DE2656801A1 - Verfahren zur herstellung von traegerampholyten fuer die isoelektrische fokussierung von hochmolekularen amphoterischen stoffen - Google Patents

Description

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PATENTANWÄLTE

Dlpl.-lng. P. WIRTH ■ Dr. V. SCHM1ED-KOWARZIK Dlpl.-lng. G. DANNENBERG ■ Dr. P. WEINHOLD · Dr. D. GUDEL

335024 SIEGFRIEDSTRASSE

TELEFON: C0893

Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V.

Bunsenstr. 10

5400 Göttingen

Verfahren zur Herstellung von Trägerampholyten für die isoelektrische Fokussierung von hochmolekularen amphoterischen Stoffen.

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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Trägerampholyten für die isoelektrische Fokussierung von hochmolekularen amphoterischen Stoffen., Trägerampholyte stellen allgemein ein geeignetes Hilfsmittel zur Auftrennung von hochmolekularen amphoterischen Stoffen, wie z.B. Proteinen usw. dar. Bedingung hierfür ist, daß sie bei der Elektrolyse einen gleichmäßigen pH-Gradienten erzeugen. Solche Trägerampholyte bestehen vorzugsweise aus einer Vielzahl von verschiedenen chemischen Verbindungen, die sich durch die/Anzahl der basichen und sauren Gruppen voneinander unterscheiden und somit unterschiedliche isoelektrische Punkte aufweisen. Bei einem besonders geeigneten System von Trägerampholyten, liegen die isoelektrischen Punkte in einem pH-Bereich von etwa 3,5 - 10, da einerseits die Mehrzahl der zu trennenden Proteine in diesem Bereich isoelektrisch sind und andererseits für pH-Bereiche unter 3,5 bzw. über 10 ein guter pH-Gradient bei der Elektrolyse durch Verwendung eines Systems von Säuren bzw. Basen verschiedener Stärke erhalten werden kann.

Wie schon oben erwähnt, ist die weitgehend gleichmäßige Verteilung der isoelektrischen Punkte der einzelnen Verbindungen über den gewünschten pH-Bereich eine wichtige Bedingung, die an ein geeignetes System von Trägerampholyten gestellt werden muß, da nur dann ein gleichförmig verlaufender pH-Gradient erzeugt werden kann.

Aus der DT-OS 1 493 939 ist nun ein Verfahren zur Herstellung von Polyaminopolycarbonsäuren als Trägerampholyte für die isoelektrische Fokussierung bekannt. Dieses Verfahren geht von einem Polyäthylenpolyamin aus, an welches .eine oi, ß-ungesättigte Säure, beispielsweise Acrylsäure, addiert wird in der Art, daß als einfachster Ampholyt ein Polyäthylenpolyamin mit addierten Carbonsäuremoldtülund in der Folge ß-Aminopolycarbonsäuren mit steigender Anzahl von Carbonsäuregruppen im Molekül entstehen. Die Herstellungsmethode bedient sich dabei eines üblichen Verfahrens, indem zu einer wässrigen Lösung des Ausgangsamins eine bestimmte, empirisch ermittelte Menge

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der wässrigen Lösung der Carbonsäure zugetropft wird.

Dabei werden einige leicht zugängliche Verbindungen in größerer Menge anfallen, während andere schwerer zugängliche Verbindungen in nur geringerer Konzentration entstehen. Die Grundvoraussetzung für ein brauchbares Trägerampholytengemisch, nämlich eine gleichmäßige Verteilung der Pufferkapazität und der Leitfähigkeit im ausgebildeten pH-Gradienten, erfordert nun, daß die verschiedenen Komponenten des Trägerampholyten in etwa gleich großer Konzentration vorliegen. Aus diesem Grund wird nach der Reaktion zur Trennung
/eine Elektrolyse in einer aufwendigen Multikompartmentanlage durchgeführt, wobei nach beendeter Elektrolyse aus den einzelnen Kompartimenten entsprechende Anteile entnommen werden und aus diesen ein geeignetes Trägerampholytengemisch gemischt wird.

Da die Reaktion der Carbonsäure mit dem Polyäthylenpolyamin bei Zimmertemperatur praktisch nicht abläuft, muß bei höheren Temperaturen gearbeitet werden, was jedoch zu Nebenreaktionen und letäHch zu einer unerwünschten Braunfärbung des Endproduktes führt. Abgesehen davon geht die Reaktion des Amins mit der Carbonsäure auch bei höheren Temperaturen nur sehr langsam vor sich, so daß das bekannte Verfahren mit einem erheblichen Zeitaufwand verbunden ist.

Die vorliegende Erfindung betrifft nun ein Verfahren zur Herstellung eines Systems von amphoter!sehen Trägern auf der Basis einer organischen Verbindung mit wenigstens 2 Amino- und/oder Iminogruppen, und einer Carbonsäureverbindung, die eine Kohlen-

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stoff-Kohlenstoff-Doppelbindung aufweist, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß als Carbonsäureverbindung ein Carbonsäureester eingesetzt, und das erhaltene Aminocarbonsäureestergemisch anschließend in an sich bekannter Weise hydrolysiert, und gegebenenfalls isoliert wird.

Anstelle des einen Amins können auch Amingemische und anstelle des einen Carbonsäureesters können auch Gemische von verschiedenen Carbonsäureestern, die 1 Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung aufweisen, verwendet werden.

Das vorliegende Verfahren hat nun gegenüber dem bekannten Verfahren den Vorteil, daß die Carbonsäureester überraschenderweise wesentlich schneller mit dem Amin reagieren als die entsprechenden Carbonsäuren und das erfindungsgemäße Verfahren somit eine erhebliche Zeitersparnis· mit sich bringt. Darüberhinaus kann das vorliegende Verfahren praktisch bei Zimmertemperatur oder leicht erhöhten Temperaturen durchgeführt werden und es tritt dabei allenfalls eine schwache Gelbfärbung des Endproduktes auf, die in einfacher Weise durch Behandlung des Syntheseproduktes in einer Wasserstoffatmosphäre unter Verwendung eines geeigneten Katalysators, z.B. eines Edelmetallkatalysators, entfernt werden kann.

Das Verfahren kann nun in üblicher Weise durchgeführt werden, indem man den Carbonsäureester dem vorgelegten gesamten Amin zugibt. Vorzugsweise wird das Verfahren jedoch so durchgeführt, daß zu steigenden Konzentrationen der einen Komponente fallende Konzentrationen der anderen Komponente zugegeben werden oder zu gleich bleibenden Konzentrationen der einen Komponente steigende bzw. fallende Konzentrationen der anderen Komponente zugegeben werden, mit der Maßgabe, daß die durch die chemische Reaktion entstehenden verschiedenen Aminocarbonsäureester nach ihrer Hydrolyse zu den entsprechenden Aminocarbonsäuren bei der stationären Elektrolyse einen praktisch linearen pH-Gradienten erzeugen. Diese Art der Durchführung des Verfahrens hat den Vorteil, daß die einzelnen Verbindungen des

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amphoter!sehen Trägersystems direkt in den richtigen Konzentrationen entstehen und somit eine komplizierte Auftrennung in einzelne Bestandteile vermieden wird.

Als organische Verbindung kommen solche Verbindungen in Betracht, die wenigstens 2 Amino- und/oder Iminogruppen aufweisen. Vorzugsweise sollten diese Verbindungen jedoch wenigstens 4 oder mehr Stickstoffatome, an die die Carbonsäureester addiert werden können, enthalten, da hierdurch das Ampholytengemisch eine größere Anzahl von verschiedenen Verbindungen umfaßt und somit auch die Anzahl der isoelektrischen Punkte entsprechend erhöht wird. Die für, das vorliegende Verfahren geeigneten Amine sollten folgende Einheiten aufweisen:

-NH-R-NH-

wobei die Kette nach links und rechts mit ähnlichen (-R-NH-)-Einheiten verlängert werden kann mit der Maßgabe, daß die Verbindung ein Molekulargewicht von etwa 300 bis 500 aufweist. Die zwischen den -NH-Gruppen angeordneten Reste -R- bedeuten z.B. -CUHg- oder vorzugsweise -CpH^-. Vorzugsweise sind diese orga- · nischen Stickstoffverbindungen lineare Kettenmoleküle, sie können jedoch auch verzweigtkettig, alizyclisch oder heterozyclisch sein oder aromatische Gruppen enthalten. Darüberhinaus können einzelne Stickstoffatome mit Substituenten versehen sein, wie mit Niederalkylgruppen^ Methyl-, Äthyl-Gruppen usw. Geeignete Amine sind z.B. Äthylendiamin, Diäthylentriamin, Triäthylentetramin und Tetraäthylenpentamin. Besonders bevorzugt wird das Pentaäthylenhexamin.

Die erfindungsgemäß verwendeten Carbonsäureester enthalten eine aktivierte Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung. Vorzugsweise werden solche Carbonsäureester eingesetzt, deren Doppelbindung sich inot-ß-Stellung befindet. Die Doppelbindung kann jedoch auch an einer weiter entfernten Stelle liegen und auf andere Weise aktiviert sein. Die Carbonsäureester sollten nicht mehr als insgesamt 10-12 C-Atome aufweisen, wobei der Ester-Rest

eine Alkylgruppe mit nicht mehr als 6, vorzugsweise nicht mehr als 4 C-Atome sein sollte. ,

Geeignet sind beispielsweise Acrylsäureester, Methacrylsäureester, !Crotonsäureester und dergleichen. Darüberhinaus sind auch ungesättigte Dicarbonsäureester geeignet, wenn eine Verstärkung der sauren Seite des pH-Gradienten erwünscht ist. In Betracht kommen Maleinsäureester, Methylenmalonsäureester, Äthylenmalonsäureester, Itakonsäureester und dergleichen. Hierin liegt ein weiterer wichtiger Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber dem bekannten Verfahren, da die freien ungesättigten Dicarbonsäuren noch reaktionsträger sind als die Monocarbonsäuren und ihre Addition an das Amin eine dementsprechend weiter erhöhte Reaktionszeit in Anspruch nimmt, während die ungesättigten Dicarbonsäureester erheblich schneller reagieren. Außerdem wird durch das vorliegende Verfahren die Verwendung von Methylenmalonsäureester ermöglicht, während nach dem Stand der Technik die freie Säure nicht eingesetzt werden kann, da diese unbeständig ist.

Der Esterrest ist vorzugsweise ein Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Isopropyl-, η-Butyl-, sek.-Butyl- oder tert.-Butylrest. Besonders bevorzugt ist der Methylrest.

Die Reaktion findet vorzugsweise in alkoholischer Lösung statt. Vorzugsweise werden Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, sek.-Butyl-, oder tert.-Butylalkohol verwendet, besonders bevorzugt wird jedoch der Methylalkohol.

Geeignet sind jedoch;auch andere wasserfreie organische Lösungsmittel die gegenüber den verwendeten Ausgangsverbindungen inert sind, wie beispielsweise Dioxan, Benzol usw.

Bei der bevorzugten Durchführung des Verfahrens, d.h. bei der gezielten Synthese eines Trägerampholytengemischs werden Angaben über die portionsweise Vermischung der Ausgangskomponenten benötigt. Diese Mischungsverhältnisse können mit guter Genauig-

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keit aufgrund im voraus ermittelter physikalisch-chemischer Parameter berechnet werden. Die Ermittlung dieser Parameter und der daraus zu berechnenden Mischungsverhältnisse wird im nachfolgenden Beispiel näher erläutert. Sind nun die Mischungsverhältnisse, die letzten Endes zu den richtigen Konzentrationen der einzelnen Komponenten des Trägerampholytengemisches führen, bekannt, so werden die Ausgangsverbindungen vorzugsweise in alkoholischer Lösung entweder per Hand in mehreren Fraktionen z.B. 60 Franktionen oder kontinuierlich mittels eines Gradientenformers gemischt. Solche Gradientenformer sind auf dem Markt erhältlich und dienen im allgemeinen zur Herstellung von Gradienten zur Elution oder Zentrifugation.

Unter Verwendung eines solchen Gradientenformers ( U 11 300 Ultrograd gradient mixer der Firma LKB Produkter AB, Stockholm) wird die sich kontinuierlich in ihrer Zusammensetzung ändernde Mischung mittels einer Schlauchpumpe durch einen etwa 10-2Om langen Teflonschlauch gepumpt, der sich in einem thermostatisierten Wasserbad befindet. Die Temperatur ist nicht kritisch und liegt in der Regel zwischen etwa 20° und 50°, vorzugsweise zwischen 30° und 40⁰C. Auf diese Art verbleiben die kontinuierlich erzeugten Mischungen etwa 1 1/2-2 Stunden bei einer Temperatur, die eine 80 - 90 &Lge Reaktion gewährleistet. Nach Durchlaufen des Teflonschlauches können die Mischungen in mehreren Fraktionen aufgefangen und durch Stehen bei 30° - 40°C zur vollständigen Reaktion'gebracht.werden. , . Danach werden die Fraktionen vereinigt und das Lösungsmittel vorzugsweise durch Verdampfen im Vakuum entfernt. Geringfügige Mengen von überschüssigem Ester werden dabei ebenfalls abgezogen.

Der erhaltene Rückstand wird anschließend in ausreichend Wasser gelöst und kann dann auf verschiedene Art und Weise der hydrolytischen Spaltung der Estergruppe unterworfen werden. Dies kann beispielsweise in einem Sterilisator bei 1-2 Atü und 120 13O⁰C erfolgen, wobei die Reaktion nach etwa 1-2 Stunden beendet ist. Eine andere Möglichkeit besteht darin, die Lösung über mehrere Stunden bei 40° - 50⁰C. zu schütteln. Es hat sich

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herausgestellt, daß das 2. Verfahren dann vorzuziehen ist, wenn ein Endprodukt mit geringerer UV-Absorption angestrebt

Wie bereits oben erwähnt wurde führt das vorliegende Verfahren zu Trägerampholytengemischen, die noch eine schwach gelbliche Färbung aufweisen können. Da Absorptionen des Endproduktes im sichtbaren und UV-Spektralbereich bei der späteren Verwendung stören können, sollte das Ampholytengemisch möglichst farblossein und auch im UV-Bereich keine Absorption zeigen. Deshalb wird zweckmäßigerweise eine etwa 2-stündige Behandlung des Syntheseproduktes in einer Wasserstoffatmosphäre unter Verwendung eines hierfür geeigneten Katalysators durchgeführt. Als Katalysatoren können beispielsweise Raney-Nickel, Platinoxid, Palladium, Palladium-Aktivkohle, Lithiumaluminiumhydrid oder Natriumborhydrid verwendet werden. Diese Reaktion wird vorzugsweise in wässriger Lösung durchgeführt, es kommen jedoch auch geeignete organische Lösungsmittel in Frage.

Die gezielte Synthese eines nach dem vorliegenden Verfahren hergestellten Trägerampholytengemisches dauert je nach Arbeitsweg ca. 1 - 2 Tage und liefert ein Produkt, welches während einer stationären' Elektrolyse einen linearen pH-Gradienten ergibt, der gleichmäßige Pufferkapazität und Leitfähigkeit durch den Gradienten aufweist und minimale Lichtabsorption zeigt. Die Verwendung von Estern und alkoholischen Lösungsmitteln ermöglicht es, die Reaktion von Anfang bis Ende bei gleichbleibendem ätark alkalischen pH, d. h. bei gleichbleibendem Ladungsmuster aller Stickstoffatome der Aminkomponente durchzuführen.

Außerdem hat das vorliegende Verfahren den Vorteil, daß wie bereits erwähnt die Entfernung von überschüssigem Carbonsäureester sehr leicht durch Abziehen im Vakuum vorgenommen werden kann, während die Entfernung von Überschüssiger freier Säure, wie z.B. Acrylsäure, mit erheblichen Schwierigkeiten verbunden ist.

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Ein weiterer Vorteil liegt darin, daß an Hand der gezielten Synthese die Möglichkeit besteht, pH-Gradienten eingeschränkter pH-Bereiche auf direktem Wege zu synthetisieren, Es ist z.B. möglich pH-Bereiche von 8-10 oder 4 - 7 zu synthetisieren, während das maximale Spektrum von pH 3,5 - 10 reicht. Zur Erzielung besserer Auflösungen schwierig zu trennender Proteine sind eingeengte Bereiche besonders wichtig.

Das folgende Beispiel soll die Erfindung näher erläutern ohne sie zu beschränken.

Beispiel

Als Ausgangskomponenten werden verwendet:

1. Pentaäthylenhexamin (1 molare Lösung in Methanol im folgenden mit A) bezeichnet)

2. Acrylsäuremethylester (4 molare Lösung in Methanol im folgenden mit B) bezeichnet).

Die im folgenden verwendeten Prozentangaben stellen jeweils Volumen-% dar.

Unter Verwendung von Pentaäthylenhexamin als Ausgangsamin stehen 6 Stickstoffatome zur Verfügung die maximal 8 Carbonsäureestermoleküle addieren können. Der einfachste Ampholyt wird daher in einem Amincarbonsäureestergemisch bei einem molaren Verhältnis von 1 ι 1 gebildet. Bei Verwendung der oben angegebenen Lösungen

A) und B) liegt dieses 1 : 1 Verhältnis bei einem prozentualen

.lösung Mischungsverhältnis von Amin-zu Ester/von 80 : 20 vor. Damit ist das Mischungsverhältnis am Beginn der Synthese festgelegt. Das Endverhältnis wird folglich erreicht sein, wenn ein molares Verhältnis von 1:8 erreicht wird. Das prozentuale Mischungsverhältnis beträgt daher 35 : 65.

Es wurden nun zunächst ausgehend von einem prozentualen Mischungsverhältnis von 80 : 20 zehn einzelne Fraktionen gemischt, wobei das Mischungsverhältnis schrittweise (75- : 25, 70 : 50 usw.) bis zum Erreichen des Endverhältnisses von 35 : 65 variiert wurde. Die einzelnen Fraktionen wurden verschlossen und bei etwa 35°C

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aufbewahrt. Nach etwa 10 Stunden war die Reaktion beendet und die Fraktionen wurden nun einzeln aufgearbeitet. Es wurde zunächst das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand mehrmals mit Methanol aufgenommen und wieder eingeengt. Schließlich wurden die Rückstände in Wasser gelöst und für etwa 2 Stunden in einen Sterilisator bei 1 Atü und 130⁰C gegeben. Das Wasser wurde dann am Rotationsverdampfer abgezogen und die Rückstände erneut in Wasser gelöst. Bei den einzelnen Fraktionen wurden nun pH-Messungen vorgenommen und die Ergebnisse in ein Diagramm, wie es in Figur 1 gezeigt ist, eingetragen. Die Ordinate stellt die prozentualen Mischungsverhältnisse dar, während die Abszisse die dazugehörigen pH-Werte wiedergibt. Die erhaltene Kurve kann " nun in ein weiteres Diagramm übertragen werden, welches dann direkt die für den Gradientenformer notwendige Schablone wiedergibt, wobei jedoch noch berücksichtigt werden muß, daß die Amin-Konzentration zum sauren Bereich des Produktes hin in dem Maße abnimmt, wie die Esterkonzentration ansteigt. Dies würde aber bedeuten, daß bei einer kontinuierlichen Durchführung des Verfahrens in gleichen Zeiteinheiten weniger Verbindungen entstehen. Da die einzelnen Verbindungen des Trägerampholytengemisches jedoch"in gleichen Konzentrationen vorhanden sein sollen, muß diese Kurve noch dahingehend korrigiert werden, daß letztlich gleiche Konzentrationen der einzelnen Komponenten erhalten werden.

Bei der Verwendung eines Gradientenformers kommen hierfür zwei Methoden in betracht.

1. Mittels eines Steuergerätes kann die Geschwindigkeit der peristaltischen Pumpe synchron mit dem Abfall der Aminkonzentration erhöht werden.

2. Die aus Figur 1 erhaltene Kurve, die den Konzentrationsverlauf von Amin und Carbonsäureester bestimmt, wird in der Weise modifiziert, daß mit abnehmender Aminkonzentration synchron längere Zeiten zur Herstellung der Mischungsverhältnisse zur Verfügung stehen.

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Im vorliegenden Fall wurde der 2. Weg eingeschlagen. Aus Figur können jene Mischungsverhältnisse abgelesen werden, die Ampholyte von pH 10, 9, 8 usw. ergeben. Aus der pro pH-Einheit erfolgten Abnahme des Amins ergibt sich in einfacher Weise der Faktor, um den der Mischungsvorgang im jeweiligen pH-Gebiet verlängert werden muß, um zu einer etwa gleichmäßigen Konzentration der einzelnen Ampholyte in den einzelnen pH-Bereichen zu gelangen. Das heißt, hätte beispielsweise die Konzentration des Amins auf die Hälfte abgenommen, so müßte dementsprechend der Mischungsvorgang auf das Doppelte verlängert werden. Unter Verwendung der ermittelten Faktoren gelangt man zu Figur 2, deren Abszisse gleichzeitig in 60 gleiche Fraktionen unterteilt wurde.

Zu dem gleichen Ergebnis kann man auch auf einem anderen Weg gelangen, indem man nämlich zu jeweils gleichen Konzentrationen der Aminkomponente steigende Konzentrationen des Carbonsäureesters hinzufügt. Nach Aufarbeitung der einzelnen Fraktionen auf dem obengenannten Wege und nach Ermittlung der zugehörigen pH-Werte dieser einzelnen Fraktionen kann unmittelbar eine Kurve gezeichnet werden, die der in Figur 2 dargestellten Kurve äquivalent ist, d.h. es ergibt sich auf direktem Wege eine Kurve, die keiner weiteren Korrektur bedarf, da ja durch die jeweils gleichbleibenden Mengen der Aminkomponente in gleichen Zeiträumen gleich viele einzelne Ampholytverbindungen entstehen.

Hat man nun die in Figur 2 dargestellte Kurve ermittelt, so können die einzelnen Fraktionen in den .durch die Kurve festgelegten Mischungsverhältnissen per Hand gemischt werden oder diese Kurve kann direkt als Schablone für den Gradientenformer dienen.

Im Nachfolgenden ist die Herstellung eines Trägerampholytengemisches unter Verwendung eines Gradientenformers beschrieben:

Die Ausgangslösungen A) und B) befanden sich in jeweils 100 ml Vorratsgefäßen, die direkt mit einem elektrisch gesteuerten

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Ventilsystem verbunden waren.· Mittels einer Schlauchpumpe wurden die Lösungen A) und B) in den in Figur 2 dargestellten Mischungsverhältnissen in eine Mischkammer¹ gesaugt und gründlich vermischt. Die sich kontinuierlich in ihrer Zusammensetzung ändernde Mischung wurde sodann mittels derselben Schlauchpumpe durch einen 20 m langen ca. 1 mm weiten Teflonschlauch gepumpt, der sich in einem auf 40⁰C thermostatisierten Wasserbad befand. Nach Verlassen des Teflonschlauches wurde das Gemisch in 60 Fraktionen zu je 2 ml aufgefangen. Die Forderleistung der Schlauchpumpe betrug ca. 0,5 ml/min. Dabei wurden etwa 70 ml der Lösung A) und ca. 60 - 70 ml der Lösung B) verbraucht. Die Fraktionen wurden verschlossen und 10 Stunden bei 35⁰C belassen. Danach wurden sie vereinigt, das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand mehrmals mit Methanol aufgenommen und wieder eingeengt. Nach üblicher Hydrolyse und Hydrierung verblieben 35-40g eines farblosen bis äußerst schwach gelblichen, festen Rückstandes, der währen der Elektrophorese einen linearen pH-Gradienten mit dem pH-Bereich 3,5 - 10 ergab.

Die Ermittlung der Kurve in Fig. 2, wie sie oben am Beispiel des Pentaäthylenhexamins beschrieben wurde, erfolgt für andere Amine in analoger Weise.

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Claims (13)

2656901 Patentansprüche

1) Verfahren zur Herstellung eines Systems von amphoter!sehen ■'Trägern auf der Basis einer organischen Verbindung mit wenigstens 2 Amino- und/oder Iminogruppen und einer Carbonsäureverbindung, die eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß als Carbonsäureverbindung ein Carbonsäureester eingesetzt, und das erhaltene Aminocarbonsäureestergemisch anschließend in an sich bekannter Weise hydrolysiert,und gegebenenfalls isoliert wird.

2.) Verfahren nach Anspruch 1,dadurch gekennzeichnet, daß zu steigenden Konzentrationen der einen Komponente fallende Konzentrationen der anderen Komponente zugegeben werden jpder zu gleich bleibenden Konzentrationen der einen Komponente steigende bzw. fallende Konzentrationen der anderen Komponente zugegeben werden, mit der Maßgabe, daß die durch die chemische Reaktion entstehenden verschiedenen Aminocarbonsäureester nach ihrer Hydrolyse zu den entsprechenden Aminocarbonsäuren bei der stationären Elektrolyse einen praktisch linearen pH-Gradienten erzeugen.

3) Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion in einem nicht wässrigen, vorzugsweise alkoholischen Lösungsmittel durchgeführt wird.

4) Verfahren nach Anspruch 1 - 3» dadurch gekennseich.net, daß als organische Verbindung Äthylendiamin, Diäthylentriamin, Triäthylentetraamin, Tetraäthylenpentamin oder vorzugsweise Pentaäthylenhexainin verwendet wird.

5) Verfahren nach Anspruch 1-4» dadurch gekennzeichnet,

daß als ungesättigter Ester Acrylsäureester, Methacrylsäureester, Methyl enraalorisäuroester, Äthyleniualorisäuree3ter,

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!Crotonsäureester, Maleinsäureester oder Itakonsäureester verwendet wird.

6) Verfahren nach Anspruch 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß als alkoholische Komponente des Esters Methylalkohol, Äthylalkohol, Propylalkoholjlsopropylalkohol, n-Butylalkohol, sek.-Butylalkohol oder tert.-Butylalkohol verwendet wird.

7) Verfahren nach Anspruch 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß anstelle eines Amins ein Gemisch von verschiedenen Aminen verwendet wird.

8) Verfahren nach Anspruch 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß anstelle eines Carbonsäureesters ein Gemisch von verschiedenen Carbonsäureestern verwendet wird.

9) Verfahren nach Anspruch 1-■-- 8, dadurch gekennzeichnet, daß nach dem Vermischen der beiden Komponenten die Mischungen mittels einer geeigneten Anordnung portionsweise in mehreren Fraktionen aufgefangen werden und portionsweise zur chemischen Reaktion gebracht werden.

10) Verfahren nach Anspruch 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß als Lösungsmittel Methylalkohol, Äthylalkohol, Propylakohol, Isopropylalkohol, n-Butylalkohol, sek.-Butylalkohol oder tert.-Butylalkohol verwendet wird.

11) Verfahren nach Anspruch 1-8, dadurch gekennzeichnet _f daß die Reaktion des Amins mit dem Carbonsäureester bei Temperaturen zwischen etwa 20° und 50° C, vorzugsweise zwischen etwa 30° und 40° C durchgeführt wird.

12) Verfahren nach Anspruch 1-9, dadurch gekennzeichne^ daß nach der hydrolytischen Spaltung das erhaltene Stoffgemisch in einem geeigneten organischen Lösungsmittel oder vorzugsweise in Wasser, mit katalytisch angeregtem Wasserstoff behandelt wird.

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13) Verfahren nach Anspruch fö, dadurch gekennzeichnet, daß als . Katalysator für die katalytische Hydrierung Raney-Nickel, Platinoxid, Palladium, Palladium-Aktivkohle, Lithiuaaluininiumhydrid oder Natriumborhydrid verwendet wird.

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