DE69633212T2

DE69633212T2 - Elektroerzeugte chemilumineszierende markierungsmittel zur analyse und/oder zur referenzbildung

Info

Publication number: DE69633212T2
Application number: DE69633212T
Authority: DE
Inventors: J. Allen BARD; C. Thomas RICHARDS; K. Jonathan LELAND
Original assignee: Bioveris Corp
Current assignee: Bioveris Corp
Priority date: 1995-02-09
Filing date: 1996-02-09
Publication date: 2005-09-22
Anticipated expiration: 2016-02-10
Also published as: ES2227580T3; DK0755458T3; ATE274601T1; US5786141A; WO1996024690A1; EP0755458A4; CA2186503C; US6479233B1; CA2186503A1; PT755458E; AU709592B2; JPH10502702A; AU4770896A; EP0755458B1; DE69633212D1; JP3989019B2; EP0755458A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren für elektrisch erzeugte Chemilumineszenz und Zusammensetzungen modifizierter Kohlenwasserstoffe und aromatischer heterocyclischer Verbindungen, die in wässerigen Lösungen mit Coreaktanten wie Tri-n-propylamin (TPrA) und Peroxydisulfat(S₂O₈ ^2–) auftreten, und insbesondere diejenigen, die für gleichzeitige Analysen und die Bildung einer internen Referenz sorgen. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung substituierte polycyclische, organische, lumineszierende Verbindungen zur Verfügung, die Ringkohlenstoffe aufweisen, die gegebenenfalls durch mindestens ein Heteroatom, ausgewählt aus N und S, ersetzt sind, wie substituiertes Diphenylanthracen, Thianthren und Promazin, für elektrisch erzeugte, chemilumineszierende Anwendungen.
Hintergrund der Erfindung
Lumineszierende Marker wurden verwendet, um eine Vielzahl von Bioanalyten, wie Enzyme, Antikörper, Antigene, Peptide, Nucleotide, Saccharide oder Zellencomplemente des interessierenden Analyten bei Immunoassays, DNA-Sondenassay und fluoreszierenden und Trennungs-Assays zu markieren. Von besonderem Interesse sind Marker, die durch elektrochemische Reaktionssysteme zum Lumineszieren gebracht werden können. Marker, die als Folge von elektrochemischer Erregung lumineszieren, sind aufgrund ihrer Sensibilität und ihrer ungefährlichen Eigenschaften nützlich.
Eine analytische Technik, die die Vorteile dieser Marker nutzt, ist die elektrisch erzeugte Chemilumineszenz (ECL). ECL ergibt sich aus einer energetischen Elektronenübertragungsreaktion zwischen elektrisch erzeugten Redoxspezies, die durch A^– und D⁺, typischerweise Radikalionen, zur Bildung eines erregten Zustands (A^• oder D^•), der in dem sichtbaren Bereich emittiert, repräsentiert sind: A + e. → A– EA (1) D – e. → D+ EO (2) A– + D+ → A + D• oderA• + D) (3) D• → D -- hν (4)
Faulkner und Bard geben in Electroanalytical Chemistry, Band 10, Seite 1, 1977 mehrere Beispiele nichtwässeriger Systeme dieses Typs an.
A. W. Knight und G. M. Greenway erörtern in Analyst, 1994, 119, 879, ECL-Vorläufer, die in wässeriger Lösung selbst mit dem begrenzten Potentialbereich, der durch die Oxidation und Reduktion von Wasser auferlegt wird, erzeugt werden können. ECL kann durch die gleichzeitige Oxidation von Tris-(2,2-bipyridin)ruthenium(II) (Ru(bpy)₃ ²⁺) und einem Coreaktanten (XY^Z), der ein geeignetes Reduktionsmittel bei der Oxidation über einen oxidativen Reduktionsmechanismus, erzeugt werden, wie: Ru(bpy)3 2+ – e. → Ru(bpy)3 3+ (5) XYZ – e. → XYZ+1 (6) Ru(bpy)3 3+ + XYZ → Ru(bpy)3 2+ + XYZ+1 (6a) XYZ+1 → Xz + Yy (x + y = z + 1) (7) Ru(bpy)3 3+ + Xz → Ru(bpy)3 2+• + Xz+1 (8) Ru(bpy)3 2+• → Ru(bpy)3 2+ + hν (9)erzielt werden.
Ru(bpy)₃ ²⁺ ist ein typischer Vorläufer (D) für diese Systeme und wurde bei Chemiluminiszenz- (CL-) Reaktionen mit Aminen sowie ECL-Untersuchungen unter Verwendung einer Reihe von verschiedenen Coreaktanten, einschließlich Oxalat (worin XY^z C₂O₄ ^2– und X^x CO₂ ^–• ist) und aliphatischen Aminen wie Tri-n-propylamin (TPrA; worin XY^z Pr₃N und X^x das Radikal ist, das sich aus der Deprotonierung von Pr₃N⁺ ergibt, verwendet. Bei diesen ECL-Systemen kann der Coreaktant entweder an der Elektrode über die Gleichung (6) oder in Lösung durch den Emitter über die Gleichung (6a) oxidiert werden. Als Alternative zum Reaktionssche ma der Gleichung (8) kann der erregte Zustand auch durch die nachstehende Folge von Gleichungen (10) und (11), wie vorstehend für Oxalat und TPrA erörtert, erzeugt werden. Ru(bpy)3 2+ + Xz → Ru(bpy)3 + + Xz+1 (10) Ru(bpy)3 + → Ru(bpy)3 3+ → Ru(bpy)3 2+• → Ru(bpy)3 2+ (11)
Für den Oxalat-Coreaktanten umfasst das Reaktionsschema der Gleichung (7) die Aufspaltung der Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung, während für den TPrA-Coreaktanten angenommen wird, dass dieser Schritt den Verlust eines Protons aus dem α-Kohlenstoff umfasst. Diese ECL-Reaktionen wurden für die Bestimmung von sowohl Ru(bpy)₃ ²⁺ als auch Oxalat verwendet.
Um diese oxidativen Reduktionsbeispiele zu ergänzen, erfahren Peroxydisulfat und Ru(bpy)₃ ²⁺ eine analoge Umkehr dieses Schemas (ein reduktiver Oxidationsmechanismus, Gleichungen (12) bis (14), gefolgt von (9)), wenn die ursprünglichen Reaktanten in Acetonitril- (MeCN)-Wasserlösungen (Volumenverhältnis 1 : 1) reduziert statt oxidiert werden. In diesem Fall führt die Reduktion von S₂O₈ ^2– zur Bildung des stark oxidierenden Mittels SO₄ ^–•: Ru(bpy)3 2+ + e. → Ru(bpy)3 + (12) S2O8 2– → e. → SO4 –• + SO4 2– (13) Ru(bpy)3 + + S2O8 2– → Ru(bpy)3 2+ + SO4 –• + SO4 –2– (13a) Ru(bpy)3 + + SO4 –• → Ru(bpy)3 2+• + SO4 2– (14)
Mittels Analogie zu den Gleichungen (10) und (11) für Oxalat und TPrA ist eine Alternative zur Gleichung (14) zum Erzeugen des erregte Zustands mit Peroxydisulfat: Ru(bpy)3 2+ + SO4 –• → Ru(bpy)3 3+ + SO4 2– (15)gefolgt von der vorstehend angegebenen Gleichung (11).
Die Sensibilität und Selektivität dieser Coreaktantenanalysen führte in jüngerer Zeit zu der kommerziellen Anwendung des Ru(bpy)₃ ²⁺/TPrA-Systems. Beispielsweise wurden elektrochemilumineszente, Ruthenium und Osmium enthaltende Marker bei Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung von interessierenden Analysen in flüssigen Medien verwendet (US-A-5,310,687, 5,238,808 und 5,221,605). Des weiteren wurde die Verwendung von elektrisch erzeugten Chemilumineszenz- (ECL-) Messungen beim Nachweis der Lösungsphasen-DNA, mit Ruthenium enthaltenden Markern interkaliert, beschrieben (Carter, M. T. et al. (1990) Bioconjugate Chem., 2: 257–263). Obgleich solche Anwendungen für eine akzeptable Analysetechnik sorgen, ist es oft notwendig, ein System zur Verfügung zu stellen, das gleichzeitige Analysen und eine Bildung der internen Referenz gestattet. Die vorliegende Erfindung stellt zusätzliche elektrochemilumineszente Systeme zur Verfügung, die statt oder zusammen mit bestehenden Systemen verwendet werden können.
Becker et al. (J. Electroanal. Chem., 167 (1984), Seiten 127–140) beschreiben eine Untersuchung der ECL von aromatischen Kohlenwasserstoff-/Peroxydisulfat-Systemen in Acetonitril-Benzol-Lösungen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft elektrolumineszente Marker, worin: 1) der Emitter in wässeriger Lösung löslich ist; 2) die Emissionswellenlänge sich von derjenigen von Ru(bpy)₃ ²⁺ unterscheidet; 3) die oxidative oder reduktive Elektrochemie innerhalb des relativ engen Potentialbereichs, der durch die Oxidation oder Reduktion von Wasser auferlegt wird, fortschreitet; und 4) das oxidierte oder reduzierte Zwischenprodukt mit dem elektrisch erzeugten Coreaktantenzwischenprodukt reagiert, was die Bildung des erregten Zustands gestattet.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von substituierten polycylischen, organischen, lumineszierenden Verbindungen, beispielsweise aromatischen Polycyclen, die Ringkohlenstoffsubstitutionen aufweisen können, die ausgewählt sind aus mindestens einem Hetero-N- oder -S-Atom mit diesen vier (4) Eigenschaften. Substituiertes Diphenylanthracen, Thianthren und Promazin sind Beispiele für solche Reagenzsysteme für elektrisch erzeugte chemilumineszente Anwendungen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von substituierten polycyclischen, organischen, lumineszierenden Verbindungen, beispielsweise aromatischen Polycyclen, die Ringkohlenstoffsubstitutionen aufweisen können, die bei bioanalytischen Anwendungen einen zu Ru(bpy)₃ ²⁺ komplementären Marker bieten.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Marker-Coreaktanten-Zuammensetzungen zur Verfügung zu stellen, die gleichzeitige Analysen gestatten.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Nachweis einer Vielzahl von Analyten zur Verfügung zu stellen durch (1) Versehen von mindestens einem ersten Biomolekül mit einem lumineszierenden Marker, der eine Emissionswellenlänge aufweist, die sich von derjenigen von Ru(bpy)₃ ^2+• unterscheidet; (2) Versehen eines zweiten Biomolekülanalyten mit einem Ruthenium oder Osmium enthaltenden Marker; (3) Zugeben von mindestens einem Coreaktanten; und (4) Aussetzen der markierten Biomolekülanalyten und Coreaktanten einer elektrochemischen Reaktion oder Erregung und Messen der sich ergebenden Lumineszenz zum Nachweis der vorhandenen verschiedenen Biomolekülanalyten.
Ein weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist das Bereitstellen einer Zusammensetzung, die die anodische Oxidation von wässerigem Natrium-9,10-diphenylanthracen-2-sulfonat (DPAS) in Gegenwart von Tri-n-Propylamin und die kathodische Reduktion von DPAS in Gegenwart von Peroxydisulfat (S₂O₈ ^2–) als Coreaktant in einer Acetonitril- (MeCN-) Wasser-Lösung (Volumenverhältnis 1 : 1) für die ECL-Analyse von Biomolekülen (d. h. Immunoassays, DNA-Sonden) umfasst. Wenn Natrium-9,10-diphenylanthracen-2-sulfonat in Gegenwart von TPrA oxidiert wird oder mit S₂O₈ ^2– reduziert wird, ergibt sich eine blaue ECL-Emission, die für die DPAS-Fluoreszenz charakteristisch ist. Die spektrale Trennung zwischen dieser Emission und derjenigen für Ru(bpy)₃ ²⁺ macht DPAS zu einem komplementären Marker für Ru(bpy)₃ ²⁺ bei bioanalytischen Anwendungen.
Eine weitere Aufgabe ist das Bereitstellen von 1- und 2-Thianthrencarbonsäure (1-THCOOH und 2-THCOOH) in Gegenwart von Tri-n-propylamin (TPrA) als Coreaktant in wässeriger Lösung für die elektrisch erzeugte Chemilumineszenz (ECL) für die ECL-Analyse von Biomolekülen (d. h., Immunoassays, DNA-Sonden).
Eine weitere Aufgabe ist das Bereitstellen eines ECL-Schemas aus oxidierendem Chlorpromazin ohne zugegebenen Coreaktanten (TPrA) zur Erzeugung einer ECL-Emission über eine noch nie dagewesene Annihilationsreaktion.
Diese und andere Aufgaben, Vorteile und herausragenden Merkmale der vorliegenden Erfindung sind aus der nachfolgenden detaillierten Beschreibung, den nichteinschränkenden Beispielen und den beigefügten Zeichnungen besser ersichtlich.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die cyclische voltammometrische Kurve einer Hintergrundoxidation von Wasser in Gegenwart von 1 × 10^–5 M DPAS in Natriumphosphatpuffer mit einem pH von 7,5 an einer 6 × 9 mm Pt Netzelektrode (Siebzahl 52), Abtastrate 100 mV/s.
2a–2c zeigen die Emission (a) während der cyclischen Voltammometrie (b) von 1 × 10^–5 M DPAS und 0,15 M TPrA in einem Natriumphosphatpuffer mit einem pH von 7,5 an einer 6 × 9 mm Pt Netzelektrode (Siebzahl 52), Abtastrate 100 mV/s; (c) die cyclische voltammometrische Kurve von 0,05 M TPrA in einem Natriumphosphatpuffer mit einem pH von 7,5 an einer Pt Elektrode mit einem Durchmesser von 1,5 mm, Abtastrate 200 mV/s.
3 zeigt die cyclische voltammometrische Kurve von 0,92 mM DPAS in MeCN an einer Pt Elektrode mit einem Durchmesser von 1,5 mm. Leitelektrolyt 0,1 M TBABF₄; Abtastrate 200 mV/s.
4 ist ein doppeltlogarithmisches Diagramm der ECL-Intensität von DPAS gegenüber der Konzentration von Lösungen, die 0,15 M TPrA in einem Natriumphosphatpuffer mit einem pH von 7,5 enthalten.
5 zeigt die Fluoreszenz- und ECL-Spektren für eine Lösung von 1 × 10^–5 M DPAS und 0,15 M TPrA in einem Natriumphosphatpuffer mit einem pH von 7,5. Die ECL-Emission wurde durch wiederholtes Pulsieren einer 6 × 9 mm Pt Netzelektrode (Siebzahl 52) von 0,0 V (gegenüber SCE, 8 s) zu +1,2 V (2 s) bis –1,4 V (2 s) und zurück zu 0,0 V erzeugt. Licht wurde auf dem positiven Impuls in dieser Sequenz erzeugt (der negative Impuls diente der Reinigung der Elektrode) und wurde 2 Minuten integriert, um das Spektrum zu erzeugen. Beide Spitzenintensitäten lagen bei 430 nm.
6 zeigt die cyclische voltammometrische Kurve von 11 mM (NH₄)₂S₂O₈ in einer MeCN-Wasserlösung (Volumenverhältnis von 1 : 1) an einer Pt Elektrode mit einem Durchmesser von 1,5 mm. Leitelektrolyt 0,2 M TEAP, Abtastrate 100 mV/s.
7 zeigt die cyclische voltammometrische Kurve von 0,93 mM DPAS in MeCN an einer Pt Elektrode mit einem Durchmesser von 1,5 mm. Leitelektrolyt 0,1 M TBABF₄, Abtastrate 200 mV/s.
8 zeigt die ECL-Emission für die Reduktion von 1,1 mM DPAS und 25 mM(NH₄)₂S₂O₈ in einer MeCN Wasserlösung (Volumenverhältnis 1 : 1) an einer Pt Elektrode mit einem Durchmesser von 2,0 mm. Leitelektrolyt 0,2 M TEAP; Abtastrate 100 mV/s.
9 zeigt die Fluoreszenz- und ECL-Spektren für die gleiche Lösung wie 8. Die ECL-Emission wurde durch Pulsieren einer Pt Elektrode mit einem Durchmesser von 2,0 mm auf –2,2 V (gegenüber SCE) und Integrieren der Emission während 5 Sekunden erzeugt. Beide Spitzenintensitäten lagen bei 430 nm.
10a–10c zeigen (a) eine cyclische voltammometrische Kurve von 2,0 mM 2-THCOOH in einem Natriumphosphatpuffer mit einem pH von 8,5 an einer Pt Elektrode mit einem Durchmesser von 1,5 mm bei einer Abtastrate von 200 mV/s; (b) eine cyclische voltammometrische Kurve von 1,4 mM 2-THCOOH unter den gleichen Bedingungen wie (a) mit dem Unterschied, dass die Abtastung von +0,15 V statt von –0,35 V im Zyklus stattfand; und (c) eine cyclische voltammometrische Kurve von 2,0 mM 2-THCOOH an einer Pt Elektrode mit einem Durchmesser von 1,5 mm in MeCN, 0,1 M TBABF₄ mit einer Abtastrate von 200 mV/s. Die wässerigen Abtastungen (a) und (b) sind bezogen auf SCE. Die nichtwässerige Abtastung (c) ist auf Ferrocen bezogen.
11a–11b zeigen (a) eine cyclische voltammometrische Kurve (unten) und (b) die gleichzeitige Emission von 5,2 mM 2-THCOOH und 0,15 M TPrA in einem Natriumphosphatpuffer mit einem pH von 7,5 an einer Pt Elektrode mit einem Durchmesser von 6 mm bei einer Abtastrate von 100 mV/s.
12a–12b zeigen (a) eine cyclische voltammometrische Kurve und (b) die gleichzeitige Emission von 0,26 mM 2-THCOOH und 0,15 M TPrA unter den gleichen Bedingungen wie 11.
13 zeigt eine cyclische voltammometrische Kurve von 2,0 mM 2-THCOOH in Gegenwart von 0,05 M TPrA. Andere Bedingungen sind die gleichen wie bei 10a.
14 zeigt die Spitzen ECL-Intensität gegenüber pH für 1 × 10^–5 M 2-THCOOH, 0,15 M TPrA in einem Natriumphosphatpuffer.
15 zeigt ein doppeltlogarithmisches Diagramm der Spitzen-ECL-Intensität gegenüber einer 2-THCOOH-Konzentration in einem Natriumphosphatpuffer mit einem pH von 7,5, der 0,15 M TPrA enthält.
16a–16b zeigen die Fluoreszenz- und ECL-Spektren von 9,1 mM 1-THCOOH (a) und 20 mM 2-THCOOH (b) genommen in einem Natriumphosphatpuffer mit einem von pH 8,5, der 0,15 M TPrA enthält. Die ECL-Emissionen wurden durch alternatives Pulsieren einer 6 × 9 mm Pt Netzelektrode (Siebzahl 52) zwischen +1,4 V (0,5 s) und –0,5 V (2 s) gegenüber SCE während einer Dauer von 40 Minuten für 1-THCOOH und 20 Minuten für 2-THCOOH mit einer gerührten Lösung. Die Spitzenfluoreszenzintensität liegt bei 480 nm für 2-THCOOH und 505 nm für 1-THCOOH. Die Spitzen-ECL-Intensitäten liegen bei 570 nm für beide Isomere. Die Intensitäten wurden für Vergleichszwecke skaliert. Bei gleichen THCOOH-Konzentrationen (20 mM) und Nachweiszeiten ist die Intensität der 2-THCOOH-Emissionen etwa 6 bis 7 mal so hoch wie diejenige von 1-THCOOH.
17a–17b zeigen (a) die cyclische voltammometrische Kurve von 0,98 mM CPZ in 0,01 M HCl, 0,2 M NaCl an einer HOPG-Elektrode mit einem Durchmesser von 6 mm bei einer Abtastrate von 50 mV/s und (b) die cyclische voltammometrische Kurve für das gleiche System und die gleichen Bedingungen wie (a) mit einer Abtastumkehr nach der ersten Oxidation.
18a–18b zeigen (a) die cyclische voltammometrische Kurve und (b) die gleichzeitige Emission für 1,0 mM CPZ an einer HOPG-Elektrode mit einem Durchmesser von 6 mm in einem Natriumphosphatpuffer mit einem pH von 7,5 bei einer Abtastrate von 200 mV/s genommen.
19 zeigt die Emissionsspektren von DPAS and Ru(bpy)₃ ²⁺.
20 zeigt eine Vorrichtung zum Messen von zwei ECL-Emissionen.
21a–21c zeigt die Erregungsspannungs- und Intensitätsrampen.
Unter einem ersten Aspekt stellt die Erfindung so ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten zur Verfügung, das umfasst:

(a) Kontaktieren einer Probe mit einem Biomolekül, das an einer organischen Markerverbindung angeheftet ist, die in wässeriger Lösung löslich ist, worin die Markerverbindung Elektrochemilumineszenz erzeugen kann;
(b) Anlegen eines Oxidationspotentials unter Verwendung einer Elektrode an die Markerverbindung in Gegenwart eines Amin-Coreaktanten unter wässerigen Bedingungen; und
(c) Messen der abgegebenen Elektrolumineszenz, wobei das Verfahren ein Immunoassay ist und das Biomolekül ein Antikörper oder Antigen ist oder wobei das Verfahren ein DNA-Hybridisierungs-Assay ist und das Biomolekül eine DNA-Sonde ist.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zum Erzeugen von Elektrochemilumineszenz zur Verfügung, das umfasst: das Anlegen eines Oxidationspotentials unter Verwendung einer Elektrode an einen löslichen organischen Marker, der ein tertiäres Amin umfasst, wodurch eine Elektrochemilumineszenz unter wässerigen Bedingungen erzeugt wird, wobei der lösliche organische Marker an einem Biomolekül, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Antikörper, einem Antigen und einer DNA-Sonde, angeheftet ist.
Die Erfindung stellt des weiteren eine elektrochemilumineszente Markerzusammensetzung zur Verfügung, die umfasst: eine wasserlösliche organische Verbin dung; und einen Amin-Coreaktanten, wobei die Verbindung an einem Biomolekül, ausgewählt aus einem Antikörper, einem Antigen und einer DNA-Sonde, angeheftet ist.
Die Erfindung stellt auch die Verwendung einer elektrochemilumineszenten, wasserlöslichen, organischen Markerverbindung zur Verfügung, die an ein Biomolekül gebunden ist, das ausgewählt ist aus einem Antigen, einem Antikörper und einer DNA-Sonde, in Kombination mit einem Amin-Coreaktanten bei der Herstellung eines elektrochemilumineszenten Markers für den Nachweis eines Analyten.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Bei der vorliegenden Erfindung erfordert die elektrisch erzeugte Chemilumineszenz-Zuammensetzung, dass: 1) der Emitter in wässeriger Lösung löslich sein muss; 2) die Emissionswellenlänge von derjenigen von Ru(bpy)₃ ^2+• unterschiedlich sein muss, 3) die oxidative oder reduktive Elektrochemie innerhalb eines relativ engen Potentialbereichs, der von der Oxidation und Reduktion von Wasser auferlegt ist, fortschreiten muss; und 4) das oxidierte oder reduzierte Zwischenprodukt mit dem elektrisch erzeugten Coreaktantenzwischenprodukt reagieren muss, was die Bildung des erregten Zustands gestattet. Wenn diese Kriterien erfüllt werden, können die neuen Zusammensetzungen unabhängig von oder zusammen mit bestehenden Ru(bpy)₃ ²⁺ Systemen verwendet werden. Marker, die mit den Rutheniummarkern verwendet werden können, sind substituierte, polycyclische, organische lumineszierende Verbindungen, z. B. aromatische Polycyclen, die Ringkohlenstoffsubstitutionen von mindestens einem Heteroatom, N und/oder S, ihren Isomeren und ihren Salzen aufweisen können. Bevorzugte Polycyclen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, substituiertes Diphenylanthracen, Thianthren und Promazin, und werden für elektrisch erzeugte, chemilumineszente Anwendungen verwendet.
Ein bevorzugter Marker gemäß der vorliegenden Erfindung ist DPAS, das einen stark fluoreszierenden Energieakzeptor mit erregtem Zustand aus Singulett-Ketonen in wässerigen Medium aufweist, das einen hohen Fluoreszenzwirkungsgrad und eine kurze Wellenlängenemission (∅_F = 0,87, Spitzenemission bei 428 nm) im Vergleich zu Ru(bpy)₃ ²⁺ (∅_F etwa 0,05, Spitzenemission bei 620 nm) aufweist. DPAS erfüllt deshalb die vorstehend angegebenen Kriterien und erzeugt eine blaue ECL-Emission, die sich aus einem oxidativen Reduktionsschema mit DPAS als Emitter und TPrA als Coreaktant in wässerigen Medien erzeugt. Des weiteren erfüllt das ECL von DPAS in einem reduktiven Oxidationssystem unter Verwendung von Peroxydisulfat(S₂O₈ ^2–) als Coreaktant in einer MeCN-Wasserlösung (Volumenverhältnis 1 : 1) auch die vorstehend angegebenen Kriterien.
DPAS
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform umfasst zwei Carbonsäurederivate von Thianthren (TH), nämlich 1- und 2-Thianthrencarbonsäure (1-THCOOH und 2-THCOOH) und ihre Isomere.
TH
Es ist bekannt, dass Thianthren in einem nichtwässerigen Ionenannihilationssystem gemäß den vorstehend angegebenen Gleichungen (1) bis (4) ECL (Spitzenintensität bei 434 nm) erzeugt. Die Derivatisierung von TH zu seinen Carbonsäurederivaten ergab die notwendige Löslichkeit in wässeriger Lösung, und diese Derivate erzeugten ECL-Emissionen in einem oxidativen Reduktionssystem mit TPrA als Coreaktanten. Jedoch anderes als Thianthren, das eine blaue ECL-Emission besitzt, sind die ECL-Spektren dieser Verbindungen jedoch beträchtlich von den Fluoreszenzspektren nach rot verschoben.
1-THCOOH
2-THCOOH
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die wässerige ECL mit Chlorpromazin (CPZ), das mit TH strukturell verwandt ist. Obgleich die Fluoreszenz, Chemilumineszenz und Elektrochemie von CPZ untersucht wurden, wurde seine Verwendung für ECL-Anwendungen nicht untersucht. McCreery untersuchte die Oxidation von CPZ und verschiedene Reaktionen des Kationenradikals, die beschrieben sind in Cheng, H. Y.; Sackett, P. H.; McCreery, R. L., J. Am. Chem. Soc., 1978, 100, 962, und erweiterte später die Arbeiten, um die Reaktion des Chlorpromazinradikals mit Dopamin in Betracht zu ziehen, was beschrieben ist in Deputy, A.; Wu, H. P.; McCreery, R. L., J. Phys. Chem, 1990, 94, 3620, und Deputy, A. L.; McCreery, R. L., J. Electroanal. Chem, 1989, 285, 1, Methoxypromazin, Deputy, A. L.; McCreery, R. L., J. Electroanal. Chem, 1989, 285, 1, und Hydrochinon, Deputy, A. L.; McCreery, R. L., J. Electroanal. Chem, 1989, 285, 1. Des weiteren ist die Fluoreszenz beschrieben in Mellinger, T. J.; Keeler, C. E., Anal. Chem., 1964, 36, 1840; Mellinger, T. J.; Keeler, C. E., Anal. Chem., 1963, 35, 554; Ragland, J. B.; Kinross-Wright, V. J., Anal. Chem., 1964, 36, 1356; und Udenfriend, S.; Duggan, D. E.; Vasta, B. M.; Brodie, B. B., J. Pharmacol. Expt. Thera., 1957, 120, 26 (einschließlich analytischer Anwendungen); Takahashi, D. M., J. Pharm. Sci., 1980, 69, 184 und Clark, B. J.; Fell, A. F.; Mine, K. T.; Pattie, D. M. G.; Williams, M. H., Anal. Chim. Acta, 1985, 170, 35, und die Chemilumineszenz, beschrieben in Nakano, M.; Sugioka, K.; Nakano, H.; Takyu, C.; Inaba, H., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1985, 130, 952, und Trush, M. A.; Reasor, M. J.; Wilson, M. E.; Van Dyke, K., Chem.-Biol. Interact., 1979, 28, 71, von Chlorpromazin wurde untersucht. Abgesehen von der Abgabe von Licht bei einem oxidativen Reduktionssystem mit TPrA emittiert CPZ, wenn es oxidiert ist, auch in Abwesenheit eines zugegebenen Coreaktanten. Vermutlich wirkt das tertiäre Amin an der CPZ-Seitenkette als innerer Coreaktant, und es wird angenommen, dass es das erste Beispiel einer "Selbstannihilations"-ECL-Reaktion liefert
CPZ
Reagenzien
MeCN wurde ungeöffnet in eine Glovebox mit einer Vakuumatmosphäre unter einer Heliumatmosphäre überführt und ansonsten wie erhalten verwendet. Für Experimentenläufe in MeCN wurde vor jedem Experiment eine abgedichtete Zelle in die Glovebox geladen. Tetrabutylammoniumtetrafluorborat (TBABF₄, elektrometrische Qualität) wurde mittels Umkristallisierung aus entweder Ethylacetat Pentan (2 mal; Volumenverhältnis 1 : 1) oder Ethylacetat : Diethylether (3 mal; Volumenverhältnis 9 : 1) gereinigt, gefolgt von Trocknen unter Vakuum bei 100°C. Tetraethylammoniumperchlorat (TEAP, elektrometrische Qualität, benetzt mit 8% Wasser, Tri-n-propylamin (TPrA, 98%), Thianthren (97%), Chlorpromazinhydrochlorid (98%), Natriumphosphat, monobasisches Monohydrat (NaH₂PO₄ ·H₂O, 99%), Natriumphosphat, dibasisches Heptahydrat (Na₂HPO₄·7H₂O) 99%, und Ammoniumperoxydisulfat ((NH₄)₂S₂O₈, 99%) wurden wie erhalten verwendet.
Puffer
0,15 M Natriumphosphatpufferlösungen, hergestellt mit Milli-Q Wasser (Millipore Corp., Bedfore, WA), bestanden aus 0,10 M in Na₂HPO₄·7H₂O und 0,05 M in NaH₂PO₄·H₂O. Pufferlösungen, die TPrA enthielten, wurden in ähnlicher Weise mit dem Unterschied hergestellt, dass 0,15 M NaH₂PO₄·H₂O verwendet wurden, um die Basizität von TPrA auszugleichen. Der pH-Wert dieser Pufferlösungen wurde entweder mit konzentrierter Phosphorsäure (H₃PO₄) oder 4 M NaOH eingestellt.
Instrumentarium
Cyclische Voltammometrie ohne Photonennachweise wurde durch Verwendung von entweder einem BAS 100A elektrochemischen Analysegerät (Bioanalytical Systems, West Lafayette, IN) oder einem Princeton Applied Research (PAR) Modell 173/175 Potentiostat/Universalprogrammiergerät (Princeton, NJ) und einem Omnigraphic 20000 X-Y Aufzeichnungsgerät (Bausch and Lomb-Houston Instrument Division, Austin, TX) erhalten. Cyclische voltammometrische Kurven mit gleichzeitigem Photonennachweis wurden unter Verwendung des PAR 173/175 zusammen mit einem Hamamatsu C1230 Photonenzähler (Bridgewater, NJ), ausgestattet mit einer Hamamatsu R928-P Photoelektronenvervielfacherröhre, aufgezeichnet. Die Photoelektronenvervielfacherröhre war in einer mit einem Wassermantel versehenen Modell TE308TSRF Kühlkammer der Products For Research, Inc., die bei –10°C gehalten wurde, untergebracht. Das primäre Kühlen des Wassermantels auf 10°C wurde unter Verwendung einer MGW Lauda Modell RMS6 Kühleinheit (verkauft von Brinkmann Instruments Co., Westbury, NY) durchgeführt. Für das Auftragen der ECL-Intensität gegenüber dem Potential wurde der Ausgangswert des Photonenzählers der Y-Achse des X-Y Aufzeichnungsgeräts während der Potentialabtastungen zugeführt.
Die ECL-Intensität gegenüber der Konzentration und die ECL-Intensität gegenüber den pH-Daten wurden unter Verwendung des Perkin Eimer Prototyp ECL Analysegeräts (Perkin-Eimer Corp., Norwalk, CT; Modell QPCR System 5000; ähnlich dem Instrument, das in Leland, J. K.; Powell, M. J., J. Electrochem. Soc., 1990, 137, 3127 beschrieben ist) gesammelt. Dieses Instrument ist an einem Digital DEC Station 316SX Personalcomputer angeschlossen.
Fluoreszenz- und ECL-Spektren wurden unter Verwendung einer ladungsgekoppelten Speicher- (CCD-) Kamera und eines Spektrometers (1 mm Eintrittsschlitz), der an einem Dell System 200 Personalcomputer (Austin, TX), wie vorstehend beschrieben, angeschlossen ist, aufgezeichnet. Die gleichen Verfahren (Spektralkalibrierung usw.) wurden wiederholt mit dem Unterschied, dass unterschiedliche Impulssequenzen verwendet wurden und der CCD-Detektor bei –110°C für die TPrA/THCOOH und TPrA/DPAS Experimente und bei –100°C für die S₂O₈ ^2–/DPAS Experimente gehalten wurde. Die Erregung für die Fluoreszenzspektren wurde durch Halten einer langwelligen (366 nm) UV-Lampe (UVP, Inc., San Gabriel, CA; Modell WGL-25; verkauft von Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) neben der Zelle und unter einem rechten Winkel zum Eintrittsschlitz des Spektrometers erzielt.
Zellen und Elektroden
Außer in den Fällen, in denen es angegeben ist, wurde bei allen elektrochemischen und ECL-Exerimenten eine herkömmliche 3-Elektrodenzellenkonfiguration verwendet. Pt Scheibenarbeitselektroden wurden vor jedem Experimentenlauf auf einem Filzkissen (Buehler, Ltd., Lake Bluff, IL) poliert, bevor jedes Experiment mit 0,05 μm Aluminiumoxid (Buehler, Ltd.), suspendiert in Wasser, durchgeführt wurde.
Die Zelle für das Perkin-Elmer Instrument wurde derart modifiziert, dass: 1) bei der Dünnschichtströmungszelle eine Arbeitselektrode (Au) und zwei quadratische (5 × 5 mm) Gegenelektroden (beide Au) verwendet wurden; 2) die zwei Gegenelektroden oberhalb der Arbeitselektrode und diese flankierend in der Strömungszelle angeordnet sind, wobei sich die Arbeitselektrode in direkter Sicht der Photoelektronenvervielfacherröhre befindet; und 3) sich die Ag/AgCl Bezugselektrode in einer Kammer neben der Strömungszelle befindet, statt in den Strömungsweg stromabwärts der Zelle integriert zu sein. Die Elektroden wurden bei diesem Instrument vor jedem Lauf unter Verwendung einer im Handel erhältlichen Reinigungslösung (IGEN Inc., Rockville, MD) in Kombination mit einer programmierten Potentialimpulssequenz gereinigt.
Für cyclische Voltammometrie-Läufe ohne Photonennachweis werden bei der CPZ-Ausführungsform eine stark ausgerichtete pyrolytische Graphit-Arbeitselektrode (HOPG; Union Carbide, Cleveland, OH) (Scheibe mit einem Durchmesser von 6 mm mit frisch freigelegtem Material für jedes Experiment), eine Pt Draht-Gegenelektrode und eine Ag Quasi-Bezugselektrode (AgQRE) in einer kürzlich beschriebenen Konfiguration verwendet (siehe Xu, X.; Bard, A. J., Langmuir, 1994, 10, 2409). Bei ähnlichen Läufen für alle anderen Verbindungen wurde eine Pt Scheibenarbeitselektrode mit einem Durchmesser von 1,5 mm, versiegelt in Glas, in Kombination mit einer Pt Drahtgegenelektrode und AgQRE verwendet.
Bei dem DPAS/TPrA-ECL-Spektrum und den Abtastungen Emission gegenüber Potential wurden eine 6 × 9 mm Pt Netz-Flagge-Arbeitselektrode (Netz mit einer Siebzahl von 52; Aldrich), eine AgQRE- und eine runde Au-Foliengegenelektrode (Durchmesser 9 mm, Dicke 0,5 mm) verwendet. Diese Anordnung wurde auch bei dem 2-THCOOH-ECL-Spektrum verwendet. Die Netzarbeitselektrode wurde vor jedem Experiment durch Eintauchen in konzentrierte Salpetersäure, gefolgt von Spülen in destilliertem Wasser und Erhitzen in einer Bunsenbrennerflamme, gereinigt.
Bei dem DPAS/S₂O₈ ^2–-ECL-Spektrum und Abtastimg Emission gegenüber Potential wurde eine Pt Scheibenarbeitselektrode mit einem Durchmesser von 2,0 mm, in Glas versiegelt, in Kombination mit einer Pt Drahtgegenelektrode und AgQRE verwendet.
Bei der CPZ-ECL-Emission gegenüber der Potentialabtastung wurden die gleichen Elektroden und die gleiche Konfiguration, wie vorstehend für CPZ beschrieben, ohne Photonennachweis verwendet. Bei der ECL-Emission gegenüber der Potentialabtastung wurde die gleiche Anordnung mit dem Unterschied verwendet, dass die Arbeitselektrode eine Pt Scheibe mit einem Durchmesser von 6 mm war.
Die nichtwässerige Potentialreferenzbildung mit Bezug auf Ferrocen wurde durch Zugabe des Standards direkt zu den Lösungen bewirkt. Die Potentialreferenzbildung wässeriger Lösungen mit Bezug auf die gesättigte Calomelelektrode (SCE) wurde durch Erwerben von Daten im Vergleich gegenüber AgQRE, für das das Potential gegenüber SCE bekannt ist, bewirkt. Für qualitative Vergleichszwecke variiert das Ferrocen E° gegenüber SCE (hauptsächlich aufgrund von Unterschie den beim Diffusionspotential) von +0,307 bis +0,56 V in Abhängigkeit von dem Lösungsmittel-/Leitelektrolyt-System.
Beispiel 1
DPAS wurde in Abänderung des Verfahrens von Catalani und Mitarbeiter, beschrieben in Catalani, L. H.; Wilson, T.: Bechara, E. J., H. Photochem. Photobiol. 1987, 45, 273, synthetisiert. So wurde 1 g 9,10-Diphenylanthracen (DPA, 98%) in 7 ml Nitrobenzol (99%) suspendiert, und die sich ergebende gelbe Suspension wurde in einem Eisbad unter einer ständigen Strömung von Stickstoff auf 10°C abgekühlt. Unter kräftigem Rühren wurden 0,25 ml rauchende Schwefelsäure (27–33% freies SO₃) tropfenweise zugegeben, um eine dunkelgrüne Suspension zu erzeugen, die anfänglich bei 50°C 4 Stunden gerührt wurde, gefolgt von Rühren über Nacht bei Raumtemperatur. Die dunkelgrüne Lösung wurde dann mit 10 M NaOH in einem Eisbad neutralisiert, um einen öligen, blassgelben Rückstand zu erzeugen. Sobald sich pH-Papier, das mit dieser Suspension benetzt wurde, statt der anfänglichen tiefroten Farbe zu einer orangeroten Farbe veränderte, wurden der Mischung 50 ml Wasser vor der endgültigen Zugabe von NaOH zugegeben, um den pH auf 7,0 zu bringen. Zusätzliches Wasser wurde dann zugegeben, um das Gesamtvolumen auf etwa 250 ml zu bringen, und das Nitrobenzol wurde durch Dampfdestillation (durch das Sieden der Suspension bewirkt) entfernt. Der größte Teil des Nitrobenzols wurde mit den ersten 75 ml des Destillats entfernt, und die Destillation wurde fortgesetzt, bis das Volumen der Suspension etwa 50 ml betrug. Die gelbe Suspension wurde dann in einen Becher überführt und auf einer Heizplatte unter Rühren sieden gelassen, um das Gesamtvolumen auf etwa 10 ml zu reduzieren. Die gelbe Aufschlämmung wurde über einen Buchner-Trichter (mit Filterpapier) filtriert, und der sich ergebende Feststoff wurde lufttrocknen gelassen, um 0,94 g des rohen, gelben Produkts zu erzeugen. Das rohe Produkt wurde mittels Ionenaustausch-Säulenchromatographie unter Verwendung des Dowex 1 × 2-100 Ionenaustauschharzes (50–100 Trockensiebnummer; 3 × 1 cm) und Eluieren mit einem Gradienten von 0–0,5 M HCl (gemischt aus 36,5% HCl) in wasserfreiem Methanol (spektrophotometrische Qualität) gereinigt. So wurden etwa 0,35 g des rohen, gelben Produkts in 10 ml Methanol unter Rühren und Beschallung gelöst. In dem rohen Produkt vorhandenes, nicht umgesetztes DPA ist in Methanol nur geringfügig löslich und wurde so mittels Zentrifugieren abgetrennt. Der Überstand wurde auf die Säule aufgebracht, und das Produkt mit etwa 5 ml Methanol, gefolgt von etwa 5 ml 0,25 M HCl in Methanol, gefolgt von 0,5 M HCl in Methanol, eluiert. Neun 20 ml Fraktionen wurden gesammelt und 60 ml Wasser wurden jeder Fraktion zugegeben. Die Fraktionen 1 bis 5 wiesen eine Trübung und/oder Präzipitatbildung auf und wurden in einem Kühlschrank über Nacht gekühlt. Das Feststoffprodukt wurde dann mittels Zentrifugieren und Filtrieren über einer feinen Fritte aus gesintertem Glas abgetrennt. Wenn der Strom von Flüssigkeit durch die Glasfritte aufgrund von Verstopfen anhielt, wurde die grünliche, geleeartige Aufschlämmung in eine Petrischale aus Glas überführt, mit einem Stück Filterpapier abgedeckt und mehrere Tage unter Umweltbedingungen lufttrocknen gelassen. Als sie trocken war, wurden 110 mg des hellgelbgrünen DPAS·5H₂O mit einer Rasierklinge aus der Petrischale gekratzt und mittels ¹H NMR und Massenspektroskopie charakterisiert.
Wässerige Lösungen aus DPAS·5H₂O wurden durch Lösen der erforderlichen Menge Feststoff in einigen Tropfen Methanol vor der Überführung in die wässerige Lösung hergestellt. Die maximale Löslichkeit des wässerigen DPAS in 0,15 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,5) beträgt etwa 1 × 10^–5 M. Bei dieser niedrigen Konzentration kann kein anodischer Strom für DPAS oberhalb der Hintergrundoxidation von Wasser, wie in 1 gezeigt, beobachtet werden. Jedoch tritt, wenn 1 × 10^–5 M DPAS in Gegenwart von 0,15 M TPrA oxidiert wird, eine Emission, die mit einer Oxidationswellenlänge zusammenfällt, auf, die der TPrA-Oxidation und der Hintergrundoxidation von Wasser, wie in 2a bis 2b gezeigt ist, überlagert ist. Für Vergleichszwecke ist die Oxidation von 0,05 M TPrA in Abwesenheit von DPAS in 2c gezeigt. Die Tatsache, dass ein Oxidationsstrom für 1 × 10^–5 M DPAS nur in Gegenwart von TPrA beobachtet wird, hat eine Verbesserung des katalytischen Stroms aufgrund der Regenerierung von DPAS über die Reduktion von DPAS⁺ mittels TPrA oder eines Zwischenprodukts zur Folge. Für diese Katalyse ist die cyclische Sequenz der Reaktionen analog zu den vorstehend angegebenen Gleichungsschemata (5), (6a), (7), (8) oder (10) und (11) und (9), worin Ru(bpy)₃ ^+/2+/+ durch DPAS^+/0/– ersetzt ist, XY^z TPrA ist, X^x Pr₂NCH·Et ist und Y^y H⁺ ist. Trotz der geringen DPAS-Konzentration, 1 × 10^–5 M, ist diese Emission sichtbar blau, wenn sie in einer Dunkelkamer beobachtet wird, und wenn entweder TPrA oder DPAS fehlen, wird keine Emission beobachtet.
Mit Bezug auf die ECL-Intensität als Funktion des pH-Werts wurden geringfügig intensivere Emissionen manchmal bei niedrigeren pH-Werten aufgezeichnet, es wurden jedoch keine Bedingungen gefunden, bei denen diese Unterschiede außerhalb der experimentellen Streubreite lagen. Für das DPAS/TPrA-System tritt eine Elektrodenpassivierung nach einer Abtastung auf und verhindert die Beobachtung von späteren Emissionen ohne eine Elektrodenreinigung. Dieses Verhalten legt nahe, dass Produkte von chemischen Reaktionen, die auf die Oxidation von DPAS folgen, die Elektrode passivieren. Die Elektrode kann mechanisch oder durch Pulsieren in die Hintergrundreduktion von Wasser (–1,4 V gegenüber SCE) während einiger Sekunden gereinigt werden, wonach bei der Oxidation wieder ECL beobachtet werden kann.
Die Oxidation von DPAS wird durch die folgenden chemischen Reaktionen kompliziert, wie dies durch den Mangel an chemischer Reversibilität, wie in 3 gezeigt, bewiesen wird. Dieses Verhalten, das bei Abtastraten von bis zu 10 V/sec anhält, ist wahrscheinlich auf den Angriff von DPAS⁺ durch Wasser oder OH^– zur Bildung von Produkten zurückzuführen. Obgleich besondere Sorgfalt angewandt wurde, um Spuren von Wasser aus diesen Lösungen auszuschließen, ist es wahrscheinlich, dass die fünf Wässer der Hydratation, die mit DPAS verbunden sind, für eine ausreichende Quelle für den nucleophilen Angriff auf DPAS⁺ sorgen. Die Zugabe von neutralem Aluminiumoxid zu diesen Lösungen bei einem Versuch, Wasser zu entfernen, führte nicht zu grundlegenden Änderungen der Elektrochemie. Versuche, die ECL-Emissionsintensität über die Stabilisierung von DPAS⁺ unter Verwendung von oberflächenaktivem Mittel oder durch die Polysulfonierung von DPA zu erhöhen, waren nicht erfolgreich.
Eine Kalibrierungskurve für die ECL-Intensität gegenüber der Konzentration über den Sensibilitätsbereich für ein Perkin-Eimer Analysegerät für DPAS bei einer Konzentration, die so niedrig wie 3,2 × 10^–8 M ist, ist in 4 gezeigt. Unter optimierten Bedingungen kann bei ähnlichen Emissionsintensitäten Ru(bpy)₃ ²⁺ bei Konzentrationen, die etwa 60 mal verdünnter sind, nachgewiesen werden. Bei höheren Konzentrationen von 5 × 10^–6 M unter Verwendung der CCD-Kamera (und Berichtigung bezüglich der Nachweisempfindlichkeit) ist die Ru(bpy)₃ ²⁺-Emission etwa 100 mal intensiver als die DPAS-Emission. Da erwartet wird, dass die ECL-Emission für DPAS aufgrund der Fluoreszenzwirkungsgrade intensiver als für Ru(bpy)₃ ²⁺ ist (⌀_F = 0,87 für DPAS und etwa 0,05 für Ru(bpy)₃ ²⁺), legt die geringere ECL-Intensität für DPAS die Gegenwart von konkurrierenden chemischen Reaktionen (wie einem nucleophilen Angriff) nahe, die DPAS⁺ verbrauchen.
5 zeigt die ECL- und Fluoreszenz-Spektren von 1 × 10^–5 M DPAS. Die Ähnlichkeit zwischen den Fluoreszenz- und ECL-Spektren legt nahe, das die ECL-Emission von DPAS^• stammt. Die geringfügige Diskrepanz zwischen den Spektren bei langen Wellenlängen kann auf die Emission aus anderen Produkten zurückzuführen sein, die durch konkurrierende chemische Reaktionen während der ECL gebildet werden.
Beispiel 2
Die Elektrochemie und ECL des Ru(bpy)₃ ²⁺/S₂O₈ ^2–-Systems in MeCN Wasser wurde früher in Betracht gezogen, und die reduktive CV von S₂O₈ ^2– ist in 6 gezeigt. Hier ist die Irreversibilität der Reaktion auf das in der vorstehend angegebenen Gleichung (13) dargestellte Verfahren zurückzuführen. Unter diesen Bedingungen tritt der Beginn der Hintergrundreduktion von Wasser (nicht gezeigt), die gasförmiges H₂ erzeugt, bei etwa –1,0 V auf.
Bei der vorliegenden Erfindung tritt die kathodische Reduktion von DPAS in Gegenwart von S₂O₈ ^2– als Coreaktant auf und erzeugt die ECL. Die Reduktion von DPAS in MeCN ist in 7 gezeigt, und die Reversibilität dieses Paars (DPAS^0/–) im Vergleich zur Oxidation von DPAS, die in 3 gezeigt ist, gibt an, dass DPAS^– beträchtlich stabiler in MeCN als DPAS⁺ ist. Die kleine Vorlaufwelle in 7 scheint auf das adsorbierte DPAS zurückzuführen zu sein, da der Strom für diese Welle linear mit der Abtastrate (ν) ansteigt, während diejenige für das negativere Paar mit ν^1/2 über einen Bereich von 0,1 bis 10 V/s ansteigt. Da diese Reduktion in die Hintergrundreduktion von Wasser hinein erfolgt, ist kein kathodischer Strom oberhalb des Hintergrunds in MeCN-Wasser-Lösungen (Volumenverhältnis 1 : 1) ersichtlich. Falls jedoch das Potential in die Hintergrundreduktion von Wasser in Gegenwart von S₂O₈ ^2– abgetastet wird, wird eine hellblaue Emission bei einem Potential beobachtet, das der Reduktion von DPAS entspricht (nachdem die etwaige Umwandlung von Ferrocen zu SCE-Potentialen vorgenommen wurde), wie in 8 gezeigt ist. In Abwesenheit von entweder S₂O₈ ^2– oder DPAS wird keine Emission beobachtet. Dieses Ergebnis stimmt mit früheren Ergebnissen mit dem Ru(bpy)₃ ²⁺/S₂O₈ ^2–-System überein, bei dem keine Emission zu sehen ist, bis das Potential ausreichend negativ abgetastet wurde, um Ru(bpy)₃ ²⁺ abzutasten und die Erzeugung des erregten Zustands über die in den vorstehend angegebenen Gleichungen (12) bis (15) gezeigte Sequenz von Reaktionen zu gestatten.
Dieses System kann modifiziert werden, um die ECL-Reaktion für DPAS durch Substituieren von DPAS^+/0/– bzw. für Ru(bpy)₃ ^3+/2+/+ zu beschreiben.
Wie in 9 gezeigt ist, passt das blaue ECL-Spektrum für die DPAS-Emission mit dem Fluoreszenz-Spektrum zusammen und passt auch mit den ECL- und Fluoreszenzspektren für die oxidative Reduktion von DPAS mit TPrA, die in 5 gezeigt ist, zusammen. Der geringere Emissionsbeitrag von Nebenprodukten in 9 bestätigt die bessere Stabilität von DPAS⁺ selbst während der Hintergrundreduktion. Wenn man die Energetik eines ECL-Systems in Betracht zieht, stellt man die Standardpotentiale der relevanten Halbreaktionen (die die freie Energie der Elektronenübertragungsreaktion ergeben) und die Energie des emittierenden Zustands fest. Für die Oxidation von DPAS und TPrA sind diese: DPAS+• + e. → DPASE° ≈ +1.3 V gegenüber SCE Pr2NC+HEt + e. → Pr2NC·HEtE° ≈ –1.1 V gegenüber SCE³⁰ DPAS• (Singulett) → DPAS + hνE₁ ≈ 2.9 eV
Die Enthalphie der Elektronenübertragungreaktion zwischen DPAS^+• und Pr₂NC·HEt, die zu einer Berichtigung für eine Entropie von etwa 0,1 eV führt, beträgt –2,3 eV, weit unterhalb derjenigen, die benötigt wird, um eine Singulett DPAS^• zu erzeugen, so dass diese als eine Reaktion "mit nicht ausreichener Energie" klassifiziert würde. Wie bei anderen Reaktionen dieses Typs bilden sich erregte Singuletts wahrscheinlich über eine Triplett-Triplett-Annihilation (einen T-Weg). Obgleich das oxidative DPAS-/Oxalat-System ein solches "mit ausreichender Energie" ist, wurde bei Läufen mit Oxalat als Coreaktant keine Emission beobachtet.
Die Reduktivweg-Energetik entspricht den Halbreaktionen: DPAS + e. ⇄ DPAS–• E° ≈ –1.9 V gegenüber SCE SO4 –• + e. ⇄ SO4 2– E° ≈ +3.2 V gegenüber SCE
In diesem Fall ist die Elektronenübertragungsreaktion zwischen DPAS^–• und SO₄ ^– ausreichend, um Singulett-DPAS^• direkt zu erzeugen (ein S-Weg). Die Emissions intensität für 1 × 10^–5 M DPAS ist etwa die gleiche für die DPAS-/TPrA-Oxidation wie für die DPAS/S₂O₈ ^2– Reduktion.
Beispiele 3 und 4
1-THCOOH und 2-THCOOH wurden gemäß den Verfahren von Gilman und Swayampati, beschrieben in Gilman, H.; Swayampati, D. R., J. Am. Chem. Soc., 1957, 79, 208, mit dem Unterschied synthetisiert, dass 1,6 M n-Butyllithium in Hexan durch seine ätherischen Lösungen von n-Butyllithium substituiert wurden.
Die Oxidation von 2-THCOOH in wässriger Lösung tritt nahe bei +1,0 V, wie in 10a gezeigt, auf. Der breite anodische Prozess zwischen 0,0 V und +0,5 V sowie der markantere kathodische Prozess bei –0,2 V sind für die Oxidbildung und Reduktion an einer Pt Elektrode in wässeriger Lösung bei diesem pH-Wert charakteristisch und erscheinen in Abtastungen in Abwesenheit von 2-THCOOH. Diese Prozesse können eliminiert werden, falls das Potential zyklisch nicht weiter negativ als –0,15 V, wie in 10b gezeigt, gestaltet wird. Die chemische Irreversibilität, die in 10a und 10b gezeigt ist (und bei ähnlichen Abtastungen bis zu 50 V/s beobachtet wird), zeigt die Instabilität von oxidiertem 2-THCOOH in wässeriger Lösung und dessen schnelle Umwandlung zu einem beliebigen Produkt. Im Gegensatz hierzu zeigen ähnliche Läufe in trockenem MeCN (10c), dass das oxidierte Produkt stabil ist. Dies zeigt, dass die Zersetzung der oxidierten Säure auf die Reaktion mit Wasser zurückzuführen ist im Gegensatz zu anderen Möglichkeiten wie der Decarboxylierung mit dem Verlust von CO₂.
Die Oxidation von Thianthren (TH) in MeCN erzeugt ein stabiles Radikalkation, das in Kexzthelyi, C. P.; Tachikawa, H.; Bard, A. J., J. Am. Chem. Soc., 1972, 94, 1522, beschrieben ist. Folglich verläuft die Oxidation von THCOOH wahrscheinlich auf ähnliche Weise:
Es ist bekannt, dass Nucleophile, wie H₂O und OH^• TH^+• am Schwefel angreifen, und dies ist in wässeriger Lösung sehr wahrscheinlich, was beispielsweise zu dem Sulfoxid führt:
Sowohl 1-THCOOH als auch 2-THCOOH erzeugen eine ECL-Emission, wenn sie in wässeriger Natriumphosphatpufferlösung in Gegenwart von TPrA als Coreaktant, wie in 11 und 12 für 2-THCOOH gezeigt ist, oxidiert werden. (Das Verhalten von 1-THCOOH ist ähnlich mit dem Unterschied, dass die Spitzenemissionsintensität 6 bis 7 mal weniger intensiv ist als diejenige von 2-THCOOH). Bei Abwesenheit von TPrA oder der Säure wird keine Emission beobachtet. Obgleich der anodische Strom durch die Oxidation der deprotonierten Säure beherrscht wird, wird die Elektrochemie durch das Zusammenfallen dieses Prozesses mit sowohl dem Beginn der breiten, irreversiblen Oxidationswelle für TPrA (2c) als auch der Hintergrundoxidation von Wasser (1) kompliziert. Die beiden unterschiedlichen Emissionsspitzen als Funktion des Potentials in 11 legen Beiträge von zwei unterschiedlichen Elektrodenprozessen nahe. Es wird angenommen, dass die erste Spitze auf Reaktionen zurückzuführen ist, die mit der homogenen Oxidation von TprA gemäß der vorstehend angegebenen Gleichung (6a) (wobei 2-TH⁺COO^– Ru(bpy)₃ ³⁺ ersetzt) zurückzuführen ist und sich die zweite Spitze aus der direkten heterogenen Oxidation von TPrA an der Elektrode gemäß der Gleichung (6) ergibt. Diese Hypothese wird von den Ergebnissen von 12 unterstützt, die bei einer niedrigeren 2-THCOOH-Konzentration aufgezeichnet wurden, wo die Reaktion zweiter Ordnung von (6a) langsamer und weniger wichtig ist. Unter den Bedingungen von 12 erscheint die Emission von dem homogenen Prozess als kleine Schulter in der dominanten Emission, die von der heterogenen Oxidation von TPrA bewirkt wird. Die negative Verschiebung der zweiten Emissionsspitze kann auf der Grundlage einer größeren Konzentration von TPrA an der Elektrode bei negativeren Potentialen aufgrund der Inaktivität der TPrA-verarmenden, homogenen Oxidationsreaktion (6a) rational erklärt werden.
Wenn 2-THCOOH in Gegenwart von TPrA oxidiert wird, verdoppelt sich der anodische Strom fast im Vergleich zu demjenigen bei der gleichen 2-THCOOH-Konzentration in Abwesenheit von TPrA, (vergleiche 10a und 13). Dies stimmt mit der katalytischen Regenerierung von THCOOH (oder einem Produkt) über seine homogene Reduktion durch TPrA oder ein Zwischenprodukt (gemäß der Analogie zu (6a) oder (8) bis (9) für dieses System) überein und unterstützt die Hypothese, dass die erste Emissionsspitze in 11 auf die Erzeugung der Coreaktantenvorläufer über die homogene Oxidation von TPrA zurückzuführen ist.
In 14 erhöht sich die Spitzenemissionsintensität für 1 × 10^–5 M 2-THCOOH mit dem pH-Wert. Der Unterschied zwischen dem hier beobachteten Trend und demjenigen für das Ru(bpy)₃ ²⁺/TPrA-System, das eine Spitze in der Nähe von pH 7,5 zeigt, legt nahe, dass H⁺ nicht nur an den Zersetzungsreaktionen von TPrA beteiligt ist, sondern auch an den Reaktionen, die mit der Emission eines Produkts von 2-THCOOH verbunden sind. Die Spitzenemissionsintensität von 2-THCOOH variiert linear mit der Konzentration über 4 Größenordnungen bei einem pH-Wert von 7,5, wie in 15 gezeigt ist.
Die Fluoreszenz- und ECL-Spektren von 1-THCOOH und 2-THCOOH sind in 16 gezeigt. Die Fluoreszenzmaxima für 1-THCOOH und 2-THCOOH liegen bei 505 nm bzw. 480 nm. Zum Vergleich liegt das Emissionsmaximum für die Thianthrenfluoreszenz in MeCN bei 434 nm. Die ECL-Maxima für jede Säure liegen bei 570 nm, was eine starke Verschiebung in Richtung auf die längere Wellenlänge im Vergleich zu den jeweiligen Fluoreszenzspektren zeigt. Unter diesen optimierten Bedingungen ist die 2-THCOOH-Emission gerade noch für ein an das Dunkel gewöhnte Auge sichtbar.
Die Unterschiede zwischen den Fluoreszenz- und den ECL-Spektren für die THCOOH-Säuren legen nahe, dass wenigstens ein Teil der ECL-Emission von einer anderen Spezies als einem erregten Zustand der intakten Säure stammt. Eine Möglichkeit ist, dass die Säure bei Oxidation decarboxyliert, jedoch ist dies aus mehreren Gründen unwahrscheinlich: 1) falls eine Decarboxylierung auftritt, würde man erwarten, dass die Emission entweder für TH oder THCOOH charakteristisch ist, was nicht der Fall ist, 2) falls TH über eine Decarboxylierung erzeugt würde, würde es aufgrund seiner geringen Löslichkeit in wässerigen Lösungen an der Elektrode ausfallen, und dafür ist kein Beweis zu beobachten, 3) unter nichtwässerigen Bedingungen (trocknes MeCN) ist die oxidierte Säure auf der voltammometrischen Zeitskala stabil, wie durch die in 10c gezeigte Rücklaufwelle bewiesen ist. Die Erwägung elektrochemischer Untersuchungen, die den nucleophilen Angriff durch Wasser an der Schwefelposition für das TH-Kationradikal zeigen, legt nahe, dass ähnliche Reaktionen mit THCOOH-Säuren auftreten können. Es gibt auch eine Parallele zwischen den THCOOH-ECL-Ergebnissen und denjenigen, die bei Anthracen beobachtet werden. Im Fall von Anthracen wird eine ähnliche nach rot verschobene ECL-Emission bei der Erzeugung des Radikalkations beobachtet und wird der Emission von Anthranol (der Enolform des Ketons Anthron) zugeschrieben, das aus der Reaktion des Anthracenradikalkations mit Spuren von Wasser in dem MeCN-Lösungsmittel gebildet wird. Wahrscheinlich tritt die von 1- und 2-THCOOH beobachtete Emission aus ähnlichen Zwischenprodukten auf, die durch die Reaktion mit der oxidierten Säure mit Wasser gebildet werden. Das ECL-Spektrum für beide Säuren weist die gleiche Spitzenwellenlänge auf, während die Spitzen für die Fluoreszenzspektren unterschiedlich sind. Die Energie des emittierenden Zwischenprodukts ist durch das zugegebene Nucleophil stärker beeinflusst als durch die Position der Carbonsäurefunktion.
Beispiel 5
Cyclische voltammometrische Kurven für die Oxidation von Chlorpromazin (17) zeigen, dass die Oxidation in zwei getrennten Prozessen verläuft. Der erste ist quasireversibel und der zweite ist irreversibel. Die anomal scharfe Spitze an der ersten anodischen Welle, die in 17a bis 17b zu sehen ist, wurde auf die Adsorption von CPZ zurückgeführt. In gleicher Weise ist die Schulter an der kathodischen Rücklaufwelle in 17b ein Adsorptionsprozess. Wenn die Abtastung nach der ersten Oxidation, wie in 17b gezeigt, umgekehrt wird, legt die erhöhte Reversibilität (im Vergleich zu 17a) nahe, dass ein Produkt von der zweiten Oxidation mit der oxidierten Form von CPZ reagiert.
Das Oxidieren von CPZ bei einem höheren pH-Wert in Natriumphosphatpufferlösung ändert die Elektrochemie, wie in 18a gezeigt ist. Die erste Oxidation ist jetzt irreversibel und die Elektrochemie ist im allgemeinen komplexer als diejenige von 17, wie durch eine Schulter an der ersten Oxidationswelle, dem erhöhten Strom und einer Verbreiterung der zweiten Welle bewiesen wird. Wie bei der TPrA-Oxidation wird die Analyse des zweiten Oxidationsprozesses durch ihr Zusammenfallen mit der Hintergrundoxidation von Wasser kompliziert. Jedoch wird (in Abwesenheit eines zugegebenen Coreaktanten), wie in 18 gezeigt, die ECL-Emission unerwarteterweise erhalten. Bestätigungen des ECL-Spektrums für diesen Prozess im Vergleich zu dem Photolumineszenzspektrum wurden durch niedrige Emissionsintensitäten und Elektrodenverschmutzung behindert. Des weiteren waren Versuche, die Wellenlänge der Spitzenemission unter Verwendung von Interferenzfiltern für spezifische, enge Wellenlängenbereiche zwischen 450 und 600 nm zu bestimmen, nicht erfolgreich. Unter den Bedingungen von 17 (mit oder ohne die Zugabe von 50 mM TPrA) wird keine Emission beobachtet, wobei die Elektrochemie weniger komplex ist und keine Elektrodenverschmutzung auftritt.
Frühere mechanische Arbeiten von McCreery haben gezeigt, dass monooxidierte Formen von CPZ zu Sulfoxiden in wässeriger Lösung über den nucleophilen Angriff durch Wasser an einer Schwefelposition umgewandelt werden. So ist die erste Oxidation von CPZ mit dem tricyclischen Ringsystem verbunden und die zweite Oxidation umfasst das tertiäre Amin an der Seitenkette (analog zur Oxidation von THCOOH und TPrA). Es ist wahrscheinlich, dass das Amin dann Reaktionen unterzogen wird, die ähnlich denjenigen sind, die bei TPrA in den vorste hend angegebenen Gleichungen (6) bis (7) zu beobachten sind, um ein starkes Reduktionsmittel zu erzeugen, das mit dem Ringsystem reagiert, um einen lumineszenten, erregten Zustand zu erzeugen. Dieser "Selbstannihilations"-ECL-Prozess verläuft wahrscheinlich wie in den Gleichungen (5) bis (8) gezeigt ist, wo der tricyclische Teil von CPZ Ru(bpy)₃ ²⁺ ersetzt und kovalent an den Coreaktanten X (dem tertiären Amin an der Seitenkette) gebunden ist. Die Selbstannihilation könnte über einen intramolekularen oder einen intermolekularen Prozess verlaufen. Die CPZ-Emission stammt von einem Produkt, das durch die Reaktion von oxidiertem CPZ mit Wasser gebildet wird. Für 0,11 mM CPZ in einem Natriumphosphatpuffer mit einem pH von 7,5 wurde eine Spitzenemissionsintensität von 80 c/s oberhalb des Hintergrunds aufgezeichnet. Für 1,1 mM CPZ betrug die Spitzenintensität 850 c/s.
Beispiel 6
Um die Varianzen in den ECL-Nachweismessungen einer Probe auszuschalten, wird eine interne Standardtechnik verwendet. Bei dem internen Standardverfahren wird eine festgelegte Menge einer Referenz der Probe zugegeben. Bei Erregung werden die ECL-Intensität der Probe und der Referenz gleichzeitig gemessen. Das Verhältnis der ECL-Intensitäten bleibt von normalen Abänderungen der Messtechnik unbeeinflusst. Der interne Standard ist zur Berichtigung bezüglich Matrixwirkungen, Temperaturschwankungen, Varianzen der Erregungsspannung usw. brauchbar. Der interne Standard ist nur gültig, wenn die Matrix das Bezugssignal und die Probe genau gleich beeinflusst. Die Verwendung dieses Bewertungsverfahrens ist auf Instrumentenkonstruktionen und ECL-Verfahren beschränkt, die zwei Luminophor-Emissionen bestimmen können. Die Auswahl eines geeigneten Bezugs-Luminophors ist für die Leistung der Technik kritisch. Die Wahl des Bezugs-Luminophors hängt von den relativen Positionen der Emissionsspektren der Probe und der Vergleichsprobe ab. Bei dem vorgelegten Beispiel ist DPAS ein idealer Kandidat für ein Bezugs-Luminophor, da seine Emission gut von dem Proben-Luminophor Ru(bpy)₃ ²⁺ getrennt ist. 19 zeigt die Emissionsspektren. Die auf 430 nm Wellenlänge konzentrierte Emission von DPAS ist gut von der auf 620 nm Wellenlänge konzentrierten Emission von Ru(bpy)₃ ²⁺ getrennt.
Die beiden ECL-Emissionen können nach der Wellenlänge durch die Verwendung von optischen Filtern getrennt werden. Die optische Anordnung ist in 20 gezeigt. Ein Rad ist aus den zwei optischen Filtern konstruiert, die zwischen der elektrochemischen Zelle und PMT angeordnet sind. Das Rad weist einen langen Passfilter für die Beobachtung der Ru(bpy)₃ ²⁺-Emission und einen kurzen Passfilter für die Beobachtung der DPAS-Emission auf. Die Drehung des optischen Rads ist mit der Erregungsspannung synchronisiert. Während einer Erregung werden zwei ECL-Emissionen beobachtet. Die Erregungsspannungsrampe ist in zwei Perioden unterteilt; 21a bis 21c. Während der ersten Periode ist das optische Rad mit dem langen Passfilter oberhalb der Elektrode angeordnet. Die Emission von der Probe wird gemessen. Die Emission von der Referenz wird filtriert. Während der zweiten Periode wird das optische Rad mit dem kurzen Passfilter oberhalb der Elektrode angeordnet. Die Emission aus der Vergleichsprobe wird gemessen und die Probe wird filtriert. Das Probensignal wird durch Integrieren des Bereichs für die ECL-Emission unter der ersten Periode erhalten. Die Bezugsprobe wird von dem Bereich für die zweite Periode erhalten. Die interne Standardisierung erfolgt dadurch, dass das Probensignal mit dem Bezugssignal in ein Verhältnis gesetzt wird. Jegliche Varianzen, die nicht mit den Änderungen der Konzentration zusammenhängen, werden sowohl in der Probe als auch der Referenz beobachtet. Das Verhältnissignal wird dann verwendet, um die Konzentration der Probe zu messen.
Beispiel 7
Die ECL-Nachweismethodik ist für die Quantifizierung von DNA-Hybridisierungsassays geeignet. Die ECL-Intensität ist zur Konzentration des bestimmten DNA-Analyten, der von Interesse ist, proportional. Die Varianzen der Verstärkung der DNA vor dem ECL-Nachweis können auch unter Verwendung eines internen Standards eliminiert werden.

Claims

Verfahren zum Nachweis eines Analyten, umfassend: (a) das In-Kontakt-Bringen einer Probe mit einem Biomolekül, angeheftet an eine organische Markerverbindung, die in wässriger Lösung löslich ist, worin die Markerverbindung Elektrochemilumineszenz erzeugen kann, (b) Anlegen eines Oxidationspotentials unter Anwendung einer Elektrode an die Markerverbindung in Anwesenheit eines Amin-Coreaktanden unter wässrigen Bedingungen, und (c) Messen emittierter Elektrochemilumineszenz, worin das Verfahren ein Immunassay ist und worin das Biomolekül ein Antikörper oder ein Antigen darstellt oder worin das Verfahren ein DNS-Hybridisierungstest ist und das Biomolekül eine DNS-Sonde darstellt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Markerverbindung eine substituierte polyzyklische organische Markerverbindung ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 und 2, worin der Coreaktand ein tertiäres Amin ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der Coreaktand ein Tripropylamin (TPA) ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin der Marker den Coreaktanden umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 5, worin der Marker Chlorpromazin ist.
Verfahren zur Erzeugung von Elektrochemilumineszenz, umfassend das Anlegen eines Oxidationspotentials unter Anwendung einer Elektrode an einen löslichen organischen Marker, umfassend ein tertiäres Amin, dadurch Erzeugen der Elektrochemilumineszenz unter wässrigen Bedingungen, worin der lösliche organische Marker an ein Biomolekül angeheftet ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Antikörper, einem Antigen und einer DNS-Sonde.
Verfahren gemäß Anspruch 7, worin das Verfahren in Anwesenheit eines internen Coreaktanden durchgeführt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7 oder 8, zusätzlich umfassend das Messen der erzeugten Elektrochemilumineszenz.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9, worin das Biomolekül ein Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 10, worin das Biomolekül spezifisch an einen Analyten gebunden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die organische Markerverbindung ein substituiertes Diphenylanthracen oder ein Thianthren ist.
Elektrochemilumineszente Markerzusammensetzung, umfassend: – eine wasserlösliche organische Markerverbindung, die Elektrochemilumineszenz erzeugen kann und – einen Amin-Coreaktanden, worin die Verbindung an ein Biomolekül angeheftet ist, ausgewählt unter einem Antikörper, einem Antigen und einer DNS-Sonde.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 13, worin die Verbindung eine substituierte polyzyklische organische Verbindung ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 14, worin die Verbindung eine aromatische polyzyklische Verbindung ist, die eine Ringkohlenstoffsubstitution durch mindestens ein Heteroatom aufweist, ausgewählt unter N und/oder S.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 13 bis 15, worin der Amin-Coreaktand ein tertiäres Amin ist.
Verwendung einer elektrochemilumineszenten wasserlöslichen organischen Verbindung, gebunden an ein Biomolekül, ausgewählt unter einem Antigen, einem Antikörper und einer DNS-Sonde, in Kombination mit einem Amin-Coreaktanden bei der Herstellung eines elektrochemilumineszenten Markers für die Detektion eines Analyten.
Verwendung gemäß Anspruch 17, worin der organische Marker eine substituierte polyzyklische organische Verbindung ist.
Verwendung gemäß Anspruch 18, worin die Verbindung eine aromatische polyzyklische Verbindung ist, die eine Ringkohlenstoffsubstitution durch mindestens ein Heteroatom aufweist, ausgewählt unter N und/oder S.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 17 bis 19, worin der Amin-Coreaktand ein tertiäres Amin ist.