DE2260185B2 - Trägergebundenes Protein und Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents

Trägergebundenes Protein und Verfahren zu seiner Herstellung

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DE2260185B2 DE2260185A DE2260185A DE2260185B2 DE 2260185 B2 DE2260185 B2 DE 2260185B2 DE 2260185 A DE2260185 A DE 2260185A DE 2260185 A DE2260185 A DE 2260185A DE 2260185 B2 DE2260185 B2 DE 2260185B2
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    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
    • G01N33/545—Synthetic resin

Description

R-C
worin X einer der folgenden Formeln entspricht:
Im Hauptpatent wird ein Verfahren zur Herstellung von trägergebundenen aktiven Proteinen offenbart und beansprucht, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Protein in wäßriger Lösung mit einer Verbindung umgesetzt wird, welche mindestens eine Epoxygruppe und mindestens eine weitere, zur Herstellung einer Bindung mit einem Träger geeignete funktionelle Gruppe aufweist, und anschließend diese weitere funktionelle Gruppe mit einer Trägersubstanz verknüpft wird.
Die Erfindung des Hauptpatentes beruht also auf dem Prinzip der Vorfixierung des Proteins mit einer wenigstens difunktionellen Verbindung in wäßriger Lösung, wobei die eine Funktion eine Bindung mit dem Protein, insbesondere mit einer Aminogruppe im Protein, eingeht und nach der Verknüpfung der beiden Substanzen anschließend eine Bindung mit der zweiten Funktion des ursprünglichen Monomeren an einen Träger hergestellt wird.
Nunmehr wurde gefunden, daß die Durchführbarkeit des Verfahrens des Hauptpatentes nicht auf solche
W) — N = NH
—O—C—O —R1
Il ο
O — R2
—ο—ρ
Il \
O O—R2
Il
—O—S-OLi
O
3 R1
ο—
/ 		R1
Ο—As \
ο— 		OC)H
S-CH J-C ,-CN
Ο—CH O
Il
Il
:χ
Ο —ΝΧ
)
C)
— Ο—Ν
H'-Ri
I "
-C-Ri
C C)
— Ο·-Ο —Ν'
R' NO,
Cl
Cl -N CH
CH CH
NH
— Ο—C
II)
18 —Ο—N
ν'
Il
N-
In den obigen Formeln 1 bis 18 bedeutet R1 eine Alkylgruppe, vorzugsweise eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, R2 eine Aryl-, Aralkyl- oder Halogengruppe. Phenyl- und Benzylgruppen werden unter den Aryl- und Aralkylgruppen bevorzugt. RJ hat dieselbe Bedeutung wie R' und kann zusätzlich auch ein Wasserstoffatom sein. Andere Beispiele für zur Kupplung mit dem Protein geeigneten Acylierungs- bzw. Alkylierungsmitteln entsprechen den nachstehenden Formeln 19 und 20:
19 R-CH-C
NH-C
20 R -CH C
NH C
Il ο
In den obigen Formeln bedeutet R den Rest der Kupplungsverbindung, welche die zur Bindung mit einem Träger geeignete funktioneile Gruppe enthält.
Als weitere zur Bildung mit einem Träger geeignete funktionell Gruppe kommen vorzugsweise solche Gruppen in Frage, welche zur Addition oder Kondensation mit der eigentlichen Trägersubstanz geeignet sind. Soweit Kupplungsverbindungen mit einer kondensationsfähigen Gruppe verwendet werden, ist darauf zu achten, daß bei der Kondensation keine Substanzen abgespalten werden, welche die Aktivität des gebundenen Proteins nachteilig beeinflussen. Die Feststellung, ob bei einer bestiminten kondensationsfähigen Gruppe die Abspaltung zu einem Produkt führt, weiches die Aktivität des eingesetzten Enzyms beeinträchtigt, läßt sich jeweils anhand des bestimmten zu bindenden Proteins durch wenige einfache Vorversuche leicht bestimmen. Allgemeine Aussagen über die Eignung bestimmter Gruppen lassen sich nicht aufstellen, da die verschiedenen aktiven Proteine höchst unterschiedliche Empfindlichkeit aufweisen. Beispielsweise wurde gefunden, daß Abspaltung von Halogeniden bei vielen empfindlichen Proteinen zu einem Aktivitätsverlust führt, während andere aktive Proteine hierdurch nicht nachteilig beeinflußt werden.
Ganz besonders schonend kann die Verknüpfung des Zwischenproduktes mit der Trägersubstanz durch Einpolymerisation in die Trägersubstanz erfolgen. Besonders bevorzugt wird daher im Rahmen des Verfahrens der Erfindung die Verwendung einer Kupplungsverbindung, welche wenigstens eine copo-
lymerisationsfähige Doppelbindung, insbesondere Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung als weitere, zur Herstellung einer Bindung mit einem Träger geeignete funktionell Gruppe enthält.
Als Trägersubstanzen lasse1· sich im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens alle solchen wasserunlöslichen festen Substanzen verwenden, welche über die weitere funktioneile Gruppe der Kupplungsverbindung unter schonenden Bedingungen in wäßriger Lösung mit dieser verknüpft werden können. Vorzugsweise werden Trägersubstanzen verwendet, welche hydrophil, leicht quellbar, weitgehend ladungsfrei sowie stabil gegenüber Mikroorganismen sind. Die Trägersubstanz kann als solche in die wäßrige Lösung zur Herstellung der Bindung mit dem Zwischenprodukt eingebracht werden, vorzugsweise wird die Trägersubstanz jedoch in der wäßrigen Lösung selbst durch Polymerisation wasserlöslicher Monomerer hergestellt. Bei dieser bevorzugten Ausführungsform des erfindungjgemäßen Verfahrens kann die Umsetzung des Proteins m/t der Kupplungsverbindung entweder bereits in Anwesenheit des oder der polyrnerisationsfähigen Monomeren erfolgen, wobei anschließend die Polymerisation unter Einpolymerisation des Kupplungsverbindungs-Protein-Zwischenproduktes vorgenommen wird, oder das polymerisationsfähige Monomere oder die Monomerenmischung wird der Lösung erst nach der Umsetzung zwischen Protein und Kupplungsverbindung zugesetzt und dann die Polymerisation ausgelöst.
Als Monomere kommen im Rahmen dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens solche wasserlöslichen Verbindungen in Frage, welche zur Polyaddition oder Polykondensation geeignet sind. Bevorzugt werden polyadditionsfähige Monomere, insbesondere solche Monomere, welche wenigstens eine olefinische Unsättigung enthalten. In diesem Falle stellt die weitere funktionell Gruppe der Kupplungsverbindung ebenfalls vorzugsweise eine copolymerisationsfähige Doppelbindung dar.
Typische Beispiele für erfindungsgemäß bevorzugte Kupplungsverbindungen sind Maleinsäureanhydrid und dessen Homologe, in denen die Wasserstoffatome der C-C-Doppelbindung durch Alkylgruppen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ersetzt sind, Allylhalogenide, insbesondere Allylbromid und dessen Homologe, Acrylsäurechlorid und dessen Homologe, in denen die H-Atome durch ein oder mehrere niedrig-Alkylgruppen ersetzt sind, Maleinsäure oder Fumarsäurechlorid und deren Homologe entsprechend der obigen Definition bei Maleinsäureanhydrid, Maleinsäureazid, Äthyleniminverbindungen wie l-Allyloxy-3-(N-äthylenimin)-propanol-(2) und ähnliche.
Das bei der bevorzugten Ausführingsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zugesetzte Monomer muß wie bereits erwähnt wasserlöslich sein und gleichzeitig eine polymerisationsfähige olefinische Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung enthalten. Vorzugsweise werden auch hier Verbindungen mit dem Michael-System, also mit einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung in Nachbarschaft zu einer Kohlenstoff-Sauerstoff-Doppelbindung verwendet. Besonders bevorzugt werden als Monomere die wasserlöslichen Derivate der Acrylsäure oder Methacrylsäure, wie beispielsweise die Amide, Nitrile und Ester dieser Verbindungen. Ganz besonders gute Ergebnisse wurden unter Verwendung von Acrylamid erzielt. Die Verbindungen können auch durch Alkylreste substituiert sein, solange hierdurch die Wasserlöslichkeit der Verbindung nicht zu sehr herabgedrückt wird. Derartige Verbindungen mit verringerter Wasserlöslichkeit sind jedoch von Vorteil, falls später das trägergebundene Enzym im nicht rein wäßrigen System eingesetzt werden soll, beispielsweise in einem wäßrig-organischen Medium. Auch die entsprechenden Derivate der Malein- oder Fumarsäure sind gut geeignet.
Alternativ können auch nicht-wasserlösliche Monomere verwendet werden. In diesem Falle wird die
κι Polymerisation nicht in Lösung, sondern in Suspension durchgeführt. Letztere Methode ist von Vorteil, falls eine feinteilige perlförmige Matrix ohne Quellfähigkeit in wäßrigen Systemen gewünscht wird. Die nach bekannten Methoden der Suspensionspolymerisation
ü (Perlpolymerisation) erhaltenen Polymerisatkügelchen enthalten dann an ihre Oberfläche anpolymerisiert das Protein-Kupplungs verbindung-Anlagerungsprodukt.
Es kann ein einziges polymerisationsfähiges Monomer oder eine Mischung von Monomeren verwendet
.'α werden. Es ist auch möglich, ein noch ungesättigte Gruppen enthaltendes Vorpolymerisat zusammen mit einem Monomer einzusetzen.
Je nach der gewünschten Konsistenz des Endproduktes werden dem Monomer noch Vernetzerverbindun-
2") gen zugesetzt, die mehr als eine polymerisationsfähige Gruppe enthalten. Beispiele für derartige Vernetzer sind N.N'-Methylen-bis-acrylamid und Äthylendiacrylat. Diese werden bevorzugt beim Arbeiten in wäßriger Lösung. Falls eine Polymerisation in heterogener Phase,
üi also eine Suspensionspolymerisation durchgeführt wird, können auch wasserunlösliche Vernetzer wie z. B. Divinylbenzol und Äthylen-di-methacrylat verwendet werden. Zahlreiche andere Vernetzer sind dem Fachmann bekannt und die geeignete Auswahl im
Ji jeweiligen Falle zu treffen, liegt im Rahmen fachmännischen Handelns. Es ist auch möglich, nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene trägergebundene Proteine, deren Träger nicht vernetzt ist, noch nachträglich zu vernetzen.
4(1 Wird kein Vernetzer verwendet, so erhält man Trägermaterialien, welche löslich oder thermoplastisch sind. Eine Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens in dieser Form führt zu spinnfähigen oder extrudierbaren Lösungen, aus denen die trägergebunde-
•t"> nen Proteine z. B. Fadenform oder in Form von Folien nach an sich bekannten Methoden erhalten werden können. Derartige mit aktiven Proteinen kovalent gebundene Fäden oder Folien können nach den Methoden der Kunststofftechnik verstreckt, gesponnen
κι und zu sonstigen Produkten verarbeitet werden, welche die aktiven Proteine gebunden enthalten und für Zwecke eingesetzt werden können, in denen diese Formen besondere Vorteile bieten, beispielsweise zur Herstellung von enzymatisch aktiven Sieben, Geweben,
Vi einpflanzbaren Fäden u. dgl.
Zum Verspinnen aus wäßriger Lösung kann beispielsweise das Vakuum-Spinnverfahren angewendet werden, bei dem die Lösung durch eine Spinndüse in ein Vakuum ausgepreßt wird. Dies kann unter den Bedingungen
mi einer Lyophilisierung erfolgen, die von den meisten aktiven Proteinen ohne Aktivitätsverlust ertragen wird. Für die Umsetzung von Protein und Kupplungsverbindungen gelten die hierzu im Hauptpatent gemachten Ausführungen in gleicher Weise. Die Umsetzung kann
t>> wie dort erwähnt, auch bereits in Gegenwart des Trägers bzw. der Ausgangsprodukte für die Herstellung des Trägers durchgeführt werden, soweit sichergestellt ist, daß zuerst die Umsetzung von Protein und
Kupplungsverbindung ablaufen kann, ehe die Bindung an den Träger erfolgt. Wird in Gegenwart der Ausgangsprodukte für den Träger gearbeitet, so läßt sich dies beispielsweise bequem dadurch erreichen, daß der Initiator für die Polymerisationsreaktion unter Bildung des Trägers erst zugesetzt wird, wenn Protein und Kupplungsverbindung miteinander umgesetzt sind.
Die Erfindung gestattet auch Erzielung der gleichen Vorteile wie bereits im Stammpatent ausgeführt. Insbesondere wird jedoch durch die wesentlich verbreiterte Skala der anwendbaren Kupplungsverbindungen auch die Anwendungsmöglichkeit des Verfahrens insgesamt erweitert. Insbesondere wenn anorganische Träger wie Glas und Oxyde bzw. Halogenide der Nebengruppenelemente als Träger verwendet werden, lassen sich nunmehr für fast jeden Fall geeignete Kupplungsverbindungen, die sowohl mit dem Protein als auch mit dem Träger zu reagieren vermögen, anhand der bekannten Reaktivitäten der funktioneilen Gruppen heraussuchen.
Von den übrigen Vorteilen seien vor allem verbesserte Ausbeute, Beseitigung von restlichen reaktiven Gruppen am Träger, die sich beim Fixierungsverfahren über aktivierte Träger nicht ausschließen lassen, Fehlen der unerwünschten lonenaustauschereigenschaften und damit auch von Quellung oder Schrumpfung bei erfindungsgemäß gebundenen Proteinen, Vermeidung von heteropolaren Bindungen des Proteins am Träger, Vermeidung unerwünschter Adsorptionseigenschaften sowohl hinsichtlich Substrat als auch Reaktionsprodukt, keine unerwünschte Verschiebung des pH-Optimums genannt. Verbesserte Ausbeuten werden insbesondere bei der Fixierung der Proteine mit höheren Molekulargewichten erzielt. Beispielsweise ergibt eine Einschlußpolymerisation von Katalase eine maximale Fixierung von 10% in Acrylamidgel, bei erfindungsgemäßer Arbeitsweise, beispielsweise mit Acryloylchlorid als Kupplungsverbindung, 75% Ausbeute. Weiter besteht ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens darin, daß auch aus Untereinheiten bestehende Proteine, die aufgrund ihrer Empfindlichkeit nach bekannten Methoden nicht oder nur schwierig am Träger gebunden werden können, mit guter Ausbeute und hoher Stabilität fixiert werden können. Überraschenderweise hat sich außerdem gezeigt, daß erfindungsgemäß fixierte Enzyme stabiler sind als in ungebundener löslicher Form. Beispielsweise wurde erfindungsgemäß trägerfixierte Urease mit einem Molekulargewicht von 480 000 noch bei 700C als voll aktiv gefunden, während sie bei gleicher Temperatur in ungebundenem Zustand innerhalb kürzester Zeit irreversibel inaktiviert wird.
Ein weiterer wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, daß sich gleichzeitig mehrere Enzyme, beispielsweise Glucoseoxydase und Katalase, auch bei unterschiedlicher Reaktivität und unterschiedlichem Molekulargewicht in statistischer Verteilung an einen Träger fixieren oder in denselben einschließen lassen. Dies gelingt auch dann, wenn die Proteine unterschiedliche isoelektrische Punkte aufweisen. In besonders schwierigen Fällen ist es möglich, die verschiedenen Proteine getrennt mit einer oder verschiedenen Kupplungsvcrbindungen umzusetzen und dann gemeinsam am Träger zu fixieren.
Das Verfahren der Erfindung eignet sich natürlich auch zur Fixierung von Proteinen an geformte Trägerkörper, beispielsweise Folien, Schläuche, Stangen, Plumper u. dgl.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
Beispiel 1
100 mg Glucoseoxydase (GOD; 220 U/mg) werden in 10 ml 1 M Triäthanolaminpuffer pH 8,0 bei 10° C unter Stickstoffatmosphäre gelöst. Dann werden 0,03 ml Acryloylchlorid in 3 ml Äther zugegeben und die
iü Mischung 30 Minuten gerührt. Anschließend wird über Nacht gegen 21 0,01 M Triäthanolaminpuffer pH 8,0 dialysiert und dann der Niederschlag abzentrifugiert und verworfen. Die enzymatische Aktivität beträgt 16 000 U.
Der so erhaltenen Lösung werden 0,4 ml 5%iges Dimethylaminopropionitril und 0,4 ml 5%iges Ammoniumperoxydisulfat bei 5 bis 10cC zugesetzt (enzymatische Aktivität 14 500). Danach werden 3 g Acrylamid, 0,015 g Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid in 9 ml Wasser
2(i unter Stickstoffatomosphäre zugegeben. Die sofort einsetzende Polymerisation führt zu einem gelartigen Erstarren der Masse. Das erhaltene Produkt wird durch ein 0,4 mm Metallsieb zur Granulierung gedrückt und dann mit 2 1 0,2 M Phosphatpuffer pH 7,5 gewaschen.
Die mit dem Waschwasser abgetrennte enzymatische Aktivität beträgt 600 U. Das Polymerisat wird lyophilisiert und ergibt 3 g Trockenprodukt mit einer enzymatischen Aktivität von 1500 U.
Das Verfahren wurde wiederholt ohne Zusatz von Acryloylchlorid. Die Einschlußpolymerisation führt zu 3 g eines Produktes mit einer Gesamtaktivität von 330U.
Beispiel 2
300 mg Trypsin (1500) werden unter Stickstoffatmosphäre in 10 ml 0,5 M Phosphatpuffer pH 8,0 bei 10°C gelöst. Die erhaltene Lösung wird mit 0,1 ml Acryloylchlorid in 10 ml Äther versetzt und 30 Minuten gerührt.
ίο Dann werden 0,4 ml 5%iges Dimethylaminopropionitril und 0,4 ml 5%iges Ainmoniumperoxydisulfat zugesetzt und 30 Minuten gerührt. Anschließend werden 3 g Acrylamid, 0,015 g Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid in 9 ml Wasser unter Stickstoffatmosphäre bei einer Tempera-
•r> tür von 5 bis 10° zugesetzt und diese Bedingungen aufrechterhalten, bis sich eine gelartige feste Masse gebildet hat. Letztere wird durch ein 0,4 mm Metallsieb granuliert und mit 31 0,2 M Phosphatpuffer pH 7,5 gewaschen. Im Waschwasser finden sich 23 U. Das
so gewaschene Produkt wird gefriergetrocknet. Man erhält 3 g Lyophilisat mit einer spezifischen Aktivität von 12,9 U/g.
Eine Wiederholung des Verfahrens unter gleichen Bedingungen, jedoch ohne Zusatz von Acryloylchlorid ergab eine spezifische Aktivität von 0,5 U/g Lyophilisat.
Beispiele 3bis 12
Wie in Beispiel 1 beschrieben wurde unter Verwen-
feo dung der Kupplungsverbindungen Acryloylchlorid, Maleinsäureazid, Maleinsäureanhydrid, Allylbromid und 1 -Allyloxy-3-(N-äthylenimin)-propanol-(2) die Fixierung der Enzyme Glucoseoxydase, Trypsin, Chymotrypsin, Uricase und Hexokinase durchgeführt. In gleicher
tir. Weise wurde das Verfahren ohne Verwendung der jeweiligen Kupplungsverbindungen wiederholt. Die nachstehende Tabelle 1 zeigt die in diesen Beispielen und den Vergleichsversuchen erhaltenen Ergebnisse.
Beispiel Nr.
Aktivitätsangabe: U/g Lyophilisat
upplu
SC U
SC SC U-O
Jr
.S S
S-U
ydrid
ο S υ—υ ·§
■α
M O
U=O
Il u
U=O
Glucoseoxydase
Trypsin
Chymotrypsin
Uricase
Hiixokinase
mit ohne
mit ohne
mit ohne
mit ohne
mit ohne
360 110
3,0 0,1
260
110
5,5 3,5
40 20
Beispiel 13
240 110
7,8 0,5
0,5 0,1
Es wird wie in Beispiel 1 beschrieben vorgegangen unter Verwendung von Hexokinase als Protein. Das Polymerisationssystem bestand aus Stärkeallyläther, Acrylamid und Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid. Das erhaltene Produkt enthielt 120 U/g Lyophilisat.

Claims (6)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung von trägergebundenen biologisch aktiven Proteinen durch Umsetzung eines biologisch aktiven Proteins in wäßriger Lösung mit einer Verbindung, welche mindestens eine Epoxygruppe und mindestens eine weitere, zur Herstellung einer Bindung mit einem Träger geeignete funktioneile Gruppe aufweist und an- κι schließend diese weitere funktioneile Gruppe mit einer Trägersubstanz verknüpft wird nach Hauptpatent 21 28 743, dadurch gekennzeichnet, daß zur Umsetzung eine Verbindung verwendet wird, welche mindestens eine zur Herstellung einer i> Bindung mit einem Träger geeignete funktioneile Gruppe und wenigstens eine in wäßriger Lösung proteinacylierende oder -alkylierende Gruppe enthält.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- 2» zeichnet, daß als zur Umsetzung mit einem Träger geeignete funktioneile Gruppe eine Äthylenimingruppe, durch Unsättigung aktivierte Halogenidgruppe, Säurehalogenidgruppe, Azidgruppe oder Säureanhydridgruppe verwendet wird. 2r>
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägersubstanz in der gleichen wäßrigen Lösung durch Polymerisation von Monomeren hergestellt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekenn- so zeichnet, daß das polymerisationsfähige Monomere bzw. die Monomerenmischung der Lösung nach der Umsetzung des Proteins mit der Kupplungsverbindung zugesetzt und polymerisiert wird.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch r> gekennzeichnet, daß als Monomer ein Acrylsäure-, Methacrylsäure- oder Vinylalkoholderivat oder eine Mischung davon verwendet wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als weite- -to re, zur Herstellung einer Bindung mit einem Träger geeignete funktioneile Gruppe eine copolymerisationsfähige Doppelbindung verwendet wird.
Verbindungen beschränkt ist, welche eine Epoxygruppe zur Kupplung mit dem Protein enthalten, sondern daß hierfür alle Verbindungen geeignet sind, welche eine zur Kupplung mit einem Protein in wäßriger Lösung geeignete Gruppe enthalten und eine Epoxygruppe nur ein Sonderfall dieses allgemeinen Prinzips darstellt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von trägergebundenen biologisch aktiven Proteinen durch Umsetzung eines biologisch akviven Proteins in wäßriger Lösung mit einer Verbindung, welche mindestens eine Epoxygruppe und mindestens eine weitere, zur Herstellung einer Bindung mit einem Träger geeignete funktiondle Gruppe aufweist und anschließend diese weitere funktionell Gruppe mit einer Trägersubstanz verknüpft wird nach Hauptpatent 21 28 743, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß zur Umsetzung eine Verbindung verwendet wird, welche mindestens eine zur Herstellung einer Bindung mit einem Träger geeignete funktionell Gruppe und wenigstens eine in wäßriger Lösung proteinacylierende oder -alkylierende Gruppe enthält.
Die Vorteile des Verfahrens des Hauptpatentes bleiben bei der erfindungsgemäßen Weiterbildung in vollem Umfang erhalten. Als in wäßriger Lösung proteinacylierende oder -alkylierende Gruppen innerhalb der mit dem Protein zur Umsetzung gebrachten und im folgenden als »Kupplungsverbindung« bezeichnete Verbindung eignen sich zahlreiche Gruppierungen, wie sie insbesondere aus der Peptidchemie bereits bekannt sind. Bevorzugte acylierende oder alkylierende Gruppen im Sinne der Erfindung sind Äthylenimingruppen, durch Unsättigung aktivierte Halogenidgruppen, Säurehalogenidgruppen, Azidgruppen, Säureanhydridgruppen, Aldehydgruppen, Oxazolongruppen sowie Verbindungen der allgemeinen Formel
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