DE2350179C3 - Verfahren zur fluorometrischen Bestimmung von sekundären alpha-Aminosäuren und Mittel zur Durchführung des Verfahrens - Google Patents

Description

(I)

worin R Wasserstoff, Halogen, nieder-Alkyl oder nieder-Alkoxy und R' nieder-Alkyl oder Aryl bedeutet, ein fluoreszierendes Material *⁵ erzeugt, und
(d) die Fluoreszenz mißt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung der Formel I 4-Phenylspiro[furan-2(3H),l'-phthalan]-3,3'-dion ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß (las Mittel, welches aktives Chlor liefert N-Chlorsuccinimid ist

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel, welches aktives Brom liefert, N-Bromsuccinimid ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel, welches aktives Brom liefert, Brom ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (a) der pH-Wert 2 ist

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur zwischen 0 und 30^rC liegt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (b) der pH-Wert des wäßrigen Mediums zwischen 7,5 und 9,5 liegt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (a), im Vergleich zur sekundären α-Aminosäure, ein 100- bis lOOOfacher Überschuß an dem Mittel, welches aktives Chlor oder Brom liefert, verwendet wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (b) ein Überschuß an fluorogenem Reagenz verwendet wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die sekundäre u-Aminosäure cyclisch ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die cyclische sekundäre «-Aminosäure Prolin ist.

13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet., daß die cyclische sekundäre «-Aminosäure 4-Hydroxyprolin ist.

worin R Wasserstoff, Halogen, nieder-Alkyl oder nieder-Alkoxy und R' nieder-Alkyl oder Aryl ist.

16. Reagenzien nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das fluorogene Reagenz de: Formel I 4 - Phenylspiro[furan - 2(3Η),Γ - phthalan]-3,3'-dion ist.

17. Reagenzien nach Anspruch 15 oder 16. dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel, welches aktives Chlor liefert, N-Chlorsuccinimid ist.

18. Reagenzien nach Anspruch 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel, welches aktives Brom liefert, N-Bromsuccinimid ist.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fluorometrischen Bestimmung von sekundären α-Aminosäuren sowie Reagenzien zur Durchführung des Verfahrens.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden sekundäre α-Aminosäuren in primäre Amine umgewandelt, woran sich eine Reaktion mit bekannten fluorogenen Reagenzien und die Messung der Fluoreszenz anschließt.

Die qualitative und quantitative Bestimmung von Aminosäuren ist heutzutage ein wichtiges Verfahrer unter denjenigen, welche dem Chemiker oder derr Biochemiker zu Verfügung stehen, um biologisch« Verfahren besser zu verstehen und unter anderen: die Kenntnisse im Bereich der Diagnose und der Be handlung von Krankheiten zu vergrößern. In vieler Laboratorien ist es üblich geworden, Analysatorer zu verwenden, welche die Untersuchung der Mengi und der Verteilung von Aminosäuren in Protein ode: Polypeptid enthaltenden Proben ermöglichen. Bii vor kurzem war jedoch der Forscher auf Grund de geringen Empfindlichkeit solcher Aminosäurebestim mungen gezwungen, mit relativ großen Mengen ai Probe zu arbeiten.

Kürzlich wurde durch M. W e i g e 1 e. et al., J. Arr Chem. Soc, Vol.94, p. 5927 (1972); S. U d e η Tr i e η < et al., Third Am. Peptide Symposium, 1972, um W. Leimgruber et al., belgische Patentschril 7 93 180 eine neue Art von Reagenzien (fluorogen Reagenzien) beschrieben, welche bei Raumtcmperatu schnell mit primäre Aminogruppen enthaltende Verbindungen, wie z. B. Aminosäuren und Peptider reagieren und fluoreszierende Produkte mit einer

sehr hohen Fluoreszenzgrad ergeben. Diese Reagenzien ermöglichen die Bestimmung von Mengen an primäre Aminogruppen enthaltenden Verbindungen, welche unterhalb eines Mikromols liegen.

Die in den obengenannten Literaturstellen be- s schriebene Bestimmungsmethode hat jedoch den Nachteil, daß sekundäre Aminosäuren wie z. B. Prolin und 4-Hydroxyprolin, welche den in der Natur vorkommenden Aminosäuren angehören, nicht bestimmt werden können, weil die fluorogenen Reagenzien nicht ι ο direkt mit sekundären Aminosäuren reagieren. Dies beschränkt diese Methode auf die Verwendung für die Bestimmung von primären Aminosäuren.

Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens, welches eine schnelle Bestimmung von sekundären Aminosäuren, insbesondere von cyclischen sekuadären α-Aminosäuren wie Prolin und 4-Hydroxyprolin, ermöglicht, sowie Reagenzien zur Durchführung des Verfahrens. Erfindungsgemäß wird eine sekundäre α-Aminosäure unter sehr milden Bedingungen, z.B. bei Raumtemperatur, in ein primäres Amin übergeführt, wobei Reagenzien verwendet werden, welche im Überschuß vorhanden sein können und mit der anschließenden Reaktion zwischen dem entstandenen primären Amin und den fluorogenen Reagenzien oder mit der Bestimmung der gebildeten fluoreszierenden Verbindungen nicht interferieren.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung einer sekundären α-Aminosäure zeichnet sich da- durch aus, daß man

(a) diese sekundäre α-Aminosäure in einem wäßrigen Medium bei einem pH-Wert zwischen 1 und 4 mit einem Mittel, welches aktives Chlor oder Brom liefert, behandelt,

(b) einen pH-Wert zwischen 6 und 11 einstellt,

(c) mittels einer fluorogenen Verbindung der allgemeinen Formel

-R'

40

(D

worin R Wasserstoff, Halogen, nieder-Alkyl oder nieder-Alkoxy und R' nieder-Alkyl oder Aryl bedeutet, ein fluoreszierendes Material erzeugt, und
(d) die Fluoreszenz mißt.

über den Abbau von sekundären Aminosäuren durch die Behandlung mit verschiedenen N-Bromimiden gibt es bereits Hinweise in der Literatur (Schönberg et al., J. Chem. Soc. [London], 1951, p. 2504). In dieser Publikation wird gezeigt, daß die Behandlung von verschiedenen cyclischen sekundären α-Aminosäuren mit N-Bromimiden zur Bildung von Aldehyden führt. In der für diese Umsetzung vorgeschlagenen chemischen Gleichung wurde die Bildung eines primären Amins als Nebenprodukt postuliert, ohne daß jedoch dieser Punkt diskutiert oder experimentell bestätigt wurde.

Die Herstellung der Verbindungen der Formel 1 wird in der belgischen Patentschrift 7 93 180 be-

Die Bezeichnung »nieder-Alkyl« umfaßt einen monovalenten, gesättigten geradkettigen oder verzweigten Kohlenwasserstoffsubstituenten, der bis zu 8 Kohlenstoffatome enthält. Der Ausdruck »nieder-Alkoxy« umfaßt eine derartige niedere Alkylgruppe, die über einen Äthersauerstoff an das Molekül gebunden ist. Der Ausdruck »Acyl« bedeutet ein aromatisches Ringsystem, das mit einem oder mehreren der folgenden Substituenten substituiert sein kann: Halogen (Fluor, Chlor, Brom oder Jod), nieder-Alkyl, nieder-Alkoxy, Nitro, Cyan usw. Als Beispiele für ein aromatisches Ringsystem können genannt werden: Phenyl, Naphthyl, Furyl, Thienyl, Pyrrolyl, Imidazolyl, Pyridyl, Pyrimidinyl, Indolyl, Chinolyl, Oxazolyl, Isoxazo-IyI usw. Eine besonders bevorzugte Verbindung der Formel I ist diejenige, worin R Wasserstoff und R' Phenyl ist, d. h. 4 - Phenylspiro[furan - 2(3H), 1 '-phthalan]-3,3'-dii>n.

Im ersten Teil des erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahrens wird eine sekundäre α-Aminosäure zu einem primären Amin abgebaut. Dieser Abbau erfolgt durch Halogenierung (Oxydation) mit Hilfe eines Mittels, welches aktives (positives) Chlor oder Brom liefert. Geeignete, aktives Chlor oder Brom liefernde Mittel sind die Halogene selbst, d. h. Chlor und Brom, N-Chlor- eier N-Bromimide und N-Chlor- oder N-Bromamide. Als Beispiele für die letztgenannten Reagenzien können N-Chlorsuccinimid, N-Bromsuccinimid, N-Bromacetamid, N-Bromphthalamid erwähnt werden.

Die Halogenierung wird in einem pH-Bereich von 1 bis 4, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 2 durchgeführt. Auf diese Weise erfolgt die Reaktion mit äußerster Schnelligkeit unter milden Bedingungen. Es wird bevorzugt, die Reaktion bei einer Temperatur zwischen 0 und 30° C durchzuführen, wobei Zimmertemperatur ganz besonders bevorzugt wird. Dies hat zur Folge, daß das erfindungsgemäße Verfahren sich sehr gut für die automatische Bestimmung von Aminosäuren eignet.

Für die Halogenierung von cyclischen sekundären α-Aminosäuren wie Prolin oder 4-Hydroxyprolin werden mit Vorteil N-Chlorsuccinimid oder N-Bromsuccinimid als Chlor oder Brom lieferndes Mittel verwendet. Für die Halogenierung von acyclischen sekundären α-Aminosäuren wie Sarcosin (N-Methylglycin) wird mit Vorteil das Halogen selbst verwendet, wobei Brom besonders bevorzugt ist.

Die Halogenierungsreaktion wird mit Vorzug in einem wäßrigen Milieu durchgeführt. Dies, weil bei einer Aminosäurebestimmung die sekundären .z-Aminosäuren von einer Chromatographiesäule normalerweise in wäßriger Lösung eluiert werden. Weiter sind die Mittel, welche aktives Chlor oder Brom liefern, genügend wasserlöslich, um die Herstellung von Vorratslösungen zur Reaktion mit Aminosäuren zu ermöglichen. Um einen maximalen Abbau der sekundären α-Aminosäure zu erreichen, wird es bevorzugt, das Mittel, welches aktives Chlor oder Brom liefert, im Überschuß zu verwenden. Besonders geeignet ist ein 100- bis lOOOfacher Überschuß. Es wurde überraschend festgestellt, daß ein derartiger Überschuß mit der anschließenden Reaktion und Fluoreszenzmessung nicht interferiert.

In der Oxydation-Decarboxylierung-Hydrolyse-Sequonz wird angenommen, daß die erste Stufe die N-Halogenierung der sekundären α-Aminosäure ist, und anschließend Kohlendioxyd und das Halogen

freigesetzt werden, wobei ein Imin erhalten wird. Die wäßrige Hydrolyse des Imins zum freien primären Amin erfolgt zweckmäßigerweise in einem neutralen oder alkalischen Milieu. Es ist dementsprechend notwendig, um eine optimale Menge an freiem primären

CO₂H

CO,H Amin in Lösung zu erhalten, den pH-Wert zwischen 6 uvid 11. vorzugsweise zwischen 7,5 und 9,5 einzustellen.

Das angenommene Veifahren wird nachstehend am Beispiel von Prolin erläutert.

H₂N(CH₂J₃CHO

Cl(Br)

In diesem Falle ist ersichtlich, daß das 1min . J'-Pyrrolin ist und in Anwesenheit von Wasser mit dem entsprechenden a-Aminoaldehyd im Gleichgewicht steht. Im Falle einer acyclischen Aminosäure ergibt die Reaktion des erhaltenen Imins mit Wasser zwei verschiedene

CH₁NHCH₂CO₂H

3H₃NCH₂CO₂H
Cl(Br)

Es ist zu bemerken, daß die obenerwähnten Reaktionen auch mit primären α-Aminosäuren erfolgen. In diesem Falle wird jedoch Ammoniak gebildet. Ammoniak reagiert mit den fluorogenen Verbindungen der Formel I unter Bildung von Reaktionsp'odukten, die, im Vergleich zu denjenigen, welche mit primären Aminen erhalten werden, einen sehr niedrigen Fluoreszenzgrad aufweisen. Aus diesem Grund können mit der erfindungsgemäßen Methode sekundäre α-Aminosäuren auch in Gegenwart von primären α-Aminosäuren bestimmt werden, und dies ohne wirkliche Störung durch die Letzteren.

In der nächsten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das durch die Oxydation-Decarboxylierung-Hydrolyse-Sequenz gebildete primäre Amin mit der fluorogenen Verbindung der Formel I, vorzugsweise mit 4-Phenylspiro[furan-2(3H),l'-phthalan]-3,3'-dion, umgesetzt. Wie in der am Anfang der Beschreibung erwähnten Literatur beschrieben, wird die Reaktion von primären Aminen mit den Verbindungen der Formel I zur Bildung von fluoreszierenden Produkten, vorzugsweise in einem schwach alkalischen Milieu, durchgeführt. In diesem Zusammenhang ist zu bemerken, daß in der bereits erwähnten Oxydation-Decarboxylierung-Hydrolyse-Sequenz der pH-Wert schon zwischen 6 und 11, vorzugsweise zwischen 7,5 und 9.5, gehalten wird, so daß keine oder nur eine geringe Einstellung des pH-Wertes notwendig ist. In der letzten Stufe wird die Fluoreszenz des Reaktionsproduktes des primären Amins mit einem Überschuß an einei Verbindung der Formel I — wie in der Literatur beschrieben — gemessen.

Es wurde überraschend festgestellt, daß die Intensität der Fluoreszenz dieser Reaktionsprodukte von der Konzentration der ursprünglich vorhandenen sekundären α-Aminosäure linear abhängig ist, und daß das erfindungsgemäße Verfahren die qualitative und quantitative Bestimmung von sehr kleinen Mengen an sekundären α-Aminosäuren ermöglicht. So konnte z. B., durch die erwähnte Oxydation-Decarboxylierung - Hydrolyse - Methode, die anschließende Reaktion mit einer fluorogenen Verbindung der Formel I und Fiuoreszenzmessung, Prolin in Konzentrationen zwischen 0,1 und 1,0 nanomolen qualitativ und quantitativ bestimmt werden. Die Empfindlichkeit Heat somit in der Größenordnung derjenigen.

Verbindungen, einen Aldehyd und ein Amin. Dies wird nachstehend am Beispiel von Sarcosin, wo Methylamin und Formaldehyd gebildet werden. illustriert.

CH₃N=CH₂

CH₃NH₂ + CH₂O

welche bei den in der Literatur beschriebenen Bestimmungen von primären Aminen festgestellt wurde.

Fs wurde überraschenderweise gefunden, daß weder Nebenprodukte (z. B. Aldehyde) noch ein Überschuß an Reagenzien auf die Messung der Fluoreszenz einwirken.

Es ist ebenfalls zu bemerken, daß das erfindungsgemäße Verfahren auch zur Bestimmung von sekundäi en u-Aminosäuren, in papierchromatographischen oder dünnschichtchromatographischen Systemen verwendet werden kann. Bei einer solchen Technik wird nicht — wie bereits beschrieben — völlig in Lösung ope-

.15 riert, sondern es werden die verschiedenen Reagenzien nacheinander auf das papier- oder dünnschichlchromatographische System, vorzugsweise als ein Spray, appliziert. Nach der Reaktion mit dem fluorogenen Reagenz wird das Papier- oder Dünnschichtchromato-

gramm unter einer Fluoreszenzlichtquelle überprüft. Das erfindungsgemäße Verfahren ist geeignet zur Verwendung bei der automischen Analyse von Mischungen, welche sowohl primäre als sekundäre «-Aminosäuren enthalten. Die Aminosäuren werden in einer chromatographischen Kolonne getrennt, wobei ein kontinuierlich ausfließender Probenstrom erhalten wird, worin die verschiedenen Aminosäuren in einer bekannten Reihenfolge und mit einem fixierten Zeitabstand zum Vorschein kommen. Dieser Probenstrom wird kontinuierlich zur Bildung von fluoreszierenden Produkten reagieren gelassen, und die entstandene Fluoreszenz wird gemessen.

So werden z. B. in einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens die primären «-Aminosäuren in dem aus der chromatographischen Kolonne ausfließenden Eluat — wie in der Literatur beschrieben — nach Einstellung des pH-Wertes kontinuierlich mit den fluorogenen Verbindungen der Formel 1 umgesetzt. Der Teil des ausfließenden Eluats, welcher

ho die sekundäre α-Aminosäuren, insbesondere Prolin und 4-Hydroxyprolin enthält, kann — vorzugsweise automatisch — abgezweigt und unter sauren Bedingungen mit einem Mittel, welches aktives Chlor oder Brom liefert, behandelt werden. Anschließend wird

6s der abgezweigte Probenstrom wieder in den Hauptstrom geleitet, der pH-Wert eingestellt und die Reaktion mit dem fluorogenen Reagenz der Formel I durchgefühlt. Die auf diese Weise entstandene Fluores-

zenz wird kontinuierlich mit Hilfe eines Fluoreszenzphotometers, gemessen.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die sekundären <i-Aminosäuren in Gegenwart von primären «-Aminosäuren bestimmt. In diesem Fall werden die primären «-A.minosäuren bei einem ersten Durchströmen der chromatographischen Kolonne und des Fluorometers in üblicher Weise bestimmt, während die sekundären α-Aminosäuren bei diesem ersten Durchströmen nicht erfaßt werden. Anschließend wird die Kolonne ein zweitesmal durchflossen (als Alternative kann ein vom ersten Durchgang abgezweigter Strom verwendet werden) und das Eluat oder ein Teil davon wird kontinuierlich unter sauren Bedingungen mit einem Mittel, welches aktives Chlor oder Brom liefert, behandelt. Anschließend wird der pH-Wert eingestellt und die Reaktion mit dem fluorogenen Reagenz der Formel 1 durchgeführt. Die entstandene Fluoreszenz wird kontinuierlich gemessen. In dieser Methode werden — wie bereits erwähnt — die in dem zweiten Durchgang oder in dem abgezweigten Strom vorhandenen primären (i-Aminosäuren zu Ammoniak abgebaut, während die sekundären α-Aminosäuren, wie z. B. Prolin und 4-Hydroxyprolin, zu primären Aminen abgebaut werden, deren Reaktionsprodukte mit Verbindungen der Formel I fluorometrisch gemessen werden können.

Mit Hilfe einer der oben beschriebenen oder einer für den Fachmann naheliegenden Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens können sehr kleine Mengen in der Natur vorkommender primärer und sekundärer α-Aminosäuren qualitativ und quantitativ bestimmt werden.

Die Erfindung betrifft weiterhin Reagenzien zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. mit einem Mittel, welches aktives Chlor oder Brom liefert, und einem fluorogenen Reagenz der allgemeinen Formel

arbiträren, in bezug auf die Blindprobe korrigierten Einheiten angegeben ist (100 entspricht der Fluoreszenz, welche: man mit 10 nmol/ml Prolin erhält). Die mit »Konzentration von Prolin« bezeichnete Kolonne entspricht dem Viertel der Konzentralion von Prolin in der Probe (Korrektur wegen der Zugabe von 3 ml Reagenzien).

Konzentration	Relative Fluoreszenz
von Prolin
(nmol/ml)
0,1	1.2
0,2	2,0
0,4	4.0
0,6	6,2
0,8	7.8
1,0	10

Beispiel 2

In Analogie zu Beispiel 1 werden, unter Verwendung von 1-ml-Proben, welche 4,0 bis 40,0 nmol/ml Prolin enthalten, die folgenden Daten erhalten:

1—R
O

40

45

Konzentration	Relative Fluoreszenz
von Prolin
(nmol/ml)
1.0	10
2.0	21
4,0	40
5.0	48
6,0	58
8,0	80
10,0	100
	Beispiel 3

worin R Wasserstoff. Halogen. nieder-Alkyl oder nieder-A'.koxy und R' nieder-Alkyl oder Aryl ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird an Hand der nachstehenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Zu einer 1-ml-Probe von Prolin (0.4 bis 4.0nmol ml) in einem Puffer vom pH-Wert 2 werden, in einem Abstand von 10 Sekunden, die folgenden Lösungen nacheinander zugegeben.

(a) 1 ml wäßriges N-Chlorsuccinimid (4 10* M).
ib! ! m! einer 2%igen Natriumbicarbonatlo'sung und (c) 1 ml einer Lösung von 4-Phenylspiro[furan-

2(3HU' - phthalan] - 3,3' - dion (2 · 10 ^Λ M) in Aceton.

Die Fluoreszenz wird 2 Minuten nach Zugabe des letzten Reagenzes gemessen (Anregung 390 nm. Fluoreszenzstrahlung 475 nm). Man erhält die nachstehend aufgeführten Ergebnisse, wobei die Fluoreszenz in In Analogie zu Beispiel 1. jedoch unter Verwendung von 1-ml-Proben, welche 4.0 bis 40,0 nmol/ml Hy droxyprolin enthalten, werden die folgenden Dater erhalten:

55

60

Konzentration von	Relative Fluoreszenz
4-Hydroxyprolin
(nmol ml)
1,0	4
2.0	9
3.0	13
4.0	17
5.0	21
6.0	26
7.0	31
8.0	35
9.0	39
10.0	43

Beispiel 4

In Analogie zu Beispiel 1. jedoch unter Verwendung on 1-ml-Proben, welche 4.0 bis 40,0 nmol/ml Sarcoin enthalten und ImI 2 10"³M Bromwasser antatt N-Chlorsuccinimid, werden die folgenden Daten Thalien:

Konzentralion
von Sarcosin

(nmol ml)

1,0
2.0
3.0
4,0
5.0
6.0
7,0
8,0
9,0
10.0

Relative Fluorcs/en'

5 8 12 17 19 24 29 34 39 42 Wasserstoff

Wasserstoff

Wasserstoff

Wasserstoff

Wasserstoff

Wasserstoff

Wasserstoff

Methyl

Methoxy

Chlor

K'

3-Chlorphenyl

4-Chlorphcnyl

4-Bromphenyl

3-lndolyl

2-Naphthyl

1-Naphthyl

n-Propyl

Phenyl

Phenyl

Phenyl

Phenyl

Beispiel 5

Die im Beispiel 1 bis 4 beschriebenen Bestimmungen können wiederholt werden, indem man das 4-Phenylspiro[furan-2(3H).l'-phthalan]-3,3'-dion durch die folgenden Verbindungen der Formel I ersetzt:

Wasserstoff
Wasserstoff
Wasserstoff
Wasserstoff
Wasserstoff
Wasserstoff
Wasserstoff
Wasserstoff
Wasserstoff

2-Methoxyphenyl

3-Methoxyphcnyl

4-Methoxyphenyi

2.4-Dimethoxyphenyl

2.5-Dimethoxyphenyl

3.5-Dimethoxyphenyl

3.4,5-Trimelhoxy phenyl

2.4.5-Trimethoxyphenvl

3.4-Methylendioxyphenyl

Beispiel 6

Verschiedene Mengen (2.5 bis 10 μΐ) einer Losung von Prolin (100 Picomole/μΙ) in 0.01 M HCl (oder in einem Puffer vom pH-Wert 2) werden bei 60 C über eine Kolonne (2,7 mm χ 50 cm) enthaltend Durrum DC-4A-Harz mit 0.2 M Citratpuffer vom pH-Wert 3.28 eluiert. Der Durchfluß ist 7 cc Stunde. Dem Eluat wird eine Lösung von 10~⁴ Mol N-Chlorsuccinimid in 0.025 Mol HCl kontinuierlich zugegeben (Durchfluß 6cc/Stunde). Nach Durchströmen einer kleinen Mischspule wird dieser Mischung ein 0.1 M Boratpuffer vom pH-Wert 9,7 zugesetzt (Durchfiuß 20cc Stunde). Nach Durchlaufen einer kleinen Mischspule wird die Mischung (pH-Wert 8.5) mit einer Lösung von 150 mg/1 4- Phenylspiro[furan -2(3 H).Γ -phthalan]-3.3'-dion in Aceton (Durchfluß 20cc/Slunde) behandelt. Nach Durchlaufen einer kleinen Mischspule wird die Lösung durch eine Durchflußküvettc zur kontinuierlichen Messung der Fluoreszenz geführt (Anregung 390 nm. Fluoreszenzstrahlung 475 nm).

Die gesamte Fluoreszenz, welche mit einer bestimmten Probe erhalten wird, ist direk! zur gesamten Menge an Prolin in dieser Probe proportional.

Die obenerwähnte Methode kann mit Proben.! welche 4-Hydroxyprolin enthalten, wiederholt werden

Claims (1)

1. Patentansprüche:

   1. Verjähren zur Bestimmung einer sekundären α-Aminosäure, dadurchgekennzeichnet, daß man

   (a) diese sekundäre α-Aminosäure in einem wäßrigen Medium bei einem pH-Wert zwischen 1 und 4 mit einem Mittel, welches aktives Chlor oder Brom liefert, behandelt,

   (b) einen pH-Wert zwischen 6 und 11 einstellt,

   (c) mittels einer fluorogenen Verbindung der allgemeinen Formel

   14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bestimmung kontinuierlich in einem wäßrigen Probenstrom durchführt.

   15. Reagenzien zur Bestimmung einer sekundären α-Aminosäure, mit einem Mittel, welches aktives Chlor ode/ Brom liefert, und einem fluorogenen Reagenz der allgemeinen Formel