DE2128743A1

DE2128743A1 - Tragergebundenes Protein und Ver fahren zu seiner Herstellung

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Publication number: DE2128743A1
Application number: DE19712128743
Authority: DE
Inventors: Klaus Dr rer nat Bergmeyer Hans Ulrich Prof Dr rer nat 8132 Tutzing Botsch Karl Heinz 8131 Bernried Jaworek Dieter Dr phil nat Nelbock Hochstetter Michael Dr phil 8132 Tutzing P Beaucamp
Original assignee: Boehnnger Mannheim GmbH, 6800 Mann heim
Priority date: 1971-06-09
Filing date: 1971-06-09
Publication date: 1972-12-21
Also published as: NL7207183A; DK133009C; FR2140541A1; NL172874B; IL39339A; ZA723168B; IT951435B; AR194231A1; IL39339A0; US3806417A; DE2128743B2; JPS5631950B1; FR2140541B1; SE415660B; NL172874C; DK133009B; CH581663A5; GB1357861A; SU463268A3; AT317424B

Description

Pat ε ν γα ν -**λ lt ε I) ι ρ l. -1 ν g. F. We ickmänn, 2128743

Dipl.-Ing. H.Weickmann, Bipl.-Phys. Dr. K. Fincke Dipl.-Ing. RA-Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber

8 MÜNCHEN 86, DEN POSTFACH 860 S20

MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 48 39 21/22

<983921/22>

BOSHRIIiGER MAMHEIM GMBH., Ma nahe im SandhoferStr. 112-132

J
Trägergebundenes Protein und Verfahren zu seiner Herstellung

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von trägergebundenen Proteinen sowie die nach diesem Verfahren erhaltenen an einen wasserunlöslichen träger gebundenen Proteine.

Das Interesse axi trägergebundenen Proteinen, insbesondere trägergebundenen Enzymen, niamt ständig zu und es wurden schon zahlreiche Trägersubstanzen und Fixierungsmethoden beschrieben. Nur 'wenige der bisher bekannten Methoden und Trägersubstanzen führen jedoch zu wirklich befriedigenden Produkten mit hoher Aktivität und guter Ausbeute und ausreichender Stabilität. Es sind daher bisher im Handel nur wenige trägergebundene Enzyme erhältlich, wobei es sich noch überwiegend um die besonders stabilen proteo·=· lytischen Enzyme handelt. Dies ist vor allem darauf zurückzuführen, daß die empfindlicheren Enzyme oder Enzymkomplexe bei einer Fixierung nach den bisher bekannten Methoden entweder ihre Aktivität völlig verlieren oder so instabil sind, daß sie sich für technische Zwecke nicht einsetzen lassen.

Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung eines besonders schonenden Verfahrens zur Bindung von Proteinen an unlösliche Träger, welches zu Produkten führt, die nicht nur hohe Aktivität

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und, Aktivitätsausbeute aufweisen, sondern vor alleiB auch so stabil sind, daß sie sich für den technischen Einsatz eignen. Erst bei Erfüllung dieser Forderungen wird es möglich, die prinzipielle Eigenschaft der enzymatisch aktiven Proteine, sich nicht zu verbrauchen und lange Zeit wiederverwendbar zu sein, technisch · ausnutzbar zu machen. ' ' -

Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgeraäß durch ein Verfahren zur Herstellung von trägergebundenen Proteinen, welches darin besteht, daß das Protein in wässriger Lösung mit einer Verbindung umgesetzt wird, welche mindestens;eine Epoxygruppe und mindestens eine weitere, zur 'Herstellung einer Bindung mit einer Trägersubstanz geeignete funktionelle Gruppe aufweist, und anschließend diese weitere funktionelle Gruppe mit einer Trägersubstanz verknüpft wird.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren geht das Protein mit der epoxygruppenhaltigen Verbindung eine kovalente Bindung unter Öffnung der Epoxygruppe ein. Das so erhaltene Zwischenprodukt wird ohne weitere Isolierung mit einem geeigneten Träger verknüpft, indem die weitere funktionelle Gruppe mit der Trägersubstanz zur Reaktion gebracht wird.

Als weitere funktionelle Gruppe kommen vorzugsweise solche Gruppen in Präge, welche zur Addition oder Kondensation mit der eigentlichen Trägersubstanz geeignet sind.Soweit Epoxyverbindungen mit einer kondensationsfähigen Gruppe verwendet werden, istdarauf zu achten, daß bei der Kondensation keine Substanzen abgespalten werden, welche die Aktivität des gebundenen Proteins nachteilig beeinflussen. Die Peststellung, ob bei einer bestimmtenkondensationsfähigen Gruppe die Abspaltung zu einem Produkt führt, welches die Aktivität des eingesetzten Enzyms beeinträchtigt, läßt sich jeweils anhand des bestimmten zu bindenen Proteins durch wenige einfache Vorversuche leicht bestimmen. Allgemeine Aussagen über die Eignung bestimmter Gruppen lassen sich' nicht aufstellen, da die verschiedenen aktiven Proteine höchst

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unterschiedliche Empfindlichkeit aufweisen. Beispielsweise wurde gefunden, daß Abspaltung von Halogeniden "bei vielen empfindlichen Proteinen, zu einem Aktivitätsverlust führt, während andere aktive. Proteine hierdurch nicht nachteilig "beeinflußt werden.

Gans besonders schonend kann die Verknüpfung des Zwischenproduktes mit der Trägersubstanz durch Binpolymerisation in 'die Trägersubstanz erfolgen. Besonders bevorzugt wird daher im Rahmen des Verfahrens der Erfindung die Verwendung einer Epoxyverbindung, welche wenigstens eine copolymerisstionsfähige Doppelbindung als weitere, zur Herstellung einer Bindung mit einem Träger geeignete funktioneile Gruppe enthält.

Als Trägersubstanzen lassen sich im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens alle solchen wasserunlöslichen festen Substanzen verwenden, welche über die weitere funktioneile Gruppe der Epoxyver-

, . , _, , ^ ,. .... '.mit dieser bindung unter schonenden Bedingungen in wässriger Losung/verknüpft werden können. Vorzugsweise werden Trägersubstanzen verwendet, welche hydrophil, leicht quellbar, weitgehend ladungsfrei sowie stabil gegenüber Mikroorganismen sind. Die Trägersubstanz kann als solche in die wässrige Lösung zur Herstellung der Bindung mit dem Zwischenprodukt eingebracht werden, vorzugsweise wird die Trägersubstana jedoch in der wässrigen Lösung selbst durch Polymerisation wasserlöslicher Monomerer hergestellt. Bei dieser bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Umsetzung des Proteins mit der Epoxyverbindung entweder bereits in Anwesenheit des oder der polymerisationsfähigen Monomeren erfolgen, wobei anschließend die Polymerisation unter Einpolymerisation des Epoxyverbindung-Protein-Zwischenproduktes vorgenommen wird, oder das polymerisationsfähige Monomere oder die Monomerenmischung wird der Lösung erst nach der Umsetzung zwischen Protein und Epoxyverbindung zugesetzt und dann die Polymerisation ausgelöst.

Als Monomere kommen im Rahmen dieeer Ausführungsform des erfin- · dungegemäßen Verfahrens solche wasserlöslichen Verbindungen in

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Präge. Vielehe zur Polyaddition, oder Polykondensation geeignet ' sind. Bevorzugt werden polyadditionsfähige Mouoaere, insbesonde-re solche Monomere, v/elohe wenigstens eine olefinische Unsättigu.ng enthalten. In diesem Ealle stellt die weitere funktionell*

G-ruppe der Epoxyverbindung ebenfalls vorzugsweise eine copolyrnerisationsfähige Doppelbindung dar.

Bevorzugte Epoxyverbindungen für die obige Ausführungsförra dos erfindungsgemäßen Verfahrens entsprechen der allgemeinen Formel

/ \
R₁ - (CH₂)_H - CH - CHR₂

in der R₁ einen ein- oder mehrfach ungesättigten Alkeirylrest, .Alkenyloxyrest oder einen ungesättigten Acylrest, dessen CO-Gruppe vorzugsweise in Konjugation mit einer C-C-Doppelbindung steht, η die Zahl 0, 1 oder 2 und R₂ ein Wasserstoff atom oder eine niedrig-Alkylgruppe bedeutet. Unter niedrig-Alkylgruppe wird hierbei eine gerade oder verzweigte G-ruppe mit 1 bis 4 • Kohlenstoffatomen verstanden. Die Gruppe R₁ v/eist vorzugsweise 2 bis 6 Kohlenstoff atome auf. Es kommen jedoch auch längere * Gruppen in Frage, soweit hierdurch die Wasserlöslichkeit der Epoxyverbindung nicht zu stark verringert wird. Eine besonders bevorzugte Gruppe von Epoxy verbindungen läßt sich vom 2,3-Epoxypropanol, bei dem gegebenenfalls ein Wasserstoffatom durch eine niedrige Alkylgruppe ersetzt ist, das mit einer weiteren olefinischungesättigten Verbindung unter Ester- oder Ätherbildung verbunden ist, ableiten. Beispiele für geeignete Gruppen R₁ sind die Allyloxy-, Methylallyloxy-, Äthylallyloxy-, Dimethylallyloxy-, Methyläthylallyloxy-, Propylällyloxy- und Diäthylallyloxygruppe sowie weitere Allyloxyhomologe, die noch ausreichend wasserlöslich in Verbindung mit dem epoxygruppenhaltigen Molekülteil sind. Besonders bevorzugt ist R₁ auch eine Acylgruppe, in der eine Οχο-gruppe in Konjugation mit einer Doppelbindimg steht. Diese so-

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genannten "Michael-Systeme" ermöglichen einerseitij eine besen- · ders sönoiienätj -Verknüpfung mit dem !Präger und sind andererseits befsonderfs wasserlöslich. Derartige Gruppen R«. leiten sieh bei™ spicl«3v;eioe von α,(3-ungesättigten Säuren wie Acrylsäure, Methacrylsäure, Fumarsäure und -Maleinsäure ab. Beispiele für derartige Verbindungen der obigen allgemeinen Formel sind Acryl« säure~(2,3-epoxypropylester), Methacrylsäure-^,3-epoxypropylester), Malein8äure~(2,3-epoxypropylmonoester), Maleinsäure-(2,3)-epoxypropyldiester), Fumarsäureepoxy-(2,3-epoxypropylmonoester), PuinarBäure-(2,3-epoxypropyldiester) _f Acrylsäure-(2,3-epoxybutylester), Acrylsäure-(2,3-epoxypentylester), Acrylsäure-(2,3-epoxyhexylester)', die entsprechenden Ester der Methacryl-, Fumar- und Maleinsäure, 1-(Allyloxy)~2,3-epoxy~ butan und dergl.

Das bei der bevorzugten Ausführungsfortn des erfindungsgemäßen Verfahrens zugesetzte Monomer muß wie bereits erwähnt wasserlöslich sein und gleichzeitig eine polymerisationsfähige olefinische Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung enthalten. Vorzugsweise werden auch hier Verbindungen mit dem Michael-System, also mit einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung in Nachbarschaft zu einer Kohlenstoffe-Sauerstoff-Doppelbindung verwendet. Besonders bevorzugt werden als Monomere die wasserlöslichen Derivate der Acrylsäure oder Methacrylsäure, wie beispielsweise die Amide, nitrile und Ester dieser Verbindungen. Ganz besonders gute Ergebnisse wurden unter Verwendung von Acrylamid erzielt. Die Verbindungen können auch durch Alkylreste substituiert sein, solange hierdurch die Wasserlöslichkeit der Verbindung nicht zu sehr"herabgedrückt wird. Derartige Verbindungen mit verringerter Wasserlöslichkeit sind jedoch von Vorteil, falls später das trägergebundene Enzym im nicht-reirmvässrigen System eingesetzt werden soll, beispielsweise in einem wässrig—organischen Medium. Auch die entsprechenden Derivate der Malein- oder Fumarsäure sind gut geeignet.

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Alternativ können auch nicht-wasserlösliche Monomere verwendet werden. In diesem Falle wird die Polymerisation nicht in Lösung, sondern in Suspension durchgeführt. Letztere Methode ist von Vorteil, falls eine feinteilige perlförraige Matrix ohne Quellfähig-' keit in wässrigen Systemen gewünscht wird; Die nach bekannten '

Methoden der Suspensionspolymerisation (Perlpolymerisation) er-™ hältenen Polymerisatkügelcben enthalten dann an ihre Oberfläche anpolymerisiert das Protein-Epoxyverbindung-Anlagerungsprodukt,

Es kann ein einziges polymerisationsfähiges Monomer oder eine Mischung von Monomeren verwendet v/erden. Es ist auch möglich, ein noch ungesättigte Gruppen enthaltendes Vorpolymerisat zusammen --mit einem Monomer einzusetzen.

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Je nach der gewünschten Konsistenz des Endproduktes werden dem Monomer noch Vernetserverbindungen zugesetzt, die mehr als eine. ; polymerisationsfähige Gruppe enthalten. Beispiele für derartige. Vernetzer sind N,N'-~Methylen~bis~acrylamid und Äthylendiacrylat. Diese werden bevorzugt beim Arbeiten in wäßriger Lösung. Falls eine Polymerisation in heterogener Phase, also eine Suspensionspolymerisation durchgeführt wird, können auch wasserunlösliche Vernetzer wie z. B. Divinylbenzol _:und Äthylen-di-methacrylat verwendet werden. Zahlreiche andere Vernetzer sind-dem Fachmann bekannt und die geeignete Auswahl im jeweiligen Falle zu treffen, liegt im Rahmen fachmännischen Handelns. Es ist auch möglich, nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene trägergebundene Proteine, deren Träger'nicht vernetzt ist, noch nachträglich "zu "vernetzen.

Wird kein Vernetzer verwendet, so erhält man Trägermaterialien, welche 'löslich"'oder thermoplastisch sind. Eine Ausführung des erfindungsgemäßeta Verfahrens in dieser Form führt zu spinnfähigen oder extrudierbaren Lösungen, aus denen die 'ürägergebundenen Proteine z.B. in Fadenforra oder in Form von Folien nach an sich bekannten Methoden erhalten werden können. Derartige mit aktiven Proteinen kovalent gebundene-Fäden oder Folien können nach den Methoden der Kunststofftechnik.verstreckt, gesponnen und zu son~ stigen Produkten verarbeitet werden, welche die aktiven Proteine gebunden enthalten und für Zwecke'eingesetzt werden können, in denen diese Formen besondere Vorteile bieten, beispielsweise zur Herstellung von enzymatisch aktiven Sieben, Geweben,einpflanzbaren Fäden und dergleichen.

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Zum Verspinnen aus wässriger Lösung kann "beispielsweise das Va'kuum-Spinnverfahren angewendet werden, bei dem die Lösung durch eine' Spinndüse in ein Vakuum ausgepreßt wird. Dies kann unter den Bedingungen einer Lyophilisierung erfolgen, die von den meisten aktiven Proteinen olme Aktivitätsverlust ertragen wird.

Wesentlich ist für das erfindungsgemäße Verfahren weiter, daß zuerst das Protein mit der Epoxyverbindung umgesetzt und erst.dann das erhaltene Zwischenprodukt an die Trägersubstanz fixiert wird. Die Umsetzung des Proteins mit der Ep oxy verbindung bedarf normalerweise keiner besonderen Maßnahmen. Es genügt, Protein und Epoxyverbindung gemeinsam bei ITormaltetnperatur in wässrige Lösung zu bringen. Zweckmäßig wird dabei in gepufferter wässriger _ Lösung eines. pH-Werts, der für das jeweilige Protein zweckmäßig ist ,gearbeitet. Die Dauer der Umsetzung zwischen Protein und Epoxyverbindung hängt von den jeweils zu verwendenden Substanzen ab, liegt jedoch im allgemeinen zwischen etwa 5 Minuten und 1 Stunde. Längere oder kürzere Inkubationszeiten können jedoch von Pail zu Pail ebenfalls zweckmäßig sein.

Die Umsetzung von Protein und Epoxyverbindung kann wie erwähnt in Gegenwart des Trägers bzw. der Ausgangsprodukte für den Träger durchgeführt werden. Zweckmäßig wird im letzteren Falle die Polymerisationsreaktion nach Bildung des Vorproduktes durch Zugabe des Initiators gestartet. Als Initiatoren sind die üblicherweise in der Polymerchemie gebräuchlichen Initiatoren und Katalysatoren verwendbar, so weit sie die Aktivität des Proteins nicht nachteilig beeinflussen. Als Initiatoren bzw. Katalysatoren kommen bei Verwendung von olefinisch ungesättigten Monomeren bzw. Vorpolymeren z.B. anorganische oder organische Peroxyde, Azoverbindungen und dgl. in Betracht. Zusätzlich können Reaktionsbeschleuniger wie Amine und dgl. verwendet werden. Bei der Verwendung von Acrylsäure- oder Metbacrylsäurederivaten als Monomere hat sich die Verwendung einer Initiatorkombination aus einem Peroxydisulfat und einem Amin wie 3-Dimethylat:iinopropionitril

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■besonders bewährt.

Bei Anwendung dieser Initiatorkombination wird zweckmäßig unter inerter Atmosphäre, z.B. unter Stickstoff, gearbeitet.

Die Gewinnung des Verfahrensproduktes erfolgt, soweit direkt unlösliche Substanzen gebildet v/erden, durch einfaches Abfiltrieren und Waschen. Palis die Träger, nicht vernetzt sind und in lösung verbleiben, wird in üblicher Weise das Lösungsmittel entfernt, beispielsweise wie oben erwähnt durch Vakuumverspinnen.

Das erfindungsgeraäße Verfahren bringt eine Reihe wesentlicher Vorteile. Von besonderer Bedeutung ist hierbei, daß es erfindungs- _._g_emäß- Tauglich ist, empfindliche Proteine und Proteinverbände, z.B. Enzyme, die aus mehreren Untereinheiten zusammengesetzt sind, ohne/Verlust der Aktivität an Träger zu binden. Bei den bisher bekannten Methoden zur Fixierung an Trägern wurden derartige eopfindliche Proteine in fast allen Fällen desaktiviert bzw. Präparate von geringer Haltbarkeit und geringer Aktivität erhalten. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht demgegenüber eine Verknüpfung auf besonders schonende V/eise. "Weiter wird durch das erfindungsgemäße Verfahren ein gewisser räumlicher Abstand des gebundenen Proteins von der eigentlichen Matrix bzw. Trägersubstanz erzielt, da die Epoxydverbindung als Zwischenglied eingeschaltet ist. Bei Quellungsvorgängen und dgl. wird dabei der Enzym- bzw. Proteinverband geschont. Diese Überlegenheit zeigt sich beispielsweise darin, daß bei Fixierung des Enzyms Urease an DEAE-Cellu- lose nach dem bekannten Triazinverfahren ein Produkt mit einer Aktivität von 4,9 U/g erhalten wird. Bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird bei Einsatz einer gleichen enzymatischen Aktivität ein Produkt mit 1200 U/g als Lyophilisat erhalten, welches auch nach wochenlanger lagerung bei einer Temperatur von 54 C keine Aktivität verliert.

Ähnlich konnte nach dem oben erwähnten bekannten Verfahren das Enzym Glucoseoxydase zwar in einer Aktivität von 300 U/g Lyophi-

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lis.at an Cellulose gebunden werden. !fach 11-tätiger Lagerung war

aber

die Aktivität bereits auf weniger als die Hälfte gesunken. Müdem erfindungsgeisäßen Verfahren konnten bei Einsatz gleicher Mengen Enzym fast doppelt ao hohe Aktivitätsausbeuten erhalten werden und das erhaltene Produkt konnte anschließend langer alsein halbes Jahr'im ständigen Einsata als Katalysator gehalten v/erden, ohne daß eine wesentliche Aktivitätsabnahuie erfolgte.

Bei Anwendung der besonders bevorzugten Ausführungsforia des.Yer·- fahrens durch Polymerisation in Gegenwart olefinisch ungesättigter Monoroerer wie insbesondere von Acrylsäure- und Methacryleäurederivaten ergibt sich weiter Stabilität gegenüber Hikroorganisaenbefall, gut beherrschbares Quellungsverhalten (wichtig, falls Eignung zur Säulenfüllung gewünscht wird) sowie leichte Einstellbarkeit der gewünschten ladung bzw. Ladungsfreiheit.

Ganz allgemein besteht ein Y_oraug des erfindungsgemäßen Terfab?:en£ auch in der besonderen Einfachheit seiner Durchführung.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter. Beispiel 1

Ausgangssubstanzen:

0,1 g Glucoseoxydase (GOD), 220 ü/mg,

Acrylamid,

Acrylsäure-(2,3-epoxypropylester),

M^üP-Mettaylen-bis-acrylamid,

3-Dimethylaaino-propionitril,

Anraoniumperoxydisulfat

Methode:

0,1 g GOD werden ia 2 hI o,? M T'riäthanolaininpuffer₅ pH = 8,0,

il Ac r,

unter Stickst of f atmosphäre bei 3O⁰O gelöst, rait 0,2!? ral Acryl-

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1-θ- -

ßäure~(2,3"epo3rypropyleater) versetzt und 30 Kinuten gerührt.

Anschließend wird auf +10⁰O gekühlt, ta it 3 g Acrylamid und 0,1 g ITjl-T'-Methylen-bis-acrylamid,-gelöst in ,18 ml destilliertem Was-

ser, versetzt.

Unter Stickstoffatmosphäre wird nach etwa 15 Minuten die Polymerisation mit 0,5 ml 5-proz;. 3-Dimethylamino-propionitril und 3 ml 5-proz. Ammoniumperoxydioulfat gestartet« Die Lösung wird nach etwa 5 Minuten zunächst viskos bis sie dann zu einem gelben,

klaren und steifen Gel auspolymerisiert. Der Polymerisationsblock wird etwa 18 Stunden im Kühlschrank stehen gelassen. •Das Polymerisat wird anschließend durch ein Metallsieb mit 0,5 mm Durchmesser gedruckt und mit et via 2 000 ml destilliertem Wasser gewaschen. Die Gel-Partikelchen v/erden in eine Säule mit 2 cm Innendurchmesser gefüllt und mit 0,2M Kalium-Phosphatpuffer j pH = 7,5, von adsorbtiv gebundener GOD ausgewaschen, bis im Eluat keine Aktivität mehr zu testen ist.

Im Eluat werden 10 $ der ursprünglich eingesetzten Enzym-Aktivität getestet.

Die enzymatische Aktivität des trägergebundenen Enzyms als Lyophilisat beträgt 500 U/g.

Beispiel 2 (Tergleichsbeispiel)

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch wurde in Abweichung von der Erfindung die Epoxyverbindung weggelassen.

3,0 g Acrylamid und 0,1 g Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid werden in 18 ml destilliertem Wasser unter Rühren und Auskühlung mit 0,1.g GOD, gelöst in 2 ml 0,05 M l'riäthanolamin-Puffer, pH = 8,0, versetzt. Anschließend wird wie in Beispiel 1 unter Stickstoffatmosphäre die Initiatörlösung zugegeben und das Produkt wie in Beispiel 1 beschrieben aufgearbeitet.

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at werden etwa 4-0 /f der eingesetzten Aktivität ungebunden, wiedergefunden. ITach- Lyopbilisierung des oriialteneri Produkte.:! beträgt die Aktivität des L/ophilisats 90 bis 100 U/g.

Beispiel 3

Ausgangssubs tanzen:

GOD-I, 220 U/mg

Acrylamid5 ■ - '

™ Acrylsäure-(2,3-epoxypropyleßter)i
ITjlT'-Hethylen-bis-acrylaniid»
3-Ditnethy-lainino-propionitril,
Araooniumperoxydisulfat

Methode:

0,15 g GOD werden in 1,5 nil destillierten) Wasser und 1,5 ml ■ , 1,0 M Triäthanolamin-Puffer, pH = 8,0, unter Stickstoffatmosphäre auf +10⁰C gekühlt. Diese Lösung wird mit 3,0 g Acryl-. amid und 0,1 g Ν,Ν'-Methylen-rbis-acrylaiBid, gelöst in 14- nil Wasser, versetzt. .

^ Unter Zugabe von 0,25 ral Acrylsäure-(2«3~epoxypropylester) v/ird die Reaktion mit 0,5 ml 5 ^ 3-Diraethylaaino-propionitril und 0,2 ml 5 i° Ammoniumperoxydisulfat gestartet. Die Polymerisationsdauer beträgt etwa 10 Minuten.

Der Polymerisationsblock wird wie vorher beschrieben durch ein Metallsieb gedrückt und entsprechend weiter aufgearbeitet.

ITach dem Aktivitätstest im Eluat wird das Protein 100-pros. kovalent gebunden.

Aktivität des Lyophilisats: 140 U/g.

■•A

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Beispiel 4

Ausgangesubstanzen:

GOD-I, 220 U/tDg, ' .

Acrylamid,

1--(Allyloxy)-2,3-epoxypropan,
IT, IT' -Methylen-bis-acrylamid,
3-])itjethylamino-propionitril,
Apjmoo.iuaperoxydisulfat ι

j
Methode: , ■ .

50 TDg GOD werden in 0,5 ml destilliert era Wasser und 0,5 ml 1 M Sriäthanolamin-Puffer, pH = 8,0, unter Stickstoff atmosphäre bei 30°C gelöst, mit 0,1 ml 1-(Allyloxy)-2,5-epoxypropan inkubiert (4-0 Minuten). Anschließend wird auf 10⁰O gekühlt, mit 3 g Acryl amid und 0,1 g HjN'-Methylen-bis-acrylamid, gelöst in 20 ml bi~ destilliertem Wa'sßor, versetzt.

Die v/eitere Aufarbeitung erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben.

Im Bluat v/erden 10 ^cß> der ursprünglich eingesetzten Enzyra-Aktivi tat getestet.

Aktivität des Lyophilisats: 210 U/g.
Beispiel 5

Ausga'ngssubstanzeii:

TJricase, 4,5 U/mg, in 50 $ Glycerin, 0,05 M Glycin und 0,13 M Acrylamid, ^Na2^CO3 ^gelÖ8t'

Acrylsäure-(2,3-epoxypropylester),

NjH'-Methylen-bis-acrylamid,

iJ-Dimethylatnino-propionitril,

AmtDoniuaperoxydxGulfat

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Methode:

10 rag Uricase werden gegen 1 1 0,01 H Glycin-Puffer, pH = 10, bei 4⁰C et v/a 4 Stunden dialysiert. Das Dialysat wird rait 1 al 1 M ^ri'riäthari.olaT3inpuffcr, pH = 8,0, versetzt. Bei 10⁰C wird unter Stickstoffatmosphäre in Gegenwart von 0,1 ml Acrylsäure-(2,.3-epoxypropylester) inkubiert und 30 Minuten gerührt.

Die Aufarbeitung erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben. Aktivität des lyophilisats: 3,5 U/g.
Beispiel 6

Ausgangssubstanzen:

Hexokinase, 140 U/mg,

Acrylamid,

Acrylsäure-(2,3-epoxypropylester)»

N,IT' -Methylen-bis-acrylamid,

3-DiraethylatDino-propionitril,

Atntnoniunrperoxydisulfat

Methode:

20 rag Hexokinase-Kristallsuspension werden in 5 ml ¥_asser gelöst und gegen 1 1 0,01 M Triäthanolarain-Puffer, pH = 8,0, bei 4°C dialysiert. In Gegenwart von Acrylsäure-(2,3-epoxypropylestar) wird unter Stickstoxfatraosphäre bei 10 G inkubiert und nach 30 Minuten auf 10⁰C gekühlt. Die Enzyralösung wird mit 3 g Acrylamid und 0,1 g IT,If'-Methylen-bis-acrylaraid, gelöst in 20 ral destilliertem Wasser, versetzt.

Die weitere Aufarbeitung erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben.

Aktivität des Lyophilisats: 12 U/g.

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Claims

Pat entatisprüche

1. Verfahren zur Herstellung von trägergebundenen Proteinen, dadurch gekennzeichnet,daß ein Protein in wässriger Lösung mit ein-jr Verbindung umgesetzt wird, welche mindestens eine Epoxygruppe und mindestens eine v/eitere, zur Herstellung einer Bindung mit einem Träger geeignete funktionelle Gruppe aufweist und anschließend diese v/eitere funktionelle Gruppe mit einer !Prägersubstanz verknüpft wird. .

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die l'rägersubstanz in der gleichen wässrigen Lösung durch Polymerisation von Monomeren hergestellt v/ird.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung des Proteins mit der Epoxyverbindung in Anwesenheit des oder der polymerisationsfähigen Monomeren erfolgt und anschließend die Polymerisation unter Einpolymerisation des Epoxyverbindung-Protein-Produktes .vorgenommen wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das polymerisationsfähige Monomere bzw. die Monomerenmischung der Lösung nach der Umsetzung des Proteins mit der Epoxyverbindung zugesetzt und polymerisiert wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß olefinisch ungesättigte Monomere verwendet werden und die weitere funktionelle Gruppe der Epoxyverbindung eine copolymerisationsfähige Doppelbindung darstellt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß eine Epoxyverbindung der allgemeinen Formel

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Ah

(CH₂J_n - CH - CHR₂

in. der IL einen ein- oder mehrfach ungesättigten Alkylrest, der gegebenenfalls mindestens eine Oxogruppe In Nachbarschaft zu einer Doppelbindung enthält und R₂ ein viasserst off atom "oder eine niedrig-Alky!gruppe bedeutet, verwendet wird.

k 7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Monomer ein Acrylsäure-', Methacrylsäure- oder Vinylalkoholderivat oder eine Mischung davon verwendet wird.

8. An einen wasserunlöslichen !Träger gebundenes Protein, dadurch gekennzeichnet, daß es nach dem Verfahren eines der Ansprüche 1 bis 7 erhalten wurde*

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