DE2128743C3 - Verfahren zur Herstellung von trägergebundenen Proteins - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von trägergebundenen ProteinsInfo
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- DE2128743C3 DE2128743C3 DE19712128743 DE2128743A DE2128743C3 DE 2128743 C3 DE2128743 C3 DE 2128743C3 DE 19712128743 DE19712128743 DE 19712128743 DE 2128743 A DE2128743 A DE 2128743A DE 2128743 C3 DE2128743 C3 DE 2128743C3
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Description
R,-(CH2)„-CH CHR2
40
in der Ri einen ein- oder mehrfach ungesättigten
Alkylrest oder einen ein- oder mehrfach ungesättigten Alkylrest, der mindestens eine Oxogruppe in
Nachbarschaft zu einer Doppelbindung enthält, η die Zahl 0,1 oder 2 und Ri ein Wasserstoffatom oder
eine niedrig-Alkylgruppe bedeutet, verwendet wird. 5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch
gekennzeichnet, daß als Monomer ein Acrylsäure-, Methacrylsäure- oder Vinylalkoholderivat oder eine
Mischung davon verwendet wird.
55
Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur erstellung von trägergebundenen Proteinen.
Das Interesse an trägergebundenen Proteinen, sbesondere trägergebundenen Enzymen, nimmt stang zu, und es wurden schon zahlreiche Trägcrsubstan- :n und Fixicrungsmethoderi beschrieben. Nur wenige :r bisher bekannten Methoden und Trägersubstan/.en hren jedoch zu wirklich befriedigenden Produkten mit )her Aktivität und guter Ausbeute und ausreichender labilität. Es sind daher bisher im Handel nur wenige ägergebundene Enzyme erhältlich, wobei es sich noch jerwieaend um die besonders stabilen proteolylischen Enzyme handelt Dies ist vor allem darauf zurückzuführen daß die empfindlicheren Enzyme oder Enzymkomnlexe bei einer Fixierung nach den bisher bekannten Methoden entweder ihre Aktivität völlig verlieren oder so instabil sind, daß sie sich für technische Zwecke nicht einsetzen lassen. „
Das Interesse an trägergebundenen Proteinen, sbesondere trägergebundenen Enzymen, nimmt stang zu, und es wurden schon zahlreiche Trägcrsubstan- :n und Fixicrungsmethoderi beschrieben. Nur wenige :r bisher bekannten Methoden und Trägersubstan/.en hren jedoch zu wirklich befriedigenden Produkten mit )her Aktivität und guter Ausbeute und ausreichender labilität. Es sind daher bisher im Handel nur wenige ägergebundene Enzyme erhältlich, wobei es sich noch jerwieaend um die besonders stabilen proteolylischen Enzyme handelt Dies ist vor allem darauf zurückzuführen daß die empfindlicheren Enzyme oder Enzymkomnlexe bei einer Fixierung nach den bisher bekannten Methoden entweder ihre Aktivität völlig verlieren oder so instabil sind, daß sie sich für technische Zwecke nicht einsetzen lassen. „
Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung eines besonders schonenden Verfahrens zur Bindung von
Proteinen an unlösliche Träger, welches zu Produkten führt die nicht nur hohe Aktivität und Aktivitatsausbeuie
aufweisen, sondern vor allem auch so stabil sind, daß
sie sich für den technischen Einsatz eignen. Erst bei Erfüllung dieser Forderungen wird es möglich, die
prinzipielle Eigenschaft der enzymatisch aktiven Proteine sich nicht zu verbrauchen und lange Ze-t
wiederverwendbar zu sein, technisch ausnutzbar /u
machen. .
Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgem.-iß durch
ein Verfahren zur Herstellung von trägergebundenen aktiven Proteinen, welches darin besteht, daß ein ;:ktives
Protein in einer wäßrigen Lösung mit einer Verbindung umgesetzt wird, welche mindestens eine Epoxygruppe
und mindestens eine weitere, zur Herstellung einer Bindung mit einem Träger geeignete funktionell
Gruppe aufweist, und daß anschließend diese weitere funktioneile Gruppe mit einer Trägcrsubstan/ verknüpft
wird.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren geht das Protein
mit der epoxygruppenhaltigen Verbindung eine kova
lente Bindung unter Öffnung der Epoxygruppc ein. Das
so erhaltene Zwischenprodukt wird ohne weitere Isolierung mit einem geeigneten Träger verknüpft.
indem die weitere funktionell Gruppe mit ck'i
Trägersubstan/ zur Reaktion gebracht wird.
Als weitere funktioncllc Gruppe kommen vorzugsweise solche Gruppen in Frage, welche zur Addition
oder Kondensation mit der eigentlichen Tragersubstanz geeignet sind. Soweit Epoxy ν erbindungen mit einer
kondensatioiisfähigen Gruppe verwendet werden, ist
darauf zu achten, daß bei der Kondensation keine Substanzen abgi spalten werden, welche die Aktivitäi
des gebundenen Proteins nachteilig beeinflussen. Die Feststellung, ob bei einer bestimmten kondensationsfahigcn
Gruppe die Abspaltung zu einem Produkt führt,
welches die Aktivitäi des eingesetzten Enzyms beeinträchtigt, läßt sich jeweils an Hand des bestimmten /u
bindenden Proteins durch wenige einfache Vorversuche leicht bestimmen. Allgemeine Aussagen über die
Eignung bestimmter Gruppen lassen sich nicht aufstellen, da die verschiedenen aktiven Proteine höchst
unterschiedliche Empfindlichkeit aufweisen. Beispielsweise wurde gefunden, daß Abspaltung von Halogeniden
bei vielen empfindlichen Proteinen zu einem Aktivitätsverlust führt, während andere aktive Proteine
hierdurch nicht nachteilig beeinflußt werden.
Ganz besonders schonend kann die Verknüpfung des Zwischenproduktes mit der Trägcrsubstan/ durch
Einpolymerisation in die Trägersiibstan/. erfolgen.
Besonders bevorzugt wird daher im Rahmen des Verfahrens der Erfindung dl·; Verwendung einer
Epoxyverbindung, welche wenigstens eine copolymcrisationsfähigc
Doppelbindung als weitere, zur Herstellung einer* Bindung mit einem Träger geeignete
funktioncllc Gruppe enthält.
Als Trägersubstanzen lassen sich im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens alle solchen wasserunlöslichen
festen Substanzen verwenden, welche über die weitere funklionclle Gruppe der Epoxyvcrbindung
schonenden Bedingungen in wäßriger Lösung nut
i"«er verknüpft werden können. Vorzugsweise werden
ί!' substanzen verwendet, welche hydrophil, leicht
llbar weitgehend ladungsfrei sowie stabil gegenüber
Mikroorganismen sind. Die Trägersubstanz kann als
•he in die wäßrige Lösung zur Herstellung der η Hun* mit dem Zwischenprodukt eingebracht werden.
/u"swcise wird die Trägersubstanz jedoch in der
ftrwen Lösung selbst durch Polymerisation wasserreicher
Monomcrer hergestellt. Bei dieser bevorzug-η Ausrührungsform des erfindungsgemäßen Verfahns
kann die Umsetzung des Proteins mit der Fnoxvverbindung entweder bereits in Anwesenheit des
ler der polymerisationsfähigen Monomeren erfolgen,
bei anschließend die Polymerisation unter Einpo-Ivmerisation
des Epoxyverbindung-Prote.n Zwisrhenoduktei vorgenommen wird, oder das polymerisafnnsfähige
Monomere oder die Monomerenmischung ird der Lösung ersl nach der Umsetzung zwischen
Protein und Epoxyverbindung zugesetzt und dann die Polymerisation ausgelöst.
Als Monomere kommen 1111 Rahmen dieser Ausluhrunßsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens solche w,sscrlöslichen Verbindungen in Trage, welche /ur
Polvuldition oder Polykondensation geeignet sind. Bevorzugt werden polvaddilionsfähige Monomere,
insbesondere solche Monomere, welche wenigstens eine olefinische Unsättigung enthalten. In diesem !alle stellt
lic weitere funktionell Gruppe der F.poxyverbindung ebenfalls vorzugsweise eine copolymcnsationsfahige
Doppelbindung dar.
Bevorzugte Epoxyvcrbindungtn für die obige Aus
führiingsform des erfindungsgemäßen Verlahrens ι·ηι-sprechen
der allgemeinen Formel
R1-(CH2),, CH- -CHR2
in der Ri einen ein oder mehrfach ungesättigten
Alkcnylrest. Alkcnyloxyrest oder einen ungesättigten Acylrcst, dessen CO-Ciruppc vorzugsweise in Konjugation
mit einer C-C-Doppelbindung steht, η die Zahl 0. I
oder 2 und Rj ein Wasserstoffalom oder eine niedrig-Alkylgruppc bedeutet. Unter niedrig-Alkylgruppc
wird hierbei eine gerade oder verzweigte Gruppe mit.
1 bis 4 Kohlenstoffatomen verstanden. Die Gruppe Ri weist vorzugsweise 2 bis b Kohlenstoffatome auf. Fs
kommen jedoch auch längere Gruppen in Frage, soweit hierdurch die Wasserlöslichkcit der Epoxy verbindung
nicht zu stark verringert wird. Eine besonders bevorzugte Gruppe von Epoxyverbindungen läßt sich
vom 2.3-F.poxypropanol. bei dem gegebenenfalls ein Wassersioffatom durch eine niedrige Alkylgruppe
ersetzt ist, das mit einer Aeitcren olefinisch ungesättigten Verbindung unter Ester- oder Ätherbildung
verbunden ist, ableiten. Beispiele für geeignete Gruppen Ri sind die Allyloxy-. Meth.ylallylo.xy-. Äthylallyloxy-,
lliinethylallyloxy-, Methyläthylallyloxy-. Propylallyloxy-
und Diäthylallyloxygruppe sowie weitere Allyloxyhomologe,
die noch ausreichend wasserlöslich in Verbindung mit dem epoxygruppcnhaltigen Molekulicil sind.
Besonders bevorzugt ist Ri auch eine Acylgruppe. in der
eine Oxogmppe in Konjugation mit einer Doppelbindung
steht. Diese sogenannten »Michael-Systeme« ermöglichen einerseits eine besonders schonende
Verknüpfung mit dem Träger und sind andererseits besonders wasserlöslich. Derartige Gruppen Ri leiten
sich beispielsweise von ^-ungesättigten Säuren wie Acrylsäure, Methacrylsäure. Fumarsäure und Maleinsäure
ab. Beispiele für derartige Verbindungen der obigen allgemeinen Formel sind
Acrylsäure-(2,3-epoxypropylester), Methacrylsäure-(2,3-epoxypropylester),
Maleinsäure-(2,3-epoxypropylmonoester), Maleinsäure-(2,3)-epoxypropyldiester), Fumarsäureepoxy-(2,3-epoxypropylmonoester),
Fumarsäure-(2,3-epoxypropyldiester), Acryisäure-(2,3-epoxybutylester),
Acrylsäure-(2,3-epoxypentylester), Acrylsäure-(2,3-epoxyhexylester). die entsprechenden Ester der Methacryl-, Fumar-
und Maleinsäure,
1 -(Allyloxy)-2,3-epoxybulan u. dgl. Das bei der bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zugesetzte Monomer muß, wie bereits erwähnt, wasserlöslich sein und gleichzeitig eine polymerisationsfähige olefinische Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung enthalten. Vorzugsweise werden auch hier Verbindungen mit dem Michael-System, also mit einer Kohlenstoff-Kohlcnstoff-Doppelbindung in Nachbarschaft /u einer Kohlenstoff-Sauerstoff-Doppclbindung, verwendet Besonders bevorzugt werden als Monomere die wasserlöslichen Derivate der Acrylsäure oder Methacrylsäure, wie beispielsweise die Amide. Nitrile und Ester dieser Verbindungen. Ganz besonders gute Ergebnisse wurden unter Verwendung von Acrylamid er/ielt. Die Verbinclungen können auch durch Alkylreste substituiert sein, solange hierdurch die Wasserlöslichkeil der Verbindung nicht /u sehr herabgedrückt wird. Derartige Verbindungen mit verringerter Wasserlöslichkcit sind jedoch von Vorteil, falls später das trägergebundene Enzym im nicht reinwäßrigcn System eingesetzt werden soll, beispielsweise in einem wäßrig organischen Medium. Auch die entsprechenden Derivate der Malein- oder Fumarsäure sind gut geeignet.
1 -(Allyloxy)-2,3-epoxybulan u. dgl. Das bei der bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zugesetzte Monomer muß, wie bereits erwähnt, wasserlöslich sein und gleichzeitig eine polymerisationsfähige olefinische Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung enthalten. Vorzugsweise werden auch hier Verbindungen mit dem Michael-System, also mit einer Kohlenstoff-Kohlcnstoff-Doppelbindung in Nachbarschaft /u einer Kohlenstoff-Sauerstoff-Doppclbindung, verwendet Besonders bevorzugt werden als Monomere die wasserlöslichen Derivate der Acrylsäure oder Methacrylsäure, wie beispielsweise die Amide. Nitrile und Ester dieser Verbindungen. Ganz besonders gute Ergebnisse wurden unter Verwendung von Acrylamid er/ielt. Die Verbinclungen können auch durch Alkylreste substituiert sein, solange hierdurch die Wasserlöslichkeil der Verbindung nicht /u sehr herabgedrückt wird. Derartige Verbindungen mit verringerter Wasserlöslichkcit sind jedoch von Vorteil, falls später das trägergebundene Enzym im nicht reinwäßrigcn System eingesetzt werden soll, beispielsweise in einem wäßrig organischen Medium. Auch die entsprechenden Derivate der Malein- oder Fumarsäure sind gut geeignet.
Alternativ können auch nicht wasserlösliche Monomere verwendet werden. In diesem Falle wird die
Polymerisation nicht in Lösung, sondern in Suspension durchgeführt. Letztere Methode ist von Vorteil, falls
eine fcintcilige perlförmige Matrix ohn? Quellfähigkeit
in wäßrigen Systemen gewünscht wird. Die nach bekannten Methoden der Suspensionspolymerisation
(Perlpolymerisation) erhaltenen Polymerisatkügelchen enthalten dann an ihre Oberfläche anpolymcrisiert das
Pro tein-F.poxy verbindung-Anlagerungsprodukt.
Es kann ein einziges polymerisationsfähiges Monomer oder eine Mischung von Monomeren verwendet
werden. Fs ist auch möglich, ein noch ungesättigte Gruppen enthaltendes Vorpolymerisat zusammen mit
einem Monomer einzusetzen
Ic nach der gewünschten Konsistenz des Endproduktes werden dem Monomer noch Vernetzerverbindungen
zugesetzt, die mehr als eine polymerisationsfähige Gruppe enthalten. Beispiele für derartige Vernetzer
sind N.N'-Methylen-bis-acrylamkl und Äthylcndiacrylat.
Fliese werden bevorzugt beim Arbeiten in wäßriger Lösung. Falls eine Polymerisation in heterogener Phase,
also eine Suspensionspolymerisation, durchgeführt wird, können auch wasserunlösliche Vernetzer, wie /.. B.
Divinylben/.ol und Äthylen di-methaerylal. verwendet
werden. Zahlreiche andere Vernetzer sind dem Fachmann bekannt und die geeignete Auswahl in
jeweiligen Falle zu treffen, liegt im Rahmen fachmänni
35
40
sehen Handelns. Es ist auch möglich, nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene trägergcbundene
Proteine, deren Träger nicht vernetzt ist. noch nachträglich zu vernetzen.
Wird kein Vernetzer verwendet, so erhält man Trägermaterialien, welche löslich oder thermoplastisch
sind. Eine Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens in dieser Form führt zu spinnfähigen oder
extrudierbaren Lösungen, aus denen die trä?ergebundenen
Proteine z. B. in Fadenform oder in Form von Folien nach an sich bekannten Methoden erhalten
werden können. Derartige mit aktiven Proteinen kovalent gebundene Fäden oder Folien können nach
den Methoden der Kunstslofftechnik verstreckt, gesponnen
und zu sonstigen Produkten verarbeitet werden, welche die aktiven Proteine gebunden enthalten
und für Zwecke eingesetzt werden können, in denen diese Formen besondere Vorteile bieten, beispielsweise
zur Herstellung von enzymatisch aktiven Sieben. Geweben, einpflanzbaren Fäden u. dgl. ϊο
Zum Verspinnen aus wäßriger Lösung kann beispielsweise das Vakuum-Spinnverfahren angewendet werden,
bei dem die Lösung durch eine Spinndüse in ein Vakuum ausgepreßt wird. Dies kann unter den Bedingungen
einer Lyophilisierung erfolgen, die von den meisten aktiven Proteinen ohne Aktivitätsverlust ertragen wird.
Wesentlich ist für das erfindungsgemäße Verfahren weiter, daß zuerst das Protein mit der Epoxyvcrbindung
umgesetzt und erst dann das erhaltene Zwischenprodukt an die Trägersubstan/ fixiert wird. Die Umsetzung
des Proteins mit der Epoxyvcrbindung bedarf normalerweise keiner besonderen Maßnahmen. Es genügt.
Protein und Epoxyverbindung gemeinsam bei Normaltemperatur in wäßrige Lösung zu bringen. Zweckmäßig
wird dabei in gepufferter wäßriger Lösung eines pH-Werts, der für das jeweilige Protein zweckmäßig ist,
gearbeitet. Die Dauer der Umsetzung zwischen Protein und Epoxyverbindung hängt von den jeweils zu
verwendenden Substanzen ab, lieg! jedoch im allgemeinen
zwischen etwa 5 Minuten und 1 Stunde. Längere oder kürzere Inkubationszeiten können jedoch von Fall
zu Fall ebenfalls zweckmäßig sein.
Die Umsetzung von Protein und Epoxyverbindung kann, wie erwähnt, in Gegenwart des Trägers bzw. der
Ausgangsprodukte für den Träger durchgeführt werden. Zweckmäßig wird im letzteren Falle die Polymerisationsreaktion
nach Bildung des Vorproduktes durch Zugabe des Initiators gestartet. Als Initiatoren sind die
üblicherweise in der Polymerchemie gebräuchlichen Initiatoren und Katalysatoren verwendbar, soweit sie
die Aktivität des Proteins nicht nachteilig beeinflussen. Als Initiatoren bzw. Katalysatoren kommen bei
Verwendung von olefinisch ungesättigten Monomeren bzw. Vorpolymeren z. B. anorganische oder organische
Peroxyde, Azoverbindungen u. dgl. in Betracht. Zusatzlieh können Reakiionsbesehlcuniger wie Amine u.dgl.
verwendet werden. Bei der Verwendung von Acrylsäure- oder Methacrylsäurederivaten als Monomere hat
sich die Verwendung einer Iniliatorkombinalion aus einem Peroxydisulfat und einem Amin, wie 3-Dimethylaminopropionitril,
besonders bewährt.
Bei Anwendung dieser Initiatorkombination wild zweckmäßig unter inerter Atmosphäre, z. B. unter
Stickstoff, gearbeitet.
Die Gewinnung des Verfahrensproduktes erfolgt, soweit direkt unlösliche Substanzen gebildet werden,
durch einfaches Abfiltricrcn und Waschen. Falls die Träeer nicht vernetzt sind und in Lösung verbleiben.
wird in üblicher Weise das Lösungsmittel entfernt,
beispielsweise wie oben erwähnt durch Vakuumversp.n-
Das erfindungsgemäße Verfahren bringt eine Reihe
wesentlicher Vorteile. Von besonderer Bedeutung .st hierbei daß es erfindungsgemäß möglich ist. empfindlicnc
Proteine und Proteinverbände, z. B. Enzyme, die aus
mehreren Untereinheiten zusammengesetzt sind, ohne großen Verlust der Aktivität an Träger zu binden. Be,
den bisher bekannten Methoden zur Fixierung an Trägern wurden derartige empfindliche Proteme in fast
,1 cn Fällen desaktiviert bzw. Präparate vor, geringer
aibarkeit und geringer Aktivität erhalten. Das
"rfindunesRcmäße Verfahren ermöglicht demgegenbe
S' Verknüpfung auf besonders schonende Weise.
Weiter wird durch das erfindungsgemäße Verfahren ein
gewisser räumlicher Abstand des gebundenen Proteins von der eigentlichen Matrix bzw Tragersubs.anz
erzielt da die Epoxydverbindung als Zwischenglied eingeschaltet ist. Bei Quellungsvorgängen α dgl wird
dabei der Enzvm- bzw. Proteinverband geschont Diese Überlegenheit zeig, sich beispielsweise dann daß be,
Fixierung des Enzyms Urease an DEAE-C elulose naen dem bekannten Tria/inverfahren ein Produkt mn einer
Aktivität von 4.9 I l/g erhalten wird. Bc. Anwendung des
erfindungsgemäßen Verfahrens w.rd bei hinsai/ e.ncr
deichen cnzvmalischen Aktivität ein Produkt nut
1200 U/u als'Lyophilisat erhalten, welches auch nach
wochenlanger Lagerung bei einer Temperatur von 34 C keine Aktivität verliert.
Ähnlich konnte nach dem obenerwähnten bekannten Verfahren das Enzym Glucoseoxydase /war m einer
Aktivität von JOO U/g Lyophilisat an CcIIu öse gebunden
werden. Nach 11 lägiger Lagerung war die Aktivität
aber bereits auf weniger als die Hälfte gesunken. Mit
dem erfindungsgcmäUen Verfahren konnten bei Einsatz Bleicher Mengen Enzym fast doppelt so hohe Aktivität*-
•uisbeutcn erhallen werden, und das erhaltene Produkt
konnte anschließend langer als ein halbes |ahr im ständigen Einsat/ als Katalysator gehalten werden,
ohne daß eine wesentliche Aktiviiätsabnahmc erfolgte.
Bei Anwendung der besonders bevorzugten Atisfuhrunesform
des Verfahrens durch Polymerisation in Gegenwart olefinisch ungesättigter Monomere.·, wie
insbesondere von Acrylsäure- und Methacrylsäurederivitcn
ergibt sich weiter Stabilität gegenüber Mikroor-E-uiismcnbcfall.
gut beherrschbares Quellungsverhallen (wichtig falls Eignung zur Säulenfüllung gewünscht
wird) sowie leichte Einstellbarkeit der gewünschten Ladung bzw. Ladungsfreiheit.
Ganz allgemein besteht ein Vorzug des crfindungsgemäßcn
Verfahrens auch in der besonderen Einfachheit seiner Durchführung.
Aus der DT-OS 19 15 970 ist ein Verfahren bekannt,
bei welchem ein Träger mit einer Lösung mindestens einer aktiven Proteinsubstanz in Gegenwart, eines
Brückenbildners in Berührung gebracht wird. Diese einstufige Arbeitsweise ergibt wesentlich schlechtere
Aktivitätsausbeuten als die erfindungsgemäße Arbeitsweise
was durch die Beispiele 1 (erfindungsgemäß) und Vergleichsbeispiel 2 veranschaulicht wird. Hiervon
abgesehen ist es aus dieser Literaturstelle nicht bekannt, ein aktives Protein mit einer Verbindung umzusetzen,
welche mindestens eine Epoxygruppe und mindestens eine weitere, zur Herstellung einer Bindung mit einem
Träger geeignete funktionell Gruppe aufweist.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
Beispiel I
Ausgangssubsianzen
Ausgangssubsianzen
0,1 g Glucoseoxydase (GOD), 220 U/mg,
Acrylamid.
Acrylsäure-^, 3-epoxypropy IeM er),
N.N'-Methylen-bis-acrylamid,
3-Dimethylamino-propionitril,
Ammoniumperoxydisiilfat
Methode
0,1 g CJOD werden in 2 ml 0.5 M 1 riäthanolaminpuffer.
pH = 8.0. unter Stickstoffatmosphäre bei 30"C gelöst, mil 0,25 ml Aerylsäure-(2.3-epoxypropylester)
versetzt und 30 Minuten gerührt.
Anschließend wird auf +10 C gekühlt, mil 3 g
Acrylamid und 0,1 g N.N'-Methylen-bis-acrylamid, gelöst in 18 ml destilliertem Wasser, versetzt.
I Inter Stickstoflatmosphäre wird nach etwa I 5 Minuten
die Polymerisation mit 0.5 ml 5prozenligem i-Dimethyiamino-propionitril und 3 ml 5piozcntigem
Ammoniumperoxydisulfat gestartet. Die Lösung wird nach etwa 5 Minuten zunächst viskos, bis sie dann zu
einem gelben, klaren und steifen CJeI auspolymerisiert. Der Polymerisationsblock wird etwa 18 Stunden im
Kühlschrank stehengelassen. Das Polymerisat wird anschließend durch ein Metallsieb mit 0.5 mm Durchmesser
gedruckt und mit etwa 2000 ml destilliertem Wasser gewaschen. Die Gcl-Partikelchen werden in
eine Säule mit 2 cm Innendurchmesser gefüllt und mit 0.2 M Kalium-Phosphalpuffer. p\^ = 7.5. von adsorbtiv
gebundener (JOD ausgewaschen, bis im Eluat keine
Aktivität mehr /u testen ist.
Im Final werden 10% der ursprünglich eingesetzten
Enzym-Aktivität getestet.
Die enzymatische Aktivität des irägergebundenen
Enzyms als l.yophilisat beträgt 500 U/g.
Vergleichsbeispiel 1
Das Verfahren von Beispiel I wurde wiederholt,
jednch wurde in Abweichung von der Erfindung die
Epoxy verbindung weggelassen.
3.0"g Acrylamid und 0.1 g N.N'-Methylen-bis-acrylamid
werden in 18 ml destilliertem Wasser unter Rühren und Auskühlung mit 0.1 g CJOD. gelöst in 2 ml
0.05 M Triäthanolamin-Puffer. pH ■■= 8.0. versetzt. Anschließend
wird wie in Beispiel 1 unter Stickstoffatmosphäre
die Initiatorlösung zugegeben und das Produkt, wie in Beispiel 1 beschrieben, aufgearbeitet.
Im Eluat werden etwa 4üu/u der eingesetzten Aktivität
ungebunden wiedergefunden. Nach Lyophilisierung des erhaltenen Produktes beträgt die Aktivität des Lyophilisats
90 bis 100 U/g.
Vergleichsbeispiel 2
Ausgangssubstanzen
Ausgangssubstanzen
GOD-1,220 U/mg
Acrylamid,
Acrylsäure-{2.3-epoxypropylesier).
N.N'-Methylen-bis-acrylamid.
3-Dimethylamino-propionitril.
Ammoniumperoxydisulfat
Methode
0.15 g GOD werden in UmI destilliertem Wasser
und 1.5 ml I.OMTriäthanoiamin-Puffer.pri = «.ö,unter
Stickstolfaimosphäre auf + IOC gekühlt. Diese Lösung
wird mit 3,0 g Acrylamid und 0,1 g N,N'-Methylen-bisacrylamid,
gelöst in 14 ml Wasser, versetzt.
Unter Zugabe von 0,25 ml Acrylsäure-(2,3-cpoxypropylester) wird die Reaktion mit 0,5 ml 5% 3-Dimelhylamino-propioniiril
und 0,2 ml 5% Ammoniumperoxydisiilfat gestartet. Die Polymerisationsdauer beträgt etwa
10 Minuten.
Der Polymcrisalionsblock wird, wie vorher beschrieben,
durch ein Mclallsieb gedrückt und entsprechend weiter aufgearbeitet.
Nach dem Aktivilätstest im Final wird das Protein
lOOprozentig kovaleni gebunden.
Aktivität des Lyophilisats: 140 U/g.
■ 5
■ 5
Ausgangssubsianzen
CJOD-1.220 U/mg,
Acrylamid.
1-(A lly loxy)-2,3-epoxy propan.
N.N'-Melhylen-bis-acrylamid.
3-Dimethylamino-propionitril,
Ammoniumperoxydisulfat
Ammoniumperoxydisulfat
Methode
50 mg CJOD werden in 0,5 ml destilliertem Wasser um] 0.5 ml 1 M Triälhanolamin-Piiffer. pH = 8,0, unter
Stickstoffatmosphäre bei 30' C gelöst, mit 0,1 ml l-(Allyloxy)-2.3-epoxypropan inkubierl (40 Minuten).
Anschließend wird auf 10"C gekühlt, mit 3 g Acrylamid und 0,1 g N.N'-Methylen-bis-acrylamid. gelöst in 20 ml
bidestilliertcm Wasser, versetzt.
Die weitere Aufarbeitung erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben.
Im Eluat werden 10% der ursprünglich eingesetzten
Enzym-Aktivität ge lest et.
Aktivität des Lyophilisats: 210 U/g.
Ausgangssubstanzen
Uncase.4,5 I J/nig. in 50%Glycerin,
0.05 M Glycin und 0.13 M Na2CC)3 gelöst.
Acrylamid.
Acrylsäure-^,3-epoxypropylester),
N.N'-Melhylcn-bis-acrylamid.
3-Dimeihylamino-propionitril.
3-Dimeihylamino-propionitril.
Ammoniumperoxydisulfat
Methode
10 mg Uricase werden gegen 1 10.01 M Glycin-Puffer.
pH = 10. bei 4DC etwa 4 Stunden dialysiert. Das
Dialysat wird mit 1 ml IM Triäthanolaminpuffer,
pH = 8.0. versetzt. Bei 100C wird unter Sticksioffatmosphäre
in Gegenwart von 0,1 ml Acrylsäure-(2,3-epoxypropylester) inkubiert und 30 Minuten gerührt
Die Aufarbeitung erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben.
Aktivität des Lyophilisats: 3,5 U/g.
Beispiel 4
Ausgangssubstanzen
Hexokinase. 140 U/mg.
Ausgangssubstanzen
Hexokinase. 140 U/mg.
609427/151
Acry lsäure-(2,3-c poxy propy lest er), N.N'-Methylen-bis-acrylamid.
3-Dimethylamino-propionitril.
Ammoniumpcroxydisulfat
Methode
20 mg Hexokinasc-Kiistallsuspension werden in >ml
Wasser gelöst und gegen I 10.01 M Triäihanolamin-Puffer,
pH = 8,0, bei 4"C dialysicrt. In Gegenwart von
Acrylsäurc-(2,3-epoxypropylester) wird unter Slifk
ttoffalmosphäre bei IOC inkubiert und naeh i0 Minuten
auf 10"C gekühlt. Die En/.ymlösung wird mit 3 g Acrylamid und 0,1 g N.N'-Methylen-bis-aerylamid. gelöst
in 20 ml destilliertem Wasser, verset/.i.
Die weitere Aufarbeitung erfolgt wie im Beispiel I beschrieben.
Aktivität des l.yophilisals: 12 D/g.
B e i s ρ i e I 5 Ausgangssubsianz.cn
100 mg Insulin-R.
Acrylamid,
Acrylsäure-2.3-epoxy propy lester.
N.N'-Methylen-bis-acrylamid, 3-Diniethylamino-propionilril,
Ammoniumpcroxidisulfal
Methode
100 mg Insulin-R werden in 100 ml Phosphat-Puffer.
pH = 8.0, suspendiert und mit wenigen Tropfen 1 M Natronlauge in Lösung gebracht. Die Proteinlösung
wird mit 100 μI Acrylsäure-2.3-epoxypropylcster versetzt
und etwa 1 Stunde bei +4"C unter Stickstoffatmo sphäre gerührt. Anschließend wird mit 2.5 g Acrylamid,
0,5 ml 5%igem Pcroxidisulfat und 0,5 ml 5"/iiigem
3-Dimcthylamino-propionitril versetzt. Der nach I bis 2 Stunden entstehende Polymerisationsblock wird, wie
in den Beispielen 1 bis 6 beschrieben, aufgearbeitet.
Das am Träger gebundene Insulin wurde qualitativ durch Totalhydrolyse und anschließende Abtrennung
der Aminosäuren an Hand bekannter dünnschichtchromatographischer
Techniken nachgcwicsen.
Der Insulingchalt wurde so zu 4.35% bestimmt.
Die Aktivität des so hergestellten Produktes wurde im Fettzellversuch bestimmt, wobei die C'Or-Bildung
aus Cl4-Glucose gemessen wird afs Parameter für die
Aufnahme von extrazcllulärer Glucose durch die
isolierte Fettzelle. Diese C14O:-Bildung wird durch
Insulin stimuliert. Im Vergleichsversuch wurde mit nativem Insulin eine Maximalstimulierung der C14Oj-Bildung von 600%, bezogen auf die Kontrolle, erzielt.
Das erfindungsgemäß erhaltene trägergebundene Insulin, welches in einer dem nativen Insulin gleichen Menge
bezüglich des Insulingehaltes eingesetzt wurde, erreichte eine maximale C 4O?-Produktion von 950%, bezogen
auf die Kontrolle. Es war damit dem nativen Insulin klar überlegen.
In-vivo-Versuche an Ratten sowohl s. c. als auch i. p.
ergaben eine deutlich bessere Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Produktes im Vergleich /u einem
anerkannt guten handelsüblichen Insulin. So sank bei Verabreichung von 2.5 U Altinsulitn/kg der Blutzucker
innerhalb von 60 Minuten von 120 auf 50. beim erfmdungsgemäßen Produkt in gleicher Menge auf 30.
Nach 480 Minuten war der Blutzuckergehalt beim Äitinsunn iGS, beim erfindungsgemäSen Produkt »5.
^ 10
Vergleichsbeispiel 3
Nacharbeitung von Beispiel 1 der DI-OS 20 53 733
I ml I.-Asparaginaselösuiig mit einer spezifischen
Aktivität von IIO U/mg (entspricht I mg Prolein) werden in 4 ml 0,1 M Tris-Puffer. pH 8,6, mit 0,32 g
Acrylamid und 0,073g N.N'-Methylcn-bis-acrylamid
versetzt und. wie in Beispiell der DT-OS 20 53 7JJ
beschrieben, weiter aulgearbeitet.
ίο Das erhaltene feste Gel wird durch ein Metallsieb mit
0.315 mm oflener Porenweite gedrückt, mehrfach gewaschen und lyophilisieri. Die spezifische Aktivität
beträgt 32 U/g Lyophihsat.
Zur Prüfung der kovalenten Bindung bzw. des Ausblutens des Proteins werden 20 mg l.vophilisal mil
5 ml 0.1 M Tris-Puffer. pH 8,b. gerührt, anschließen:
abzentnfugiert. und im Überstand wird noch Vorhände
lies Protein bei 200 niii gemessen. Die Lxtinktion de?
Uberstands betrug 0,19.
Das folgende Beispiel beschreibt die erfindungsgema-I3e
Herstellung von gebundener Asparaginaselösun^ unter genau vergleichbaren Bedingungen.
Fixierung von !.-Asparaginase nach den Verfahren clei
Vorinkubation nut Acry lsäure-2.3-epoxy propy lester
Aiisgangssubsianzen
0,2 ml Asparaginase, einsprechen 1 mg I jizympro lein mit einer spezifischen Aktivität von 110 U/mg.
0.02 ml Acrylsäure 2, J-epoxy propy lesler,
360 mg Acrylamid.
24 mg N.N'-Methyleii-bis-acrylamid.
0.1 ml 5% 3-Dimethylamino-Propionitril.
'S 0! ml r>% Ammoniumperoxidisulfai.
'S 0! ml r>% Ammoniumperoxidisulfai.
Methode
0.2 ml Asnaragmase Suspension (entsprechen 1 mi
l.nzyntprotein mn einer spezifischen Aktivität voi
110 U/mg) werden mit 1 ml 0,1 M Tris-Puffer, pH = 8.t
aufgenommen und in Sticksiollatniosphäre bei 25 C mi
0.02 ml Acrylsäure-2,3-epoxypropylester inkubier
Nachdem man 30 Minuten gerührt hat, wird auf 10°< abgekühlt und mit 360 mg Acrylamid und 24 nij
N.N'-Methylen-bis-acrylamid. gelöst in 2 ml 0.1 Iv Tris-Puffer, pH = H.b. versetzt. Die Reaktion wird mi
0.1 ml 5% 3-Dimt'ihylaminopropioniiril und 0.1 ml 5"/
Ammoniumperoxidisullat gestartet. Der Polymerisa tions-Block wird durch ein O.315-mm-Sieb gedruckt un<
wie in Beispiel 1 bis b weiter aufgearbeitet.
Die spezifische Aktivität des nach diesem Vertahrci
gebundenen Enzyms betragt 60 U/g.
Beispiel 7
Ausgangssubstanzen
Ausgangssubstanzen
GOD-1,220 U/mg.
Acrylamid,
U-Epoxy-buten-3.4.
N.N'-Methylen-bis-acrylamid.
3-DimethylamJno-prop'ionitriL
Ammoniumperoxodisulfat.
Methode
100 mg GOD werden in 2 ml 0.5 M Triethanolamin
Puffer. pH = 8,0. unter Stickstoffatmosphäre bei 30°<
gelöst, mit 0.05 ml O-Epoxy-butf-n-^4 30 Minute
inkubiert. Anschließend wird auf 100C gekühlt mit 3;
Acrylamid und 0,125 g N.N'-Methylen-bis ncryla
gelöst in 18 ml bideslilliertem Wasser, versetzt.
gelöst in 18 ml bideslilliertem Wasser, versetzt.
Die weitere Aufarbeitung erfolgt wie im Beispiel I beschrieben. Im llluat werden 35% der ursprünglich
eingesetzten linzymaktiviiäl getestet.
Aktivität des l.yophilisats: 355 I )/g.
Beispiel 8
A. Herstellung des Trägers
A. Herstellung des Trägers
IO g Stärke (Merck, Art.-Nr. 1252) werden in 150 ml Aceton aulgeschlämmt und mit 100 ml einer 3%igen
Natronlauge versetzt. Zu dieser Suspension werden 28 ml Allylbromid (Schuekardt) gegeben und 2 Stunden
unter Rückfluß in Stiekstoffatmosphärc erhitzt. Nach Abkühlen der Reaktion wird dl·? entstandene Allylstärke
mit Aceton ausgefällt, gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 9.2 g.
B. rixierung des l'nzyms
300 mg Acylasc (Schweinenieren, spezifische Aktivität: 20 U/mg) werden in 20 ml 0,3 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan,
pH 7,5, gelöst, auf 4"C abgekühlt und innerhalb von 30 Minuten mit 200 μΐ Acrylsäure^,3-epoxypropylester
inkubiert. Diese Liizymlösung wird
mit einer Lösung von 3,5 g Acrylamid, 1,5 g Slärke-Allyläther
in 25 ml 0,3 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomcihan,
pH 7,5, und mit 3 ml l%igcm CoCb versetzt. Nach Zugabe von je 3 ml 5%igcni Ammoniumperoxydistilfat
und 3 ml 5%igcm Dimcthylaminopropionitril wird der Reaktionsansatz bei 25°C in Stickstoffatmosphäre
gestartet.
Das Polymerisat wird wie vorher besehrieben aufgearbeitet. Die spezifische Aktivität des Lyophilisats
beträgt 34 U/g.
Claims (4)
1. Verfahren zur Herstellung von trägergebundenen aktiven Proteinen, dadurch gekennzeichnet,
daß ein aktives Protein in einer wäßrigen Lösung mit einer Verbindung umgesetzt
wird, welche mindestens eine Epoxygruppe und mindestens eine weitere, zur Herstellung einer
Bindung mit einem Träger geeignete funklionclle Gruppe aufweist und daß anschließend diese weitere
funktionell Gruppe mit einer Trägersubstanz verknüpft wird.
2. Verfahren zur Herstellung von trägergebundenen
aktiven Proteinen, dadurch gekennzeichnet, daß zunächst ein aktives Protein in einer wäßrigen
Lösung mit einer Verbindung, welche mindestens eine Epoxygruppe und mindestens eine weitere, /ur
Herstellung einer Bindung mit einem Träger geeignete funktionell Gruppe aufweist, in Anwesenheit
von polymerisationsfähigen Monomeren umgesetzt wird und da.3 anschließend in dieser
Lösung die Polymerisation unter Einpolymerisation des Epoxyverbindung-aktives-Protein-Produktes
vorgenommen wird oder daß die polymerisalionsfähigen
Monomeren der Lösung erst nach der Umsetzung des aktiven Proteins mit der Epoxyverbindung
zugesetzt werden und daß sodann polymerisiert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2. dadurch gekennzeichnet,
daß olefinisch ungesättigte Monomere verwendet werden und die weitere funktioneile
Gruppe der Epoxyverbindung eine copolymerisalionsfähige Doppelbindung darstellt.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch
,gekennzeichnet, daß eine Epoxyvcrbindung der allgemeinen Forme!
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