ES2227580T3 - Marcadores de quimioluminiscencia electrogenerada para labores de analisis y/o referencia. - Google Patents
Marcadores de quimioluminiscencia electrogenerada para labores de analisis y/o referencia.Info
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Abstract
ANALISIS DE BIOMOLECULAS QUE EMPLEA OXIDACION ANODICA DE 9, 10-DIFENILANTRACEN-2-SULFONATO DE SODIO ACUOSO (DPAS) Y ACIDO 1- Y 2-TIANTRENOCARBOXILICO (1-THCOOH Y 2-THCOOH) EN PRESENCIA DE TRIN-PROPILAMINA (TPRA) COMO CORREACTIVO EN SOLUCION ACUOSA QUE PRODUCE QUIMILUMINISCENCIA ELECTROGENERADA (ECL). ADEMAS, LA REDUCCION CATODICA DE DPAS EN PRESENCIA DE PEROXIDISULFATO (S2O8-2) COMO CORREACTIVO PRODUCE TAMBIEN ECL EN UNA SOLUCION ACUOSA DE ACETONITRILO (MECN) (1:1 EN VOLUMEN). LA OXIDACION DE CLOROPROMAZINA (CPZ) PRODUCE UNA EMISION ECL EN AUSENCIA DE UN CORREACTIVO AÑADIDO SIGUIENDO UN MECANISMO "AUTOANIQUILACION" SIN PRECEDENTES.
Description
Marcadores de quimioluminiscencia electrogerenada
para labores de análisis y/o referencia.
La presente invención se refiere a procedimientos
de quimioluminiscencia electrogenerada y composiciones de
hidrocarbonos modificados y compuestos heterocíclicos aromáticos que
aparecen en una solución acuosas con correactivos como
tri-n-propilamina (TPrA) y
peroxidisulfato (S_{2}O_{8}^{2-}) y en particular, los que
proporcionan el análisis simultáneo y procedimientos de referencia
interna. Más específicamente, la presente invención proporciona
compuestos luminescentes orgánicos policíclicos sustituidos que
presentan unos anillos de carbono opcionalmente reemplazados al
menos con un heteroátomo seleccionado de entre N y S, como
difenilantraceno, triantreno y promazina sustituidos, para
aplicaciones de quimioluminiscencia electrogenerada.
Los marcadores luminescentes se han utilizado
para marcar varios bioanalitos, como enzimas, anticuerpos,
antígenos, péptidos, nucleótidos, sacáridos o células
cumplimentadoras del analito de interés, en inmunoensayos,
procedimientos con sondas de ADN y procedimientos de fluorescencia y
de separación. Resultan particularmente interesantes los marcadores
que pueden convertirse en luminescentes mediante procedimientos de
reacción electroquímica. Los marcadores que se convierten en
luminescentes como consecuencia de la excitación electroquímica
resultan útiles por sus propiedades de sensibilidad y ausencia de
peligrosidad.
Una técnica analítica que explota los beneficios
de esos marcadores es la quimioluminiscencia electrogenerada (ECL).
La ECL surge de una reacción energética de transferencia de
electrones entre especies redox electrogeneradas representadas por
A^{-} y D+, habitualmente iones radicales, para dar lugar a un
estado excitado (A^{\bullet} o D^{\bullet}) que emite en la
región visible:
(1)A + e^{-}
\rightarrow A^{-} \
E_{A}
(2)D - e^{-}
\rightarrow D^{+} \
E_{D}
(3)A^{-} +
D^{+} \rightarrow A+D^{\bullet}(o \
A+D)
\hskip6,7cmD^{\bullet}\rightarrow D - - hu
\hskip6,6cm(4)
Faulkner y Bard en Electroanalytical
Chemistry, Vol. 10, p. 1, 1977, proporcionan varios ejemplos de
sistemas no acuosos de este tipo.
A.W. Knight y G.M. Greenway en Analyst,
1994, 119, 879, comentan los precursores de la ECL que se pueden
generar en una solución acuosa incluso con un intervalo de potencial
limitado impuesto por la oxidación y reducción de agua. La ECL se
puede conseguir mediante la oxidación simultánea de tris
(2,2'-bipiridina) rutenio (II)
(Ru(bpy)_{3}^{2+})
y un correactivo (XY^{z}) capaz de generar un reductor adecuado al oxidarse, mediante un mecanismo de oxidación-reducción como:
y un correactivo (XY^{z}) capaz de generar un reductor adecuado al oxidarse, mediante un mecanismo de oxidación-reducción como:
(5)Ru(bpy)_{3}{}^{2+}
- e^{-} \rightarrow
Ru(bpy)_{3}{}^{3+}
(6)XY^{Z} . \
e^{-} \rightarrow
XY^{Z+1}
(6a)Ru(bpy)_{3}{}^{3+}
+ XY^{Z} \rightarrow Ru(bpy)_{3}{}^{2+} +
XY^{Z+1}
(7)XY^{Z+1}
\rightarrow X^{X} + Y^{Y} (x+y =
z+1)
(8)Ru(bpy)_{3}{}^{3+}
+ X^{X} \rightarrow Ru(bpy)_{3}{}^{2+\bullet} +
X^{X+1}
(9)Ru(bpy)_{3}{}^{2+\bullet}
Ru(bpy)_{3}{}^{2+} +
h\upsilon
Ru(bpy)_{3}^{2+} es un
precursor típico (D) de dichas reacciones y se ha utilizado en las
reacciones de quimioluminiscencia (CL) con aminas y también en
investigaciones sobre ECL utilizando varios correactivos diferentes,
como oxalato (donde XY^{Z} es C_{2}O_{4}^{2-} y X^{X} es
CO_{2}^{+\bullet}) y aminas alifáticas como
tri-n-propilamina (TPrA; donde
XY^{Z} es Pr_{3}N y X^{Z} es el radical que se obtiene por la
desprotonación de Pr_{3}N^{+}). En estas reacciones de ECL el
correactivo se puede oxidar bien en el electrodo mediante la
ecuación (6) o en solución mediante el emisor vía la ecuación (6a).
Como alternativa a la reacción reflejada en la ecuación (8), el
estado excitado puede generarse también mediante la secuencia de
ecuaciones (10) y (11), que se muestran a continuación, tal como se
ha comentado anteriormente para oxalato y TPrA.
(10)Ru(bpy)_{3}{}^{2+}
+ X^{X} \rightarrow Ru(bpy)_{3}{}^{+} +
X^{X+1}
(11)RU(bpy)_{3}{}^{+}
+ + \ Ru(bpy)_{3}{}^{3+} -
Ru(bpy)_{3}{}^{2+\bullet} +
Ru(bpy)_{3}{}^{2+}
En el caso del correactivo oxalato, la reacción
que se expone en la ecuación (7) implica la escisión del enlace
carbono-carbono mientras que se cree que el
correactivo TPrA en este paso implica la pérdida de un protón del
carbono \alpha. Estas reacciones de ECL se han utilizado para
determinar tanto Ru(bpy)_{3}^{2+} como
oxalato.
Para complementar estos ejemplos de
oxidación-reducción, peroxidisulfato y
Ru(bpy)_{3}^{2+} sufren una inversión análoga de
la reacción (un mecanismo de reducción-oxidación,
ecuaciones (12)-(14) seguidas por (9)) cuando se reducen los
reactivos iniciales, en lugar de oxidarse, en soluciones de
acetonitrilo (MeCN)-agua (relación de volumen 1:1).
En este caso, la reducción de S_{2}O_{8}^{2-} da lugar a la
formación del agente fuertemente oxidante SO_{4}^{-\bullet}:
(12)Ru(bpy)_{3}{}^{2+}
+ e^{-} \rightarrow
Ru(bpy)_{3}{}^{+}
(13)S_{2}O_{8}{}^{2-} + e^{-}
\rightarrow SO_{4}{}^{-\bullet} +
SO_{4}{}^{2-}
(13a)Ru(bpy)_{3}{}^{+}
+ S_{2}O_{8}{}^{2-} \rightarrow Ru(bpy)_{3}{}^{2+}
+SO_{4}{}^{-2} +
SO_{4}{}^{-2-}
(14)Ru(bpy)_{3}{}^{+}
+ SO_{4}{}^{-\bullet}\rightarrow
Ru(bpy)_{3}{}^{2+\bullet} +
SO_{4}{}^{2-}
Por analogía con las ecuaciones (10) y (11) para
oxalato y TPrA, una alternativa a la ecuación (14) para generar el
estado excitado con peroxidisulfato es:
(15)Ru(bpy)_{3}{}^{2+}
+ SO_{4}{}^{-\bullet} \rightarrow
Ru(bpy)_{3}{}^{2\bullet} +
SO_{4}{}^{2-}
Seguida por la ecuación (11) anterior.
La sensibilidad y selectividad de estos análisis
de correactivos ha dado lugar a la reciente aplicación comercial del
sistema Ru(bpy)_{3}^{2+}/TPrA. Por ejemplo, los
marcadores de quimioluminiscencia electrogenerada que contienen
rutenio y osmio se han usado en procedimientos para detectar y
cuantificar analitos de interés en medios líquidos, patentes US nº
5.310.687; nº 5.238.808; y nº 5.221.605. Además, se ha descrito la
aplicación de mediciones de quimioluminiscencia electrogeneradas
(ECL) para la detección de una fase de solución de ADN intercalado
con marcadores que contienen rutenio (Carter, M. T. et al.
(1990) Bioconjugate Chem 2:257-263). Aunque
dichas aplicaciones constituyen una técnica de análisis aceptable, a
menudo es necesario proporcionar un sistema que permita el análisis
simultáneo y procedimientos de referencia interna. La presente
invención proporciona sistemas de quimioluminiscenia electrogenerada
que pueden usarse en lugar de los sistemas existentes, o junto a
ellos.
Becker et al. (J. Electroanal.
Chem. 167 (1984) págs. 127-140) describen un
estudio de la ECL de sistemas hidrocarbono aromático/peroxidisulfato
en soluciones de acetonitrilo-benceno.
La presente invención se refiere a marcadores de
quimioluminiscencia electrogenerada en los cuales: 1) el emisor es
soluble en una solución acuosa; 2) la longitud de onda de la emisión
es distinta a la de Ru(bpy)_{3}^{2+}; 3) la
electroquímica oxidativa o reductora continúa dentro del intervalo
potencial relativamente estrecho impuesto por la oxidación o
reducción del agua; y 4) el producto intermedio oxidado o reducido
reacciona con el producto intermedio correactivo electrogenerado,
permitiendo la formación del estado excitado.
Un objetivo de la presente invención es
proporcionar compuestos luminescentes orgánicos policíclicos
sustituidos, como, por ejemplo, compuestos policíclicos aromáticos,
que pueden presentar sustituciones en el anillo de carbono
seleccionado de entre al menos un heteroátomo N ó S que tiene estas
cuatro (4) propiedades. Difenilantraceno, triantreno y promazina
sustituidos son ejemplos de dichos sistemas de reactivos para
aplicaciones de quimioluminiscencia electrogeneradas.
Otro objetivo de la presente invención es
proporcionar compuestos luminescentes orgánicos policíclicos
sustituidos, como, por ejemplo, aromáticos policíclico, que pueden
tener sustituciones en el anillo de carbono, que ofrecen un marcador
complementario a Ru(bpy)_{3}^{2+} en aplicaciones
bioanalíticas.
Es un objetivo de la presente invención
proporcionar composiciones de marcador-correactivo
que permitan el análisis simultáneo.
Es otro objetivo más de la presente invención
proporcionar un procedimiento de detección de varios analitos (1)
proporcionando al menos una primera biomolécula con un marcador
luminiscente que tiene una longitud de onda de emisión distinta de
la de Ru(bpy)_{3}^{2+\bullet}; (2) proporcionando
un segundo analito biomolecular con un marcador que contiene rutenio
u osmio; (3) añadiendo al menos un correactivo; y (4) exponiendo los
analitos biomoleculares y correactivos marcados a la reacción
electroquímica o a la excitación y medir la luminiscencia resultante
para detectar los distintos analitos biomoleculares presentes.
Otro objetivo adicional de la presente invención
es proporcionar una composición que implica la oxidación anódica de
9,10-difenilantraceno-2-sulfonato
sódico acuoso (DPAS) en presencia de
tri-n-propilamina y la reducción
catódica de DPAS en presencia de peroxidisulfato
(S_{2}O_{8}^{2-}) como un correactivo en una solución de
acetonitrilo (MeCN)-agua (1:1 en volumen) para el
análisis ECL de biomoléculas (es decir, inmunoensayos o sondas de
ADN). Cuando el sodio
9,10-difenilantraceno-2-sulfonato
se oxida en presencia de TPrA o se reduce con S_{2}O_{8}^{2-},
se produce una emisión de ECL azul que es característica de la
fluorescencia del DPAS. La separación espectral entre esta emisión y
la de Ru(bpy)_{3}^{2+} hace que el DPAS sea un
marcador complementario de Ru(bpy)_{3}^{2+} en
aplicaciones bioanalíticas.
Otro objetivo adicional consiste en proporcionar
los ácidos 1- y 2-triantrenocarboxílico
(1-THCOOH y 2-THCOOH) en presencia
de tri-n- propilamina (TPrA) como correactivo en una
solución acuosa para la quimioluminiscencia electrogenerada (ECL)
para análisis mediante ECL de biomoléculas (es decir, inmunoensayos
o sondas de ADN).
Otro objetivo adicional consiste en proporcionar
una reacción de ECL para oxidar clorpromazina sin un correactivo
añadido (TPrA) para producir una emisión de ECL mediante una
reacción de autoaniquilación que no tiene precedentes.
Estos y otros objetivos, ventajas y
características más destacados de la presente invención serán más
evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, ejemplos
no limitativos y dibujos anexos.
En la Figura 1 se muestra el voltamograma cíclico
de la oxidación de fondo del agua en presencia de DPAS 1 x 10^{-5}
M en tampón fosfato sódico pH 7,5 en un electrodo de gasa de Pt de 6
x 9 mm (malla 52). Velocidad de barrido, 100 mV/s.
En la Figura 2a y 2c se muestra la emisión (a)
durante la voltametría cíclica (b) de DPAS 1 x 10^{-5} M y TPrA
0,15 M en tampón fosfato sódico pH 7,5 en un electrodo de gasa de Pt
de 6 x 9 mm Pt (malla 52). Velocidad de barrido, 100 mV/s. (c)
Voltamograma cíclico de TPrA 0,05 M en un tampón fosfato sódico pH
7,5 en un electrodo de Pt de 1,5 mm de diámetro. Velocidad de
barrido, 200 mV/s.
En la Figura 3 se muestra el voltamograma cíclico
de DPAS 0,92 mM en MeCN en un electrodo de Pt de 1,5 mm de diámetro.
Electrolito de soporte, TBABF_{4} 0,1 M; velocidad de barrido,
200mV/s.
En la Figura 4 se muestra un trazado
"log-log" de la intensidad de la ECL de DPAS
frente a la concentración de soluciones que contienen TPrA 0,15 M en
tampón fosfato sódico pH 7,5.
En la Figura 5 se muestra la fluorescencia y
espectro de la ECL de una solución de DPAS 1 x 10^{-5} M y TPrA
0,15 M en tampón fosfato sódico pH 7,5. La emisión de ECL se generó
por la provocación repetitiva de impulsos en un electrodo de gasa de
Pt de 6 x 9 mm (malla 52) entre 0,0 V (frente al SCE, 8
s) y +1,2 V (2 s) hasta -1,4 V (2 s) y volviendo a 0,0 V. La luz se
generó con el impulso positivo en esta secuencia (el impulso
negativo se utilizó para limpiar el electrodo) y se integró durante
2 minutos para producir el espectro. Ambas intensidades de los
máximos se miden a 430 nm.
En la Figura 6 se muestra el voltamograma cíclico
de (NH_{4})_{2}S_{2}O_{8} 11 mM en una solución de
MeCN-agua (relación de volumen, 1:1) en un electro
de Pt de 1,5 mm de diámetro. Electrolito de soporte, TEAP 0,2 M;
velocidad de barrido, 100 mV/s.
En la Figura 7 se muestra el voltamograma cíclico
de DPAS 0,93 mM en MeCN en un electrodo de Pt de 1,5 mm de diámetro.
Electrolito de soporte, TBABF_{4} 0,1 M; velocidad de barrido, 200
mV/s.
En la Figura 8 se muestra la emisión de la ECL
para la reducción de DPAS 1,1 mM y
(NH_{4})_{2}S_{2}O_{8} 25 mM en una solución de
MeCN-agua (relación de volumen, 1:1) en un electrodo
de Pt de 2,0 mm de diámetro. Electrolito de soporte, TEAP 0,2 M;
velocidad de barrido, 100 mV/s.
En la Figura 9 se muestra la fluorescencia y
espectro de la ECL de la misma solución que en la Figura 8. La
emisión de la ECL se generó mediante impulsos en un electrodo de Pt
de 2,0 mm de diámetro a -2,2 V (frente al SCE) e integrando la
emisión durante 5 s. Ambas intensidades máximas se miden a 430
nm.
En las Figuras 10a y 10c se muestran (a) el
voltamograma cíclico de 2-THCOOH 2,0 mM en tampón
fosfato sódico a pH 8,5 con un electrodo de Pt de 1,5 mm de diámetro
y una velocidad de barrido de 200 mV/s; (b) el voltamograma cíclico
2-THCOOH 1,4 mM en las mismas condiciones de (a)
excepto que el barrido se hizo con un ciclo desde + 0,15 V en lugar
de -0,35 V; y (c) el voltamograma cíclico de
2-THCOOH 2,0 mM con un electrodo de Pt de 1,5 mm de
diámetro en MeCN, TBABF_{4} 0,1 M y una velocidad de barrido de
200 mV/s. Los barridos acuosos (a) y (b) se hacen con respecto al
SCE. El barrido no acuoso (c) se hace con respecto a
ferro-
ceno.
ceno.
En las Figuras 11a y 11b se muestran (a) un
voltamograma cíclico (parte inferior) y (b) la emisión simultánea de
2-THCOOH 5,2 mM y TPrA 0,15 M en tampón fosfato
sódico a pH 7,5 y un electrodo de Pt de 6 mm de diámetro con una
velocidad de barrido de 100 mV/s.
En las Figuras 12a y 12b se muestran (a) un
voltamograma cíclico y (b) la emisión simultánea de
2-THCOOH 0,26 mM y TPrA 0,15 M en las mismas
condiciones que en la Figura 11.
En la Figura 13 se muestra un voltamograma
cíclico de 2-THCOOH 2,0 mM en presencia de TPrA 0,05
M. Las demás condiciones son las mismas que en la Figura 10a.
En la Figura 14 se muestra la intensidad máxima
de la ECL frente al pH de 2-THCOOH 1 x 10^{-5} M y
TPrA 0,15 M en tampón fosfato sódico.
En la Figura 15 se muestra un trazado
"log-log" de la intensidad máxima de la ECL
frente a la concentración de 2-THCOOH en tampón
fosfato sódico de pH 7,5 que contiene TPrA 0,15 M.
En las Figuras 16a y 16b se muestran la
fluorescencia y espectro de la ECL
1-THCOOH 9,1 nM (a) y 2-THCOOH 20 mM
(b) tomados en un tampón fosfato sódico de pH 8,5 que contiene TPrA
0,15 M. Las emisiones de la ECL se generaron con impulsos
alternativos en un electrodo de gasa de Pt de 6 x 9 mm (malla 52)
entre +1,4 V (0,5 s) y -0,5 V(2 s) frente al SCE y una
duración de 40 minutos para 1-THCOOH y 20 minutos
para 2-THCOOH con una solución agitada. La
intensidad de fluorescencia máxima se encuentra a 480 nm para
2-THCOOH y a 505 nm para 1-THCOOH.
Las intensidades máximas de la ECL se miden a 570 nm para ambos
isómeros. Las intensidades se han representado a escala con fines
comparativos. En concentraciones de THCOOH (20 mM) y tiempos de
adquisición iguales, la intensidad de las emisiones de
2-THCOOH son aproximadamente 6-7
veces las de 1-THCOOH.
En las Figuras 17a y 17b se muestran (a) el
voltamograma cíclico de CPZ 0,98 mM en HCl 0,01 M y NaCl 0,2 M con
un electrodo de HOPG de 6 mm de diámetro y una velocidad de barrido
de 50 mV/s y (b) el voltamograma cíclico para el mismo sistema y
condiciones que en (a) con un barrido inverso tras la primera
oxidación.
En las Figuras 18a y 18b se muestran (a) el
voltamograma cíclico y (b) la emisión simultánea de CPZ 1,0 mM
tomados con un electrodo HOPG de 6 mm de diámetro en tampón fosfato
sódico a pH 7,5 y una velocidad de barrido de 200 mV/s.
En la Figura 19 se muestra el espectro de emisión
de DPAS y Ru(bpy)_{3}^{2+}.
En la Figura 20 se muestra un dispositivo para
medir las dos emisiones de la ECL.
En las Figuras 21a y 21c se muestran el voltaje
de excitación y las pendientes de la intensidad.
Por tanto en un primer aspecto, la invención
proporciona un procedimiento de detección de un analito que
comprende:
- (a)
- poner en contacto una muestra con una biomolécula unida a un compuesto marcador orgánico que es soluble en una solución acuosa, en el que dicho compuesto marcador es capaz de generar electroquimioluminiscencia;
- (b)
- aplicar un potencial oxidante usando un electrodo a dicho compuesto marcador en presencia de un correactivo amina en condiciones acuosas; y
- (c)
- medir la electroquimioluminiscencia emitida, en el que dicho procedimiento es un inmunoensayo, y dicha biomolécula es un anticuerpo o un antígeno o en el que dicho procedimiento es un procedimiento de hibridación de ADN y dicha biomolécula es una sonda de ADN.
En otro aspecto de la invención se proporciona un
procedimiento destinado a generar electroquimioluminiscencia que
consiste en aplicar un potencial oxidante usando un electrodo a un
marcador orgánico soluble formado por una amina terciaria con lo que
se genera electroquimioluminiscencia en condiciones subacuosas, en
el que dicho marcador orgánico soluble está unido a una biomolécula
seleccionada de entre el grupo formado por un anticuerpo, un
antígeno y una sonda de ADN.
La invención proporciona además una composición
marcadora electroquimioluminescente que comprende:
un compuesto orgánico hidrosoluble; y
una amina correactivo, en la que dicho compuesto
está unido a una biomolécula seleccionada de entre un anticuerpo, un
antígeno y una sonda de ADN.
La invención proporciona asimismo el uso de un
compuesto marcador orgánico hidrosoluble electroquimioluminescente
unido a una biomolécula seleccionada de entre un antígeno, un
anticuerpo y una sonda de ADN, en combinación con un correactivo
amina, en la fabricación de un marcador electroquimioluminescente
para la detección de un analito.
En la presente invención, la composición de
quimioluminiscencia electrogenerada requiere que: 1) el emisor sea
soluble en una solución acuosa; 2) la longitud de onda de la emisión
sea distinta a la de Ru(bpy)_{3}^{2+\bullet}, 3)
la electroquímica oxidativa o reductora continúe dentro de un
intervalo potencial relativamente estrecho impuesto por la oxidación
y reducción del agua; y 4) el producto intermedio oxidado o reducido
reaccione con el producto intermedio correactivo electrogenerado,
permitiendo la formación del estado excitado. Al satisfacer estos
criterios, se permite el uso de las nuevas composiciones
independientemente de los sistemas
Ru(bpy)_{3}^{2+} existentes, o junto a ellos. Los
marcadores que se pueden usar con los marcadores rutenio son
compuestos luminescentes orgánicos policíclicos sustituidos, como,
por ejemplo, compuestos policíclicos aromáticos, que pueden tener
sustituciones en el anillo de carbono de al menos un heteroátomo, N
y/o S, sus isómeros y sus sales. Los policíclicos preferidos son,
entre otros, difenilantraceno, triantreno y promazina sustituidos y
se usan en aplicaciones de quimioluminiscencia electrogeneradas.
Un marcador preferido según la presente invención
es DPAS, que es un aceptor de energía en el estado excitado
procedente de cetonas simples en un
medio acuoso que presenta una eficiencia fluorescente alta y una
emisión de longitud de onda corta (emisión máxima, \phiF = 0,87 a
428 mm) comparado con Ru(bpy)_{3}^{2+} (\phiF =
aproximadamente a 0,05, emisión máxima a 0,05 a 620 nm). Por lo
tanto, el DPAS satisface los criterios anteriores y produce una
emisión azul de la ECL resultante de una reacción de
oxidación-reducción que incluye DPAS como el emisor
y TPrA como el correactivo en el medio acuoso. Además, la ECL de
DPAS en una reacción de reducción-oxidación usando
peroxidisulfato (S_{2}O_{8}^{2-}) como un correactivo en una
solución de MeCN-agua (relación de volumen, 1:1)
también satisface los criterios
mencionados.
Otra realización preferida implica dos derivados
del ácido carboxílico de triantreno (TH), a saber, los ácidos 1- y
2-triantrenocarboxílicos (1-THCOOH y
2-THCOOH) y sus isómeros.
Es conocido que el triantreno produce ECL
(intensidad máxima a 434 nm) en una reacción de aniquilación iónica
no acuosa según las ecuaciones (1)-(4) anteriores. La derivación de
TH a sus derivados del ácido carboxílico
consiguió la solubilidad necesaria
en una solución acuosa y estos derivados produjeron las emisiones de
la ECL en una reacción de oxidación-reducción con
TPrA como correactivo. No obstante, a diferencia del triantreno, que
tiene una emisión de ECL azul, el espectro de ECL de estos
compuestos está desviado significativamente al rojo, con respecto a
su espectro de
fluorescencia.
Otra realización preferida según la presente
invención implica la ECL acuosa con clorpromazina (CPZ), que está
relacionada estructuralmente con TH. Aunque se ha estudiado la
fluorescencia, quimioluminiscencia y electroquímica de CPZ, no así
su uso en aplicaciones de ECL. McCreery estudió la oxidación de CPZ
y varias reacciones del radical catión que se describen en
(Cheng, H. Y; Sackett, PH.; McCreery, R.L. J. Am. Chem. Soc.
1978, 100, 962), y más recientemente amplió el trabajo para tener en
cuenta la reacción del catión clorpromazina con dopamina que se
describe en (Deputy, A.; Wu, H.P; McCreery, R.L. J. Phys. Chem.
1990, 94, 3620) y (Deputy, A.L.; McCreery, R.L. J.
Electroanal. Chem. 1989, 285, 1), metoxipromazina (Deputy,
A.L.; McCreery, R.L. J. Electroanal. Chem. 1989, 285, 1) e
hidroquinona (Deputy, A.L,; McCreery, R.L. J. Electroanal. Che.
1989, 285, 1). Además, se ha investigado la fluorescencia
descrita en (Mellinger, T.J; Keeler, C.E. Anal Chem. 1964,
36; 1840; Mellinger, T.J; Keeler, C.E. Anal. Chem. 1963, 35,
554; Ragland, JB.; Kinross-Wright, V.J. Anal.
Chem. 1964, 36, 1356; y Udenfriend, S.; Duggan, D.E.; Vasta,
B.M.; Brodie, B.B. J. Pharmacol. Expt Thera. 1957 120, 26)
incluidos las aplicaciones
analíticas (Takahashi, D.M. J. Pharm. Sci. 1980, 69, 184.) y
(Clark, B.J.; Fell, A.F.; Milne, K. T.; Pattie, D.M.G.; Williams,
M.H. Anal. Chim. Acta. 1985, 170,35.) y la quimioluminiscencia
que se describe en (Nakano, M.; Sugioka, K.; Hakano, H.; Takyu,
C.; Inaba, H. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1985, 130, 952) y
(Trush, M. A.; Reasor, M.J.; Wilson, M.E.; Van Dyke, K.
Chem.-Biol. Interact. 1979, 28, 71.) de clorpromazina. Además de
la luz emisora en una reacción de
oxidación-reducción con TPrA, CPZ también emite
cuando se oxida en ausencia de un correactivo añadido.
Presumiblemente, la amina terciaria de la cadena lateral de CPZ
actúa como un correactivo interno, y se cree que proporciona el
primer ejemplo de reacción de ECL de
autoaniquilación.
Se transfirió MeCN sin abrir a una caja con
guantes en atmósfera de vacío bajo atmósfera de helio, que se usó
como receptor. Para los experimentos efectuados con MeCN, se cargó
una celda sellada en la caja de guantes antes de cada experimento.
El tetrafluoroborato de tetrabutilamonio (TBABF_{4}, calidad
electrométrica) se purificó mediante recristalización a partir de
acetato de etilo:pentano (2 veces; relación de volumen, 1:1) o de
acetato de etilo:dietiléter (3 veces; relación de volumen, 9:1)
seguido por el secado al vacío a 100ºC. Como receptores se usaron
perclorato tetraetilamonio, (TEAP, calidad electrométrica con un 8%
de agua, tri-n-propilamina (TPrA,
98%), triantreno (97%), clorhidrato de clorpromazina (98%), fosfato
sódico monobásico monohidrato (NaH_{2}PO_{4}\cdotH_{2}O,
99%), fosfato sódico dibásico heptahidrato
(Na_{2}HPO_{4}.7H_{2}O, 99%) y peroxidisulfato amónico
[(NH_{4})_{2}S_{2}O_{8}, 99%].
Las soluciones de tampón fosfato sódico 0,15 M
preparadas con agua Milli-Q (Millipore Corp.,
Bedfore, WA) fueron 0,10 M en Na_{2}HPO_{4}.7H_{2}O y 0,05 M
en NaH_{2}PO_{4}\cdotH_{2}O. Las soluciones tampón que
contenían TPrA se prepararon de forma similar, excepto que se usó
NaH_{2}PO_{4}.H_{2}O 0,15 M para compensar la alcalinidad de
la TPrA. El pH de estas soluciones tampón se ajustó con ácido
fosfórico (H_{3}PO_{4}) concentrado o con NaOH 4 M.
La voltametría cíclica sin detección de fotones
se obtuvo usando un equipo BAS 100A Electrochemical Analyzer
(Bioanalytical Systems, West Lafayette, IN) o un equipo
potentiostat/programador universal Applied Research (PAR) modelo
173/175 (Princeton, NJ) y una registradora Omnigraphic 20000
X-Y (Bausch and Lomb-Houston
Instrument, Division, Austin, TX). Los voltamogramas cíclicos con
detección simultánea de fotones se registraron usando el equipo PAR
173/175 junto a un contador de fotones Hamamatsu C1230 (Bridgewater,
NJ) equipado con un tubo fotomultiplicador Hamamatsu
R928-P. El tubo fotomultiplicador se alojó en una
cámara refrigerada con camisa de agua de Products For Research,
Inc., modelo TE308TSRF mantenida a -10ºC. El enfriamiento primario
de la camisa de agua hasta 10ºC se consiguió usando una unidad de
refrigeración MGW Lauda model RMS6 (vendida por Brinkmann
Instruments Co., Westbury, NY). Para los trazados de intensidad de
la ECL frente al potencial se introdujo el resultado del recuento de
fotones en el eje Y de la registradora X-Y durante
los barridos del potencial.
Los datos de la intensidad de la ECL frente a la
concentración y de la intensidad de la ECL frente al pH se
adquirieron usando un analizador prototipo para ECL de
Perkin-Elmer (Perkin-Elmer Corp.,
Norwalk, CT; modelo QPCR System 5000; similar al equipo descrito en
Leland, J.K.; Powell, M.J. J. Electrochem. Soc. 1990, 137,
3127). Este instrumento se conecta con un ordenador personal
Digital DEC 316SX.
Los espectros de fluorescencia y ECL se
registraron usando un dispositivo consistente en una cámara de carga
(CCD) acoplada al espectrómetro (hendidura de entrada, 1 mm)
conectado a un ordenador personal Dell System 200 (Austin, TX), como
se ha descrito previamente. Se siguieron los mismos procedimientos
(calibración espectral, etc.) excepto que se usaron secuencias de
impulso diferentes y que el detector CCD se mantuvo a -110ºC para
los experimentos con TPrA/THCOOH y TPrA/DPAS y a -100ºC para los
experimentos con S2O82-/DPAS. La excitación del espectro de
fluorescencia se consiguió manteniendo una lámpara UV con una
longitud de onda (366 nm) (UVP, Inc., San Gabriel, CA; modelo
UVGL-25; vendida por Fisher Scientific, Pittsburgh,
PA) cerca de la celda y con ángulos hacia la derecha con respecto a
la hendidura de la entrada del espectrómetro.
Excepto cuando se mencione lo contrario, en todos
los experimentos electroquímicos y de ECL se utilizó una
configuración convencional de la celda con 3 electrodos. Los
electrodos funcionales con disco de Pt se pulieron con una
almohadilla de fieltro (Buehler, Ltd., Lake Bluff, IL) antes de cada
experimento efectuado, con 0,05 \mum de alumina (Buehler; Ltd.)
suspendida en agua.
La celda del equipo Perkin-Elmer
se modificó de manera que: 1) la celda de flujo en capa fina utiliza
un electrodo funcional (Au) y dos electrodos contadores cuadrados (5
x 5 mm) (ambos de Au); 2) los dos electrodos contadores se colocan
por encima y a los lados del electrodo funcional, en línea directa
con el tubo fotomultiplicador; y 3) el electrodo de referencia de
Ag/AgCl se sitúa en un compartimento al lado de la celda, en lugar
de incorporarse en el trayecto del flujo distalmente a ella. Los
electrodos de este equipo se limpian electroquímicamente antes de
cada análisis, usando una solución de limpieza comercializada (IGEN
Inc., Rockville, MD) en combinación con una secuencia programada de
impulsos potenciales.
En el caso de los análisis de voltametría
cíclica, sin detección de fotones, en la realización de CPZ se
utilizó un electrodo funcional grafito pirolítico de orientación
alta (HOPG; Union Carbide, Cleveland, OH) (disco de 6 mm de diámetro
con material recién expuesto en cada experimento), un electrodo
contador de alambre de Pt y un electrodo de
cuasi-referencia de Ag (AgQRE) en una configuración
descrita recientemente. Ver Xu, X.; Bard, A.J. Langmuir, 1994,
10, 2409. En los análisis similares de todos los demás
compuestos utilizados se usó un electrodo de trabajo con un disco de
Pt de 1,5 mm sellado en vidrio, en combinación con un electrodo
contador de alambre de Pt y un AgQRE.
Para obtener el espectro de la ECL y los barridos
de emisión frente al potencial de DPAS/TPrA frente a los barridos de
potencial se utilizó un electrodo funcional marcador de gasa de Pt
de 6 x 9 mm (gasa de malla 52; Aldrich), un AgQRE y un electrodo
contador redondo (de 9 mm de diámetro, de un grosor de 0,5 mm) de
lámina de Au. Para obtener el espectro de la ECL de
2-THCOOH también se utilizó esta distribución. El
electrodo funcional de gasa se limpió antes de cada experimento por
inmersión en ácido nítrico concentrado, aclarándose después en agua
destilada y calentando en un mechero de llama bunsen.
Para obtener el espectro de la ECL y el barrido
de emisión frente al potencial de DPAS/S_{2}O_{8}^{2-} se
utilizó un electro funcional de un disco de Pt de 2,0 mm de diámetro
sellado en vidrio en combinación con un electrodo contador de
alambre de Pt y un AgQRE.
Para el barrido de emisión de la ECL frente al
potencial de CPZ se utilizaron los mismos electrodos y configuración
descritos anteriormente para CPZ sin detección de fotones. Para
obtener la emisión frente al potencial de la ECL para
2-THCOOH se utilizó la misma disposición, excepto
que el electrodo funcional era un disco de Pt de 6 mm de
diámetro.
El potencial no acuoso en referencia a ferroceno
se consiguió añadiendo el estándar directamente a las soluciones. La
obtención del potencial en referencia a las soluciones acuosas del
electrodo de calomelano saturado (SCE) se consiguió adquiriendo los
datos frente a un AgQRE para el cual se conocía el potencial frente
al SCE. Para la comparación cualitativa, el Eº frente al SCE de
ferroceno varía (debido, principalmente, a las diferencias en los
potenciales de unión de líquidos) entre + 0,307 y +0,56 V
dependiendo del sistema de soporte de disolvente/electrolito.
El DPAS se sintetizó según variaciones en el
procedimiento de Catalani y cols. descrito en Catalani, L.H.;
Wilson, T: Bechara, E.J. H. Photochem. Photobiol, 1987, 45,273.
En consecuencia, se suspendió 1 g de
9,10-difenilantraceno (DPA, 98%) en 7 ml de
nitrobenceno (99%) y la suspensión amarilla resultante se enfrió
hasta 10ºC en un baño de hielo bajo un flujo constante de nitrógeno.
Mediante la aplicación de una agitación enérgica se añadieron gota a
gota 0,25 ml de ácido sulfúrico fumante (27%-33% de SO_{3} libre)
para producir una suspensión de color verde oscuro, que se agitó
inicialmente a 50ºC durante 4 horas seguido por una agitación
durante toda la noche a temperatura ambiente. La solución de color
verde oscuro se neutralizó a continuación con NaOH 10 M en un baño
de hielo para producir un residuo oleoso de color amarillo claro.
Cuando se humedeció un papel de pH con esta solución primero cambió
a un color naranja-rojo en lugar del color inicial
de color rojo oscuro, se añadieron 50 ml de agua a la mezcla antes
de la adición final de NaOH para llevar el pH a 7,0. A continuación,
se añadió más agua para llevar el volumen total aproximadamente
hasta 250 ml y se extrajo el nitrobenceno por destilación con vapor
(que se afecta por la ebullición de la suspensión). La mayoría del
nitrobenceno se extrajo con los primeros 75 ml del destilado y la
destilación continuó hasta que el volumen de la suspensión fue de
aproximadamente 50 ml. La suspensión amarilla se transfirió a
continuación a un vaso y se llevó a ebullición sobre una placa
caliente con agitación para reducir el volumen total hasta
aproximadamente 10 ml. El lodo amarillo se filtró sobre un embudo de
buchner (con un filtro de papel) y el sólido resultante se dejó
secar al aire para producir 0,94 g del producto amarillo crudo. El
producto crudo se purificó por cromatografía de intercambio iónico
en columna usando una resina de intercambio iónico Dowex 1 x
2-100 (mezcla seca 50-100; 3 x 1 cm)
y elución con un gradiente de HCl 0-0,5 M (mezclado
a partir de HCl al 36,5%; en metanol anhidro (calidad
espectrofotométrica). Por tanto, se disolvió aproximadamente 0,35 g
de producto amarillo crudo en 10 ml de metanol con agitación y
sonicación. El DPA que no había reaccionado en el producto en crudo
sólo es ligeramente soluble en metanol y se separó por
centrifugación. El sobrenadante se aplicó a la columna y el producto
se eluyó con aproximadamente 5 ml de metanol seguidos por
aproximadamente 5 ml de HCl 0,25 M en metanol, seguido por HCl 0,5 M
en metanol. Se recogieron 9 fracciones de 20 ml y se añadieron 60 ml
de agua a cada una de ellas. Las fracciones 1 a 5 se mostraron
turbias o con formación de precipitado y se enfriaron en la nevera
toda la noche. El producto sólido se separó después por
centrifugación y filtración sobre una frita de cristal sinterizado.
Cuando el flujo del líquido a través de la frita se interrumpió
debido a la obstrucción, el lodo gelatinoso verdoso se transfirió a
una placa de petri de vidrio, se cubrió con papel de filtro y se
dejó secar al aire durante varios días en condiciones ambiente.
Cuando estuvo seco se arañaron 110 mg de DPAS.5H_{2}O de color
verde claro o amarillo de la placa de petri con una cuchilla y se
identificó el producto mediante ^{1}H NMR y espectrometría de
masa.
Se prepararon soluciones acuosas de
DPAS.5H_{2}O disolviendo la cantidad requerida de sólido en unas
gotas de metanol antes de transferirlo a la solución acuosa. La
solubilidad máxima de DPAS acuoso en tampón fosfato sódico 0,15 M
(pH 7,5) es aproximadamente de 1 x 10^{-5} M. Con esta
concentración tan baja no se puede observar corriente anódica para
DPAS por encima de la oxidación de agua de fondo, como se ve en la
Figura 1. No obstante, si se oxida 1 x 10^{-5} M de DPAS en
presencia de M TPrA 0,15 M se produce una emisión que coincide con
una onda de oxidación que se superpone a la oxidación de TPrA y a la
oxidación de fondo de agua, como se muestra en las Figuras
2a-2b. Como comparación, en la Figura 2c se muestra
la oxidación de TPrA 0,05 M en ausencia de DPAS. El hecho de que se
observe una corriente de oxidación con 1 x 10^{-5} M DPAS sólo en
presencia de TPrA implica una potenciación de la corriente
catalítica debido a la regeneración de DPAS mediante la reducción de
DPAS^{+} mediante TPrA o un producto intermedio. Para esta
catálisis, la secuencia cíclica de las reacciones es análoga a la
que se muestra con las reacciones (5), (6a), (7), (8) o (10) y (11),
y (9) anterior, es donde Ru(bpy)_{3}^{3+/2+/+} se
remplaza, respectivamente por DPAS^{+/0/-}, XY^{z} es TPrA, XX
es Pr_{2}NCH\cdotEt e Y^{Y} es H^{+}. A pesar de la
concentración baja de DPAS, 1 x 10^{-5} M, esta emisión es
visiblemente azul cuando se contempla en una sala oscura y no se
observa emisión en ausencia de TPrA o de DPAS.
Con respecto a la intensidad de la ECL en función
del pH, en ocasiones se registraron emisiones más intensas con pH
más bajos pero no se encontraron condiciones en las que esas
diferencias quedaran fuera de la dispersión experimental. En cuanto
al sistema DPAS/TPrA se produce la pasivación del electrodo después
de un barrido y se impide así observar las emisiones posteriores si
no se limpia el electrodo. Este comportamiento indica que los
productos que participan en las reacciones químicas después de la
oxidación de DPAS pasivizan el electrodo. El electrodo se puede
limpiar mediante procedimientos mecánicos o empujándolo hacia la
reducción de fondo del agua (-1,4 V frente al SCE) durante unos
segundos, después de lo cual se puede observar de nuevo la ECL
durante la oxidación.
La oxidación de DPAS se complica por las
siguientes reacciones químicas, como se demuestra por la ausencia de
reversibilidad química que se ve en la Figura 3. Este
comportamiento, que persiste con velocidades de barrido tan altas
como 10 V/s, se debe, probablemente, al ataque del DPAS^{+} por
agua o por OH^{-} para formar los productos. Aunque se tomaron
precauciones especiales para excluir las trazas de agua de estas
soluciones, es probable que las cinco moléculas de agua de
hidratación que se asocian a DPAS proporcionan una fuente suficiente
para el ataque nucleofílico sobre el DPAS^{+}. La adición de
alúmina neutra a estas soluciones en un intento de eliminar el agua
no dio lugar a cambios profundos de la electroquímica. Los intentos
de aumentar la intensidad de la emisión de la ECL mediante la
estabilización del DPAS^{+} usando surfactante o mediante la
polisulfonación del DPA no tuvieron éxito.
En la Figura 4 se muestra una curva de
calibración de la intensidad de la ECL frente a la concentración en
todo el intervalo de sensibilidad del analizador de
Perkin-Elmer para DPAS con una concentración tan
baja como 3,2 x 10^{-8} M. En condiciones optimizadas, se puede
detectar el Ru(bpy)_{3}^{2+} en concentraciones
aproximadamente 60 veces más diluidas en intensidades de emisión
similares. Con concentraciones mayores de 5 x 10^{-6} M usando la
cámara CCD (y corrigiendo según la sensibilidad del detector) la
emisión del Ru(bpy)_{3}^{2+} es aproximadamente
100 veces más intensa que la emisión del DPAS. Como se espera que la
emisión de la ECL para DPAS sea más intensa que para
Ru(bpy)_{3}^{2+}
basada en las eficiencias de fluorescencia (FF = 0,87 para DPAS y aproximadamente 0,05 para Ru(bpy)_{3}^{2+\bullet}) la intensidad más baja de la ECL para DPAS indica la presencia de reacciones químicas competitivas (como el ataque nucleofílico) que consume DPAS^{+}.
basada en las eficiencias de fluorescencia (FF = 0,87 para DPAS y aproximadamente 0,05 para Ru(bpy)_{3}^{2+\bullet}) la intensidad más baja de la ECL para DPAS indica la presencia de reacciones químicas competitivas (como el ataque nucleofílico) que consume DPAS^{+}.
En la Figura 5 se muestra la ECL y el espectro de
fluorescencia de DPAS 1 x 10^{-5} M. La similitud entre la
fluorescencia y el espectro de la ECL indica que la emisión de la
ECL procede del DPAS^{+}. La ligera discrepancia entre los
espectros en longitudes de onda largas puede deberse a la emisión de
otros productos formados por reacciones químicas competitivas
durante la ECL.
Previamente, se ha valorado la electroquímica y
la ECL del sistema
Ru(bpy)_{3}^{2+}/S_{2}O_{8}^{2-} en
MECN-agua y el CV reductor de S_{2}O_{8}^{2-}
se muestra en la Figura 6. En este caso, la irreversibilidad de la
reacción se debe al proceso representado en la ecuación (13)
anterior. En estas condiciones, el inicio de la reducción de fondo
del agua (no se muestra) que produce H_{2} gaseoso ocurre
aproximadamente a -1,0 V.
En la presente invención, la reducción catódica
DPAS se produce en presencia de S_{2}O_{8}^{2-} como
correactivo y produce la ECL. La reducción de DPAS en MeCN se
muestra en la Figura 7 y la reversibilidad de esta pareja
(DPAS^{0/-}) comparada con la oxidación de DPAS que se muestra en
la Figura 3 indica que DPAS^{-} es significativamente más estable
en MeCN que en DPAS^{+}. La pequeña preonda de la Figura 7 parece
deberse al DPAS absorbido porque la corriente de esta onda aumenta
linealmente con la velocidad de barrido (v) mientras que para una
pareja más negativa aumenta con v^{y2} en un intervalo de 0,1 a
1,0 V/s. Como esta reducción se produce en el seno de la reducción
de fondo del agua, no hay una corriente catódica evidente por encima
del fondo en las soluciones de MeCN-agua (1:1 en
volumen). No obstante, si el potencial se escanea dentro de la
reducción de fondo del agua en presencia de S_{2}O_{8}^{2-} se
observa una emisión de color azul brillante con un potencial que se
corresponde a la reducción del DPAS (después de hacer la conversión
aproximada por el ferroceno a los potenciales del SCE) como se
muestra en la Figura 8. No se observa emisión en ausencia de
S_{2}O_{8}^{2-} o de DPAS, resultado que es compatible con los
datos previos con el sistema Ru(bpy)_{3}^{2+}/
S_{2}O_{8}^{2-}, en el cual no se observa ninguna emisión
hasta que el potencial se escanea en una zona suficientemente
negativa como para reducir Ru(bpy)_{3}^{2+} y
permite la generación del estado excitado mediante la secuencia de
reacciones que se muestra en las ecuaciones (12)-(15) anteriores.
Este esquema se puede modificar para describir la reacción de la ECL
del DPAS al sustituir DPAS^{+/0/-} respectivamente para
Ru(bpy)_{3}^{3+/2+/+}.
Como se muestra en la Figura 9, el espectro azul
de la ECL para la emisión del DPAS coincide con el espectro de
fluorescencia y también coincide con la ECL y el espectro de
fluorescencia para la oxidación-reducción de DPAS
con TPrA que se muestran en la Figura 5. La menor contribución de la
emisión de los productos colaterales de la Figura 9 confirma la
mejor estabilidad del DPAS^{-}, incluso durante la reducción del
fondo. Al considerar el balance energético de un sistema ECL se
observan los potenciales estándar de las semirreacciones relevantes
(dando una energía libre de la reacción de transferencia de
electrones) y la energía del estado emisor. Para la oxidación de
DPAS y TPrA son estas:
DPAS^{+\bullet} + e^{-}
\rightarrow DPAS
\hskip0,5cmEº \sim +1,3 V frente al SCE
Pr_{2}NC^{+}HEt + ^{e-}
\rightarrow Pr_{2}NC^{\bullet} HEt
\hskip0,5cmEº \sim -1,1 V frente al SCE^{30}
DPAS^{\bullet} (singlete)
\rightarrow DPAS + hu
\hskip0,5cmE_{S} = 2,9 eV
La entalpía de la reacción de transferencia de
electrones entre DPAS^{-} y Pr_{2}NC\cdotHEt, corregida según
una entropía aproximadamente de 0,1 eV, es -2,3 eV, muy por debajo
de la que se necesita para producir el singlete DPAS^{-}, por lo
que se clasificaría como una reacción "deficiente en energía".
Como con otras reacciones de este tipo, los singletes excitados se
forman, probablemente, mediante una aniquilación
triplete-triplete (una vía T). Aunque el sistema
oxidativo DPAS/oxalato sería "suficiente en energía" no se
observó ninguna emisión en los análisis que usaron oxalato como
correactivo.
El balance energético de la vía reductora
corresponde a las semirreacciones:
DPAS + e^{-}
\leftarrow \rightarrow DPAS^{-}
\hskip0,5cmEº \sim 1,9 V frente al SCE
SO_{4}^{-}
+ e^{-} \leftarrow \rightarrow SO_{4}^{2-}
\hskip0,5cmEº \sim +3,2 V frente al SCE
En este caso, la reacción de transferencia de
electrones entre DPAS^{-} y SO_{4}^{-} es suficiente para
producir un singlete DPAS^{\bullet} directamente (una vía S). La
intensidad de la emisión de DPAS 1 x 10^{-5} M es aproximadamente
la misma que para la oxidación de DPAS/TPrA y para la reducción de
DPAS/S_{2}O_{8}^{2-}.
Ejemplos 3 y
4
Se sintetizaron 1-THCOOH y
2-THCOOH siguiendo los procedimientos de Gilman y
Swayampati descritos en Gilman, H.; Swayampati, D.R. J. Am. Chem.
Soc. 1957, 79, 208. Con la excepción de que se sustituyó
n-butillitio 1,6 M en hexano por sus soluciones de
n-butillitio en éter.
La oxidación de 2-THCOOH en una
solución acuosa se produce cerca de + 1,0 V como se muestra en la
Figura 10a. El proceso anódico ancho entre 0,0 V y +0,5 V y también
el proceso catódico más prominente a -0,2 V son características de
la formación de óxido y la reducción de un electrodo de Pt en una
solución acuosa de este pH y aparece en los barridos en ausencia de
2-THCOOH. Estos procesos se pueden eliminar si se
establecen ciclos de potencial que no lleguen más allá en el polo
negativo de -0,15 V como se muestra en la Figura 10b. La
irreversibilidad química que se muestra en las Figuras 10a y 10b (y
que se observa en los barridos similares hasta 50 V/s) indica la
inestabilidad de 2-THCOOH oxidado en una solución
acuosa y su conversión rápida a algún producto. Por el contrario,
procesos similares en MeCN seco (Figura 10c) demuestran que el
producto oxidado es estable. Así se demuestra que la descomposición
del ácido oxidado se debe a la reacción con agua frente a otras
posibilidades, como la descarboxilación con pérdida de CO_{2}.
La oxidación de triantreno (TH) a McCN produce un
radical catiónico estable que se describe en Kexzthelyi, C.P.;
Tachikawa, H.; Bard, A.J. J. Am. Chem. Soc. 1972, 94, 1522, por
lo que es probable que la oxidación de THCOOH se efectúe de una
forma similar:
Es conocido que los nucleófilos como H_{2}O y
OH^{-} atacan el TH^{+} del azufre, lo que es muy probable en
una solución acuosa, produciendo, por ejemplo, el sulfóxido:
\vskip1.000000\baselineskip
Tanto 1-THCOOH como
2-THCOOH producen emisiones de ECL cuando se oxidan
en una solución acuosa de tampón fosfato sódico en presencia de TPrA
como correactivo, como se ve en las Figuras 11 y 12 para
2-THCOOH. (La conducta de 1-THCOOH
es similar excepto que la intensidad de la emisión máxima es
6-7 veces menor que la de 2-THCOOH).
En ausencia de TPrA o de ácido no se observa emisión. Aunque la
corriente anódica está dominada por la oxidación del ácido
desprotonado, la electroquímica se complica por la coincidencia de
este proceso tanto con el inicio de una onda ancha de oxidación
irreversible de TPrA (Figura 2c) como por la oxidación de fondo del
agua (Figura 1). Los dos picos de emisión distintos en función del
potencial de la Figura 11 indican las contribuciones de los dos
procesos en los electrodos diferentes. Se cree que el primer pico se
debe a las reacciones asociadas con la oxidación homogénea de TPrA
según la ecuación (6a) anterior (remplazando
2-TH^{+}COO^{-} por
Ru(bpy)_{3}^{3+}) y el segundo pico es
consecuencia de la oxidación heterogénea directa de TPrA en el
electrodo según la ecuación (6). Esta hipótesis se confirma con los
resultados de la Figura 12 registrada con la concentración más baja
de 2-THCOOH, donde la reacción de segundo orden de
(6a) será más lenta y menos importante. Según las condiciones de la
Figura 12, la emisión del proceso homogéneo aparece en una pequeña
joroba en la emisión dominante emitida por la oxidación heterogénea
de TPrA. El desplazamiento negativo del segundo pico de emisión
puede racionalizarse según la mayor concentración de TPrA en el
electrodo con potenciales más negativos debido a la inactividad de
la reacción de oxidación que depleciona la TPrA (6a).
Cuando el 2-THCOOH se oxida en
presencia de TPrA, la corriente anódica casi es el doble frente a la
que crea la misma concentración de 2-THCOOH en
ausencia de TPrA, (comparar las Figuras 10a y 13). Este resultado es
compatible con la regeneración catalítica de THCOOH (o algún
producto) a través de su reducción homogénea mediante TPrA o un
producto intermedio (según la analogía con (6a) o (8)-(9) para este
sistema) y confirma la hipótesis de que el primer pico de emisión de
la Figura 11 se debe a la generación de precursores del correactivo
mediante la oxidación homogénea de TPrA.
En la Figura 14 la intensidad de la emisión del
pico de 2-THCOOH 1 x 10^{-5} M aumenta con el pH.
La diferencia entre la tendencia que aquí se observa y la del
sistema Ru(bpy)_{3}^{2+}/TPrA, que muestra un pico
cerca del pH 7,5, indica que el H^{+} participa no sólo en las
reacciones de descomposición de TPrA sino también en las reacciones
asociadas a la emisión de un producto de 2-THCOOH.
La intensidad de la emisión del pico de 2-THCOOH
varía linealmente con la concentración en 4 órdenes de magnitud a pH
7,5, como se demuestra en la Figura 15.
La fluorescencia y espectro de HCL de
1-THCOOH y 2-THCOOH se muestran en
la Figura 16. La fluorescencia máxima de 1-THCOOH y
2-THCOOH es de 505 nm y 480 nm, respectivamente.
Como comparación, la emisión máxima de la fluorescencia de
triantreno en MeCN se produce a 434 nm. La ECL máxima de cada ácido
se produce a 570 nm mostrando un desplazamiento importante hacia una
longitud de onda más potente frente al espectro de fluorescencia
respectivo. En estas condiciones optimizadas, la emisión de
2-THCOOH es apenas visible con el ojo adaptado a la
oscuridad.
Las diferencias entre la fluorescencia y el
espectro de la ECL de los ácidos THCOOH indican que al menos parte
de la emisión de la ECL procede de algunas especies distintas de un
estado oxidado de ácido intacto. Una posibilidad es que el ácido se
descarboxila con la oxidación, pero esto es improbable por varias
razones: 1) si se produjo la descarboxilación, se esperaría que el
espectro de emisión fuese característico de TH o de THCOOH, y no lo
es, 2) si se produjera TH mediante la descarboxilación, precipitaría
en el electrodo debido a su baja solubilidad en soluciones acuosas y
no se observan signos de que estos suceda, 3) en condiciones no
acuosas (MeCN seco), el ácido oxidado es estable en una escala de
tiempo voltamétrica, como se demuestra por la onda de retorno que se
muestra en la Figura 10c. Si se tienen en cuenta los estudios
electroquímicos que demuestran el ataque nucleofílico por agua en la
posición del azufre por el radical catiónico TH, se deduce que
pueden producirse reacciones similares con los ácidos THCOOH.
También existe un paralelismo entre los resultados de la ECL de
THCOOH y los observados con antraceno. En el caso de este último, se
observa una emisión de la ECL similar desplazada al rojo tras la
generación del radical catión, que se atribuye a la emisión del
antranol (la forma enol de la antrona cetona) formada por la
reacción del radical catiónico antraceno con trazas de agua que
queden en el disolvente McCN. Presumiblemente, la emisión observada
desde 1- y 2-THCOOH se produce a partir de productos
intermedios similares formados por la reacción del ácido oxidado con
agua. El espectro de la ECL de ambos ácidos tiene el mismo pico de
longitud de onda, mientras que los picos son distintos para el
espectro de fluorescencia. La energía del producto intermedio emisor
se ve más afectada por el nucleófilo añadido que por la posición del
ácido carboxílico funcional.
Unos voltamogramas cíclicos de la oxidación de
clorpromazina (Figura 17) demuestran que la oxidación se produce
como dos procesos discretos. El primero de ellos es casi reversible
y el segundo es irreversible. El pico anormalmente ancho de la
primera onda anódica que se muestra en las Figuras 17a y 17b se ha
atribuido a la absorción de CPZ. Asimismo, la joroba de la onda de
retorno catódica de la Figura 17b es un proceso de adsorción. Cuando
el barrido se invierte tras la primera oxidación, como se ve en la
Figura 17b, el aumento de reversibilidad (comparado con la Figura
17a) indica que un producto de la segunda oxidación reacciona con la
forma oxidada de CPZ.
La oxidación de CPZ a un pH más alto en una
solución de tampón fosfato sódico altera la electroquímica, como se
muestra en la Figura 18a. La primera oxidación es ahora irreversible
y la electroquímica es, en general, más compleja que la de la Figura
17, como se demuestra por una joroba que aparece en la primera onda
de oxidación, el aumento de corriente y el ensanchamiento de la
segunda onda. Como sucede con la oxidación de TPrA, el análisis del
segundo proceso de oxidación se complica por su coincidencia con la
oxidación de fondo de agua. No obstante, (en ausencia de un
correactivo añadido) como se observa en la Figura 18, se obtiene
inesperadamente una emisión de ECL. Las verificaciones del espectro
de la ECL para este proceso para comparar con el espectro de
fotoluminescencia estaban dificultadas por intensidades de emisión
bajas y la contaminación del electrodo. Además, no se tuvo éxito
cuando se intentó determinar la longitud de onda de emisión del pico
usando filtros de interferencia para los intervalos estrechos de
longitud de onda específica entre 450 y 600 nm. No se observó
emisión en las condiciones de la Figura 17 (con o sin adición de
TPrA 50 mM), en la cual la electroquímica es menos compleja y no se
produce la contaminación del electrodo.
El trabajo mecánico anterior de McCreery ha
demostrado que las formas monooxidadas de CPZ se convierten en
sulfóxidos en una solución acuosa mediante el ataque nucleofílico
del agua en la posición del azufre. Por tanto, la primera oxidación
de CPZ se asocia al sistema de anillo tricíclico y la segunda
oxidación involucra a la amina terciaria de la cadena lateral (de
forma análoga a la oxidación de THCOOH y TPrA). Presumiblemente, la
amina sufre entonces una reacción similar a la que se observa con
TPrA en la ecuación (6) y (7) anterior, para producir un fuerte
agente reductor que reacciona con el sistema de anillo para generar
un estado excitado luminiscente. Este proceso de
"autoaniquilación" probablemente se desarrolla como se muestra
en las ecuaciones (5)-(8), donde la porción tricíclica de CPZ
remplaza a Ru(bpy)_{3}^{2+} y se une
covalentemente al correactivo X (la amina terciaria de la cadena
lateral). La autoaniquilación podría producirse mediante un proceso
intramolecular o intermolecular. La emisión de CPZ procede de un
producto formado por la reacción de CPZ oxidada con agua. En el caso
de CPZ 0,11 mM en tampón fosfato sódico de pH 7,5, se registró una
intensidad de emisión del pico de 80 c/s por encima del ruido de
fondo. En caso de CPZ 1,1 mM, la intensidad del pico fue de 850
c/s.
Para eliminar las variancias de las mediciones de
la detección de la ECL de una muestra se usa la técnica estándar
interna. En el procedimiento estándar interno se añade a la muestra
una cantidad fija de un patrón. Durante la excitación se miden
simultáneamente la intensidad de la ECL de la muestra y la de
referencia. La relación entre las intensidades de la ECL no se
afectará por las variaciones normales en la técnica de medición. El
estándar interno resulta útil para corregir los efectos de la
matriz, las fluctuaciones de la temperatura, las variancias del
voltaje de excitación, etc. El estándar interno sólo es válido si la
matriz afecta por igual a la señal de referencia y a la de la
muestra. El uso de este procedimiento de evaluación se limita a los
diseños del instrumento y al procedimiento de ECL capaz de
determinar dos emisiones del luminóforo. La selección de un
luminóforo apropiado de referencia es fundamental para el
rendimiento de la técnica. La elección del luminóforo de referencia
depende de las posiciones relativas del espectro de emisión de la
muestra y la de referencia. En el ejemplo que se presenta, el DPAS
es un candidato ideal para el luminóforo de referencia porque su
emisión está bien separada de la del luminóforo de la muestra
Ru(bpy)_{3}^{2+-}. En la Figura 19 se muestra el
espectro de emisión. La emisión de DPAS centrada en la longitud de
onda de 430 nM se separa bien de la emisión de
Ru(bpy)_{3}^{2+} centrada en la longitud de onda
de 620 nM.
Las dos emisiones de la ECL se pueden resolver
mediante la longitud de onda con el uso de filtros ópticos. La
distribución óptica es la que se muestra en la Figura 20. Se
construye una rueda con dos filtros ópticos colocados entre la
célula electroquímica y el PMT. La rueda presenta un filtro de paso
largo para la observación de la emisión de
Ru(bpy)_{3}^{2+} y un filtro de paso corto para la
observación de la emisión del DPAS. La rotación de la rueda óptica
se sincroniza con el voltaje de la excitación, durante la cual se
observan dos emisiones de ECL. La rampa del voltaje de excitación se
divide en dos periodos, ver las Figuras 21a y 21c. Durante el primer
periodo, la rueda óptica se coloca con el filtro de paso largo por
encima del electrodo. Se mide la emisión de la muestra y se filtra
la emisión de la muestra de referencia. Durante el segundo periodo,
la rueda óptica se coloca con el filtro de paso corto por encima del
electrodo. Se mide la emisión de la muestra de referencia, se filtra
la muestra y después se obtiene su señal integrando el área de la
emisión de la ECL bajo el primer periodo. La muestra de referencia
se obtiene a partir del área del segundo periodo. La estandarización
interna se realiza obteniendo el cociente entre la señal de la
muestra y la señal de referencia. Cualquier variancia no
relacionada con los cambios de concentración se observa tanto en la
muestra como en la de referencia. La señal del cociente se usa
entonces para medir la concentración de la muestra.
La metodología de detección de la ECL es adecuada
para la cuantificación de los procedimientos de hibridación de ADN.
La intensidad de la ECL es proporcional a la concentración del
analito de interés de ADN en particular. Las variancias de la
amplificación del ADN antes de la detección de la ECL también se
pueden eliminar usando un estándar interno.
Claims (20)
1. Procedimiento de detección de un analito que
comprende:
- (a)
- poner en contacto una muestra con una biomolécula unida a un compuesto marcador orgánico que es soluble en una solución acuosa, en el que dicho compuesto marcador es capaz de generar electroquimioluminiscencia;
- (b)
- aplicar un potencial oxidante usando un electrodo a dicho compuesto marcador en presencia de un correactivo amina en condiciones acuosas; y
- (c)
- medir la electroquimioluminiscencia emitida, en el que dicho procedimiento es un inmunoensayo, y dicha biomolécula es un anticuerpo o un antígeno o en el que dicho procedimiento es un ensayo de hibridación de ADN y dicha biomolécula es una sonda de ADN.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que el compuesto marcador es un compuesto orgánico marcador
policíclico sustituido.
3. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 2, en el que dicho correactivo es una amina
terciaria.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho correactivo es una amina
tripropilo (TPA).
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho marcador comprende dicho
correactivo.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el
que dicho marcador es clorpromazina.
7. Procedimiento de generación de
electroquimioluminiscencia que comprende aplicar un potencial
oxidante utilizando un electrodo a un marcador orgánico soluble que
comprende una amina terciaria con el cual se genera
electroquimioluminiscencia en condiciones subacuosas, en el que
dicho marcador orgánico soluble está unido a una biomolécula
seleccionada de entre el grupo consistente en un anticuerpo, un
antígeno y una sonda de ADN.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el
que dicho procedimiento se realiza en presencia de un correactivo
interno.
9. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 7 u 8, que comprende además medir la
electroquimioluminiscencia generada.
10. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 9, en el que dicha biomolécula es un
anticuerpo.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, en
el que dicha biomolécula está unida específicamente a un
analito.
12. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que el compuesto marcador orgánico es
difenilantraceno sustituido o un triantreno.
13. Composición marcadora
electroquimioluminescente, que comprende:
- un compuesto marcador orgánico hidrosoluble capaz de generar electroquimioluminiscencia; y
- un correactivo amina, en el que dicho compuesto está unido a una biomolécula seleccionada de entre un anticuerpo, un antígeno y una sonda de ADN.
14. Composición según la reivindicación 13, en la
que el compuesto es un compuesto orgánico policíclico
sustituido.
15. Composición según la reivindicación 14, en la
que el compuesto es un compuesto aromático policíclico que presenta
una sustitución en el anillo de carbono de por lo menos un
heteroátomo seleccionado de entre N y/o S.
16. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 15, en la que el correactivo amina es una
amina terciaria.
17. Uso de un compuesto orgánico hidrosoluble
electroquimioluminescente unido a una biomolécula seleccionada de
entre un antígeno, un anticuerpo y una sonda de ADN, en combinación
con un correactivo amina, en la fabricación de un marcador
electroquimioluminescente para la detección de un analito.
18. Uso según la reivindicación 17, en el que el
marcador orgánico es un compuesto orgánico policíclico
sustituido.
19. Uso según la reivindicación 18, en el que el
compuesto es un compuesto aromático policíclico que presenta una
sustitución en el anillo de carbono de por lo menos un heteroátomo
seleccionado de entre N y/o S.
20. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
17 a 19, en el que el correactivo amina es una amina terciaria.
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