffe allgemein anwenden lassen.

Es ist bereits bekannt unter den Bedingungen der Acrylamidpoiymerisation Proteine in gut quellbarem Material zu fixieren. Das Enzym wird dabei radialisch an die Ketten gebunden. Weiter wurden Proteine bereits an Äthylen-Maleinsäureanhydridcopolymere (EMA) und an Styrol-Maleinsäure-anhydrid-copolymere gebunden.

Die bisher bekannten Methoden sind nicht befriedigend und nicht allgemein für Proteine anwendbar. Bei der Acrylamidpolymerisalion werden nur 18 bis 20% des eingesetzten Proteins gebunden, wovon nur wenige Prozent Aktivität gegenüber Substraten entwickeln können. Höhermolekulare Substrate (Hämoglobin) werden nur zu 1 bis 2% umgesetzt.

Derzeit ergibt EMA die befriedigensten Ergebnisse. Es findet für Antigene, Inhibitoren und Enzyme Anwendung. Die Bindungsreaktion erfolgt schonend in wäßrigem Milieu; etwa 50 bis 60% des Proteins lassen sich unter optimalen Bedingungen fixieren.

Jedoch ist das verwendete Ausgangsmaterial sehr uneinheitlich, es hat niedermolekulare (z. T. lösliche) und höhermolekulare (unlösliche) Fraktionen, die sich weder sieben noch auf andere Weise trennen lassen. Daher werden nur bis zu 60% Protein an den unlöslichen Träger gebunden, der Rest geht als lösliches Material verloren. Aber auch das gebundene Protein befriedigt noch nicht.

In der Bindung des Proteins an den Träger (EMA) hat das Protein Comonomer-Funktion; es kann nicht nur an einer Stelle, sondern an mehreren (d.h. vernetzt) gebunden werden. In Abhängigkeit von der Proteinkonzentration werden mehr oder weniger gut quellbare Protein-auf-Träger-Substanzen erhalten. Das Protein liegt dabei in einem Netzwerk covalent gebunden vor, so daß die Diffusion bei diesem Material eine wesentliche Rolle spielt, und es nur teilweise für Substrate zugänglich ist. Auch durch Zugabe von Vernetzern (Hexamethylendiamin) wird dieser Nachteil nicht aufgehoben. Von dem gebundenen Protein sind daher nur noch etwa 50% für niedermolekulare Substrate erreichbar, so daß die Gesamtaktivität nicht mehr als 30% beträgt. Gegenüber hochmolekularen

Substraten sind nur 10% und weniger gefunden worden.

Ein zusätzlicher Nachteil dieses Materials liegt darin,

daß es von Protein zu Protein verschieden, auch in Abhängigkeit von der Proteinkonzeniration, z. B.

flockig, schwer filtrierbar anfällt und nicht ohne weiteres in Säulen gepackt werden kann.

S tyrol-Maleinsäureanhydrid·· Polymere lassen sich zur Entfernung von Proteinen, z. B. Reinigung des Trinkwassers zur Anwendung bringea Diese Träger haben

ίο ähnlich dem Polyaminopolystyrol ausgesprochen lypophilen Charakter. Proteine können nicht ohne Verlust ihrer Struktur gebunden werden, auch könnten sie mit Proteinen beladen nicht lyophilisiert werden.

Die nicht durch Protein verknüpften funktioneilen Gruppen der EMA tragen als COrGruppen in entsprechenden pH-Bereichen positive bzw. negative Ladungen. Zusätzlich entstehen CC>2-Gruppen bei der Proteinbindung des cyclischen Anhydrids. Dieser polyvalente Charakter des Proteinträgers verursacht Adsorption an der Matrix, ähnlich den Ionenaustauschern, erhöhte Inaktivierung bzw. Denaturierung der Proteinstruktur und Verschiebung der pH-Optima bei gebundenen Enzymen.
Es besteht daher großes Interesse an der Schaffung

2^ri eines geeigneten Trägers für wasserunlösliche Proteine. Die Erfindung löst die anstehenden Probleme durch das Mischpolymerisat gemäß den Patentansprüchen.

Vorzugsweise liegt die einpolymerisierte Dicarbonsäure als Anhydrid vor. Der Bestandteil c), d. h.

jo Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid oder/und Äthylendiacrylat, macht vorzugsweise nicht mehr als 0,45 Teile im oben angegebenen Gewichtsverhältnis aus.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der oben beschriebenen Mischpolymerisa-

Y-, te zur Fixierung von Protein.

Im folgenden wird das erfindungsgemäße Mischpolymerisat, seine Herstellung und Verwendung näher beschrieben.
Acrylamid, Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid oder/und

4(i Äthylendiacrylat sowie Maleinsäure bzw. deren Anhydrid werden in Gegenwart von Radikalbildnern und Radikalbeschleunigern in den oben angegebenen Verhältnissen nach an sich bekannten Methoden polymerisiert. An sich ist es möglich, Maleinsäure- bzw.

<r> Maleinsäure-anhydridgruppen in breiten Konzentrationsbereichen einzupolymerisieren. Im Hinblick auf die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabenstellung erwies sich jedoch die oben näher gekennzeichnete Zusammensetzung als Bedingung für die Erzielung eines

i» Mischpolymerisats, welches als Trägersubstanz die gewünschten günstigen Eigenschaften aufweist.

Bei der Herstellung läßt sich das Mengenverhältnis von Acrylamid zu Maleinsäure bzw. Äthylenmaleinsäure oder den entsprechenden Anhydriden in verhältnis-

V) mäßig weiten Bereichen variieren, ohne daß hierdurch die erforderliche Vernetzermenge wesentlich beeinflußt wird.

Für die Verwendung zur Fixierung von Proteinen ergaben sich besonders gute Ergebnisse bei Verwen-

feo dung von Acrylamid und Maleinsäure bzw. deren Anhydrid im Gewichtsverhältnis 3 :0,5 bis 1,0. Bei Erhöhung der Konzentration der Dicarbonsäure bis 1,5 wird das Mischpolymerisat zwar spröder und weniger quellbar, zeigt jedoch immer noch gute Eigenschaften

ei als Träger. Bei einem Verhältnis von Acrylamid zu Vernetzer, d. h. Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid bzw. Äthylendiacrylat, von 3 :0,075 bis 0,450 werden gelartige Polymerisate mit besonders bevorzugten

Eigenschaften erhalten. Ein Verhältnis von 3:0,075 stellt die untere Grenzkonzentration dar, bei der die Maleinsäure noch befriedigend eingeschlossen wird.

Für die Fixierung von Proteinen in wäßrigem Milieu erwiesen sich auch Verrietzerkonzentrationen entsprechend einem Verhältnis von Acrylamid zu Vernetzer von mehr als 3:0,45 bis 3 :0,6 noch als gut geeignet Bei Arbeiten mit höheren Salzkonzentrationen, d. h. mehr als 0,05 M, erwiesen sich jedoch die hierbei erhaltenen relativ eng vernetzten Gele für die Proteinstruktur als ι ο nachteilig.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Mischpolymerisate läßt sich beispielsweise in wäßriger Lösung, vorzugsweise in inerter Atmosphäre, durchführen. Beispiele für geeignete Radikalbildner bzw. Radiakalbeschleuniger sind Propionsäurenitril und Ammoniumperoxydisulfat Die Polymerisation kann bei Zimmertemperatur, aber auch bei höheren Temperaturen bis zu 100° oder bei niedrigerer Temperatur durchgeführt werden. Die Polymerisationsdauer ist von der gewählten Polymerisationstemperatur, den gewählten Beschleunigern bzw. Katalysatoren und der mengenmäßigen Zusammensetzung des Ansatzes abhängig. Sie liegt gewöhnlich zwischen etwa 5 Minuten und mehreren Stunden. ^

Nach dem Erstarren wird der polymerisierte Ansatz zur Erzielung einer für die Handhabung besonders günstigen Körnung durch ein Sieb der gewünschten Maschenweite gedrückt, mit Wasser gewaschen und lyophilisiert · )⁽¹

Für die Fixierung des Proteins ist es notwendig, daß die Dicarbonsäure in Form des Anhydrids vorliegt. Es müssen daher vor der Proteinverknüpfung sämtliche Säuregruppen wieder in das cyclische Anhydrid überführt werden. Dies erfolgt beispielsweise durch v> Erhitzen des lyophilisierten Mischpolymerisats im Vakuum auf eine Temperatur von etwa 80 bis 120°C oder unter Atmosphärendruck bei einer Temperatur von etwa 160 bis 220, vorzugsweise 18Cbis 200° C.

Die erfindungsgemäßen Mischpolymerisate sind in to Abhängigkeit von der Vernetzerkonzentration wasserklare bis milchig-trübe Substanzen mit gummiartiger bis spröder Konsistenz.

Die Mischpolymerisate lassen sich leicht körnen, beispielsweise indem man sie durch ein Metallsieb ■*> drückt Als günstig für die Zwecke der Proteinverknüpfung erwiesen sich hierbei Korngrößen von etwa 0,35 bis 0,8 mm. Dieses Granulat quillt bei Zusatz von Wasser nach. Die Stärke der Quellung ist vom Vernetzergehalt abhängig. Je enger die erfindungsge- so mäßen Mischpolymerisate vernetzt sind, desto weniger quellbar sind sie.

Die Entquellung ist z. B. mit Alkohol oder noch einfacher durch Gefriertrocknung möglich. .

In mancher Hinsicht gleichen die Teilchen der ·3^Γ> erfindungsgemäßen Mischpolymerisate denen des bekannten Polyacrylamidmolekularsiebes. Bei Behandlung mit Pufferlösungen erfolgt eine Schrumpfung in Abhängigkeit von der Zahl der vorhandenen Carboxylgruppen, ähnlich wie bei den Ionenaustauschern auf ^o Dextran- oder Polyacrylamidbasis.

Wenn die Carboxylgruppen durch Erhitzen auf etwa 200⁰C in das cyclische AnhydriH überführt werden, tritt häufig eine leichte Gelbfärbung auf. Wird längere Zeit erhitzt so vertieft sich die Farbe von gelb bis braun und ^hi gleichzeitig nimmt die Bindungskapazität deutlich ab. Eine länger dauernde Erhitzung auf die erforderliche TemDeratur unter Normaldruck wird daher tunlichst vermieden.

Die Porosität und die Härte des erfindungsgemäßen Mischpolymerisats im Zustand eines gequollenen Gels wird in erster Linie durch den Vernetzergehalt bestimmt Das Material weist Molekularsiebeigenschaften auf, ähnlich wie bei den Polyacrylamidgelen, wobei die Ausschlußgrenzen beliebig durch den Vernetzergehalt festgelegt werden können. In gequollenem Zustand läßt sich das erfindungsgemäße Mischpolymerisat leicht filtrieren oder zentrifugieren und zeigt als Säulenfüllung ideale Eigenschaften. In Wasser- oder Pufferlösungen gequollen und in entquollenen Zustand ist das gelartige Mischpolymerisat uneingeschränkt haltbar.

Das erfindungsgemäße Mischpolymerisat ermöglicht eine schonende Bindung des Proteins, weil es hydrophil und stark quellbar ist, und die Proteinverknüpfung nur durch Solvolyse der cyclischen Anhydridgruppen erfolgt Die Proteinstruktur bleibt nach erfolgter Bindung des Proteins erhalten, wobei Aktivitätsausbeuten bis zu 100% (und sogar darüber durch Steigerung der Aktivität) gewonnen werden. Das nicht gebundene Protein läßt sich ohne Aktivitätsverlust zurückgewinnen. Bei der Bindung übernimmt das Protein nicht eine Vernetzerfunklion in der Matrix sondern die erhaltenen, als »Enzymgele« zu bezeichnenden trägergebundenen Enzyme sind vollkommen einheitlich und weisen nicht in Abhängigkeit von der Proteinkonzentration unterschiedliche Festigkeit auf.

Durch die gezielte Vernetzung können die Molekularsiebeigenschaften des Mischpolymerisats so eingestellt werden, daß Proteine nur in gewünschte Bereiche gelangen können. So ist es möglich, das Mischpolymerisat für bestimmte Proteine so zu vernetzen, daß die Proteinbindung nur an der Oberfläche des Gelpartikels erfolgen kann, wahlweise aber auch im gesamten Gel. Die Polymerisationsparameter lassen sich je nach dem wirksamen Moiekülradius, sterischen Effekten und Ladungsverteüung variieren.

Die erfindungsgemäßen Mischpolymerisate besitzen Adsorptionseigenschaften, so daß in Wasser oder schwachen Pufferlösungen (bis etwa 0,01 M) das Eiweiß 100%ig am Träger fixiert wird. Bis zu 85% des Eiweißes werden hierbei kovalent, der Rest heteropolar gebunden. Bei Verwendung der erfindungsgemäßen Mischpolymerisate ohne vorherige Cyclisierung der Säuregruppen erfolgt die Eiweißbindung nur adsorptiv. Es wurde gefunden, daß sich unter diesen Bedingungen das Protein mit Salzlösungen ohne Aktivitätsverlust vom Träger wieder eluieren läßt.

Die Proteinbindungskapazität des erfindungsgemäßen Mischpolymerisats ist abhängig von der Zahl der vorhandenen Anhydridgruppen und der Porengröße. Bei einem enger vernetzten Produkt ist die Bindungskapazität geringer als bei einem weniger eng vernetzten Produkt bei gleicher Anzahl an vorhandenen Anhydridgruppen, da das Proteinmolekül bei engerer Vernetzung nicht alle zur Verfügung stehenden bindungsfähigen Gruppen erreichen kann.

Liegen im erfindungsgemäßen Mischpolymerisat zu viele Ladungen vor, die nicht von Protein durch kovalente Bindung besetzt werden können, so erfolgt im allgemeinen eine Verschiebung der pH-Optima bei den gebundenen Enzymen. Entsprechend wurde bei den bekannten trägergebundenen Enzymen beobachtet, daß es bei negativ geladenen Trägermaterialien zu einer Verschiebung um zwei pH-Einheiten und bei positiv gelagerten Trägern eine Verschiebung in den sauren Bereich erfolgt. Bei dem erfindungsgemäßen Mischpo-

lymerisat ist es möglich, die bindungsfähigen Gruppen maximal auszunutzen, so daß sich trägergebundene Proteine erhalten lassen, die keine Verschiebung des pH-Wert-Optimums zeigen.

Eine besonders interessante Eigenschaft der auf Träger gebundenen wasserunlöslichen Proteine besteht darin, daß unier Umständen höhere Michaelis-Konstanten erhalten werden als bei nichtgebundenem Enzym. So wurde beispielsweise gefunden, daß die Aktivität von gebundenem Trypsin gegenüber N-Benzoyl-1-argininp-nitranilid erhöht wird in Vergleich zu nichtgebundenem Enzym.

Die trägergebundenen Enzyme weisen eine Fülle höchsterwünscht.er Eigenschaften auf und lassen sich für zahlreiche Anwendungsgebiete verwenden. So ermöglichen sie es, Substratumsätze weitaus gezielter als bisher auszuführen, da das Enzym zu jedem gewünschten Zeitpunkt aus dem Inkubationsansatz wieder entfernt werden kann. Ist der Umsatz noch nicht quantitativ, so läßt sich das gleiche Enzym erneut zusetzen. Bei Proteasen kann das zu spaltende Protein bei jeder gewünschten Hydrolyserate isoliert werden. Die Spaltungsreaktion läßt sich damit direkt verfolgen. Das enzymatisch aktive Protein muß nicht mehr, wie bisher, nach dem Substratumsatz ausgefällt werden — hierdurch wurden oftmals die Substratumsätze verändert — sondern es läßt sich durch einfaches Filtrieren oder Abdekantieren oder dgl. entfernen.

Substratumsätze lassen sich mit derartigen trägergebundenen enzymatisch aktiven Proteinen auch über in Säulen ausführen. In ein käfigartiges Gefäß gepackte Trägerenzyme lassen sich ähnlich wie ein Tee-Ei zu einem Inkubationsansatz geben und jederzeit wieder daraus entfernen.

Mit proteolytisch wirksamen trägergebundenen Enzymen lassen sich auf einfache Weise Inhibitoren isolieren. Die Stabilität der Proteasen wird dabei durch die Bindung an das Trägermaterial wesentlich erhöht, da die Proteasen keiner Autolysereaktion mehr unterliegen.

Mit den trägergebundenen Proteasen-Inhibitoren lassen sich Proteasen einfach, schnell und ganz spezifisch isolieren. Mit ihrer Hilfe ist es auch möglich, Proteasen enthaltende Proteinlösungen von den Proteasen zu reinigen und damit zu stabilisieren.

Durch auf Träger fixierte Antigene bzw. Antikörper läßt sich eine einfache Isolierung von Antigenen bzw. Antikörpern durchführen. Mit derartigen trägergebundenen Enzymantikörpern kann eine besonders einfache und wirksame Enzymisolierung durchgeführt werden.

Die gebundenen Proteine lassen sich ganz allgemein wiederholt benutzen und zeigen zum Teil auch bei verlängertem Gebrauch keinerlei Aktivitätsschwund.

Aufgrund der Molekularsiebeigenschaften der erfindungsgemäßen Mischpolymerisate lassen sich die trägergebundenen Proteine auch zur Substrattrennung einsetzen.

Die erfindungsgemäßen Mischpolymerisate sind hinsichtlich ihrer Eignung zur Fixierung von biologisch aktiven Proteinen den bisher bekannten, für gleiche Zwecke verwendeten Trägermaterialien in hohem Ausmaße überlegen, wie die in der nachstehenden Tabelle 1 zusammengefaßten Ergebnisse zeigen.

Tabelle

Trügermaterial	Einheitlichkeil	Träger: Protein	Ausheule	Aktivität⁴)	Ausbeute
	des Materials		geh. Protein	niedcrmolck.	Aktivität
			in "■:,	Substrate	v. cingcs.
				in "/■	in %
PAAD¹)	einheitlich	20:1	15-18	90')	10-13
CMC-HYDRAZ1D	einheitlich	10:0,5-1	25-30	bis 40")	bis 14
(ENZYME)²)
EMA³)	nicht einheitlich	5:!	40-45	60-70')	bis 30
erfindungsgcm.	einheitlich	beliebig 1:2	bis 80	bis 100^s)	bis 80

Anmerkungen:

') Polyacrylamid

") Carboxymethylcellulosehydrazid

■') Äthylenmaleinsäurcanhydrid-Copolymerisat

⁴) Trypsin-Aktivitäl

*) Alle niedermolekularen Aminosäuren-Substrate

'') Chymotrypsin-Aktivität

⁷) Am Stickstoff geschützte Aminosäure-Ester

⁸) N-Benzoyl-l-arginin-p-nitranilid

Die Überlegenheit der trägergebundenen Proteine liegt nicht nur in ihrer überlegenen Ausbeute und Aktivität, sondern auch in dem weitaus vorteilhafteren zulässigen Verhältnis von Träger zu Protein.

Die erfindungsgemäßen Mischpolymerisate lassen sich zur Fixierung von Proteinen sehr unterschiedlicher Molekülgröße und Eigenschaften verwenden, da sich die Eigenschaften dieses Trägermaterials ohne weiteres je nach den Erfordernissen des zu bindenden Proteins einstellen lassen. Wenn z. B. das Protein ein besonders großes Molekül aufweist, so kann durch Verringerung des Vernetzungsgrades in weitern Umfange noch ein Eindringen des Proteins in die Matrix und Bindung in derselben bewirkt werden. Bei Proteinmolekülen, die so groß sind, daß auch durch eine Vernetzung im geringstmöglichen Ausmaß ihr Eindringen in die Matrix

wesentlich erschweren wird, ist es auch möglich, eine Fixierung des Proteins lediglich an der Oberfläche der Teilchen vorzunehmen, wobei in diesem Falle das Mischpolymerisat vorzugsweise so fein gekörnt wird, daß eine sehr große Oberfläche erhalten wird, wobei die dann allein an der Oberfläche stattfindende Fixierung des Proteins zu einem völlig ausreichenden Fixierungsgrad führt.

Das Verhältnis von homöopolar zu adsorptiv bzw. heteropolar am Träger gebundenen Enzym läßt sich beeinflussen durch die Art der Herstellung der Bindung zwischen Protein und Träger. Wird beispielsweise das Protein vorgelegt in relativ hoher Pufferkonzentration und langsam das nichtgequollene Gel zugegeben, so ist die Ausbeute an homöopolar gebundenem Enzym sehr hoch und praktisch kein adsorptiv gebundenes Hnzym nachzuweisen. Wird andererseits mit niedriger Pufferkonzentration gearbeitet und Träger und Enzym rasch zusammengegeben, so ist zwar die Ausbeute an gebundenem Protein höher, von diesem an den Träger -'» gegangenen Protein läßt sich jedoch mit hohen Pufferkonzentrationen wieder ein erheblicher Anteil eluieren, der also nicht homöopolar gebunden gewesen sein kann. Wird beispielsweise wie oben angegeben mit hoher Pufferkonzentration und langsamer Trägerzugabe gearbeitet, so gehen etwa 80% des vorgelegten Enzyms an den Träger und es läßt sich dann nichts mehr davon eluieren. Das Enzym ist also annähernd vollständig homöopolar gebunden und seine Aktivität wird lediglich noch durch die Zugänglichkeit für das jo Substrat bestimmt. Im zweiten Fall hingegen bei niedriger Pufferkonzentration und rascher Zugabe werden zwar 100% des vorgelegten Proteins am Träger absorbiert. Hiervon lassen sich aber bis 35% wieder mit hohen Salz- oder Pufferkonzentrationen eluieren, r> waren also nicht homöopolar gebunden. Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Herstellung der Mischpolymerisate

Beispiel 1 ⁴"

3 g Acrylamid (AAD), 0,075 g Äthylendiacrylat und 1 g Maleinsäure werden iii 23 ml 0,05 M Phosphatpuffer pH 7,6 suspendiert und unter starkem Rühren in Stickstoffatmosphäre bei Raumtemperatur mit je 1 ml 4·-, 5%igem Propionsäurenitril und 5%igem Ammoniumperoxydisulfat versetzt, 15 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen und dann durch ein Metallsieb mit einer lichten Maschenweite von 0,5 mm gedrückt Das erhaltene Granulat wird mit etwa 51 destilliertem 3« Wasser gewaschen.

Das so erhaltene gequollene Mischpolymerisat wird zum Entquellen gefriergetrocknet. In getrocknetem Zustand beträgt das Gewicht (Ausbeute) 2,3 g.

Zur Cyclisierung zum Säureanhydrid wird anschließend !,5 bis 2 Stunden bei 200⁰C im Trockenschrank erhitzt Nach der Cyclisierung beträgt das Gewicht des Produktes 2,05 g.

Beispiel 2

60

3 g Acrylamid, 03 g N.N'-Methylen-bis-acrylamid und 1 g Maleinsäure werden wie in Beispiel 1 beschrieben mischpolymerisiert Die Polymerisationsdauer beträgt 15 Stunden. Die Weiterverarbeitung erfolgt ebenfalls wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Ausbeute an Lyophilisat beträgt 2,67 g. Nach Cyclisierung beträgt das Gewicht des Produktes 2,45 g.

Beispiel 3

Wie in Beispiel 1 beschrieben werden 3 g Acrylamid, 0,6 g Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid und 1 g Maleinsäure mischpolymerisiert. Die Polymerisationsdauer beträgt 5 Stunden. Die Weiterverarbeitung erfolgt ebenfalls wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Ausbeute an Lyophilisat beträgt 2,8 g. Nach der Cyclisierung werden 2,6 g Endprodukt erhalten.

Verwendung der Mischpolymerisate
Beispiel 4

Es wird ein cyclisiertes Mischpolymerisat aus 3 g Acrylamid, 0,15 g Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid und 1 g Maieinsäure ais Träger verwendet. iOö mg Trypsin werden mit 1 g Träger in 15 ml eiskaltem Wasser, pH = 5,2, eingerührt und bei 40⁰C 15 Stunden im Kühlraum reagieren lassen. Anschließend wird das Produkt in eine Säure gepackt.

Das heteropolar gebundene Protein wurde mit 65 ml Waschwasser eluiert. Mit 0,2 M Phosphatpuffer, pH = 7,8, konnte danach kein weiteres Protein mehr eluiert werden.

Heteropolar gebundenes Protein
bei pH 7,0,8,5,10
Rest-Aktivität, bezogen auf nicht
gebundenes Trypsin

31% 20%

50%

Beispiel 5

Es wird der gleiche Träger wie in Beispiel 4 verwendet. 100 mg Träger und 200 mg Trypsin werden wie in Beispiel 1 beschrieben reagieren gelassen.

Nichtgebundenes Protein 50%
Aktivität des gebundenen Proteins

vor Behandlung mit 0,2 M Puffer 100%

nach Behandlung mit 0,2 M Puffer 48%

Beispiel 6

Es wird das Produkt von Beispiel 2 als Träger verwendet 100 mg Rinderserumalbumin werden mit 1 g Träger wie in Beispiel 1 beschrieben reagieren gelassen.

Nichtgebundenes Protein: 32%.

Weder mit 0,2 M Phosphatpuffer, pH = 7,8, noch mit 0,2 M Glycinpuffer, pH = 1,8, kann Protein vom Träger eluiert werden. Die Ausbeute an homöopolar gebundenem Protein beträgt 68%, bezogen auf eingesetztes Protein, und 100%, bezogen auf gebundenes Protein.

Bei Verwendung von Humanserumalbumin anstelle von Rinderserumalbumin wird das gleiche Ergebnis erhalten.

Beispiel 7

Es wird das Produkt von Beispiel 2 als Träger verwendet 1 g Träger wird portionsweise innerhalb von 60 Minuten zu 200 mg Trypsin gelöst in 18 ml Phosphatpuffer (0,1 M, pH = 7,8) gegeben und 18 Stunden bei 4° C reagieren gelassen.

Nichtgebundenes Protein
Aktivität des gebundenen Proteins,
bezogen auf eingesetzte Aktivität

50% 40%

Mit OZ 033 bzw. 0,5 M Phosphatpuffer kann kein Protein und keine Aktivität vom Träger eluiert werden.

Claims

Patentansprüche:

1. Acrylamid-mischpolymerisate, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch Polymerisation von a) Acrylamid, b; Maleinsäure bzw. deren Anhydriden sowie c) Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid oder Äthylendiacrylat im Gewichtsverhältnis a : b : c von 3:0,5-1,5:0,075-0,6 in wäßriger Lösung in Gegenwart von Radikalbildnern und Beschleunigern und gegebenenfalls anschließendes Lyophilisieren und Erhitzen unter Anhydridbildung erhalten worden sind.

2. Verwendung des Mischpolymerisats nach Anspruch 1 zur Fixierung von Protein.