DE1493939B2

DE1493939B2 - Gemisch aus polyamino-monocarbonsaeuren und -polycarbonsaeuren, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung als traegerampholyte

Info

Publication number: DE1493939B2
Application number: DE1965L0051357
Authority: DE
Inventors: Olof Alfred Yngve Dr Solna Vesterberg (Schweden)
Original assignee: Lkb-Produkter Ab, Stockholm
Priority date: 1964-08-26
Filing date: 1965-08-10
Publication date: 1977-12-15
Also published as: GB1106818A; DE1493939C3; SE314227B; US3485736A; DE1493939A1

Description

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Die Erfindung betrifft den in den vorstehenden Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Anwendungszweck der Erfindung ist die isoelektrische Fraktionierung von hochmolekularen, amphoteren Stoffen, wie z. B. Proteine, Toxine, Antitoxine, bakteriel-Ie Antigene, Antikörper, Viren, Hormone, Enzyme mittels einer stationären Elektrolyse, d. h. einer Elektrolyse, die konvektionsfrei so lange durchgeführt wird, bis keine wesentlichen Konzentrationsänderungen der Substanzen in der Elektrolysezelle mehr stattfinden.

R. R. Williams& R. E. Waterman (Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 27, 56-59, 1929) beschrieben bereits Versuche zur Elektrolyse einer Ampholytmischung, bei der eine Durchmischung des Elektrolyten verhindert wird, so daß sich die mehr sauren amphoteren Stoffe im stationären Gleichgewicht in der Nähe der Anode und die mehr basischen Stoffe in der Nähe der Kathode ansammeln. Da jeder amphotere Stoff dazu neigt, den pH-Wert der Lösung auf seinen eigenen isoelektrischen Punkt einzustellen, ergibt sich bei der Elektrolyse ein Gradient von pH-Werten, die von der Anode zur Kathode zunehmen und deren genauer Verlauf von den Mengen sowie von den Eigenschaften der Elektrolyten im System abhängt.

Verbesserungen dieser Versuche haben die Fraktionierung von biologischen Stoffen, insbesondere von niederen Peptiden und Aminosäuren, die aus der Hydrolyse von Proteinen erhalten wurden, ermöglicht. Eine Zerlegung von amphoteren Stoffen mit dicht nebeneinanderliegenden isoelektrischen Punkten war e,o jedoch nicht durchführbar. Die Bedeutung dieses bekannten Verfahrens blieb deshalb auf die Trennung der Stoffe in saure, neutrale und basische amphotere Stoffe beschränkt. So beschrieb z. B. A. T i s e 1 i u s (Svensk Kemisk Tidskr., 53, 305, 1941) die Anwendung _b5 der stationären Elektrolyse auf eine Mischung von zwei so verschiedenen Proteinen wie Eialbumin und Hämoglobin, deren pH-Werte bei 4,6 bzw. 7,0 liegen, die jedoch nicht vollständig getrennt, sondern lediglich jeweils angereichert werden konnten, während ihre Trennung mit anderen Verfahren einfach ist.

H. S ve η s so η (Acta Chem. Scand., 15, 325, 1961) zeigte, daß bei einem stationären, vom elektrischen Strom gebildeten pH-Gradienten ein amphoterer Stoff theoretisch nicht in reinem Zustand existieren kann, sondern sogar bei seinem eigenen Konzentrationsmaximum zumindest mit solchen anderen amphoteren Stoffen vermischt ist, die einen benachbarten isoelektrischen Punkt aufweisen. Die Konzentration eines amphoteren Stoffes innerhalb einer engen Zone ist um so größer, je geringer die Diffusionskonstante und je größer der Wert des Gradienten du/d(pH) am isoelektrischen Punkt ist, worin u die Ionenbeweglichkeit darstellt. Da die meisten Aminosäuren und niederen Peptide hohe Diffusionskonstanten und niedrige Werte des vorstehend bezeichneten Gradienten aufweisen, erscheint es somit nicht möglich, eine saubere Trennung von niedrig molekularen amphoteren Stoffen mit Hilfe einer stationären Elektrolyse durchzuführen.

Proteine und andere hochmolekulare, amphotere Stoffe weisen jedoch niedrige Diffusionskonstanten und hohe Werte des Gradienten du/d(pH) an den isoelektrischen Punkten auf, so daß Svensson auf die Möglichkeit hinwies, diese Stoffe mit Hilfe eines sich über die betreffenden isoelektrischen Punkte erstrekkenden, stabilen pH-Gradienten sehr genau und selektiv zu analysieren und fraktionieren. Hierzu können gewisse niedrigmolekulare amphotere Stoffe der Elektrolyse als Trägerampholyte zugesetzt werden, die in dem zwischen den beiden Elektroden liegenden Bereich einen allmählichen Übergang der pH-Werte bilden und zu einem nur leichten Gradienten der Leitfähigkeit führen, wodurch folglich keine unerwünschten starken Feldstärkeänderungen auftreten. Von den die reinen, voneinander abgetrennten Proteinen enthaltenden Fraktionen wird nachträglich der amphotere Träger auf einfache Weise, z. B. mittels Dialyse oder einem anderen Verfahren, entfernt.

H. Svensson (Acta Chem. Scand., 16, 456, 1962) zeigte weiterhin, daß ein niedrigmolekularer, amphoterer Stoff als guter Trägerampholyt geeignet ist, wenn er wenigstens zwei pK_s-Werte in der Nähe seines eigenen isoelektrischen Punktes aufweist. Histidin mit einem pH-Wert von 7,6 und nächstgelegenen pKj-Werten von 6,10 und 9,18 ist deshalb gut geeignet, während Glycin mit einem pl-Wert von 6,1 und nächstgelegenen pKj-Werten von 2,35 und 9,78 wie alle anderen neutralen Aminosäuren, ein wenig geeigneter Trägerampholyt ist.

Ferner bewies H. Svensson (Arch. Biochem. Biophys. Supp., 1,132,1962) in Übereinstimmung mit der Theorie, daß eine saubere Trennung von Proteinen auch experimentell möglich ist, wobei zwei Proteine mit isoelektrischen Punkten im Abstand von nur 0,1 pH-Einheiten vollständig voneinander getrennt wurden.

Im pH-Wertbereich zwischen 0 und 3 werden keine amphoteren Träger benötigt, weil hier ein guter pH-Gradient bei der Elektrolyse einer Mischung von starken bis sehr schwachen Säuren erhältlich ist. Das gleiche gilt auch für den pH-Wertbereich zwischen 11 und 14, in dem eine Mischung von Basen verschiedener Stärke benutzt werden kann. Die Mehrzahl der Proteine sind jedoch zwischen den pH-Werten von 3 und 11 isoelektrisch. Zu ihrer Trennung werden somit amphotere Träger benötigt, deren isoelektrische Punkte ziemlich gleichmäßig zwischen den pH-Werten 3 und 11

verteilt sind. Die Durchführbarkeit einer Analyse und Trennung von Proteinen hängt vollständig von der Beschaffenheit derartiger amphoterer Träger ab.

Unter den bisher handelsüblichen, niedrigmolekularen Trägerampholyten findet sich jedoch kein Stoff, der zwischen den pH-Werten von 4 und 7 isoelektrisch ist, und es gibt nur zwei Stoffe, die zwischen den pH-Werten von 7 und 8 isoelektrisch sind. Nur wenige Stoffe sind oberhalb eines pH-Wertes von 8 isoelektrisch. Dazu kommt, daß die hohen Kosten mancher im Handel erhältlicher Trägerampholyte sich nachteilig auf die Anwendbarkeit des Verfahrens auswirken.

Bisher wurden zur Behebung des Mangels an geeigneten Trägerampholyten hauptsächlich zwei prinzipiell verschiedene Wege zu ihrer Beschaffung eingeschlagen. Der erste beruht auf der organisch-chemischen Synthese von verschiedenen amphoteren Trägern und der zweite auf die partielle Hydrolyse von Proteinen, deren Produkt im wesentlichen aus niederen Peptiden besteht.

Das erste Verfahren wird hauptsächlich dadurch eingeschränkt, daß die meisten leicht verfügbaren, organischen Protolyte pK_s-Werte aufweisen, die innerhalb eng begrenzter pH-Bereiche liegen. So betragen beispielsweise die pH-Werte bei der Dissoziation fast aller einwertigen Carbonsäuren zwischen 4 und 5, fast aller einwertigen aliphatischen Amine zwischen 9 und 10 und der meisten aromatischen Amine etwa 5. Die Synthese einzelner amphoterer Träger mit gewünschten isoelektrischen Punkten ist selbst für einen sehr geschickten Fachmann äußerst schwierig. Bisher durchgeführte Syntheseversuche führten auch zu keinem nennenswerten Erfolg. Überdies würde eine derartige synthetische Herstellung mit Sicherheit sehr kostspielig sein. r,

Das zweite Verfahren ist erfolgreicher, weil partielle Hydrolysate von Proteinen nach der Entsalzung geeignete amphotere Träger in beträchtlicher Menge enthalten. Im Gegensatz zum synthetischen Verfahren ergibt die partielle Hydrolyse von Proteinen direkt ein zur isoelektrischen Fraktionierung von Proteinen verwendbares Ampholytgemisch. Hierdurch erübrigt sich eine zeitraubende und teure Umkristallisation oder andere Reinigung der einzelnen chemischen Stoffe. Partielle Hydrolysate von Proteinen waren deshalb für die weitere Entwicklung der stationären Elektrolyse von großer Bedeutung, insbesondere für die Proteintrennung.

Ein bisher unberücksichtigter Nachteil besteht jedoch darin, daß die Fraktion eines partiellen Hydrolysats, das zwischen pH-Werten von 5 und 6,5 isoelektrisch ist, zwar quantitativ ausreicht, jedoch als amphoterer Träger unzulänglich ist. Bei der Elektrolyse ist innerhalb dieses pH-Bereiches die Leitfähigkeit sehr gering, und es entstehen darin lokale Überhitzungen, während außerhalb davon die Feldstärke zu niedrig ist.

Ein weiterer Nachteil der partiellen Hydrolysate liegt darin, daß sie selten ganz farblos sind. Die amphoteren Träger lassen deshalb Farbzonen entstehen, die bei der isoelektrischen Trennung von farbigen Proteinen, wie t>o z. B. Hämoglobin und Myoglobin, sehr hinderlich sind.

Der letztgenannte Nachteil steht im Zusammenhang mit einer weiteren, bisher unerfüllten Forderung, die an einen Trägerampholyten gestellt werden muß. Es ist erforderlich, nach der Elektrolyse die Proteine qualitativ und quantitativ zu erfassen, die sich an verschiedenen Punkten zwischen den Elektroden angesammelt haben. Hierbei darf derTrägerampholyt das Analyseverfahren nicht beeinträchtigen. Peptide ergeben bei den meisten Analyseverfahren für Proteine eine positive Reaktion. Lediglich Koagulationsverfahren und besondere Proteinreaktionen, wie Enzymaktivität, Antigenaktivität, toxische Aktivität, Antikörperwirkung usw., können bei amphoteren Trägern benutzt werden, die aus Peptiden bestehen. Bei allen anderen Proteinanalysen müssen die Peptide zuerst entfernt werden. Meistens kann dies mittels einer Dialyse durchgeführt werden, die zwar einfach, jedoch sehr zeitaufwendig ist, insbesondere weil große Peptide nur sehr langsam ausdialysieren.

Die einfachste, bequemste und an häufigsten angewendete Proteinanalyse beruht auf Extinktionsmessungen bei 280 nm. Dafür wäre jedoch ein bis zu dieser Wellenlänge durchlässiger Trägerampholyt erforderlich. Die partiellen Hydrolysate sind hierzu unbrauchbar.

Aufgabe der in den Ansprüchen angegebenen Erfindung ist es demgemäß, einen zur isoelektrischen Fraktionierung von hochmolekularen, amphoteren Stoffen mittels stationärer Elektrolyse brauchbaren Trägerampholyten vorzusehen, der zwischen den pH-Werten von 3 und 11 isoelektrisch, farblos und bis zu einer Wellenlänge von 280 nm lichtdurchlässig ist, sowie ein Verfahren zur einfachen und wirtschaftlichen Herstellung eines derartigen Trägerampholyten aufzuzeigen.

Das erfindungsgemäße Ampholytgemisch besteht aus mehreren polyprotischen Aminocarbonsäuren, von denen jede mindestens vier schwache protolytische Gruppen enthält, wobei wenigstens eine Carboxylgruppe und wenigstens drei basische Stickstoffatome, jedoch keine Petidbindungen vorkommen. Zwischen zwei Stickstoffatomen ist eine — (CH₂)„-Gruppe angeordnet, in der π die Bedeutung 2 oder 3 hat.

Diese einzelnen amphoteren Stoffe weisen aufgrund ihres polyprotischen Charakters gute Eigenschaften als amphotere Träger auf, wie im folgenden näher erläutert werden soll. Es ist bekannt, daß zwei protolytische Gruppen innerhalb desselben Moleküls ihre Dissoziationen sehr stark gegenseitig beeinflussen. Dieser wechselseitige Einfluß bewirkt eine Vergrößerung des pKj-Abstands in einem biprotischen Molekül. Dies ist einer der Gründe dafür, daß Versuche zur synthetischen Herstellung von biprotischen, amphoteren Trägern nicht zu dem gewünschten Ergebnis führten. Diese gegenseitig abstoßende Wirkung zwischen verschiedenen pKj-Werten tritt im gleichen oder sogar noch höherem Maße bei identischen protolytischen Gruppen innerhalb desselben Moleküls auf. Es ist deshalb bei einer zweiwertigen Säure oder Base theoretisch unmöglich, daß die pKy Werte einen kleineren Abstand voneinander haben als 0,6 pH-Einheiten. In der Regel liegen sie noch viel weiter auseinander, wie dies die folgende beispielhafte Aufstellung einiger pK_s-Werte zeigt:

pK₃ pK₄

Äthylendiamin 6,85 9,9

Diäthylentriamin 4,34 9,13 9,94

Triäthylentetramin 3,32 6,67 9,20 9,92

Tetraäthylenpentamin 2,65 4,25 7,87 9,08 9,92

Aus organischen Verbindungen mit Amino- oder Iminogruppen können nun durch Einführung von Substituenten am Stickstoffatom mehrere Homologe und Isomere mit verschiedenen pKs-Werten gewonnen werden. Indem man Moleküle mit mindestens vier

protolytischen Gruppen herstellt, wird auf der pH-Skala eine Ballung der pKs- Werte der verschiedenen Dissoziationsstufen erreicht, und es wird einem amphoteren Stoff ein Paar von pK_s-Werten in der Nähe des isoelektrischen Punktes aufgezwungen, was sich bei bi- und triprotischen Ampholyten, die im pH-Bereich von 4 bis 7 isoelektrisch sind, nicht erreichen läßt.

Das erfindungsgemäße Ampholytgemisch weist eine große Anzahl von verschiedenen chemischen Einzelstoffen auf, die sich voneinander durch die Anzahl an sauren und basischen Gruppen unterscheiden oder Isomere und Homologe sind. Jeder einzelne chemische Stoff enthält vorzugsweise vier bis zehn schwache protolytische Gruppen. Infolge der großen Anzahl verschiedener amphoterer Stoffe mit schwachen protolytischen Gruppen erhält das Gemisch ein sehr reiches Spektrum von verschiedenen isoelektrischen Punkten innerhalb des pH-Wertbereiches von 3 bis 11.

Die Erfindung umfaßt auch Gemische von polyprotischen, amphoteren Stoffen, deren isoelektrische Punkte innerhalb von engeren pH-Wertbereichen verteilt sind als dem oben angegebenen breiten Bereich. Gemische, deren isoelektrische Punkte sich vorzugsweise über nur zwei bis drei pH-Werteinheiten oder manchmal sogar über nur eine pH-Werteinheit erstrecken, sind für eine sehr feine Trennung von Proteinen nützlich, die nahe nebeneinanderliegende, isoelektrische Punkte aufweisen, ζ. B. ein System von Antikörpern, Hämoglobinen, Myoglobinen.

Bei der stationären Elektrolyse einer Zusammensetzung amphoterer Stoffe, deren isoelektrische Punkte zwischen den pH-Werten 6 und 8 liegen, wird ohne Berücksichtigung von Sekundäreffekten ein anodischer pH-Wert von ungefähr 6 und ein kathodischer pH-Wert von ungefähr 8 erhalten. Das gesamte Volumen der Elektrolysezelle steht deshalb für die Trennung innerhalb dieses engen pH-Wertbereiches zur Verfügung.

Die erfindungsgemäßen Ampholytgemische enthalten nur aliphatische Verbindungen ohne aromatische Gruppen, weil diese oftmals eine Lichtabsorption im kritischen Bereich von 280 nm aufweisen. Somit eignet sich der Trägerampholyt zum Arbeiten mit Proteinen, die anhand ihrer UV-Absorption analysierbar sind.

Das beschriebene Ampholytgemisch erfüllt alle gestellten Forderungen. Es besteht aus einzelnen amphoteren Stoffen, deren isoelektrische Punkte innerhalb eines pH-Wertbereiches gut verteilt sind, was mit aus Säuren oder Basen zusammengestellten Systemen nicht erzielbar ist. Die Puffereigenschaften und die elektrische Leitfähigkeit im isoelektrischen Zustand sind zufriedenstellend. Weiterhin ist der Vorteil der Farblosigkeit gegeben. Bei 280 nm ist lediglich eine völlig unbedeutende, leichte Absorption zu beobachten. Keines der üblichen Analyseverfahren für Proteine wird beeinträchtigt.

Die Einzelstoffe des erfindungsgemäßen Ampholytgemisches sind nicht im Handel erhältlich. Das erfindungsgemäße Verfahren zu dessen Herstellung ist seiner Natur nach ein synthetisches, jedoch weist es, ähnlich wie das zur Herstellung von partiellen Hydrolysaten verwendete, den Vorteil auf, daß es direkt zu einem ganzen System von amphoteren Trägern führt. Somit entfällt die aufwendige und kostenmäßig unvertretbare synthetische Herstellung von reinen, einzelnen chemischen Stoffen und die nachfolgende Zusammenmischung im geeigneten Mengenverhältnis. Die Ausgangsstoffe des erfindungsgemäßen Verfahrens sind billig, so daß dieses sehr wirtschaftlich und bei guter Ausbeute durchgeführt werden kann.

Zur Herstellung des erfindungsgemäßen Ampholytgemisches wird ein Polyamin mit einem Molekulargewicht von höchstens 500, vorzugsweise von höchstens 300, das wenigstens drei Aminogruppen enthält, von denen wenigstens eine primär ist und die anderen primär oder sekundär sind, mit einer der im Anspruch 1 genannten ungesättigten Carbonsäuren oder einem

ίο Gemisch dieser Säuren umgesetzt, wobei die Reaktion mit einer Menge an Säure durchgeführt wird, die kleiner ist als diejenige Menge, die zur Substitution sämtlicher primären und sekundären Stickstoffatome erforderlich ist.

Bei dem eingesetzten Polyamin sind zwischen zwei Stickstoffatomen höchstens drei, vorzugsweise zwei Kohlenstoffatome angeordnet, so daß es die Struktur -NH-R-NH- aufweist, in der R eine -(CH₂J₃- oder vorzugsweise eine —(CH2)2-Gruppe bedeutet.

Eines oder mehrere der Stickstoffatome können beispielsweise mit Methyl-, Äthyl- oder 2-Hydroxyäthylgruppen substituiert sein.

Das Polyamin ist aliphatisch, und sollte auf jeden Fall wenigstens einen pKj-Wert aufweisen, der weniger als 8 beträgt. Besonders geeignet sind Diäthylentriamin, Triäthylentetramin, Tetraäthylenpentamin und Pentaäthylenhexamin. Es kann in vorteilhafter Weise auch ein Amingemisch eingesetzt werden.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte ungesättigte Säure weist eine Doppelbindung in der ocjS-Stellung auf. Acrylsäure, Methacrylsäure und Crotonsäure haben sich als geeignet erwiesen. Die Säure kann weiterhin mehr als eine Carboxylgruppe enthalten, wie Maleinsäure und Itaconsäure. Gemische dieser Carbonsäuren können auch eingesetzt werden.

Typische Reaktionen zwischen dem Amin und der Säure können folgendermaßen dargestellt werden:

R²—NH-R¹—NH₂ + 2R³—CH=CH-COOH

R³—CH-CH₂-COOH

► R²—NH-R¹—N (1)

R³—CH-CH₂-COOH

oder

R³—CH-CH₂-COOH

► R²—N—R¹—NH

R³—CH-CH₂-COOH

In den vorstehenden Gleichungen bedeutet R¹ eine zweiwertige Gruppe, die ein oder mehrere Stickstoffatome enthalten kann, oder eine -(CH₂J_n-NH-(CH₂)n-Gruppe, in der π 2 oder 3 ist, R² ist Wasserstoff oder eine Alkylgruppe, die ein oder mehrere Stickstoffatome enthalten kann, z. B. eine HaC-NH-(CH₂J₂-Gruppe, und R³ entspricht den in Anspruch 1 genannten Carbonsäuren.

e,5 Die alternativen Reaktionen (1) und (2) finden gleichzeitig statt, wobei die Anzahl der möglichen Kombinationen im wesentlichen mit der Anzahl primärer und sekundärer Aminogruppen im eingesetz-

ten Amin sowie mit der Anzahl der Carboxylgruppen der hinzugegebenen Säure zunimmt.

Ein Aminmolekül kann bis zur maximalen Anzahl der substituierbaren Wasserstoffatome in den Aminogruppen mit einem oder mehreren Molekülen einer ungesättigten Carbonsäure eine Additionsreaktion eingehen. Durch geeignete Wahl der eingesetzten molaren Anteile des Amins und der Säure wird eine statistische Verteilung der Produkte erreicht, so daß eine Homologreihe mit verschiedenen Anzahlen von Carboxylgruppen und somit verschiedenen pl-Werten erhalten wird.

Bei einer gegebenen Anzahl von sauren und basischen Gruppen wird spontan eine große Anzahl von Isomeren gebildet, weil die Säure mit Amino- oder Iminogruppen verbunden werden kann, die an verschiedenen Stellen des Aminmoleküls liegen, wie aus den vorstehenden Reaktionsgleichungen ersichtlich ist. Dies ist von großer Bedeutung, weil die Carboxylgruppen mit den Amino- und Iminogruppen so reagieren, daß verschiedene pK_s-Werte an verschiedenen Stellen des resultierenden Moleküls erhalten werden, wobei die isomeren Möglichkeiten sehr stark mit der Anzahl der protolytischen Gruppen zunehmen.

Weil die Reaktion mit einer Menge an Säure durchgeführt wird, die kleiner ist als diejenige Menge, die zur Sättigung sämtlicher primären und sekundären Stickstoffatome erforderlich ist, entsteht eine als Trägerampholyt geeignete Mischung von verschiedenen Aminocarbonsäuren und Isomeren.

Die Reaktion zwischen dem Polyamin und der ungesättigten Carbonsäure wird vorzugsweise bei einer erhöhten Temperatur, die gewöhnlich 30 bis 150° C, vorzugsweise 40 bis 100°C beträgt, und in Gegenwart eines Lösungsmittels durchgeführt, wobei oft unter Rückfluß des Lösungsmittels gearbeitet wird, welches Wasser oder ein organisches Lösungsmittel, z. B. Alkohol oder ein Kohlenwasserstoff, sein kann. Die Reaktion kann mit Katalysatoren durchgeführt werden, die z. B. aus den erwähnten Basen bestehen sowie aus sauer reagierenden Salzen, wie z. B. primäres Natriumphosphat, Zinkchlorid und Aluminiumchlorid. Hydrochinon wird als Inhibitor für die Polymerisation der ungesättigten Säure benutzt.

Bei der isoelektrischen Trennung ist man oft an einem bestimmten pH-Wertbereich interessiert, der gemäß den isoelektrischen Punkten der zu trennenden Stoffe, insbesondere der Proteine, ausgewählt wird. Das benutzte Ampholytgemisch sollte deshalb mit seinem pl-Spektrum diesen Bereich überdecken. Es ist oft von Vorteil, das erfindungsgemäße Ampholytgemisch in bezug auf pi-Werte grob aufzuteilen, was mit isoelektrischer Trennung durchgeführt werden kann, vorzugsweise in einer Vorrichtung, die mehrere, durch konvektionsverhindernde Membrane voneinander getrennte Zellen aufweist. Hierin wird auf die eingangs genannte Veröffentlichung von Williams & Waterman verwiesen. Ein gemäß der Erfindung hergestelltes und in verschiedene pl-Intervalle aufgeteiltes Ampholytgemisch kann getrocknet oder auskristallisiert werden. Diese Aufteilung ist auch dann geeignet, wenn die Ausbeute an amphoteren Trägern in einem bestimmten pl-Intervall bestimmt wird. Aufgrund dieser Bestimmung kann die Reaktion dann so modifiziert werden, daß ein größerer Teil der gesamten Ausbeute innerhalb eines bestimmten pI-Bereiches erhalten wird. Dies kann beispielsweise dufch Änderung der relativen Mengen des Amins und der Carbonsäure erreicht werden sowie der Menge und Art des Katalysators und Lösungsmittels.

Wenn das erfindungsgemäße Ampholytgemisch nach pI-Bereichen aufgeteilt und getrocknet worden ist, kann seine Brauchbarkeit als amphoterer Träger dadurch bestimmt werden, daß die Puffereigenschaften und die Leitfähigkeit gemessen werden. Diese Werte werden vorzugsweise auf ein Milligramm des trockenen Ampholytgemisches bezogen. Die erfindungsgemäß

ίο hergestellten Ampholyte werden durch Elektrolyse in einem Bad so aufgeteilt, daß diejenigen mit niedrigen pl-Werten, d. h. die saureren, sich im Gleichgewichtszustand in der Nähe der Anode ansammeln und diejenigen mit höheren pl-Werten mehr in der Nähe der Kathode.

Die Konzentrationsverteilung im Gleichgewichtszustand, bei der jeder amphotere Stoff eine Konzentrationsspitze am entsprechenden pl-Wert aufweist, ähnelt derjenigen normaler Verteilungskurven (Gaußsche Kurven), die sich teilweise überlagert. Im Gleichgewichtszustand ist der pH-Wert in einem bestimmten Bereich des elektrolytischen Bades ungefähr gleich dem pl-Wert der Ampholyte, die in diesem Bereich vorliegen. Eine Messung des pH-Wertes ergibt somit sehr einfach ein Maß für den pl-Wert der vorliegenden Ampholyte.

Anhand der folgenden Versuchsbeispiele wird die Erfindung noch näher erläutert.

Beispiel 1

Ein mit Rückflußkühlung, einem Rührwerk, einem Thermometer und einem Tropftrichter versehener Rundkolben wurde mit 100 Molanteilen reinen Triäthylentetramins in 50%iger wäßriger Lösung beschickt und in ein Wasserbad bei einer Temperatur von 50° C eingetaucht. Über den Tropftrichter wurden kleine Mengen einer 50%igen wäßrigen Lösung vakuumdestillierter Acrylsäure so zugegeben, daß bei der exothermen Reaktion die Temperatur im Kolben 65° C nicht überstieg. Nach Zugabe der gesamten Menge an Acrylsäure, die bei verschiedenen Teilversuchen 200, 250, 300 und 350 Molanteile betrug, wurde jeweils eine Teilmenge von 0,5 ml aus der Reaktionsmischung entfernt und in 10 ml Wasser zur pH-Wertbestimmung gelöst. Diese wäßrige Lösung wurde anschließend mit Salzsäure auf einen pH-Wert von ungefähr 2 angesäuert und mit Äther extrahiert. Der Äther wurde verdampft und die verbleibende Substanz mit einer KMnO₄-Losung auf Doppelbindungen titriert, um die nicht umgesetzte Acrylsäure zu bestimmen. Zur Beendigung

so der Reaktion wurde der Kolben unter Umrühren erhitzt und 2 bis 6 Stunden lang auf eine Temperatur zwischen 80 und 100°C gehalten, bis der Acrylsäurenachweis negativ ausfiel.

Zur Untersuchung der erhaltenen Ampholytmischung wurde diese in einer etwa 40 g Ampholyt in 450 ml destilliertes Wasser entsprechenden Konzentration in eine Elektrolysevorrichtung mit 20 durch Membrane voneinander getrennte Zellen eingeführt. Um eine Zerstörung der amphoteren Stoffe durch anodische

so Oxidation und kathodische Reduktion zu verhindern, wurde die Elektrolyse so durchgeführt, daß diese Stoffe die Elektroden so wenig wie möglich berührten.

Die Elektrolyse fand bei einer Spannung von 400 bis 800 Volt statt, was einer durchschnittlichen Feldstärke von 20 bis 40 Volt/cm entsprach. Ein Gleichgewichtszustand wurde in der Regel innerhalb von 48 Stunden erreicht, wonach die Stromdichte bei konstant gehaltener Spannung konstant blieb.

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Die einzelnen Zellen der Elektrolysevorrichtung wurden gleichzeitig jeweils in getrennte Gefäße geleert. Der pH-Wert dieser Teilmengen wurde bestimmt und entsprach etwa dem pl-Wert der amphoteren Stoffe. Geeignete pH-Wertbereiche aufweisende Teilmengen ^r> wurden miteinander kombiniert und durch Verdampfen eingetrocknet. Die Rückstände wurden in kochendem Alkohol gelöst und das Lösungsmittel verdampft, wobei die amphoteren Stoffe oft kristallisierten. Trat dies nicht ein, so wurde die Behandlung wiederholt, um restliches Wasser abzutreiben. Die erhaltenen Stoffe wurden schließlich in einem Exsikkator getrocknet. Die den verschiedenen pH-Wertbereichen entsprechenden Ausbeuten an Trockensubstanzmenge wurden bestimmt und die Puffereigenschaften und die Leitfähigkeit der |-, Produkte gemessen. Es zeigte sich, daß mehr als 90% der gesamten erhaltenen Stoffe pl-Werte zwischen 3, 5 und 10 aufwiesen.

Die gewonnenen Trägerampholyte waren praktisch farblos und wiesen bei 280 bis 285 nm eine Lichtabsorption auf, die im Vergleich zu derjenigen von Proteinen praktisch vernachlässigbar war.

Beispiel 2

In ähnlicher Weise wie beim Beispiel 1 wurden 0,03 Mol vakuumdestilliertes Pentaäthylenhexamin (Siedepunkt 180-185°C/0,05 Torr) mit 0,09 Mol vakuumdestillierter 99%iger Acrylsäure und in Gegenwart von 30 ml Wasser bei 70° C umgesetzt.

Entnommene Proben wurden auf einen pH-Wert von _J0 2,5 mit 1 M Schwefelsäure angesäuert. Die noch enthaltene Acrylsäure wurde mit Äther extrahiert, der Äther verdampft und der Rückstand jeweils in 2 ml destilliertes Wasser aufgelöst. Die Titration erfolgte mit 0,01 M KMnO₄. Nach 5 Stunden wurde in der _Γ) Reaktionslösung keine Acrylsäure mehr festgestellt.

Die Lösung wurde mit 500 ml Wasser verdünnt, was eine 4 —8%ige Lösung der Ampholyte ergab und diese in einer durch Membrane in 20 Zellen unterteilten Elektrolysevorrichtung elektrofokussiert. Um Kontakt mit den Elektroden zu vermeiden, wurden die ersten beiden anodenseitigen Zellen jeweils mit 50 ml 0,1 M H2SO4 und die erste kathodenseitige Zelle mit 25 ml 0,1 M NaOH gefüllt. Die Elektrolyse wurde 24 Stunden lang bei einer maximalen zugeführten Leistung von 500 W durchgeführt und die Spannung am Ende auf 800 V erhöht. Danach wurden die Zellen entleert.

Die bei 20°C bestimmten pH-Werte der einzelnen Ampholytfraktionen ergaben einen annähernd linearen Verlauf zwischen 3,5 und 9,5. Im pH-Bereich von 5 — 8 war die minimale Pufferwirkung 1,1 m Äquivalente/ g · pH-Einheit. Die Ausbeuten in den einzelnen Zellen betrugen zwischen 3 und 8% der Gesamtausbeute an Ampholyten von 15 g.

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Beispiel 3

Es wurde 0,1 Mol gereinigtes Pentaäthylenhexamin mit 0,2 Mol gereinigter Maleinsäure in Gegenwart von 100 ml Wasser bei 95°C unter einer Argonatmosphäre _bo 2,5 Stunden lang umgesetzt.

Die Lösung wurde mit Wasser auf l%ige Konzentration verdünnt und danach einer Elektrofokussierung unterzogen, wobei die üblichen Vorsichtsmaßnahmen getroffen wurden, um die Oxidation und Reduktion an den Elektroden zu verhindern.

Nach 44 Stunden wurden die pH-Werte der einzelnen Fraktionen bei 4° C bestimmt. Es ergab sich dabei eine fast lineare Änderung der pH-Werte von Fraktion zu Fraktion im Bereich zwischen 2,5 und 10.

Beispiele 4 und 5

In diesen Beispielen wird die Verwendung eines erfindungsgemäßen Ampholytgemisches bei der isoelektrischen Trennung von Myoglobinen aufgezeigt. Die dazu verwendeten Trägerampholyte bestanden aus einer Fraktion, die im pH-Bereich zwischen 6,5 und 8 aus einem nach Beispiel 2 durch Umsetzen von Pentaäthylenhexamin mit Acrylsäure erhaltenen Gemisch isoliert wurde.

Zur Durchführung der Elektrolyse wurden die Trägerampholyte in l°/oiger Konzentration in eine Säule von 110 ml Inhalt eingeführt, die mit einem Kühlflüssigkeitsbad bei einer Temperatur von 4° C gehalten wurde. Um Konvektionsströmungen innerhalb der Säule zu unterbinden, wurde darin mittels Saccharose ein stabilisierender Dichtegradient hergestellt.

Zum Schutz der Trägerampholyte vor anodischer Oxidation und kathodischer Reduktion wurde die Anode mit einer Phosphorsäurelösung und die Kathode mit einer Äthanolaminlösung umgeben.

Danach erfolgte die Zugabe der jeweiligen Myoglobinprobe zu den Lösungen. Die isoelektrische Trennung wurde bei einer zugeführten Leistung von maximal 1 Watt und bei einer auf einen Endwert von 1000 V ansteigenden Spannung 48 Stunden lang durchgeführt.

Beim Beispiel 4 wurde eine aus einer rohen, kristallinen Mischung dialysierte Lösung, die 16 mg Myoglobin enthielt, kurz vor Zugabe zur Säule mit einem geringen molaren Überschuß an K3Fe(CN)6 behandelt, wodurch sich, wie spektralphotometrisch nachgewiesen wurde, alle Haemoproteine in die dreiwertiges Eisen enthaltende Form überführt wurden.

Nach Durchführung der isoelektrischen Fokussierung, bei der sich die Kathode am unteren Ende der Säule befand, wurden mehrere braune Zonen, jedoch keine roten sichtbar. Die an einem Maßstab abgelesenen Lagen der einzelnen Zonen des isoelektrischen Spektrums und deren Numerierung zeigt die Fig. 1. Spektralphotometrische Analysen und pH-Messungen wurden durchgeführt und die Zonen 1—7 in entsprechender Reihenfolge wie folgt identifiziert:

Ferri-Mb I, Hb, Ferri-Mb Hi, Ferri-Mb H₂, Ferri-Mb Uli, Ferri-Mb HI₂ bzw. Ferri-Mb IH₃.

Den Verlauf des pH-Gradienten und die Konzentrationsverteilung der Myoglobine zeigt die F i g. 2.

Beim Beispiel 4 wurde der Säule eine aus der rohen kristallinen Mischung dialysierte Lösung zugegeben, die 40 mg Myoglobin enthielt, davon 60% als Ferri-Mb und den Rest als Ferro-Mb, wie spektralphotometrisch nachgewiesen wurde. Nach isoelektrischer Fokussierung entstanden mehrere braune und rote Zonen, deren Lagen in der Fig.3 dargestellt sind. Die Zonen 1 — 10 wurden in entsprechender Reihenfolge wie folgt identifiziert:

Ferri-Mb I, Hb, Ferri-Mb II_t, Ferro-Mb I, Ferri-Mb H₂, Ferri-Mb Uli, Ferro-Mb Hi, Ferro-Mb H₂,
Ferri-Mb IH₃.

Oberhalb der Zone 10 wurden drei weitere, bei pH-Werten von ungefähr 6,5 liegende Zonen festgestellt. Diese enthielten derart geringe Mengen an Mb, daß deren Analyse Schwierigkeiten bereitete. Wahrscheinlich stellten diese Zonen zweiwertiges Eisen enthaltende Formen des Mb III dar.

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Die isoelektrischen Punkte (pl-Werte) der untersuchten Myoglobine bei +4⁰C zeigt die nachfolgende Aufstellung:

Ferri Mb I Ferro Mb I Ferri Mb II, Ferri Mb U₂ Ferro Mb Π, Ferro Mb Ih

7,78

7,32 7,26

7,76 7,27 (7,33) (7,27) 6,86 6,80

Ferri Mb Uli
Ferri Mb IH₂
Ferri Mb IH₃

6,88 6,84 6,81

Es hat sich somit als möglich erwiesen, Myoglobine zu trennen und zu identifizieren, deren isoelektrische Punkte um nur 0,03 pH-Einheiten auseinanderliegen und diese zu bestimmen, woraus das bei erfindungsgemäßer Verwendung der beschriebenen Ampholytgemische erzielbare Auflösungsvermögen bei der isoelektrischen Fraktionierung ersichtlich wird.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Gemische aus Polyamino-monocarbonsäuren und -polycarbonsäuren, dadurch erhältlich, ■-, daß man ein Polyamin mit einem Molekulargewicht von höchstens 500, das wenigstens 3 Aminogruppen enthält, von denen wenigstens eine primär ist und die anderen primär oder sekundär sind, und in dem zwischen zwei Stickstoffatomen eine — (CH2),,-Gruppe angeordnet ist, in der η die Bedeutung 2 oder 3 hat, und das mindestens einen unter 8 liegenden pK_s-Wert aufweist oder ein Gemisch derartiger Polyamide mit einer solchen Menge an Acrylsäure, Methacrylsäure, Crotonsäure, Maleinsäure oder Itaconsäure oder an Gemischen dieser Säuren, die geringer ist als diejenige Menge, die zur Substitution aller an Stickstoffatome gebundenen Wasserstoffatome erforderlich ist, umsetzt.

2. Verfahren zur Herstellung der Gemische nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die im Anspruch 1 angegebenen Verfahrensmaßnahmen.

3. Verwendung der Gemische nach Anspruch 1 als Trägerampholyte bei der isoelektrischen Fraktionierung von hochmolekularen amphoteren Stoffen mittels stationärer Elektrolyse.