DE2260184C3 - Verfahren zur Herstellung einer trägerfixierten makromolekularen Verbindung - Google Patents

Verfahren zur Herstellung einer trägerfixierten makromolekularen Verbindung

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von makromolekularen Verbindungen mit biologischer Wirksamkeit, die an einem unlöslichen Träger oberflächenfixiert sind.
Trägerfixierte makromolekulare Verbindungen sind bekannt. Sie befinden sich entweder auf der Oberfläche eines Trägermaterials, an welches sie entweder adsorbiert oder, gewöhnlich nach Aktivierung des Trägermaterials, kovalent gebunden wurden. Derartige oberflächlich trägerfixierte makromolekulare Verbindungen wie z. B. Enzyme, weisen noch erhebliche Nachteile auf. Insbesondere ist die Oberflächenkonzentration gering, soweit es sich um biologisch aktive makromolekulare Verbindungen handelt, ist die Aktivität nur noch partiell vorhanden und bei der Fixierung an der Oberfläche sind die Ausbeuten zumeist gering.
Bokinnt sich auch schon makromolekulare und niedermolekulare Verbindungen mit biologischer oder Arzneimittelwirksamkeit, die in feste Träger physikalisch oder chemisch eingeschlossen vorliegen. Sie weisen den Nachteil auf, daß sie für Reaktionspartner nur schlecht oder gar nicht zugänglich sind, so daß im letzteren Falle nur die an die Oberfläche gebundenen Substanzen chemisch wirksam werden können. Die reaktiven Oberflächen derartiger »Biokatalysatoren«, können zur Erhöhung der spezifischen Aktivität auch nicht beliebig durch Zerkleinerung des Polymerisats erhöht werden, da kleine Teilchen mechanisch instabil werden und vielfach nicht mehr ausreichend eingesetzt werden können.
Bei der Oberflächenfixierung an aktivierte oder mit
ionogenen Gruppen versehene Träger werden nicht alle reaktiven Gruppen von der makromolekularen Substanz erreicht, so daß der Träger noch geladene Gruppen enthält und andererseits die Bindungsdichte der makromolekularen Verbindung nie die nach der Zahl der bindungsfähigen Stellen zu erwartende Größe erreicht. Durch Adsorption am Träger gebundene makromolekulare Verbindungen sind nicht universell einsetzbar, da sie leicht wieder eluiert werden können,
ίο Der Erfindung Hegt daher die Aufgabe zugrunde, die Nachteile der bekannten trägerfixierten makromolekularen Verbindungen und der Verfahren zu ihrer Herstellung zu beseitigen und ein Verfahren zu schaffen, welches bessere Ausbeuten liefert, weniger Inaktivierung der makromolekularen Verbindung und höhere Konzentration der makromolekularen Verbindung an der Oberfläche des Trägers als dies bisher möglich war.
Die erfindungsgemäße Lösung diesgr Aufgabe besteht darin, daß eine biologisch aktive makromolekulare Verbindung zuerst mit einer monomeren oder niedermolekularen Verbindung gekuppelt und die niedermolekulare Komponente des Kuppiungsproduktes in ein Molekularsiebmaterial eingesaugt und darin zur Polymerisation gebracht wird, wobei die makromolekulare Verbindung, die in das Molekularsieb nicht eindringen kann, an dessen Oberfläche fixiert wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer an die Oberfläche eines Trägers kovalent gebunden biologisch aktiven makromolekularen Verbindung besteht daher darin, daß eine biologisch aktive makromolekulare Verbindung A zuerst mit einer Verbindung B umgesetzt wird, die wenigstens eine zur Kupplung mit der biologisch aktiven makromolekularen Verbindung A befähigte Funktion und wenigstens eine weitere zur Polymerisation befähigte Funktion aufweist, dann ein Molekularsiebmaterial eines die makromolekulare Verbindung A ausschließenden Vernetzungsgrades in entquollenem Zustand zugesetzt und die polymerisationsfähige Gruppe des Kupplungsproduktes AB allein oder in Gegenwart weiterer copolymerisierbarer oder/und polymerisationsfördernder Verbindungen im Molekularsiebmaterial polymerisiert wird.
Man erhält so erfindungsgemäß eine trägerfixierte makromolekulare Verbindung, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie kovalent an die Oberfläche eines Polymerisatkörpers gebunden ist, welcher einen Molekularsiebmaterialkörper durchdringt
Biologisch aktive makromolekulare Verbindungen im Sinne der Erfindung sind Proteine, insbesondere
so biologisch aktive Proteine, wie Enzyjr.8, Hormone und Antikörper, Nucleinsäuren und Peptide. Wesentlich ist, daß das Makromolekül so groß ist, daß es praktisch nicht in die Maschen des jeweils verwendeten Molekularsiebes eindringen kann. Die Mindestgröße der für die Erfindung in Betracht kommenden Makromoleküle ist daher abhängig von der »Maschenweite« des verwendeten Molekularsiebmaterials. Be* sonders bevorzugte Makromoleküle im Rahmen der Erfindung sind die biologisch aktiven Proteine, insbesondere die enzymatisch aktiven Proteine.
Als Verbindung B, die beim erfindungsgemäßen Verfahren mit der makromolekularen Verbindung A gekuppelt wird und die wenigstens eine zur Kupplung mit letzterer befähigte Funktion und wenigstens eine weitere zur Polymerisation befähigte Funktion aufweist, eignet sich eine große Vielzahl von Verbindungen in Abhängigkeit von den zur Kupplung an der makromolekularen Verbindung A zur Verfügung stehenden
Funktionen sowie der Art des herzustellenden Polymers oder Copolymers, Enthält das Makromolekül A beispielsweise Aminosäuren, handelt es sich also um ein Protein, Peptid oder eine solche enthaltende Verbindung, so kann die kupplungsfähige Funktion beispielsweise eine Oxirangruppe, Athylenimingruppe, Halogenidgruppe, Säurehalogenid-, Säureazid- und Säureanhydridgruppe sein. Weitere Beispiele sind die bisher zur Acylierung oder Alkylierung von Aminogruppen in der Peptid- und Proteinchemie verwendeten Gruppen, wie z.B. Aldehyde, Hydrazine, Oxazolone, gemischte Chlorameisensäureester, Ester von Carbonsäuren mit sekundären Phosphorsäureestern, sekundären Arsensäureestern, Hydroxyessigsäurenitril, N-Hydroxysuccinimid, p-Nitrophenol, Polyhalogenphenole, Dicyclohexylcarbodiimid und Phenyltriazin. Ferner gemischte Anhydride von Carbonsäuren mit Schwefelsäure, Leuch'sches Anhydrid, Leuch'sches Thioanhydrid, Carbonsäureimidazolide, CarbonsäuretoIylsulfonyl-N-methylamid, Säureamid einer Carbonsäure mit Phenyltriazin-N-oxid.
Bei anderen makromoiekuairen Verbindungen werden entsprechend ihren zur Kupplung geeigneten funktionellen Gruppen die hierfür bekannten und geeigneten Alkylierungs- und Acylierungsmittel eingesetzt Bei Nucleinsäuren lassen sich im wesentlichen die gleichen Kupplungsgruppen wie bei Proteinen und Peptiden anwenden. Besonders geeignet sind hier Säureamide, wie normales Carbonsäureamid, Alkylamide, Morpholide u. dgl. jo
Die mehrfunktionelle Verbindung B kann eine oder mehrere zur Kupplung mit der makromolekularen Verbindung A geeignete Gruppen aufweisen. Bevorzugt weist sie nur eine derartige Gruppe auf.
Außer der Kupplungsfunktion weist die Verbindung B mindestens eine weitere Funktion aul, welche an einer Polymerisationsreaktion teilhaben kann. Hierbei kann es sich sowohl um eine zur Additionspolymerisation als auch zur Kondensationspolymerisation geeignete Gruppe handeln. Additionspolymerisierbare Gruppen sind vor allem Kohlenstoff-Kohlenstoffdoppelbindungen, vorzugsweise in üblicher Weise aktivierte Doppelbindungen, welche in Homo- und Copolymerisationsreaktionen eintreten können, sowie Kohlenstoff-Sauerstoff-Doppelbindungen wie Carbonylgruppen u.dgl. Neben im eigentlichen Sinne polymerisierbaren Gruppen eignen sich auch die zur Polyaddition befähigten Gruppen wie OH-Gruppen, Isocyanatgruppen und Caprolactamgruppen sowie die zur Polykondensation befähigten Gruppen.
Bevorzugt werden zur Polymerisation und Copolymerisation im engeren Sinne geeignete Gruppen.
Beispiele für im Rahmen der Erfindung geeignete Verbindungen B sind
Acrylsäure-2,3-epoxypropylester,
Buten-23-oxyd,
l-Allyloxy-3-(N-äthyleniminpropanol-2)1
Maleinsäureanhydrid, Allylbromid, Acryloylchlorid, Mäleinsäüfeäzid, Methacrylsäure-(2r3-epoxypropylester), Maleinsäure-(2,3-epoxypropylmonoester), Fumarsäureepoxy-(2r3-epoxypropyldiester),
1 (AIIyloxy)-23-epoxybutan u. dgl.
Diese und weitere geeignete Verbindungen sind beispielsweise in der deutschen Patentschrift 21 28 743
60
65 beschrieben,
Im Rahmen der Erfindung verwendbare Molekularsiebmaterialien sind solche, deren Maschenweite zwar die makromolekulare Verbindung A ausschließt, die mehrfunktionelle Kupplungsverbindung B jedoch durchtreten läßt. Bevorzugt werden die gelartigen Molekularsiebe auf Basis vernetzter Polymerer wie Polyacrylamidgel, vernetzter Kohlehydrate wie vernetztes Dextran, Agar u.dgl. Besonders geeignete Molekularsiebmaterialien sind zusammengestellt in L. Fischer »An Introduktion to Gel Chromatography«, 1969, S, 182,188,194. Geeignete Molekularsiebmaterialien lassen sich daneben auch gewissermaßen nach Maß für die jeweils in Betracht gezogene molekulare Verbindung A und Kupplungsverbindung B herstellen, indem geeignete polymerisationsfähige Monomere wie beispielsweise Acrylamid, Methacrylamid, Acryl- und Methacrylsäureester, Styrol u.dgl. mit einer entsprechenden Menge an Vernetzersubstanz wie z. B. Ν,Ν'-MethyIen-bis-acrylamid, Tetraäthylenglycoldimethacrylat oder Äthylendiacrylat, Divinylbenzol u. dgl. polymerisiert werden. Die »Siebweite« wird durch die Vernetzermenge reguliert, wobei mit steigender Vernetzermenge die Porenweite des Siebs abnimmt. Bevorzugt werden erfindungsgemäß Molekularsiebmaterialien auf Basis vernetzter Dextrane und Acryl- bzw. Methacrylsäurederivate, insbesondere Amide und Ester.
Das Molekularsiebmaterial muß beim Verfahren der Erfindung in ganz oder teilweise entquollenem Zustand vorliegen. Dies ist erforderlich, da die Polymerisation oder Copolymerisation der polymerisationsfähigen Funktion der Kupplungsverbindung B innerhalb des Molekularsiebes ablaufen soll und daher die Quellung des Molekularsiebmaterials derart vorgenommen wird, daß das Polymerisationssystem durch das quellende Molekularsiebmaterial aufgesaugt wird und sich im wesentlichen im Inneren des Molekularsiebmaterials befindet. Beim Quellen des Molekularsiebes wird hierbei die Lösung, in der die Kupplung der makromolekularen Verbindung A mit der Verbindung B erfolgt ist, aufgesogen, so daß im Prinzip nur der makromolekulare Anteil des Kupplungsproduktes AB auf der Oberfläche des Molekularsiebkörpers zurückbleibt Vorzugsweise wird das Volumen der Reaktionslösung so gewählt, daß es nicht zum vollständigen Ausquellen des Molekularsiebes ausreicht, da dann sichergestellt ist, daß die anschließende Polymerisation ausschließlich innerhalb des Molekularsiebkörpers erfolgt
Durch geeignete Abstimmung des Molekularsiebmaterials auf die Kupplungsverbindung B und das übrige polymerisationsfähige System sowie gegebenenfalls das Lösungsmittel, falls ein solches verwendet wird, kann je nach Wunsch eine vollständige Füllung und Durchdringung des Molekularsiebkörpers mit dem Polymerisat oder eine mehr oberflächliche Durchdringung unter Aufrechterhaltung eines gewissen Hohlraumvolumens innerhalb der Molekularsiebkörper bewirkt werden.
Das polymerisationsfähige System kann je nach den insbesondere im Hinblick auf die Aufrechterhaltung der an der makromolekularen Verbindung A erwünschten Eigenschaften, beispielsweise der enzymatischen Aktivität, zulässigen Polymerisationsbedingungen insbesondere hinsichtlich der Polymerisationstemperatur und den Polymerisationseigenschaften der polymerisationsfähigen Funktion der Verbindung B gewählt werden. Handelt es sich bei der makromoiekuairen Verbindung A um eine relativ temperaturstabile Nucleinsäure, so
kann eine unter Erhitzen zur Polykondensation befähigte Verbindung ß als einziger Bestandteil des Polymerisationssystems ausreichen. Ist die makromolekulare Verbindung A ein temperaturempfindliches Enzym, so arbeitet man zweckmäßig unter Copolymer!- sationsbedingungen unter Verwendung eines geeigneten Comonomeren wie z, B, Acrylamid in Gegenwart von Tieftemperaturpolymerisationskatalysatoren, beispielsweise Peroxyden und gegebenenfalls Beschleunigern und Vernetzungsmitteln. Als Initiatoren sind die üblicherweise in der Polymerchemie gebräuchlichen Initiatoren und Katalysatoren verwendbar, soweit sie die Aktivität der makromolekularen Verbindung A nicht nachteilig beeinflussen. Als Initiatoren bzw. Katalysatoren kommen bei Verwendung von olefinisch ungesättigten Monomeren oder Comonomeren z. B. anorganische oder organische Peroxyd, Azoverbindungen u. dgl. in Betracht Zusätzlich können Reaktionsbeschleuniger wie Amine u.dgl. verwendet werden. Bei der Verwendung von Acrylsäure- oder Methacrylsäurederivaten als Comonomere bzw. als polymerisationsfähige Funktion der Verbindung B hat sich die Verwendung einer Initiatorkombinatiorr aus einem Peroxydisulfat und einem Amin wie Dimethylaminopropionitril besonders bewährt
Die Verwendung von vernetzungsfähigen Monomeren im Polymerisationssystem ist grundsätzlich nicht notwendig, da durch die Polymerisation innerhalb des Molekularsiebnetzes stets die Eigenschaften eines vernetzten Polymers erhalten werden. Es kann jedoch zur Modifikation der physikalischen Eigenschaften trotzdem zweckmäßig sein, einen Vernetzer, d. h. eine mehr als eine polymerisationsfähige Gruppe tragende Verbindung, wie sie beispielsweise oben aufgeführt wurde, zu verwenden.
Die Erfindung gestattet es, auch besonders empfindliche Makromoleküle auf schonendste Weise an unlöslich Träger unter maximaler Aktivitätsausbeute zu fixieren. Ein besonderer Vorzug der Erfindung ist hierbei darin zu sehen, daß die Fixierung hierbei in einem gelösten System erfolgt mit dementsprechend fast quantitativer Kupplung der makromolekularen Verbindung A mit der Kupplungsverbindung B während des Kupplungs- oder Vorinkubationsschrittes. Zugleich aber nützt die Erfindung in vollem Umfange die Vorteile einer reinen Oberflächenfixierung der makromolekularen Verbindung A aus, da diese selektiv an der Oberfläche der Polymerisationskörper, die mit der Oberfläche des Molekularsiebkörpers zusammenfällt, angereichert und fixiert wird. Hierbei gelingt es, die Besetzung der Polymerkörperoberfiäche mit den Molekülen der makromolekularen Verbindung A weit dicher zu erhaltc/i, als bei bekannten Fixierungsmethoden. Dementsprechend weisen erfindungsgemäße trägerfixierte makromolekulare Verbindungen eine überlegene Oberflächenaktivität auf.
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.
B e i s ρ i e 1 1
Ausgangsmaterial
Molekularsiebmaterial auf Basis von
vernetzten! Dextran
Glucose-Oxydase (220 U/mg) μ
Acrylamid
N.N'-Methylen-bis-acrylamid
Acrylsäurechle/id
Methylenchlorid Ammoniumperoxidisulfat N-Dimethylaminopropionitril
Methode
100 mg Glucoseoxydase werden in 5 ml 0,5 M Triäthanolamin-Puffer, pH=8,0, gelöst und auf 10° C in Stickstoffatmosphäre vorgekühlt Zu diesem Reaktions ansatz werden 0,03 ml Acrylsäurechlorid in 2 ml Methylenchlorid zugegeben und 30 min gerührt In dieser mit Acrylsäurechlorid vorinkubierten Proteinlösung werden 0,8 g Acrylamid und 0,05 g N,N'-Methylenbis-acrylamid gelöst Dann wird mit 0,05 ml 5%iger N-Dimethylamino-Propionitril-Lösung sowie 0,05 ml 5%iger Ammonium-Peroxydisulfat-Lösung die Polymerisation gestartet Sofort nach dieser Zugabe werden 5 g Molekularsieb (Sephadex G-25, medium) dem Reaktionsansatz zugesetzt und in Stickstoffatmosphäre gerührt
Das Volumen der Reaktionslösung ist so berechnet, daß es nicht zum vollständigen Ausquellen des Molekularsiebes ausreicht, so daß kein einheitlicher Polymerisationsblock gebildet wird, sondern die Polymerisation ausschließlich in den Molekularsiebkugeln erfolgt Die erhaltenen Partikel werden in 500 ml dest H2O suspendiert mit einem Rührer kräftig aufgeschlämmt abgenutscht und lyophilisiert
Ausbeute: ca. 5 g (bezogen auf Lyophilisat); spezifische Aktivität 160 U/g Lyophilisat
Vergleichsbeispiel
Ausgangsmaterial
Sephadex G-25, medium
Glucoseoxydase (220 U/mg)
Bromcyan
Methode
5 g Sephadex G-25, medium, wurde mit tS ml H2O vorgequollen und mit 100 ml einer 2,5%igen Bromcyan-Lösung versetzt Der pH-Wert wurde sofort auf 11 eingestellt und 6 min durch Zudosieren von 2 N Natronlauge bei diesem Wert konstant gehalten. Anschließend wurde mit 0,1 M NatriumJiydrogencarbonatlösung gewaschen. Das Bromcyan-aktivierte Sephadex wurde mit 200 mg Glucoseoxydase, gelost in 10 ml 0,5 M Triäthanolamin-Puffer, pH=8,0, versetzt Der Reaktionsansatz wurde 18 Std. bei 4° C belassen. Anschließend wird mit 0,2 M Phosphat-Puffer, pH = 7,5, gewaschen. Die spezifische Aktivität des so erhaltenen trägergebundenen Enzyms beträgt 38 U/g.
Die Fixierungsreaktion von Proteinen durch Bromcyanaktivierung vernetzter Polysaccaride wird als die Methode höchster Aktivitätsausbeute angesehen. Der Vergleich der Beispiele 1 und 2 zeigt daß trotz doppelt so hohem Einsatz an Enzym, bezoger, auf den Träger, nach dem bekannten Verfahren ein Produkt mit einer Aktivität erhalten wird, die unter 25% der erfindungsgemäß erzielten Aktivität liegt Bezogen auf eingesetztes Enzym ist dl-a Aktivitätsausbeute bei der Erfindung 8fach höher.
Beispiel 2
Ausgangsmaterial
Molekulaniicbmatcrial auf Basis von
vernetztem Polyacrylamid
Glucose-Oxydase (220 U/mg)
Acrylamid
N.N'-Methylen-bis-acrylamid
Acrylsäurechlorid
Methylenchlorid
Ammoniumperoxidisulfat
N-Dimethylamino-Propionitril
Methode
Die Vorinkubation der Enzymlösung erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben.
Sofort nach Zugabe der Initiatorlösungen werden 5 g Molekularsieb (Biogel P6 50-100 mesh) dem Reaktionszusatz zugesetzt und in Stickstoff-Atmosphäre gerührt. Die Quellung des Molekualrsiebs erfolgi. erst nach einigen Sekunden, so daß eine gute Durchmischung erreicht wird.
Das Volumen der Reaktionslösung ist so berechnet, daß es nicht zum vollständigen Ausquellen des Molekularsiebs ausreicht, so daß kein einheitlicher Polymerisationsblock gebildet wird, sondern die Polymerisation ausschließlich in den Molekularsiebkugeln erfolgt. Die erhaltenen Partikel werden in 500 ml dest. Wasser suspendiert, mit einem Rührer kräftig aufgeschlämmt, und anschließend durch zwei Normsiebe von 0,4 und 0,2 mm Maschenweite fraktioniert. Die Partikel mit der Körnung 0,2-0,4 mm werden in eine Säule mit einem Durchmesser von 20 mm eingefüllt und mit 4 I 0,2 M Phosphatpuffer pH = 7,5 eluiert.
Ausbeute: Ca. 5 g (bezogen auf Trockenmasse) — spezifische Aktivität 160 U/g (bezogen auf Trockenmasse).
Beispiel 3
Fixierung von Polyadenylsäure (Poly A)
Ausgangsmaterial
■; Poly A
Triäthanolaminpuffer(0,5M,pH=8,0)
Acryloylchlorid
Äther
Acrylamid
ίο Ν,Ν'-bis-Acrylamid
Dimethylaminopropionitril (5%)
Ammoniumperoxydisulfat (5%)
Sephadex G-25, medium
Methode
27,4 mg Poly A werden in 2 ml Triäthanolaminpuffer gelöst und auf IO°C abgekühlt. Dieser Reaktionslösung werden in Stickstoffatmosphäre 0,01 ml Acryloylchlorid, gelöst in I ml Äther, zugegeben und 30 Minuten gerührt.
2n Anschließend wird mit 0,3 g Acrylamid und U1^! g Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid sowie 2 g Sephadex G-25 versetzt und die Polymerisation der Suspension mit 0,02 ml Dimethylaminopropionitril und 0,02 ml Ammoniumperoxydisulfat gestartet. Das erhaltene körnige
>=, Produkt wird nach etwa 8 Stunden in eine Säule überführt und mit 2,5 I 0,5 M Kochsalzlösung gewaschen.
Zum Nachweis der Oberflächenfixierung des an Sephadex gebundenen Poly A wird in 0,3 N Kalilauge
in suspendiert und über Nacht bei 370C hydrolysiert.
Die nach Hydrolyse erhaltene Nucleinsäurekonzentration beträgt, berechnet auf das eingesetzte Poly A, etwa 10%.

Claims (3)

Patentansprüche;
1. Verfahren zur Herstellung einer an die Oberfläche eines Trägers kovalent gebundenen biologisch aktiven, makromolekularen Verbindung, dadurch gekennzeichnet, daß eine biologisch aktive, makromolekulare Verbindung A zuerst mit einer Verbindung B umgesetzt wird, die wenigstens eine zur Kupplung mit der makromolekularen Verbindung A befähigte Funktion und wenigstens eine weitere, zur Polymerisation befähigte Funktion aufweist, dann ein Molekularsiebmaterial eines die biologisch aktive makromolekulare Verbindung A ausschließenden Vernetzungsgrades in entquollenem Zustand zugesetzt und die polymerisationsfähige Gruppe des Kupplungsprodukts AB allein oder in Gegenwart weiterer copolymerisierbarer oder/und polymerisationsfördernder Verbindungen im Molekularsiebmaterial polymerisiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Verbindung B verwendet wird, welche als kupplungsfähige Funktion eine Alkylierungs- oder Acylierungsgruppe und als polymerisationsfähige Funktion eine CC- oder CO-Doppelbindung trägt.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das entquollene Molekularsiebmaterial in einer Menge zugesetzt wird, die durch die polymerisationsfähige Lösung des Kupplungsproduktes AB nicht vollständig gequollen werden kann.
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