DE2128743B2 - Verfahren zur Herstellung von trägergebundenen Proteins - Google Patents

Description

O
Rj (CH₂)„ CH CHR₂

in der Ri einen ein- oder mehrfach ungesättigten Alkylrest oder einen ein- oder mehrfach ungesättigten Alkylrest, der mindestens eine Oxogruppe in Nachbarschaft zu einer Doppelbindung enthält, η die Zahl 0,1 oder 2 und R: ein Wasserstoffatom oder eine niedrig-Alkylgruppe bedeutet, verwendet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Monomer ein Acrylsäure-, Methacrylsäure· oder Vinylalkoholderivat oder eine Mischung davon verwendet wird.

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von trägergebundenen Proteinen.

Das Interesse an trägergebundenen Proteinen, insbesondere trägergebundenen Enzymen, nimmt standig zu, und es wurden schon zahlreiche Trägersubsianzen und Fixierungsmethoden beschrieben. Nur wenige der bisher bekannten Methoden und Trägersubstanzen führen jedoch zu wirklich befriedigenden Produkten mil hoher Aktivität und guter Ausbeute und ausreichender Stabilität. Es sind clahr: bisher im Handel nur wenige trägergebundene Enzyme erhältlich, wobei es sich noch überwiegend um die besonders stabilen proteolytischen 743

Enzyme handelt. Dies ist vor allem darauf zurückzuführen, daß die empfindlicheren Enzyme oder Enzymkomplexe bei einer Fixierung nach den bisher bekannten Methoden entweder ihre Aktivität völlig verlieren oder so instabil sind, daß sie sich für technische Zwecke nicht einsetzen lassen.

Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaltung eines besonders schonenden Verfahrens /ur Bindung w>n Proteinen an unlösliche Träger, welches zu Produkten führt, die nicht nur hohe Aktivität und Aktivitätsausbeute aufweisen, sondern vor allem auch so stabil ' ind. daß sie sich für den technischen Einsatz eignen. Erst bei Erfüllung dieser Forderungen wird es möglich, die prinzipielle Eigenschaft der enzymatisch aktiven Proteine." sich nicht zu verbrauchen und lange Zeil wiederverwendbar zu sein, technisch ausniitzbar /u

machen.

Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Herstellung von trägergebundenen aktiven Proteinen, welches darin besteht, daß ein akti\ es Protein in einer wäßrigen Lösung mit einer Verbindung umgesetzt wird, welche mindestens eine Epo\>gruppe und mindestens eine weitere, /ur Herstellung einer Bindung mit einem Träger geeignete funktioneile Gruppe aufweist, und daß anschließend diese weitere funktioneile Gruppe mit einer Trägersubstanz \e; knüpft wird.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren geht das Protein mit der epoxygruppenhaltigen Verbindung eine kovalente Bindung unter Öffnung der Epoxygruppe ein. Das so erhaltene Zwischenprodukt wird ohne weitere Isolierung mit einem geeigneten Träger verknüpft. indem die weitere funktioneile Gruppe mit der Trägersubstanz zur Reaktion gebracht wird.

Als weitere funktionell Gruppe kommen vorzugsweise solche Gruppen in Frage, welche zur Addition oder Kondensation mit der eigentlichen Trägersubstanz geeignet sind. Soweit Epoxyverbindungen mit einet kondensationsfähigen Gruppe verwendet werden, ist darauf zu achten, daß bei der Kondensation keine Substanzen abgespalten werden, welche die Aktivität des gebundenen Proteins nachteilig beeinflussen. Die Feststellung, ob bei einer bestimmten kondensatiorisfähigen Gruppe die Abspaltung zu einem Produkt führt, welches die Aktivität des eingesetzten Enzyms beeinträchtigt, läßt sich jeweils an Hand des bestimmten zu bindenden Proteins durch wenige einfache Vorversuche leicht bestimmen. Allgemeine Aussagen über die Eignung bestimmter Gruppen lassen sich nicht aufstellen, da die verschiedenen aktiven Proteine höchst unterschiedliche Empfindlichkeit aufweisen. Beispiels weise wurde gefunden, daß Abspaltung von Halogeniden bei vielen empfindlichen Proteinen zu einem Aktivitätsverlusi führt, während andere aktive Proteine hierdurch nicht nachteilig beeinflußt werden.

Ganz besonders schonend kann die Verknüpfung des Zwischenproduktes mit der Trägersubstanz durcii Einpolymerisation in die Trägersubstan/ erfolgen. Besonders bevorzugt wird daher im Rahmen des Verfahrens der Erfindung die Verwendung einer Epoxyverbindung, welche wenigstens eine copolymerisationsiahige Doppelbindung als weitere, zur Herstellung cin^r Bindung mit einem Träger geeignete funktionell.? Gruppe enthält.

Als Trägsrsubstanzen lassen sich im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens alle solchen wasserunlöslichen festen Substanzen verwenden, welche über die weitere funktionell Gruppe der EpoMyverbindung

₃ 21

unter schonenden Bedingungen in wäßriger Lösung mit dieser verknüpft w erden können. Vorzugsweise w e'rden Trägcrsubsianzen verwendet, welche hydrophil, leicht quellbar, weitgehend ladungsfrei sowie stabil gegenüber Mikroorganismen sind. Die Trägersubstanz kann als solche in die wäßrige Lösung zur Herstellung der Bindung mit dem Zwischenprodukt eingebracht werden, vorzugsweise wird die Trägersubsianz jedoch in der wäßrigen Lösung selbst durch Polymerisation wasserlöslicher Monomerer hergestellt. Bei dieser bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgeniäßen Verfahrens kann die Umsetzung des Proteins mit der Epoxyverbindung entweder bereits in Anwesenheit des oder der polymerisationsfähigen Monomeren erfolgen. wobei anschließend die Polymerisation unter Einpolymerisation des Epoxyverbindung-Protein-Zwischenproduktes vorgenommen wird, oder das pohmerisationsfäiiige Monomere oder die Monomerenmischung wird der Lösung erst nach der Umsetzung zwischen protein und Epoxyverbindung zugesetzt und dann die Polymerisation ausgelöst.

Als Monomere kommen im Rahmen dieser Ausführungsform des erfindungsgeniäßen Verfahrens solche wasserlöslichen Verbindungen in Frage, welche zur Polyaddition oder Polykondensation geeignet sind. Bevorzugt werden polyadditionsfähige Monomere, insbesondere solche Monomere, w eiche wenigstens eine olefinische Unsälligung enthalten. In diesem Falle stellt die weitere funktionell Gruppe der Epoxyverbindung ebenfalls vorzugsweise eine copolvnierisationsfähigc Doppelbindung dar.

Bevorzugte Epoxyverbindungen für die obige Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens entsprechen der allgemeinen Formel

35 O

/ \
R₁-(CH₂I₁₁-CH CHR₂

in der Ri einen ein- oder mehrfach ungesättigten Alkenylrest, Alkenyloxyrest oder einen ungesättigten Acyirest. dessen CO-Gruppe vorzugsweise in Konjugalion mit einer C-C-Doppelbindung steht. /? die Zahl 0. 1 oder 2 und R: ein Wasserstoffaiom oder eine niedrig-Alkylgruppe bedeutet. Unter niedrig-Alkylgruppe wird hierbei eine gerade oder verzweigte Gruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen verstanden. Die Gruppe Ri weist vorzugsweise 2 bis 6 Kohlenstoffatome auf. Es kommen jedoch auch längere Gruppen in Frage, soweit hierdurch die Wasserlöslichkeit der Epoxyverbindung nicht zu stark verringert wird. Eine besonders bevorzugte Gruppe von Epoxyvcrbindungen läßt sich vom 2.3-Epoxypropanol. bei dem gegebenenfalls ein Wasserstoffatom durch eine niedrige Alkylgruppe ersetzt ist, das mit einer weiteren olefinisch ungesättigten Verbindung unter Ester- oder Ätherbildung verbunden ist, ableiten. Beispiele für geeignete Gruppen Ri sind die Allyloxy-, Meihylallyloxy-, Äthylallyloxy-. Dimethylallyloxy-, Melhylälhylallyloxy-. Propylallyloxy- und Diäthylallyloxygruppe sowie weitere Allyloxyhomologe, die noch ausreichend wasserlöslich in Verbindung mit dem epoxygruppenhaltigen Molekülteil sind. Besonders bevorzugt ist Ri auch eine Acylgruppe. in der eine Oxogruppc in Konjugation mit einer Doppelbindung steht. Diese sogenannten »Michael-Systeme« ermöglichen einerseits eine besonders schonende Verknüpfung mit dem !rager und sind andererseits besonders wasserlöslich. Derartige Gruppen Ri leiten sich beispielsweise von <v/J-ungesättigten Säuren wie Acrylsäure, Methacrylsäure, Pumarsäure und Maleinsäure ab. Beispiele für derartige Verbindungen der obigen allgemeinen Formel sind

Acrylsäure-(2.3-epoxypropylesier),

Meihacrylsäure-(2,3-epoxypropylester).

Ma!einsäure-(2,3-epoxypropylmonoester),

M aleinsäure-(2,3)-cpoxypropy !diester).

Fumarsäureepoxy-(2,3-epoxyptOpylmonoester).

Fumarsäure-(2.3-epox\ props !diester).

Acrylsäure -(2.3-epox\buiy tester),

Acrylsäure-(2.3-epoxypentylestcr).

•\erylsäurc-(2.3-epoxyhexy tester),

die entsprechenden Ester der Methacrvl-. Fumar-Lind Maleinsäure.

! -(Allyloxy)-2,3-epoxybutan u. dgl.
Das bei der bevorzugten Ausführungsl'orm des erfindungsgemäßen Verfahrens zugesetzte Monomer muß. wie bereits erwähnt, wasserlöslich sein und gleichzeitig eine polymerisationsfähige olefinische Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung enthalten. Vorzugsweise werden auch hier Verbindungen mit dem Michael-System, also mit einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung in Nachbarschaft zu einer Kohlenstol'l-Sauerstoff-Doppelbindung, verw endet. Besonders bevorzugt werden als Monomere die wasserlöslichen Derivate der Acrylsäure oder Methacrylsäure, wie beispielsweise die Amide. Nitrile und Ester dieser Verbindungen. Ganz besonders gute Ergebnisse w urden unter Verwendung von Acrylamid er/ielt. Die Verbindungen können auch durch Alkylreste substituiert sein, solange hierdurch die Wasscrlöslichkeil der Verbindung nicht /u sehr herabgedrückt w ird. Derartige Verbindungen mit verringerter Wasscrlöslichkeit sind jedoch von Vorteil, falls später das trägergebundcne Enzym im nicht reinwäßrigen System eingesetzt werden soll beispielsweise in einem wäßrig-organischen Medium Auch die entsprechenden Derivate der Malein- odei Fumarsäure sind gut geeignet.

Alternativ können auch nicht wasserlösliche Monomere verwendet werden. In diesem Falle wird die Polymerisation nicht in Lösung, sondern in Suspensior durchgeführt. Letztere Methode ist von Vorteil, falb eine feinteilige perlförmige Matrix ohne Qucllfähigkeii in wäßrigen Systemen gewünscht wird. Die nacr bekannten Methoden der Suspensionspolymerisiitior (Perlpolynierisation) erhaltenen Polymerisatkiigelcher enthalten dann an ihre Oberfläche anpolymerisiert da< Protein- Epoxy verbindung- A nlagcrungsprodukt.

Es kann ein einziges polymerisationsfähiges Mono mer oder eine Mischung von Monomeren verwende werden. Es ist auch möglich, ein noch ungesättigt« Gruppen enthaltendes Vorpolymerisat zusammen mi einem Monomer einzusetzen.

|e nach der gewünschten Konsistenz des Endproduk tes werden dem Monomer noch Vernetzen erbindun gen zugesetzt, die mehr als eine polymerisalionsfähigt Gnippe enthalten. Beispiele für derartige Vernetze sind N.N'-Methylen-bis-acrylamid und Athylendiacrylai !Diese werden bevorzugt beim Arbeiten in wäßrige Lösung. Falls eine Polymerisation in heterogener Phase also eine Suspensionspolymerisation, durchgeführt wire können auch wasserunlösliche Vernetzet·, wie ζ. ΐ· Divinvlbenzol und Äthylen-di-methacrylat. verwende werden Zahlreiche andere Vernetzer sind den Fachmann bekannt und die geeignete Auswahl in jeweiligen Falle zu treffen, liegt im Rahmen fachmänni

schon Handelns. Es ist auch möglich, nach dem erfiudungsgemäßen Verfahren erhaltene irägergebundcne Proteine, deren Träger nicht vernetzt ist. noch nachträglich zu vernetzen.

Wird kein Vernetzer verwendet, so erhält man Trägermaterialien. welche löslich oder thermoplastisch sind. Eine Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens in dieser Form führt zu spinnfähigen oder extrudierbaren Lösungen, aus denen die trägrrgebundenen Proteine z. B. in Fadenform oder in Form von Folien nach an sich bekannten Methoden erhalten werden können. Derartige mit aktiven Proteinen kovulcni gebundene Fäden oder Folien können nach den Methoden der Kunststofftechnik verstreckt, gesponnen und zu sonstigen Produkten verarbeitet werden, welche die aktiven Proteine gebunden enthalten und für Zwecke eingesetzt werden können, in denen diese Formen besondere Vorteile bieten, beispielsweise zur Herstellung von enzymatisch aktiven Sieben, Geweben,einpflanzbaren Fäden u.dgl.

Zum Verspinnen aus wäßriger Lösung kann beispielsweise das Vakuum-Spinnverfahren angewendet werden, bei dem die Lösung durch eine Spinndüse in ein Vakuum ausgepreßt wird. Dies kann unter den Bedingungen einer Lyophilisierung erfolgen, die von den meisten aktiven Proteinen ohne Aktivitätsverlust ertragen wird. Wesentlich ist für das erfindungsgemäße Verfahren weiter, daß zuerst das Protein mit der Epoxyverbindung umgesetzt und erst dann das erhaltene Zwischenprodukt an die Trägersubstanz fixiert wird. Die Umsetzung des Proteins mit der F.poxyvcrbindung bedarf normalerweise keiner besonderen Maßnahmen. Es genügt. Protein und Epoxyverbindung gemeinsam bei Normallempcratur in wäßrige Lösung zu bringen. Zweckmäßig wird dabei in gepufferter wäßriger Lösung eines pH-Werts, der für das jeweilige Protein zweckmäßig ist. gearbeitet. Die Dauer der Umsetzung zwischen Protein und Epoxyverbindung hängt von den jeweils zu verwendenden Substanzen ab, liegt jedoch im allgemeinen zwischen etwa 5 Minuten und 1 Stunde. Längere oder kürzere Inkubationszeiten können jedoch von Fall zu Fall ebenfalls zweckmäßig sein.

Die Umsetzung von Protein und Epoxyverbindung kann, wie erwähnt, in Gegenwart des Trägers bzw. der Ausgangsprodukte für den Träger durchgeführt werden. Zweckmäßig wird im letzteren Falle die Polymerisalionsreaktion nach Bildung des Vorproduktes durch Zugabe des Initiators gestartet. Als Initiatoren sind die üblicherweise in der Polymerchemie gebräuchlichen Initiatoren und Katalysatoren verwendbar, soweit sie die Aktivität des Proteins nicht nachteilig beeinflussen. Als Initiatoren bzw. Katalysatoren kommen bei Verwendung von olefinisch ungesättigten Monomeren bzw. Vorpolymeren z. B. anorganische oder organische Peroxyde, Azoverbindungen u. dgl. in Betracht. Zusät/ lieh können Rcaktionsbeschlcuniger wie Amine u.dgl. verwendet werden. Bei der Verwendung von Acrylsäure- oder Methacrylsäurcderivaien als Monomere hat sich die Verwendung einer Initiatorkombination aus einem Peroxydisulfat und einem Amin, wie 3-Dimethylaminopropionitril, besonders bewährt.

Bei Anwendung dieser Initiatorkombination wird zweckmäßig unter inerter Atmosphäre, z. B. unter Stickstoff, gearbeitet.

Die Gewinnung des Verfahrensproduktes erfolgt. soweit direkt unlösliche Substanzen gebildet werden, durch einfaches Abfillricrcn und Waschen. Falls die Triiirer nicht vernetzt sind und in Lösung verbleiben.

wird in üblicher Weise Jas Lösungsmittel entfernt, beispielsweise wie oben erwähnt durch Vakuumverspin

Das erfindungsgemäße Verfahren bringt eine Rfunwesentlicher Vorteile. Von besonderer Bedeutung ist hierbei, daß es erfindungsgemäß möglich ist, empfindliche Proteine und Proleinverbände, z. B. Enzyme, die aus mehreren Untereinheiten zusammengesetzt sind, ohne großen Verlust der Aktivität an Träger zu binden. Bu den bisher bekannten Methoden zur Fixierung an Trägern wurden derartige emplindiichc Proteine in fast allen Fällen desaktiviert bzw. Präparate von geringer Haltbarkeit und geringer Aktivität erhalten. Das erfindungsgemäßc Verfahren ermöglicht demgegenüber cmc Verknüpfung auf besonders schonende Weise. Weiter wird durch das erfindungsgemäßc Verfahren ein gewisser räumlicher Abstand des gebundenen Proteins von der eigentlichen Matrix bzw. Trägersubstanz erzielt, da die Epoxydverbindung als Zwischenglied eingeschaltet ist. Bei Qucllungsvorgängen u.dgl. wird dabei der Enzym- bzw. Protcinverband geschont. Diese Überlegenheit zeigt sich beispielsweise darin, daß bei Fixierung des Enzyms Urease an DEAE-Cellulosc nach dem bekannten Triazinvcrfahrer. ein Produkt mit einer Aktivität von 4,9 U/g erhalten wird. Bei Anwendung des erfiudungsgemäßen Verfahrens wifd bei Einsat/ einer gleichen enzymatischcn Aktivität ein Produkt nut 1200 U/g als Lyophilisat erhalten, welches auch nach wochenlanger Lagerung bei einer Temperatur von 34 C keine Aktivität verliert.

Ähnlich konnte nach dem obenerwähnten bekannten Verfahren das Enzym Glucoscoxydasc zwar in einer Aktivität von 300 U/g Lyophilisat an Cellulose gebunden werden. Nach 11 lägiger Lagerung war die Aktivität aber bereits auf weniger als die Hälfte gesunken. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren konnten bei Einsat/ gleicher Mengen Enzym fast doppelt so hohe Aktivitätsausbeuten erhalten werden, und das erhaltene Produkt konnte anschließend langer als ein halbes Jahr im ständigen Einsatz als Katalysator gehalten werden ohne daß eine wesentliche Aktivitätsabnahme erfolgte.

Bei Anwendung der besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens durch Polymerisation in Gegenwart olefinisch ungesättigter Monomeren wie insbesondere von Acrylsäure- und Meihacrylsäurederivatcn. ergibt sich weiter Stabilität gegenüber Mikroor ganismenbefall, gut beherrschbares Quellungsverhalten (wichtig, falls Eignung zur Säulcnfüllung gewünscht wird) sowie leichte Einstcllbarkeit der gewünschten Ladung bzw. Ladungsfreiheit.

Ganz allgemein besteht ein Vorzug des erfindungsgemäßen Verfahrens auch in der besonderen Einfachheit seiner Durchführung.

Aus der DT-OS 19 15 970 ist ein Verfahren bekannt, bei welchem ein Träger mit einer Lösung mindestens einer aktiven Proi.einsubstanz in Gegenwart eines Brückenbildncrs in Berührung gebracht wird. Diese einstufige Arbeitsweise ergibt wesentlich schlechtere Aktivitätsausbeuten als die erfindungsgemäßc Arbeitsweise, was durch die Beispiele 1 (erfindungsgemäß) und Vergleichsbeispiel 2 veranschaulicht wird. Hiervon abgesehen ist es aus dieser Literaturstellc nicht bekannt, ein aktives Protein mit einer Verbindung umzusetzen, welche mindestens eine Epoxygruppe und mindestens eine weitere, zur Herstellung einer Bindung mit einem Träger geeignete funktionclle Gruppe aufweist.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

Ii e i s ρ i e I 1
AusgangsMibstanzen

O.I g Glueoseoxydase (CiC)D). 220 U/mg.

Acrylamid.

Acrylsäure-(2.3-cpox>propylcster).

N.N'-Methylen-bis-acrylamid.

3-Dimcthylamino-piOpioiiitril,

Ammoniumperoxydisulfal

Methode

0.1 g GOD werden in 2 ml 0.5 M Triälhanolaminpiiffer. pH = 8,0. unter Siickstoflatmosphärc bei 30 C gelöst, mit 0,25 ml Acr\lsäurc-(2.3-cpoxyprop>lcster) versetzt und 30 Minuten gerührt.

Anschließend wird auf +10 C gekühlt, mit 3g Acrylamid und 0.1 g N.N'-Mcthylcn-bis-acrylamid. gelöst in 18 ml destilliertem Wasser, versetzt.

Unter Stickstoffatmosphäre wird nach etwa 15 Minuten die Polymerisation mit 0.5 ml 5pro/entigcm 3-Dimethylamino-propionitril und 3 ml 5pro/cntigcni Ammoniumpcroxydisulfat gestartet. Die Lösung wird nach etwa 5 Minuten zunächst viskos, bis sie dann zu einem gelben, klaren und steifen Gel auspolymerisiert. Der Polymerisationsbloek wird etwa 18 Stunden im Kühlschrank stehengelassen. Das Polymerisat w ird anschließend durch ein Mctallsieb mit 0.5 mm Durch messer gedruckt und mit etwa 2000 ml destilliertem Wasser gewaschen. Die Gcl-Parlikelchen werden in eine Säule mit 2 cm Innendurchmesser gefüllt und mit 0.2 M Kalium-Phosphalpufkr. pH = 7.5. von adsorbtiv gebundener GOD ausgewaschen, bis im Eluat keine Aktivität mehr zu testen ist.

Im Eluat werden 10% der ursprünglich eingesetzten Enzym-Aktivität getestet.

Die enzymatischc Aktivität des trägergebundenen Enzyms als Lyophilisat beträgt 500 U/g.

Vcrgleichsbcispiel 1

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch wurde in Abweichung von der Erfindung die Epox ν verbindung weggelassen.

3.0 g Acrylamid und 0.1g N.N'-Methylen-his-acrvlamid werden in 18 ml destilliertem Wasser unter Rühren und Auskühlung mit 0.1 g GOD. gelöst in 2 ml 0.05 M Triäthanolamin-Puffcr. pH = 8,0. versetzt. Anschließend wird wie in Beispiel 1 unter Stieksloffalmosphäre die Initiatorlösung zugegeben und das Produkt, wie in Beispiel 1 beschrieben, aufgearbeitet.

Im Elual werden etwa 40% der eingesetzten Aktivität ungebunden wiedergefunden. Nach Lyophilisierung des erhaltenen Produkies beträgt die Aktivität des Lyonhilisats90bis100U/g.

Vergleichsbeispiel 2
Ausgangssubstanzen

GOD-1.220 U/mg

Acrylamid,

Acrylsäure-(2.3-cpoxypropylcster).

N.N'-Methylcn-bis-acrylamid.

3-Dimethylamino-propionitril.

Ammoniumpcroxydisulfat

Methode

0.15 g GOD werden in 1.5 ml destilliertem Wasser und 1.5 ml 1.0 M Triäthanolamin-Puffer. pH = 8.0. unter

ίο

Stickstoffatmosphäre auf + IOC gekühlt. Diese Lösung wild mit 3.0g Acrylamid und 0.1 g N.N'-Methylen-bisacrylamid. gelöst in 14 ml Wasser, versetzt.

Unter Zugabe von 0.2 5 ml Acr>lsäurc-(2.3-cpoxypropylcster) wird die Reaktion mit 0.5 ml 5% 3-Dimethylamino-propionitril und 0.2 ml 5% Ammoniumpcroxydisulfat gestartet. Die Pohnierisaiionsdauer beträgt etwa 10 Minuten.

Der Polymcrisationsbiock wird, wie vorher beschrieben, durch ein Metallsieb gedruckt und entsprechend weiter aufgearbeitet.

Nach dem Aktivitätstest im Eluat wird das Protein lOOprozentig kovalent gebunden.

Aktivität des Lyophilisais: 140 U/g.

Beispiel 2

Ausgangssubsian/cn

CiOD-I. 220 U/mg.

Acrylamid.

1-( Ally loxy)-2.3-epo\y propan.

N.N'-Methylen-bis-acrvlamid.

3-Dimethylamino-propionitril.

Ammoniumperoxydisulfal

Methode

50 mg GOD werden in 0.5 ml destilliertem Wasser und 0.5 ml 1 M Triäthanolamin-Puffer. pH = 8.0, unter Stickstoffatmosphäre bei 30C gelöst, mil 0.1 ml 1-(Allyloxy)-2.3-cpoxypropan inkubiert (40 Minuten). Anschließend wird auf IOC gekühlt, mit 3 g Acrylamid und 0.1 g N.N'-Mcthylcn-bis-acrylamid. gelöst in 20 ml bidestillicrtem Wasser, versetzt.

Die weitere Aufarbeitung erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben.

Im Elual werden 10% der ursprünglich eingesetzten Enzym-Aktivität getestet.

Aktivität des l.yophilisals: 210 U/g. 40

Beispiel 3

Ausgangssubslanzcn

Uricasc.4.5 U/mg. in 50%Glycerin.

0.05 M Glycin und 0.13 M Na:COi gelöst.

Acrylamid.

Acrylsäurc-(2.3-cpoxypropy tester).

N.N'-Mcthylcn-bis-acrylamid.

3-Dimethylamino-propionitril.

Ammoniumperoxydisulfat

Methode

10 mg Uricase werden gegen 1 10.01 M Glycin-Puffer, pH = 10. bei 4 C etwa 4 Stunden dialysicrt. Das Dialysat wird mil 1 ml 1 M Triälhanolaminpuffcr pH = 8.0. versetzt. Bei 10C wird unter Stickstoffatmosphärc in Gegenwart von 0.1 ml Acrylsäure-(2.3-cpoxypropylestcr) inkubiert und 30 Minuten gcrühri. Die Aufarbeitung erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben.

Aktivität des Lyophilisats:3.5 U/g.

Beispiel 4 Ausgangssubstanzen

Hcxokinasc. 140 U/mg.
Acrylamid.

509548/43

Acrylsäure-(2.3-epoxypropy lesler). N.N'-Methylen-bis-acrylamid. 3-Dimethylamino-propionitril, Ammoniumperoxydisulfat

Methode

20 mg I lexokinase-Kristallsuspension werden in 5 ml Wasser gelöst und gegen I 10.01 M I riäthanolamin-Pulfer. pH = 8,0. bei 4 C" dialysiert. In Gegenwart von Acrylsäure-(2.3-epoxypropylesier) wird unter Slickstoffaimosphäre bei 10 C inkubiert und nach 30 Minuten auf H)C gekühlt. Die Hnzymlösung wird mit 3 g Acrylamid und 0.1 g N.N'-Methylcnbis-aerylamid. gelöst in 20 ml destilliertem Wasser, »'ersetzt.

Die weitere Aufarbeitung erfolgt wie im Beispiel 1 beschrieben.

Aktivität des l.yophilisais: 1 2 I l/g.

Beispiel 5 Ausgangssubstan/en

100 mg Insulin-R.

Acrylamid.

Acrylsäure^J-epoxypropy !ester.

N.N'-Melhylen-bis-aerylamid.

3-Dimethylamino-propioniiril.

Ammoniumperoxidisiillai

Methode

100 mg lnsulin-R worden in K)OmI Phosphat-Puffer. pH = 8.0. suspendiert und mit wenigen Tropfen I M Natronlauge in Lösung gebracht. Die Proleinlösung wird mit 100 μΙ Acrylsäure-2.3-epoxypropylesier versetzt und etwa 1 Stunde bei +4 C" unter Stickstol'fatinosphärc gerührt. Anschließend, wird mit 2.5 g Acrylamid. 0.5 ml 5^1!/tiigeni Pcrnxidisulfai und 0.5 ml 5%igem 3-Dimelhylamino-propioniti'il versetzt. Der nach 1 bis 2 Stunden entstehende Polymerisaiionsblock wird, wie in ilen Beispielen 1 bis 6 beschrieben, aufgearbeitet.

Das am Träger gebundene Insulin wurde qualitativ durch Totalhydrolyse und anschließende Auftrennung der Aminosäuren an Hand bekannter düunschichlchromatographischer Techniken naehgew iesen.

Der Insulingeh.ilt wurde so zu 4.35% bestimmt.

Die Aktivität des so hergestellten Produktes wurde im l-'eitzellversuch bestimmt, wobei die C ' K):-Bildung aus ("'■'-Glucose gemessen wird als Parameter für die Aufnahme von exirazelhilärcr Glucose durch die isolierte lettzelle. Diese C ¹¹Oj-BiIdUtIg wird durch Insulin stimuliert. Im Vcrgleichsversuch wurde mit nativem Insulin eine Maximalstimulierung der O¹O:- Biklung von 600%. bezogen auf die Kontrolle, erzielt. Das erfindiingsgemaß erhaltene tragergebundene Insulin, welches in einer dem naliven Insulin gleichen Menge bezüglich des Insulingehallcs eingesetzt wurde, erreichte eine maximale O ^J0:-Produkiion von 950¹Vn. bezogen auf die Kontrolle. Ils war damit dem nativen Insulin klar überlegen.

ln-vi\o-Versuche an Ratten sowohl s. c. als auch i. p. ergaben eine deutlich bessere Wirksamkeit des erfindiingsgemäßen Produktes im Vergleich /u einem anerkannt guten handelsüblichen Insulin. So sank bei Verabreichung von 2.5 1) Altinsulin/kg der Blutzucker innerhalb von 60 Minuten von 120 auf 50. beim erfindungsgemäßen Produkt in gleicher Menge auf 30. Nach 480 Minuten war der Blutzuckergehalt beim Allinsulin 108. beim erfindungsgemäßen Produkt 85.

Vergleichsbeispiel 3 Nacharbeitung von Beispiel 1 der DT-OS 20 53 7 33

1 ml I.-Asparaginaselösimg mit einer spezifischen Aktivität von 110 U/mg (entspricht 1mg Protein) werden in 4 ml 0,1 M Tris-Puffer. pH 8,6. mit 0.32g Acrylamid und O.O7 3g N.N'-Melhy len-bis-acrvlaniid versetzt und. wie in Beispiel I der DT-OS 20 53 713 beschrieben, w eiter aufgearbeitet.

Das erhaltene feste Gel wird durch ein Meiallsieb mit 0.315 mm offener Porenweite gedruckt, mehrfach gewaschen und lyophilisieri. Die spezifische Aktivität benagt i2 U/g l.yophilisat.

Zur Prüfung der kovalenlen Bindung bzw. des Ausbliiieiis des Proteins werden 20 mg l.yophilistit mit 5 ml 0.1 M Tns Puffer. pH N.6. gerührt, anschließend ab/entrilugieri. und im Überstand wird, noch vorhandenes Protein bei 200 mn gemessen. Die Extinktion des Überstands betrug 0.1¹I.

Das folgende Beispiel beschreibt die erfindungsgeniäl.le Herstellung von gebundener Asparaginasclösung unter genau vergleichbaren Bedingungen.

Beispiel b

lixicrung von !.-Asparaginase nach den Verfahren der Vorinkubaiion mit Acrylsäure-2.3-epox\prop\ lest er

AusgangsMibstanzen

0.2 ml Asparaginase, entsprechen 1 mg Kn/\mpiotein mit einer spezifischen Aktivität von 110 U/mg. 0.02 ml Acr\lsaure-2.3-epo\yprop\lesier. 3W) mg Acrxlamid.
24 mg N.N'-Meihvlen-bis-aervkimid. 0.1 ml VA) 3-Dimeih\lamiiio-Propionitril. 0.1 ml 5% Animoniumperoxidisull'ai.

Methode

0.2 ml \spaiaginase-Suspension (entsprechen 1 mg l'.n/vmprotem mn einer spezifischen Aktivität von I 10 U/mg) weiden mit 1 ml 0.1 M Tris-Puffer. pH = 8.6. aufgenommen und in Stiekstoflatmosphäre hei 25 C" mit 0.2 ml Acrvlsäure-2.3-epoxypropylesler inkubiert. Nachdem man 30 Minuten gerührt hat. wird auf IOC abgekühlt und mit 360 mg Acrylamid und 24 ms; N.N'-Meihylen-bis-acrvlamid. gelöst in 2 ml 0.1 N' Tris-Puffer. pH = 8.6. versetzt. Die Reaktion wird mi 0.1 ml 5"(i 3-Dimeihvlaminopropionitril und 0.1 ml 5¹Vi ■\mmomuinperoxidisulfat gestartet. Der PoKmerisa lions-Block wird durch ein 0.31 5-mm-Sieb gedrückt um wie in Beispiel 1 bis 6 weiter aufgearbeitet.

Die spezifische Aktivität des nach diesem Verlahrei gebundenen l'nz\ ms beträgt 60 U/g.

B e i s ρ i e 1 7

Ausgangssiibstanzen

GOD-1. 220 U/mg.

Acrylamid.

1.2-i:pox\-biiien-3.4.

N.N -Methylen-bis-acrvlamid.

3-Dimethylamino-propioniiril.

Ammoniumperoxodisulfat.

Methode

100mg GOD werden in 2 ml 0.5 M r.iäihanolamii Puffer. pH = 8.0. unter Slicksioflatmosphärc bei 30 gelöst, mit 0,05 ml 1.2-Ep₍,x\-buien-3.4 loMinun inkubiert. Anschließend wird auf 10 C gekühlt, mit 3

Acrylamid und 0.125g N.N'-Methylen-bis-acrylamid. gelöst in 18 ml bidestilliertem Wasser, versetzt.

Die weitere Aufarbeitung erfolgt wie im Beispiel I beschrieben. Im Klual werden 35"/» der ursprünglich eingesetzten l'nzymakiivitäi getestet.

Aktivität des l.yophilisats: 355 U/g.

Beispiel 8

A. Herstellung des Trägers

to

lOg Stärke (Merck. Art.-Nr. 1252) werden in 150 ml Aceton aufgeschlämmt und mit 100 ml einer 3"/<>igen Natronlauge versetzt. Zu dieser Suspension werden 28 ml Allylbromid (Schuckardi) gegeben und 2 Stunden unter Rückfluß in Stiekstoffaimosphäre erhitzt. Nach Abkühlen der Reaktion wird die entstandene Allylstiirke mit Aceton ausgefällt, gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 4.2 g.

B. Fixierung des linz.yms

300 mg Acylasc (.Schweinenieren, spezifische Aktivitiii: 20 U/mg) werden in 20 ml 0.3 M Tris-(hydroxyme thyl)-aminomethan, pH 7,5, gelöst, auf 4 C abgekühli und innerhalb von 30 Minuten mit 200 μΙ Acrylsäure-2.3 epoxypropylester inkubicrl. Diese Enzymlösung wire mit einer Lösung von 3,5 g Acrylamid. 1,5 g Star ke-Allyläther in 25 ml 0,3 M Tris-(hydroxymethyl)-ami nomcihan. pH 7,5. und mit 3 ml I "/oigein CoCI: versetzt Nach Zugabe von je 3 ml 5%igem Ammoniumperoxydi sulfat und 3 ml 5%igem Dimethylaminopropionitri v.iid der Reakiionsansatz bei 25 C in Siickstoffatmo sphäre gestartet.

Das Polymerisat wird wie vorher beschriebe! aufgearbeitet. Die spezifische Aktivität des l.yophilisatf beträgt 34 U/g.

Claims (4)

Patentansprüche: 21

1. Verfahren zur Herstellung von trägergebundenen aktiven Proteinen, dadurch gekennzeichnet, daß ein aktives Protein in einer wäßrigen Lösung mit einer Verbindung umgesetzt wird, welche mindestens eine Epoxygruppe und mindestens eine weitere, zur Herstellung einer Bindung mit einem Träger geeignete funkiionelle Gruppe aufweist und daß anschließend diese weitere funktionell Gruppe mit einer Trägersubstan/ verknüpft wird.

2. Verfahren zur Herstellung von trägergebundenen aktiven Proteinen, dadurch gekennzeichnet, daß zunächst ein aktives Protein in einer wäßrigen Lösung mit einer Verbindung, welche mindestens eine Epoxygruppe und mindestens eine weitere, zur Herstellung einer Bindung mit einem Träger geeignete funktioneile Gruppe aufweist, in Anwesenheil von polymensaiionsfähigen Monomeren umgesetzt wird und daß anschließend in dieser Lösung die Polymerisation unter Einpolymcrisation des Epoxy verbindung-akti\ es- Protein- Produktes vorgenommen wird oder daß die polymerisationsfähigen Monomeren der Lösung erst nach der Umsetzung des aktiven Proteins mit der Epowverbindung zugesetzt werden und daß sodann polymerisiert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2. dadurch gekennzeichnet, daß olefinisch ungesättigte Monomere verwendet werden und die weitere funktioneile Gruppe der Epoxyverbindung eine copolymerisationsfähige Doppelbindung darstellt.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3. dadurch gekennzeichnet, daß eine Epoxyverbindung der allgemeinen Formel