DE1493939A1 - Verfahren zur Herstellung eines Systems von amphoterischen Traegern - Google Patents

Description

Pnre iimiwaii Dipl.-Pliys. GERHARD LlEDL . 8 München 22, SteinsdorfsfraOe

B 2554

Dr. Expl.

1KB-PR0DÜKTER AB, Box 76, Stockholm-Bromma 1 / Schweden

Verfahren zur Herstellung eines Systems von amphoterischen Trägern

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Systems von amphoterischen Trägern, das zur isoelektrischen Fraktionierung von hochmolekularen amphoterischen Stoffen, wie z.B, Proteinen, Toxinen, Antioxinen, bakterischen Antigenen, Antikörpern, Viren, Hormonen, Enzymen usw„ mittels

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einer stationären Elektrolyse geeignet is*., d.h. einer Elektrolyse, die konvektionsfrei solange durchgeführt wiri, bi3 keine der Substanzen msiir wesentlichen Konzentrations'inderungen in der Elektrolysezelle unterworfen ist. Die Έτι'L in ι-mc betrifft weiterhin die Anwendung des Systems von amphoterischen Trägern zu verschiedenen Zwecken.

Ein Verfahren zur Darstellung und Fraktionierung von amphoterischen Stoffen mit Hilfe einer stationären Elektrolyse wurde von Williams & Waterman (Proc.Soc.Exp.Biol.Med.27, 56-59, I929) beschrieben. Dieses Verfahren beruhte im v/es entliehen auf einer einfachen Weiterentwicklung der bekannten Tatsache, daß reines Natriumhydroxyd und reine Schwefelsäure bei der Elektrolyse von Natriumsulfat gewonnen v/erden können, wenn eine konvektive Mischung des an der Kathode gebildeten Alkalis und der an der Anode gebildeten Säure verhindert wird. Das gleiche gilt für andere Säuren und Basen die gegen anodische Oxydation und kathodische Reduktion resistent sind. Williams & Waterman folgerten deshalb, daß, wenn es gelingt, eine konvektionsfreie Elektrolyse einer Mischung von amphoterigehen Stoffen durchzuführen, das Ergebnis so ausfallen muß, daß, je mehr saure amphoterische Stoffe sich, im stationären Gleichgewicht in der Nähe der Anode ansammeln, umso mehr basische amphoterische Stoffe sich auch in der Nahe der Kathode befinden müssen. Da jeder amphoterische Stoff die Neigung zeigt,

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den ρίΤ-V/ert der Löaung in Richtung auf seinen eigenen isoelekt riechen Punkt einzustellen, ergibt sich die Tatsache, daß d»»r Strom f.ui'^ruiid seiner elektrolytischen Wirkung einen i H-Gr-idiont erzeugt mit einem von der Anode zur Kathode zuni'hiaenden pH-Wert. Der genaue Verlauf des pH-Wertes zwischen den l-niden Elektroden hängt von der Menge,, sowie von den Ei; enschuf ten tier Elektrolyte im System ab.

Die Versuche von Williams & Waterman wurden vielfach verbessert und verfeinert, so daß da;· vorgenannte Verfahren große Bedeutung V'.iv die Fraktionierung von biologischen Stoffen, insbesondere von niederen Peptiden und Aminosäuren, hergestellt durch Hydrolyse von Proteinen, erhielt. Es vurde bisher jedoch noch nicht festgestellt, dab eine Zerlegung der amphoter! sehen Stoffe mit dicht nebeneinander liegenden isoelektrisehen Punkten möglich ist· Die Bedeutung dieses bekannten Verfahrens war deshalb auf die Trennung von amphoteri3chen Stoffen in drei Hauptgruppen beschränkt; Saure, neutrale und basische amphoterische Stoffe. Tiselius kar. zu derselben Erkenntnis hinsichtlich der sehr beschränkten Verwendbarkeit dieses Verfahrens, als'er dasselbe für eine Mischung von Proteinen anwandte (Svensk Kemisk Tidskr. 5J5, 305, 19Λ1). Zwei so verschiedene Proteine wie Eialbunin - isoelektrischer Punkt, pi = 4,6 - und Hämoglobin - pi = 7,0 - die mit anderen Verfahren sehr einfach getrennt werden können, konnten mit Hilfe

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der stationären Elektrolyse nicht vollständig voneinander getrennt werden, sondern lediglich angereichert werden.

Eine Erklärung zu diesen Versuchnergebninsen wurde von Svensson (Acta Chem.Scan. 15» 325, 1961) gegeben,. Svensson zeigte dabei in einer theoretischen Analyse, daß bei einem stationären, vom elektrischen Strom gebildeten pH-Gradienten überhaupt kein amphoterischer Stoff in reinem Zustand existieren kann, wenn von einer Mischung ausgegangen wird« Jeder amphoterische Stoff ist nämlich selbst bei seinem eigenen Konzentrationsmaximum zumindest durch solche amphoterischen Stoffe verseucht, die einen benachbarten isoelektricchen Punkt haben. Es zeigte sich weiterhin, daß der Konzentrationsgrad eines amphoterischen Stoffes innerhalb einer engen Zone umso besser ist, je niedriger der Wert der Diffusionskonstante ist und je höher der Wert der Ableitung du/d (pH) am isoelektrischen Punkt ist. Mit u ist hierbei die Ionenbeweglichkeit gekennzeichnet. Es ist bekannt, daß die meisten Aminosäuren und niederen Peptide hohe Diffusionskonstanten und niedrige Werte der vorgenannten Ableitungen am isoelektrischen Punkt aufweisen. Es ist somit daraus zu schließen, daß theoretisch keine Möglichkeiten hinsichtlich einer sauberen Trennung von niedrig molekularen Amphoteren mit Hilfe einer stationären Elektrolyse bestehen.

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Ea ist weiterhin "bekannt, daß Proteine und andere hochmolekulare amphoteriache Stoffe niedrige Diffusionskonstanten und hohe Werte der Ableitung du/d (pH) am isoelektrischen Punkt aufweisen. Svensson schloß hieraus, daß es möglich sein müßte, ein Verfahren zur sehr genauen, selektiven Analyse und Fraktionierung von Proteinen zu entwickeln, vorausgesetzt, daß der pH—Gradient eine gewisse Zeit lang stabil gehalten werden kann und über die isoelektrischen Punkte des Proteinsystems genügend ausgedehnt werden kann« Der letztgenannten Bedingung kann dadurch entsprochen werden, daß gewisse Arten von niedrig molekularen amphoterischen Stoffen benutzt werden, die gleichzeitig bei der Elektrolyse vorhanden sein müssen. Auf diese Art und Weise wurde somit im Prinzip ein amphoterischer Träger geschaffen, der im wesentlichen auf dem Sachverhalt beruht, daß ein amphoterischer Stoff bei der Elektrolyse mit anderen ähnlichen amphoterischen Stoffen in der Lage ist, einen leicht veränderlichen pH-Wert zwischen den beiden Elektroden einzustellen und darüber hinaus eine leicht veränderliche leitfähigkeit zu erzeugen. Die letztgenannte Bedingung gründet sich darauf, daß es wünschenswert ist, eine nicht zu stark sich ändernde Feldstärke, die im umgekehrten Verhältnis zum Leitvermögen steht, zu haben, lin amphoterisoher Träger ermöglicht es, Proteine vollständig voneinander zu trennen· Die letzte Verfahrensstufe besteht dabei darin, die gereinigten Proteine noch vom amphoterischen Träger-iu trennen,

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was senr einfach mit Hilfe der Dialyse oder mit anderen Verfahren durchgeführt werden kann, die auf der verschiedenen Molekulargröße der zu trennenden Stoffe beruhen· In speziellen Anwendungsfällen können jedoch auch andere Ver^rahren zur Anwendung kommen, die gegebenenfalls eine noch einfachere und bequemere Trennung von den amphoter!schen Trägern ermöglichen.

In einer zweiten Arbeit (Acta Chem.Scand. IjS, 456, (1962)) wurde von Svensson weiterhin die Auffassung vertreten, daß die Anforderungen an den amphoterischen Träger an sich wichtiger und mehr zu beachten sind als die Tatsache, daß derselbe einfach von den zu trennenden Substanzen selbst wieder abgetrennt werden kann. Ausgehend von dieser Einsicht wurden weitere neue und wertvolle Erkenntnisse über einen amphoterischen Träger gewonnen. Es zeigte sich hierbei, daß ein niedrig molekularer, amphoterischer Stoff ein guter amphoterischer Träger ist, wenn er wenigstens zwei pK -Werte in der Nähe seines eigenen isoelektrischen Punktes aufweist. Histidin mit einem pl-Wert von 7,6 und nächstgelegenen pK -Werten von 6,10 und 9»18 ist deshalb ein guter amphoterischer Träger, während Glyzin wie alle anderen neutralen Aminosäuren mit einem pl-Wert von 6,1 und nächetgelegenen pK -Werten von 2,35 und 9»78 ein schlechter amphoterischer Träger ist. Eine Übersicht über die handelsüblichen, niedrig molekularen amphoterischen Träger zeigt, daß kein Stoff existiert, der

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zwischen pH-Werten von 4 und 8 isoelektrisch ist und daß es nur-, :;wei Stoffe gibt, die 'zwischen pH-Werten von 7 und 8 isoelektrisch sind. Es finden sich auch nur wenige Stoffe, die ot f'rlu-ll eines pH-Wertes von 8 isoelektrisch sind. Manche d'^r im Handel erhältlichen am^hoteriECher. Tr^y.,jer sind sehr t'-uer, uc dai.^} allein hierdurch iie Anwendbarkeit d^a Verfahrt-·:.;· -{'i.r clark eingeschränkt int. Das Verfahren let jedcch noch vielmehr durch die Tatsache becci.r-.inkt, dal? es innerhalb fcwrlo: er jH-Werte überhaupt keine im Handel erhältlichen am,'. c tericcken Träger gibt.

in ein* r dritten Ar tu-it (Arch.BiocheE.Bioj.hys., Su:-p. 1, 13^., 19lC) coigte Svensson, daß eine saubere Trennung vcn Proteinen, die innerhalb vcn pH-Bereichen iHoelek*<-riech sind, wo gute amjhctericche Träger verfügbar oind, exreriirentell iröglich ist. Dies ist in Übereinstiimnung mit den theoretischen Erkenntnipyen. Es konnte gezeigt werden, di.-· zwe. Ircteine mit isoelektrischen Punkten mit einem Abstand von lediglich 0,1 pH-Einheiten voneinander vollständig getrennt werden können. Dieses Ergebnis wurde später durch die vorliegende Erfindung bestätigt und sogar noch übertroffen.

Pur den pH-Wertbereich zwischen 0 und 3 sir.d keine amphoterischen Träger notwendig, da innerhalb dieses Bereiches ein guter pH-Gradient bei der Elektrolyse eines Systems von Säuren

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verschiedener Stärke erhalten v/erden kann. Dies betrifft starke und sehr schwache Säuren. Das gleiche gilt für einen pH-Wertbereich zwischen 11 und 14, indem ein System von Basen verschiedener Stärke benutzt werden kann. Die Mehrzahl der Proteine sind jedoch zwischen pH-Werten von 3 und 11 isoelektrisch. Zur Trennung derselben wird somit ein System von amphoterischen Trägern benötigt» deren isoelektri.sche Punkte ziemlich gleichmäßig zwischen den pH-Werten von 3 und 11 verteilt sind. Es kann ohne Übertreibung gesagt v/erden, daß die Durchführbarkeit eines Verfahrens zur Analyse und Trennung von Proteinen vollständig von der Beschaffenheit eines derartigen Systems von amphoterischen Trägern abhängig ist.

Bisher wurden in Ermangelung von geeigneten amphoterischen Trägern im wesentlichen zwei prinzipiell verschiedene V/ege eingeschlagen. Der erste beruht auf der organisch-chemischen Synthese von verschiedenen amphoterischen Trägern, der zweite in der partiellen Hydrolyse von Proteinen, die so ausgeführt wird, daß das Hydrolyseprodukt im wesentlichen aus niederen Peptiden besteht.

Das erste Verfahren ist hauptsächlich dadurch beschränkt, daß die meisten leicht verfügbaren, organischen Protolyte pE_s-Werte aufweisen, die innerhalb eng begrenzter pH-Bereifche

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liegen. So dissoziieren beispielsweise fast alle einwertigen !Carboxylgruppen zwischen pH-Werten von 4 und 5» fast alle einwertigen aliphatischen Amine zwischen pH-Werten von 9 und 10 und die ineisten aromatischen Amine etwa bei einem pH-Wert von 5. Mit Hilfe einer Synthese einzelne amphoterische Träger mit gewünschten isoelektrischen Punkten herzustellen, ist selbst für einen sehr geschickten Pachmann sehr schwierig· In dieser Richtung durchgeführte Syntheseversuche führten zu keinen nennenswerten Erfolgen. Überdies ist in diesem Zusammenhang noch zu bemerken, daß derartige synthetische Produkte mit Sicherheit sehr teuer, sein würden.

Das zweite Verfahren führte zu besseren Ergebnissen, da partielle Hydrolysate von Proteinen nach der Entsalzung geeignete amphoterische Träger in beträchtlicher Menge aufweisen. Im Gegensatz zu dem obengenannten synthetischen Verfahren ergibt die partielle Hydrolyse von Proteinen direkt die Mischung, d.h. das System von amphoterisehen Trägern, das zur isoelektrischen Fraktionierung von Proteinen benötigt wird. Dies bedeutet insofern einen Vorteil, als sich hierdurch eine zeitraubende und teure Rekristallisation oder eine andere Reinigung der einzelnen chemischen Stoffe erübrigt. Partielle Hydrolysate von Proteinen waren deshalb für die

ι weitere Entwicklung der stationären Elektrolyse von großer

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Bedeutung und ermöglichten <;ine Reihe von geeigneten Protein-Abtrennungen auf isoelektrischem Weg·

Die Tatsache, daß partielle Hydrolysate von Proteinen ale amphoterische Träger immer noch nicht ganz befriedigen, beruht auf folgendem Sachverhalt, der bislangnoch nicht erkannt wurde. Die Fraktion eines partiellen Hydrolysates das zwischen

^ pH-Werten von 5 und 6,5 isoelektrisch ist, ist zwar quantitativ völlig zufriedenstellend, jedoch nicht in Bezug auf die Eigenschaften als amphoterischer Träger. Man erhält deshalb bei der Elektrolyse eine sehr geringe Leitwirkung innerhalb dieses pH-Bereiches, sowie lokale Überhitzungen innerhalb dieses Bereiches und eine zu niedrige Feldstärke außerhalb desselben. Ein weiterer Nachteil von partiellen Hydrolysaten ist darin zu sehen, daß sie selten ganz farblos gemacht werden können. Der amphoterische Träger läßt deshalb Farbzonen entstehen, die bei der isoelektrischen Trennung von

F gefärbten Proteinen, wie z.B. Hämoglobin und Mioglobin sehr hinderlich sind.

letztgenannte Tatsache ist nur eine der vielen Forderungen, die an ein System von amphoterisehen Trägern gestellt werden müssen, denen bisher jedoch noch nicht zufriedenstellend entsprochen werden konnte. Beim isoelektrischen Arbeiten mit Proteinen genügt es nicht, die Elektrolyse zu beenden,

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d.h. -,-inen stationären Zustand zu erzielen. Ea muß nämlich au,.·erdein noch möglich sein, die Proteine nach der Elektrolyse zu lokalisieren und quantitativ den Betrag von Protein zu mfciK-.eii, der sich an verschiedenen Punkten zwischen den Elektroden angesammelt hat. Aus diesem Grund ist ea sehr v.'ünschenswort, dt-l: diti- System vor. ariphoterischen Trägern das Analyseverf-ihren für die Proteine nicht beeinträchtigt. Ein System \"ol Peptiden gibt natürlich für die meisten AnalyBeverfahren, die für Proteine benutzt werden kennen, eine positive Reaktion, lediglich Koafrulationsverfahren und besondere Protestaktionen wie die Enzym-Aktivität, Antigen-Aktivität, toxische Aktivität, Antikörperwirkung Usw. können bei amphoterischen Trägern benutzt werden, die aus Peptiden bestehen. Für alle anderen Arten der Proteinanalyee müssen die Peptide zuerst entfernt werden. Meistens kann dies, um sicher zu sein, mit Hilfe einer Dialyse vorgenommen werden, die zwar einfach, jedoch sehr zeilraubend ist, besonders deshalb, weil ziemlich große Peptide nur sehr langsam ausdialysieren. Die einfachste, bequemste und am häufigsten angewandte Proteinanalyse beruht auf der Ausleuchtung bei 2800 £. Es herrschte deshalb lange das Bestreben, daß ein System von amphoterischen Trägern fir Licht, sowie höhere Wellenlängen durchlässig ist. Eie partiellen Hydrolysate genügen dieser Forderung in keiner Weise.

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Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Herstellung eines Systems von amphoterischen Trägern vorgeschlagen, daß aus mehreren polyprotischen Aminokarbonsäuren besteht, von denen jede mindestens vier schwache protolyticche Gruppen enthält, wenigstens eine eine !Carboxylgruppe ist und wenigstens eine ein basisches Stickstoffatom, jedoch keine peptidischen Bindungen enthält. Das System ist dadurch gekennzeichnet, daß es erstens eine große Zahl, d.h. auf jeden Fall wenigstens

" 300 verschiedene chemische Einzelstoffe (Individuale) enthält, die sich voneinander durch die Zahl der sauren und basischen Gruppen unterscheiden oder, wenn diese Zahl gleich ist, Isomere und Homologe voneinander sind und daß zweitens jeder einzelne chemische Stoff wenigstens vier, vorzugsweise vier bis zehn schwache protolytische Gruppen enthält. Ein bevorzugtes System gemäß der Erfindung enthält keine amphoterinchen Stoffe mit aromatischen Zellen, sondern nur Substanzen aliphatischen oder alizyklischen Charakters. Ein solcher Stoff

k weißt keine Liehtabsorption bei 2800 £ oder darüber auf und ist dementsprechend besonders gut zum Arbeiten mit Proteinsystemen geeignet, die mit Hilfe von UV-Absorption analysiert werden müssen.

Da die Zusammensetzung, d.h. das System eine große Zahl von verschiedenen amphoterischen Stoffen mit schwachen protolytischen Gruppen enthält, ergibt sich ein sehr reiches Spektrum

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von verschiedenen isoelektrischen Punkten innerhalb des pH-Wertbereiches von 3 bis 11, was eine notwendige Eigenschaft eines Systems von amphoter!sehen Trägern sein muß. Aufgrund der polyprotischen Oharakters der einzelnen amphoterischen Stoffe werden die meisten von ihnen gute Eigenschaften als amphoterische Träger aufweisen. Dies wird nachfolgend noch näher erläutert·

Aus der physikalischen, organischen Chemie ist es bekannt, daß zwei protolytische Gruppen innerhalb desselben Moleküls sehr stark ihre gegenseitige Dissosation beeinflussen* Dieser wechselseitige Einfluß hat immer «lie- Wirkung, dai der pK -Abstand in einem biprotisehen Molekül größer wird als

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dies ohne diesen gegenseitigen Einfluß der fall wärt« Dies ist einer der Gründe dafür, daß die Versuche der synthetischen Herstellung von biprotiachen, aaphoterisehen Irägera nicht KU dem gewünschten Begebnis führten. Die surüeketoflende Wirkung zwischen zwei verschiedenen pK -Werten eines Protolyts ist nicht auf verschiedene protolytische Gruppen beschränkt, wie sie in einem biprotischen, amphoterischen Stoff vorliegen. Dieser Sachverhalt gilt im gleichen oder sogar noch in höherem Maß für identische protolytische Gruppen innerhalb desselben Moleküls. Es ist deshalb bei einer zweiwertigen Säure oder Base theoretisch unmöglich, daß di,e

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pK -Werte einen kleineren Abs ιand voneinander haben, als 0,6 pH-Einheiten. In der Regel liegen sie nämlich noch in einen wesentlich größeren Abstand voneinander.

Dies ist den nachfolgenden Bei3pielen au entnehmen. Di· pK_a-Werte bei 25⁰O betreffen!

Xthylendiamin Diäthylentriamin

PK1	PlC2	PX5	PK4.	pKc
6,85	9»9
4.34	9.13	9.94
3.32	6,67	9,20	9.92
2.65	4·25	7.8t	9.08	9.92

25⁰C

Honoäthanolaain 9*5 Diäthanolamin 9.0 Triäthanolamin 7·9

Aus organischen Verbindungen nit Amine- und/oder Imino-^ruppen fcözm«* «ehr·«· Ho*o1q£· und Ieo*er· uX% vtrtcliitdenen |f_B-Werten gewonnen werden, was durch Einführung von d*e 3ticlwtofΓα torn substituierenden Stoffen erfolgt. So können z.B. verschiedene Äthanolamine »it versehiedenen. pK -Werten herge- f stellt werden. Der EinfluS der Jtthanolgruppe auf den p& -Wert |_: für die Aminogruppe zeigt sich aus der folgenden Homoldgreihei ^

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Eo v/iirde e*rfindung:sgen:iB hergestellt, daß dieser physikalii5ch-chemiBche Effekt praktisch so benutzt werden kann, indem man den Molekülen wenigstens 4 oder vorzugsweise bis zu 10 schwache protolytische Gruppen zugibt. Dadurch wird eine Ansammlung auf der pH-Skala für die verschiedenen Diseoziationsstufen erreichte sowie ein Paar von pK -Werten in

der Nähe des isoelektrischen Punktes, die dem ainphcterischen Stoff, aufgezwungen werden, was jedoch für bi- und triprotisehe, amphoterische Stoffe, die zwischen pH-Werten von 4 und 7 isoelektrisch sind, nahezu unmöglich ist»

Die Kr indung umfaßt ebenso Zusammensetzungen von polyprotischen, amphoter!sehen Stoffen mit isoelektrischen Punkten, die innerhalb von pH-Wertbereichen enger verteilt sind als die erwähnten zwischen den pH-Werten vcn 3 und 11. Derartige Zusammensetzungen, die sich vorzugsweise über nur zwei bis drei pH-Werteinheiten erstrecken, manchmal sogar nur über eine pH-Werteinheit, sind für eine sehr feine Trennung von Proteinen nützlich, die nahe nebeneinander gelegene, isoelektrische Punkte aufweisen, z*B. ein System von Antikörpern, Hämoglobinen, Myoglobinen usw.

Bei einer stationären Elektrolyse einer amphoterisehen Zusammensetzung mit isoelektrischen Punkten zwischen pH-Werten von 6 und 8 wird ohne Sekundäreffekle ein anodischer pH-Wert

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von ungefähr 6 und ein kathodischer pH-Wert von ungefähr 8 erhalten. Das gesamte Volumen der Elektrolysezelle ist deshalb für die Trennung innerhalb dieses engen pH-Wertbereiches verfügbare

Das beschriebene System von amphoter!sehen Trägern befriedigt alle Forderungen, die an ein solches gestellt werden können. Es besteht aus einzelnen amphoterischen Stoffen, deren isoelek-

* trische Punkte innerhalb eines pH-Wertbereiches gut verteilt sind, was durch Systeme von Säuren und durch Systeme von Basen nicht erreicht werden kann. Die Puffereigenschaften und die elektrische Leitfähigkeit im isoelektrischen Zustand sind zufriedenstellend. Weiterhin ist der Vorteil der Farblosigkeit vorhanden. Bei 2800 Ä ist lediglich eine völlig unbedeutende, leichte Absorption zu beobachten. Keines der üblichen Analyseverfahren für Proteine wird beeinträchtigt. Wie noch nachfolgend beschrieben wird, sind die Ausgangsstoffe zur Herstellung des Systemes sehr billig, so daß das ganze Verfahren sehr wirtschaftlich durchgeführt werden kann.

Keiner der einzelnen amphoterischen Träger des Systemes ist im Handel erhältlich. Diese werden vielmehr nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt. Seiner Hatur nach ist dieses Verfahren ein synthetisches, weist jedoch ähnlich wie das zur Herstellung von partiellen Hydrolysates den Vorteil

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auf, daß es direkt ein ganzes System von amphoterischen Trägern ergibt. Es taucht deshalb nicht die Schwierigkeit auf, der synthetischen Herstellung von reinen einzelnen chemischen Stoffen mit nachfolgender Zusammenmischung in bekannten Mengen, was nämlich ungeheure Kosten verursachen würde·

Die genannte Mischung aus amphoterischen Trägern wird erfindungsgemäß so hergestellt, daß y eine niedrig molekulare, organische Verbindung mii; wenigstens zwei primären und/oder sekundären Stickstoffatomen mit einer Säure zusammengegeben wird, die wenigstens eine Kohlenstoff-Kohlenstoff -Doppelbindung enthält.

Die niedrig molekulare Stickstoffverbindung bzw. Stickstoffbase weist ein Molekulargewicht von höchstens 500, vorzugsweise von höchstens 500 auf, Ein oder mehrere Stickstoffatome können substituiert werden, beispielsweise mit Methyl, Äthyl, lthp,nolamino oder Hydroxyl. Bei diesen organischen Stickstoffverbindungen sind zwischen zwei Stickstoffatomen höchstens drei, vorzugsweise zwei Kohlenstoffatome angeordnet. Die Verbindung sollte deshalb folgende Struktur aufweisen» -

- NH - R - flH -.

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Hierbei bedeutet R - (CHp), oder vorzugsweise -CH₂-CH₂-. Das benutzte Amin sollte jedoch auf jeden Fall wenigstens einen pK -Wert aufweisen, der weniger als 8 beträgt. Das benutzte'

Amin ist vorzugsweise aliphatisch. Besonders geeijjr.ete Amine sind Äthylendiamin, Diäthylendiamin, Triäthylentetramin, Tetraäthylenpentamin und Pentaäthylenhexamin. Das Amin kann jedoch auch alizyklisch und auch heterozyklisch sein oder aromatische Gruppen enthalten, wobei in letzteren Fällen die hergestellte amphoterische Tragermischung oft eine leichte Absorption im kritischen Bereich von 2300 Ä zeigt. Es können auch Amine vorteilhaft in der Mischung benutzt werden, wobei auch ein oder mehrere Amine in der Mischung enthalten sein können.

Die ungesättigte Säure, die gemäß der Erfindung ber.utzt wird, enthält vorzugsweise eine einzige Doppelbindung und vorzugsweise höchstens 10 Kohlenstoffatome. Die Doppelbindung sollte in^α -ß-Stellung sein. Die Säure ist vorzugsweise eine ungesättigte aliphatische Säure» Akrylsäure, Methakrylsäure und !Crotonsäure haben sich als geeignete Säuren erwiesen. Die Säure kann weiterhin mehr als eine !Carboxylgruppe enthalten, z,.Bo Maleinsäure und Itakonsäure. Mehrere ungesättigte Karbonsäuren können ebenso gleichzeitig benutzt werden. Die Reaktion zwisehen Amin und Säure kann recht typisch durch die folgende Reaktionsgleichung gezeigt werden:

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R...1IH,R-,UH₀ + R*.CH « CH . COOH

R-CH.CH^.COOH
R .,HH, R-, II

R₃CH,CH₂.COOH
²* R₅.CH.CH₂.COOH
R₂N_-R₁NH
R^CH.CK₂.COOH

Bei der vorstehenden'31eichung bedeutet R^ eine zweiwertige «πι;·ίθ, die ein oder mehrere Stickstoffatome enthalten kann, •■•in s.F. eine Alkengruppe oder -(CH₂)n ^{# m} * (^CH2)ⁿ~· R,-, iist eine einwertige Gruppe vie Stickstoff oder eine Alkylgruupe, die fin oder mehrere Stickstoffatome enthalten kann C.3. CH,.KH.(CH₂)₂-, R- ist eine Alkylgrurpe, in der η eine ganiie Zalil z.B. mit Werten zwischen 1 und 5 bedeutet.

Eie aufgeseigten alternativen Reaktionen 1 und 2 finden gleichseitig statt, wobei die Zahl der möglichen Kombinationen im wesentlichen mit der Zahl von primären und/oder sekundären Stickstoffatomen im Ausgangsamin zunimmt, sowie mit der Zahl der Karboxylgruppen, die hinzugegeben werden.

Eine organische Stickstoffbase kann i eine oder mehrere ungesättigte Karbonsäuren binden. Die Zahl der Karbon-

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Säuremoleküle bezogen auf die Zahl der Moleküle der Stickstoffbase entspricht höchstens der Zahl der Stickstoff-gebundenen Wasserstoffatome in der Stickstoffbase. Durch geeignete Wahl der molaren Menge von Stickstoffbase und Säure wird eine statistische Verteilung der Stoffe erreicht, so daß man eine Homologreihe mit verschiedenen Zahlen von !Carboxylgruppen und somit verschiedenen pi—Werten erhält.

Bei einer gegebenen Zahl von sauren und basischen Gruppen wird spontan eine große Zahl von Isomeren gebildet. Dies beruht zum Teil auf der !Tatcache, daß die Zugabe zu irgendeinem der beiden Kohlenstoffatome der Doppelbindung in der ungesättigten Säure erfolgen kann, zum Teil jedoch auch darauf, daß die Säure mit Amino- oder Iminogruppen verbunden werden kann, die an verschiedenen Stellen im Molekül liegen, was zum Teil aus der vorstehenden Reaktionsgleichung ersichtlich ist. Dies ist deshalb von großer Bedeutung, da Karboxylgruppen, sowie Amino- und Iminogruppen jeweils miteinander so reagieren, daß verschiedene pK - Werte an verschiedenen Stellen erhalten werden. Es ist evident, daß die isomeren Möglichkeiten sehr stark mit der Anzahl der protolytischen Gruppen zunehmen.

Die Reaktion wird mit einer Menge an Säure durchgeführt, die kleiner ist als diejenige Menge, die zur Sättigung

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sämtlicher primären und sekundären Stickstoffatome erforderlich ist· Auf diese Art und Weise wird eine geeignete Mischung von verschiedenen Amino-Karbonsäuren und Isomeren davon erhalten. Die Reaktion zwischen Polyamin und ungesättigter !Carbonsäure wird vorzugsweise bei erhöhter !Temperatur und in Gegenwart eines Lösungsmittels durchgeführt, Die Reaktionstemperatur beträgt gewöhnlich 30 bis 150 C, vorzugsweise 40 bis 100?C„ Wenn Lösungsmittel benutzt werden, so wird die Reaktion oft mit einem Rückfluß des Lösungsmittels ausgeführt. Das Lösungsmittel kann Wasser oder ein organisches Lösungsmittel, z*B. Alkohol oder ein Kohlenwasserstoff sein. Die Reaktion kann mit Hilfe von Katalysatoren durchgeführt werden, die z.B. aus den erwähnten Basen bestehen können, sowie aus sauer reagierenden Salzen, wie z.B. primäres Uatriumphosphat, Zinkchlorid, Aluminiumchlorid. Hydrochinon wird als Inhibitor für die Polymerisation der ungesättigten Säure benutzt»

Bei dem vorliegenden Verfahren werden im allgemeinen amphoterische Stoffe erzeugt, deren pi einen pH-Wertbereich von 3 bis 10 zeigt. Dies erklärt aich teilweise durch die verschiedene Zahl von Karboxylgruppen, teilweise durch die verschiedene Lage dieser Karboxylgruppen im Molekül, Die Variation entsteht spontan, und es werden gleichzeitig eine große Zahl von Homologen und Isomeren gebildet.

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Bei der iaoelektrischen Trennung ist man oft an einem "bestimmten pH-Wertbereich interessiert, der nit Rückesicht auf die isoelektrischen Punkte der Stoffe, insbesondere der Proteine, ausgewählt wird, die man abzutrennen wünscht. Die benutzte Mischung von amphoterischen Trägern sollte deshalb mit ihrem ρΙ-Spektrum diesen Bereich überdecken. Es ist cft von Vorteil, die erfindungsgemäße Mischung von amphoteriscken

»Trägern in Bezug auf pi grob zu.trennen« Diese Trennung kann mit Hilfe der isoelektrischen Trennung durchgeführt werden, was vorzugsweise mit einer Vorrichtung geschieht, die mehrere Zellen aufweist, die durch konvektionsverhindernde Diaphragmen voneinander getrennt sind. Es wird in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Williams & Waterman verwiesen. Die gemäß der Erfindung hergestellte und in zwei verschiedene pl-Intervalle getrennte Mischung von amphoterischen Trägern kann getrocknet oder kristallisiert werden. Liese Trennung ist auch dann geeignet, wenn die Ausbeute an amphoteri-P sehen Trägern in einem bestimmten pi—Intervall bestimmt wird. Aufgrund dieser Bestimmung kann die Reaktion so modifiziert werden, daß ein größerer Teil der gesamten Ausbeute innerhalb eines bestimmten pI-Bereiches erhalten wird. Dies kann beispielsweise durch Änderung der relativen Mengen des Amins und der Karbonsäure erreicht werden, sowie durch Menge und Art des Katalysators und Lösungsmittels·

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Wenn die erfindunongemäö hergestell Le l-iiachung von amphoteriö":.(.·ΐ; Trümern iff. Hinblick auf den pI-Bereich getrennt und *;γ trocknet worden lsi., ,können ihre Eirenschaften als amphoteriHche Trügerinigchung dadurch bestimmt werden, daß die Pufferei/joiifichaften. und die Lg it wirkung gemessen werden. Diese Wf'rte werden vorzugsweise auf ein Milligramm der trockenen, air.Inotorischen Mischung bezogen« Die erfindungsgemäß hergestellten araphoterisehen Stoffe werden bei der erwähnten Klektroljrse in einem Bad so getrennt, daß diejenigen mit niedrigeren: pl, d,h· die sauereren sieh im Gleichgewichtsr.'ustand in der Nähe der Anode ansammeln und diejenigen mit höherem pi mehr in der Nähe der Kathode. Die Konzentrationsverteilung im Gleichgewichtszustand, bei der jeder amphoterisoke Stoff (:ine Konzentrationsspitze entsprechend dem pi des Amphoters aufweist, ähnelt normalen Verteilungskurven (3aus8-Kurven), die sich teilweise überlappen. Im Gleichgewichtszustand ist der pH-Wert in gewissen Bereichen des elektrolytiachen Bades ungefähr gleich dem pi für solche amphoterischen Stoffe, die in diesem Bereich vorliegen. Eine Messung des pE-Wertes gibt somit sehr einfach ein Maß für den pi des amphöteriechen Stoffes.

Nähere Einzelheiten und Herinnale der Erfindung sind aus der nachfolgenden Beschreibung eines Ausführungsbeispieles ersichtlich.

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Beispiel:

Ein runder Korben mit Rückflußkühlung, einem Rührwerk, einem Thermometer und einem Tropftrichter wurde mit 100 molaren Teilen reinen Triäthylentetramins in 50$ wässriger Lösung beschickt. Der Kolben wurde in ein Wasserbad mit einer Temperatur von 50⁰C eingetaucht» Über den Tropftrichter wurden kleine Mengen einer 50$-igen wässrigen Lösung von Akrylsäure hinzugegeben, die zuvor durch Vakuumdestillierung

gereinigt wurde und IJo Hydrochinon enthielt. Die Gesamtmenge an Akrylsäure betrug bei verschiedenen Teilversuchen 200, 250, ,300 und 350 molare Teile. Die Zugabe erfolgte so, daß die Temperatur im Kolben 65°C -exothermische Reaktion nicht überstieg. ITachdem die gesamte Menge an Akrylsäure

3 hinzugegeben worden war, wurde eine Teilmenge von 0,5 cm aus der Reaktionsmischung herausgenommen, und in 10 cm Wasser zur pH-WertheStimmung gelöst. Diese wässrige Lösung wurde anschließend mit Salzsäure auf einen pH-Wert von ungefahr 2 angesäuert und mit Äther extrahiert. Der Äther wurde verdampft und die verbleibende Substanz wurde auf Doppelbindungen mit einer KMnO.-Lösung titriert. Hieraus ergab sich Aufschluß darüber, in welcher Menge die Akrylsäure in nicht gekoppeltem und gebundenem Zustand vorlag. Um die Reaktion zu beenden, wurde sodann der Kolben unter Umrühren erhitzt und auf einer Temperatur zwischen 80 und 10O⁰C wfihrend

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2 bis 6 Stunden gehalten, bis der vorerwähnte Test mit Akrylsäure negativ ausfiel.

Zum genaueren Studium der Ergebnisse der Kopplungsreaktion wurde die gewonnene Mischung an amphoterischen Trägern in einer ElektroIysevorrichtung in 20 durch Diaphragmen voneinander getrennte Zellen aufgeteilt. In diese Elektrolysevorrichtung wurde ein Teil der Reaktionsmischung gegeben, di-e etwa 40 Gramm amphoterischen Trägers, gelöst in 450 cm destillierten Wasser, entspräche Um zu verhindern, daß die amphoterischen Stoffe durch anodische Oxydation und kathodische Reduktion zerstört werden, ist es wichtig, die Elektrolyse so auszuführen, daß die amphoterischen Stoffe die Anode und die Kathode so wenig als möglich berühren.

Die Elektrolyse wird unter einer Spannung von 400 bis 800 Volt ausgeführt, was einer durchschnittlichen Feldstärke von 20 bis 40 Volt/cm entspricht. Ein Gleichgewichtszustand wird in der Regel innerhalb von 48 Stunden erreicht, wobei die Stromdichte bei konstant gehaltener Spannung sich nicht ändert.

Die Zellen der Elektrolysevorrichtung werden gleichzeitig in ein besonderes Gefäß geleert. Hierbei erhält man eine

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AnzahL von Teilmengen, die der Zahl der Zellen entspricht, Der pH-Wert einer jeden einzelnen Teilmenge wird gemessen und entspricht in etwa dem pi der amphoterischen Stoffe. Die Teilmengen mit geeigneten pH-Wertbereichen werden miteinander kombiniert und durch Verdampfen getrocknet. Eie verbleibende Substanz wird danach in kochendem Methanol oder Äthanol gelöst. Das Lösungsmittel wird sodann verdampft, wobei die amphoterischen Stoffe oft kristallisieren. Wenn dies nicht der Pail ist, wird die Behandlung wiederholt, um das gesamte Wasser auszutreiben. Die erhaltenen Substanzen werden schließlich in einem Trockner getrocknet. Die Ausbeute innerhalb der verschiedenen pH-Wertbereiche wird sodann durch Wiegen der trockenen amphoterischen Stoffe bestimmt. Die Puffereigenschaften und das Leitvermögen der amphoterischen Stoffe werden gemessen, wobei die Werte auf 1 Milligramm trockener Substanz bezogen werden.

Bei den Versuchen zeigte es sich, daß 90$ der gesamten Ausbeute an amphoterischen Stoffen einen pl-Wert zwischen 3,5 und 10 aufwiesen. Die gewonnenen amphoterischen Stoffe ergeben somit innerhalb des gesamten, hinsichtlich des isoelektrischen Trennungsverfahrens interessierenden Bereiches den gewünschten pl-Wert. Es ist weiterhin möglich, die Ausbeute innerhalb gewisser pi-Werte und Bereiche zu modifizieren.

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Der ;;emäß dein vorgenannten Ausfülirungsbeispiel gewonnene amphoterische Träger ist praktisch farblos. Im Vergleich zur Absorption von Proteinen kann seine leichte Lichtabserptjon lei 2:00 bis 2850 £ praktisch vernachlässigt werden.

Trdäthylentetramin kann durch Äthylendiamin, Diäthylentriamih oder Tetraäthy1enpentamin ersetzt werden. In gleicher Weise kann die Akrylo iure durch folgende Säuren ersetzt werden, ohne da3 dadurch andere Ergebnisse erhalten würden:'Methane krylsäure, Frotons-äure, Maleinsäure, Fumarsäure und Itakonsäure,

Gemäß der. erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, sehr einfach und wirtschaftlich, sowie mit j_:uter Ausbeute gute amphoterische Träger herzustellen. Die pl-We-rte und Bereiche dieser amphoterisehen Stoffe zeigen ein Spektrum, das den gesamten zur Durchführung der iscelektrischen Trennung benötigten Bereich überdeckt«

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Claims (2)

U93939 Patentansprüche

1. Verfahren r.ur Herstellung eines Systems von amphoterischen Trägern, dadurch gekennzeichnet, daß eine organische Verbindung mit wenigstens zwei Amino- und/oder Iminogruppen zur chemischen Reaktion mit einer Karbonsäure gebracht werden, die eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung enthält.

2. Ver.ahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ™ die organische Verbindung Äthylendiamin, Diäthylentriamin, Triäthylentetramin oder Tetraäthylenpentamin ist.

3· Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die ungesättigte Säure Acrylsäure ist oder Methakryl- C säure, ^rotonsäure» Maleinsäure oder Itakonsäure.

4· Verfahren gemäß einem oder ,mehreren der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß anstelle einer organischen Verbindung mehrere organische Verbindungen benutzt v/erden, vorzugsweise zusammen mit einer organischen Verbindung, die nur ein primäres oder sekundäres Stickstoffatom enthält·

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5p Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß anstelle einer ungesättigten !Carbonsäure eine Mischung aus mehreren !Carbonsäuren benutzt wird.

6 ο Anwendung einer gemäß dem Verfahren nach einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche 1 bis 5 hergestellten Mischung von amphoter!sehen Trägern zur isoelektrischen Fraktionierung und Analyse von hochmolekularen amphoterisehen Stoffen durch stationäre Elektrolyse, wobei die Mischung aus polyprotischen Aminokarbonsäuren mit wenigstens vier

protolytischen Gruppen besteht und wenigstens eine Karbongruppe und wenigstens ein basisches Stickstoffatom vorhanden ist«

7ο Anwendung einer gemäß dem Verfahren nach einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche 1 bis 5 hergestellten Mischung von amphoterischen Trägern zur isoelektrischen Fraktionierung und Analyse von hochmolekularen amphoterischen Stoffen durch stationäre Elektrolyse, wobei die isoelektrischen Punkte der amphoterischen Stoffe innerhalb eines engen pH-Wertbereiches liegen_e

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8, Anwendung einer gemäß dem Verfahren nach einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche 1 bis 5 hergestellten Mischung von amphoterischen Trägern zur isoelektrischen Fraktion und Analyse von hochmolekularen amphoterischen Stoffen durch stationäre Elektrolyse, wobei die amphoterischen Stoffe Hydroxylgruppen einschließen.

9β Anwendung einer gemäß dem Verfahren nach hinein oder mehreren der vorstehenden Ansprüche 1 bis 5 hergestelLten Mischung von amphoterischen Trägern zur isoelektrischen Fraktionierung und Analyse von hochmolekularen amphoterischen Stoffen lurch stationäre Elektrolyse, wobei die amphoterischen Stoffe nichtaromatische Stoffe sind.

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