JP4951759B2 - レドックス応答性発光プローブ及びそれを用いる検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、レドックス応答性発光プローブ及びこの発光プローブを用いた各種の検出方法に関するものである。本発明のレドックス応答性発光プローブは、生体レドックス状態の変化に可逆的又はほぼ可逆的に応答することができるので、例えば、血液、尿、唾等の試料を用いた酸化ストレス状態の計測診断、細胞を含む生体試料中のレドックス状態の計測又はイメージング、健康食品等の抗酸化能の計測、あるいは、適当な１又は２種類以上の酵素及び／又は補酵素と共に用いることによって、特定の生体関連物質を検出するのに用いることができる。

ヒトを含む地球上の大部分の生物は、酸素を使い栄養物質を燃焼させエネルギーを得ている。この酸素は完全に酸化されると水Ｈ_２Ｏになるが、実際はこの際、不完全な酸化体Ｏ_２ ^−・、Ｈ_２Ｏ_２、ＨＯ^・なども少量だが発生する。これらの不完全な酸化体は、活性酸素種と呼ばれ、元の酸素に比べ高い反応活性を持っている。この高い活性のため、活性酸素種はタンパク、核酸、脂肪酸等の各種生体成分と反応し、これらを損傷させる。これが、ガン、脳血管疾患、心疾患、糖尿病等の各種疾病や老化の根本原因であると考えられ、現在さまざまな観点から研究が行われている。

他方、生体にはこれら活性酸素種を除去する機能も備わっており、スーパーオキシドジムスターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ等の酵素やアスコルビン酸（ビタミンＣ）、トコフェロール（ビタミンＥ）、グルタチオン、ポリフェノール等の抗酸化性物質がその機能を担っている。結局、生体内では、この活性酸素種による酸化作用と、抗酸化物質による抗酸化作用のバランスが重要であるといえる。このバランスはレドックスバランスと呼ばれ、「レドックスバランスが酸化側に振れると、疾病の危険因子が増大し、老化が促進される」と考えられている。

また、レドックスバランスは、様々な因子に影響されることが知られており、例えば、ストレスを受けることでも酸化側に振れることが知られている。つまり、ストレスの健康への影響も、レドックスバランスの変化で説明することができる。このように、レドックスバランスは、生体の健康状態を見る上で非常に重要なパラメータである（本明細書では、このようなレドックスバランスの酸化側へ振れた状態を酸化ストレス状態、及びこれを引き起こす要因を総称して酸化ストレスと呼ぶこともある）。

以上のように、レドックスバランスは疾病・老化に深く関係するパラメータであるので、これを計測する方法が様々に報告されている。大きく分けると、１）血又は尿中の酸化ストレスマーカー量を定量する方法、２）電子スピン共鳴（ＥＳＲ）測定により活性酸素種発生量（又は種類も）若しくは抗酸化能を計測する方法、及び、３）蛍光／燐光（以下、まとめて発光と呼ぶ）測定により活性酸素種発生量（又は種類も）若しくは抗酸化能を計測・イメージングする方法等がある。

酸化ストレスマーカーは、活性酸素種と生体成分との反応でできる特異的な酸化生成物質である（非特許文献１）。８−ヒドロキシデオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）（非特許文献２）、４−ヒドロキシノネナール（４−ＨＮＥ）（非特許文献３）、Ｆ２−イソプロステイン類（非特許文献４）、カルボニル化タンパク（非特許文献５）等の様々な物質が提案されている。これらの血中もしくは尿中での量は、それぞれ実際に受けた酸化ストレスの程度と良い相関を示すことが報告されている。この方法は特に個体の受けた酸化ストレスを計測するのに有効であり、診断への応用が期待される。しかし、これらの酸化ストレスマーカーによる検出は間接的であり、酸化ストレスとの相関がどこまで成立するかは個別に詳細に検討する必要がある。

生体のレドックスバランス又は酸化ストレスを、ＥＳＲを用いて計測する方法もある。活性酸素種の内、例えば、Ｏ_２ ^−・及びＨＯ^・はラジカル種であるので原理的にはＥＳＲで検出できる。実際には、これらの生体中での存在量は少ないので、直接検出することは非常に難しいが、スピントラップ剤を用い、これらを安定なラジカル種に変換することで検出することが行われている。この場合、検出されるＥＳＲ信号のパターンから、活性酸素種の種類を特定することができる。

また、この他、ニトロキシルラジカルなどの安定なラジカル種をプローブとすることで検出することも行われている。即ち、ニトロキシルラジカル類は、生体中ではアスコルビン酸などの生体内抗酸化物質により、ヒドロキシルアミン体に還元され常磁性を失う。しかし、これらは活性酸素種と反応すると再酸化され、ニトロキシルラジカル体に戻り、ＥＳＲ信号を再び発するようになる。以上の原理で、生体のレドックス状態を調べることができる（特許文献１及び２）。

ＥＳＲによるレドックス状態の計測は、細胞、組織片及び実験動物個体レベルで行われている（非特許文献６）。特に、低周波ＥＳＲを用い、実験動物個体を対象とした実験ができる点が有利な点ではあるが、感度や空間解像度が、まだまだ満足行くものではない。特に細胞及び組織片を対象とした場合は、以下に述べる発光に基づく方法が圧倒的に有利である。

発光測定に基づく方法では、各種発光プローブが開発され、活性酸素種発生若しくは抗酸化作用の計測・イメージングが行われている。発光測定は、感度や分解能が良いので、特に細胞レベルでの研究に最適である。以下に発光プローブの種類別に紹介する。

良く使われている発光プローブは、活性酸素種と反応し発光するタイプのものである。このような発光プローブ剤は、様々なものが報告されており、幾つかは特定の活性酸素種に特異的であると報告されている（非特許文献７）。代表例としては、先ず２、７−ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＤＣＦＨ）がある（特許文献３）。本プローブは、Ｈ_２Ｏ_２、ＨＯ^・、ＲＯＯ^・等と反応し２、７−ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎに変化し蛍光を発する。特に、ＤＣＦＨのジアセタトエステルは、脂溶性が高く細胞膜を良く透過し、かつ細胞内で酵素エステラーゼの働きによりＤＣＦＨに変換される。このように変換されると、今度は細胞膜を透過しないので、細胞内に滞留し効果的なイメージングが可能である。

また、Ｐｅｒｏｘｙｒｅｓｏｒｕｆｉｎ−１（ＰＲ１）、
Ｐｅｒｏｘｙｆｌｕｏｒ−１（ＰＦ１）、及びＰｅｒｏｘｙｘａｎｔｈｏｎｅ（ＰＸ−１）は、Ｈ_２Ｏ_２と特異的に反応し蛍光を発すると報告されている（非特許文献８）。この他、
２−［６−（４′−ｈｙｄｒｏｘｙ）ｐｈｅｎｏｘｙ−３Ｈ−ｘａｎｔｈｅｎ−３−ｏｎ−９−ｙｌ］ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ（ＨＰＦ）及び２−［６−（４′−ａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｏｘｙ−３Ｈ−ｘａｎｔｈｅｎ−３−ｏｎ−９−ｙｌ］ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ（ＡＰＦ）が報告されている（非特許文献９及び１０）。これらはＨＯ^・又はＨＯＣｌ等の高活性酸素種（ｈｉｇｈｌｙ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ）と反応し、蛍光を発する。その他にも多数が開発・報告されている（非特許文献７）。

これらのプローブは非常に便利であり、活性酸素種のイメージングによく使われている。しかし、これらのプローブは、あくまで活性酸素種を検出するものであり、レドックス状態自体を直接検出するものではない点注意する必要がある。このため、これらの蛍光プローブを用いて活性酸素種が検出されたとしても、それが常に細胞のレドックス状態変化を反映しているかどうかは分からない。極端な場合、もしプローブと活性酸素種の反応性が非常に高いと、通常なら生体の抗酸化作用で分解され、生理学的に問題とならないような活性酸素種をも検出してしまう可能性がある。また、大きな問題点として、プローブと活性酸素種との反応が非可逆的であるという点がある。このため、プローブが一度、活性酸素種と反応してしまうと発光性に変化したままとなり、その後活性酸素種濃度が低下しても、それに対応した発光強度の変化は現れない。つまり、これらのプローブを用いて、レドックス状態のダイナミックな変化を計測又はイメージングすることは非常に難しい。

上とは逆に、フリーＳＨ基と特異的に反応する発光プローブも報告されている。このようなプローブには、例えば、ｍｏｎｏｃｈｌｏｒｏｂｉｍａｎｅ、ｍｏｎｏｂｒｏｍｏｂｉｍａｎｅ、５−ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ、及び７−ａｍｉｎｏ−４−ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎがあり（非特許文献１１）、これらを用いて、細胞の酸化ストレスを計測することも可能と報告されている。しかし、これらのプローブとＳＨ基との反応も不可逆的であり、前記した活性酸素種と反応する発光プローブと同じ欠点がある。

同じく発光測定によるものであるが、タンパクの構造変化を利用したプローブも報告されている。変化の要因としては、主にシステインチオール基の酸化還元が利用される。このような変化は、実際に細胞内でレドックス状態変化に対応して起こっていると考えられるので、これらのプローブは、細胞生理学的に意味のある変化を検出できると期待できる。

そのようなタンパクプローブの代表的な例が、緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）の変異体であるレドックス感受性ＧＦＰである（非特許文献１２及び１３）。これは、自身のシステインチオール基の酸化還元に応答し、蛍光特性が変化するよう変異を加えたＧＦＰである。この変化は可逆的であるので、細胞等のレドックス状態の変化をリアルタイムに可視化することができる。しかし、ＧＦＰはまず遺伝子として細胞内に導入する必要がある。このため、測定したい細胞に安定に導入できるか、また遺伝子が安定に発現するかという問題点が常につきまとい、常にこの方法が適用できるかは分からない。

この他、メタロチオネインを利用した方法が報告されている（非特許文献１４）。ここでは、メタロチオネインに二つの蛍光基（Ａｌｅｘａ４８８と５４６）がラベルされ、レドックス変化に対応し、両蛍光基間のＦＲＥＴが変化する。しかし、この場合、細胞のイメージングのためには、この二重ラベルしたタンパクを細胞内に導入する必要があり、使い勝手は良くない。

タンパクに基づかない比較的低分子量の化合物で、レドックス状態の変化に対応し可逆的に酸化還元するプローブがあれば、使い易く便利である。このようなプローブは、発色変化を利用するものも加えると数多くあるが、これらはむしろ、酵素及び補酵素と共に使われ特定の化学物質の検出に使用されている。例えば、レザズリン、アラマーブルー（特許文献４）、ベンゾフラザン−Ｎ−オキシド誘導体（ＮＢＤ−ａｍｉｎｅ−Ｎ−ｏｘｉｄｅ）（特許文献５）、及びキノン−フルオレセイン（特許文献６）が報告され、応用例としてグルコースアッセイ等が報告されている。

グルコースアッセイでは、グルコースはグルコースデヒドロゲナーゼにより酸化され、その際、ＮＡＤ^＋が還元されＮＡＤＨが生成する。ここに酵素ジアフォラーゼを共存させることで、これらのプローブは、ＮＡＤＨにより還元され、それぞれ対応する発光性物質に変化する。このように、この還元作用には酵素ジアフォラーゼが必要であり、単独での還元性物質との反応は起こっても非常に遅いと考えられる。このため、これらのプローブを、生体のレドックス状態計測又はイメージングに使うことは難しい。また、［Ｒｕ^３（ｂｐｙ）_３］^３＋も報告されている（非特許文献１５）。これは単独で生体物質と反応するが、反応性が高すぎ、水溶液中（ｐＨ＝８）での半減期は約５分に過ぎない。このため、このプローブも生体レドックス状態計測又はイメージングには使用できない。

酸化還元電位及び生体物質との反応性がより適当な化合物として、ニトロキシルラジカル化合物が知られている。これらを用いたｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−ｎｉｔｒｏｘｙｌ（非特許文献１６）、ｈｅｍａｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ−ｎｉｔｒｏｘｙｌ（非特許文献１７）、及びｐｙｒｅｎｅ−ｎｉｔｒｏｘｙｌ（非特許文献１８）が報告されている。これらについて、アスコルビン酸（非特許文献１６）及びＦｅ（２価）（非特許文献１８）によるニトロキシルラジカルの還元に伴う蛍光の増強も報告されており、これまで述べてきたものの中では、生体レドックス状態に対する可逆的かつ使いやすいプローブとして最も有望である。しかし、これらの蛍光体（ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ、ｈｅｍａｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ、ｐｙｒｅｎｅ）を含む一般の有機蛍光体には、夾雑物による蛍光やバックグラウンド蛍光の影響を強く受けるという欠点があり、試料によっては、これらのためまともな測定ができなくなる場合もある。

以上のように、細胞レベルでの詳細なレドックスシグナルや酸化ストレス応答研究には、発光プローブの使用が最適であるが、多くの発光プローブは、その発光オンへの変化が非可逆的であるという問題がある。数は少ないが、タンパクを基にしたプローブでは、可逆的な発光のオン／オフが報告されているものはある。しかし、これらは分子量が大きいため、細胞に導入するには高度な技術が必要である。また、ニトロキシルラジカルの消光能を利用した低分子量可逆型プローブも報告されているが、現在知られているものは、全て夾雑物による蛍光やバックグラウンド蛍光の影響を強く受けるという欠点がある。これらの理由のため、現在、レドックス状態のダイナミックな変化をリアルタイムに追跡することは難しく、細胞のレドックスシグナル及び酸化ストレスへの応答についてのより詳細な研究の障害となっている。

特開２００２−１２２６４６号公報 特開２００４−２２９６１３号公報 特開２００４−５１８４３３号公報 特開平１０−３３１９６号公報 特開２００４−２６４２９６号公報 特開２００４−２５８０２１号公報 特開２００１−３３５５７４号公報 「酸化ストレスマーカー」、二木鋭雄・内田浩二・野田範子編、学会出版センター、２００５年６月 Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｈｅａｌｔｈ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ． ２００４、１１２、６６６−６７１ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００３、４２、３４７３−３４８０ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００１、９８、９８４２−９８４６ Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２、２、１２０−１２３ Ａｐｐｌ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．２００３、２５、２１７−２２５ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００５、６５、４５−８０ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００５、１２７、１６６５２−１６６５９ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００３、２７８、３１７０−３１７５ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓ．２００５、５３、３０４−３１３ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐａｒｔ Ａ ２００３、５１Ａ、１６−２５ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００４、２７９、１３０４４−１３０５３ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００４、２７９、２２２８４−２２２９３ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ２００３、１００、２２５５−２２６０ Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９、７１、１５０４−１５１２ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． １９８８、１１０、１９１５−１９１７ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９０、１１２、７３３７−７３４６ Ｓｐｅｃｔｒｏｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ Ｐａｒｔ Ａ ２００６、６３、４３８−４４３ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９２、３１、７０３−７１１ Ａｎａｌ．Ｓｃｉ．２００２、１８、８６９−８７４ Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００１，７３、１８６９−１８７６ Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００６、７８、５２９６−５３０１

本発明の課題は、細胞レベルでの詳細なレドックスシグナルや酸化ストレス応答を検出するために最適の、発光プローブを提供することにある。特に、以下のような特徴を持ったレドックス応答性発光プローブ、及びこの発光プローブを用いた各種の検出方法を提供することにある。その特徴は、（１）生体又は生体に関連したレドックス状態変化に、可逆的又はほぼ可逆的に応答する性質を有すること、（２）夾雑物による蛍光やバックグラウンド蛍光の影響を受けにくく、高感度測定が可能であること、（３）タンパクをベースとしない化合物であり、細胞等による発現を必要とせず、簡便に様々な系に適用することができるものであることである。

本発明者らは、これまでの研究成果に基づき、新規なレドックス状態計測用、即ち、レドックス応答性発光プローブを着想した。即ち、本発明は、酸化又は還元が可能な原子団（レドックス原子団ということもある）及び発光ランタニドキレート原子団の両原子団を、一分子内に含む化合物からなるレドックス応答性発光プローブである。本発明の発光プローブの特徴は、少なくとも、酸化又は還元可能な原子団と発光ランタニドキレート原子団の両原子団を、同一分子内に持つことである。なお、本発明における発光ランタニドキレート原子団は、後述のように、励起光を受けるアンテナ部と希土類イオンをキレートするキレート配位子部と希土類イオンから形成される。

本発明のようなランタニドキレートに基づいたレドックス応答型発光プローブは、これまで提案されていなかった。確かに、非特許文献１９において、ニトロキシルラジカルがＴｂ^３＋錯体の発光を消光する一方、その還元体は消光能を示さないことが報告されている。しかし、このケースでは、溶液中で両者を単に混合して実験しただけであり、ニトロキシルラジカルとＴｂ^３＋錯体を結合させ一分子のプローブとした訳ではない。また、特許文献６には、新しいレドックス検出発光プローブが開示され、その中で請求項において、発光基としてランタニドキレート、消光基としてスピンプローブ（ニトロキシルラジカル）が挙げられている。しかし、この文献では、具体的にはキノン−フルオレセイン系しか報告しておらず、ランタニドキレートに基づくプローブについての具体的な言及は全くない。ランタニドキレートの発光機構は、フルオレセイン等の通常の有機蛍光色素のそれと異なっており、有機蛍光色素系での知識だけでは、実際に使用可能なランタニドキレート系レドックス応答発光プローブを構築することは困難である。本発明は、これを克服し、実際に使用可能なランタニドキレート系レドックス応答性発光プローブを初めて提供し得たものである。

本発明のレドックス応答性発光プローブは、例えば、細胞又は組織切片のレドックス状態の計測及びイメージングに用いることができる。また、表面又は表面に近い位置についてであれば、厚みのある組織及び生物そのものも対象とすることができる。本発光プローブの蛍光オン／オフはほぼ可逆的なので、これらの計測及びイメージングにおいて、レドックス状態のダイナミックな変化の観察を容易に行うことができる。

この他、本発明の発光プローブは、血液、尿、唾、汗、組織ホモジネートなどについても、未処理試料又は適切に処理された試料を対象に、レドックス状態の評価、診断又は計測を行うことができる。また、果物、野菜、若しくは、その他の健康食品等の試料についても、未処理試料又は適切に処理された試料を対象に、抗酸化能の評価又は計測を行うことが可能である。

更に、この他、適当な１又は２種類以上の酵素（代表的にはデヒドロゲナーゼとジアフォラーゼの２種類）及び補酵素（代表的にはＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ）と共に用いることで、様々な化合物の検出又は定量を行うこともできる。検出又は定量できる化合物の例としては、糖類、アルコール類、アルデヒド類、ステロイド類、キサンチン、クエン酸、乳酸、ピルビン酸、アミノ酸、テトラヒドロ葉酸、クレアチニン、クレアチン、サルコシン、又はグリセロールを挙げることができる。

以上のように、本発明の発光プローブは、様々な系においてレドックス状態の評価、計測、及びイメージング、並びに特定の化合物の検出及び定量に用いることができる。更に、これらの用途において、本プローブを用いることにより時間分解発光測定が可能となり、夾雑物による蛍光やバックグラウンド蛍光を除去した、高感度な計測を行うことができるようになる。

本発明のレドックス応答性発光プローブは、酸化又は還元が可能な原子団と発光ランタニドキレート原子団の両原子団を一分子内に含むものである。本発明における酸化又は還元が可能な原子団、あるいは発光ランタニドキレート原子団としては、以下に具体的に述べるようなものが好ましいが、それらに限定されるものではなく、それらと化学的性質が同様又は類似した類縁体や誘導体等の、その他の酸化又は還元可能な原子団又は発光ランタニドキレート原子団も含まれる。

本発明のレドックス応答性発光プローブとして用いられる、酸化又は還元が可能な原子団及び発光ランタニドキレート原子団の両原子団を一分子内に含む化合物として好ましいものは、希土類イオンと下記式１で表される配位性化合物との錯化合物である。そして、本発明において、特に好ましいのは、実施例１に式１４として示される、酸化又は還元が可能なニトロキシルラジカル類を含む原子団と、発光ランタニドキレート原子団の両原子団を一分子内に含む錯化合物である。

（式１中、Ａｒ^１、Ａｒ^２及びＡｒ^３は、希土類イオンに配位可能なヘテロ原子を少なくとも一つ含む複素環であり、Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^３は、それぞれ独立に水素原子、アリール基、置換基を有するアリール基、複素環基、又は置換基を有する複素環基であり、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓは独立に１〜３であり、Ｑは酸化又は還元が可能な原子団であり、ＹはＮＨ又はＯを示す。）

前記式１において、Ａｒ^１、Ａｒ^２及びＡｒ^３は、希土類イオンに配位可能なヘテロ原子を少なくとも一つ含む複素環であれば特に制限はなく、五員環でも六員環でも、また２〜３の環からなる縮合環であっても良い。Ａｒ^１、Ａｒ^２及びＡｒ^３間の結合並びにＲ^１、Ｒ^２及びＲ^３基との結合は、Ｃ−Ｃ原子間、Ｃ−ヘテロ原子間及びヘテロ−ヘテロ原子間のいずれであっても良い。Ａｒ^１と（ＣＨ_２）_ｍ、及びＡｒ^３と（ＣＨ_２）_ｎ間の結合についても、Ａｒ^１、Ａｒ^３中の結合に使われる原子は、炭素原子及びヘテロ原子のどちらでも良い。また、Ａｒ^１、Ａｒ^２及びＡｒ^３は、全て同じであっても、一つだけ異なっても、また三つとも異なっても構わない。Ａｒ^１、Ａｒ^２及びＡｒ^３の好ましい例としては、ピラゾール、ピリジン、イミダゾール、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、１Ｈ−トリアゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、フラザン、ベンゾフラン、イソベンゾフラン、インドール、イソインドール、キノリン、イソキノリン及びこれらの誘導体が挙げられる。

本発明の好ましい化合物としては、より具体的には、希土類イオンと下記式２又は式３で表される配位性化合物との錯化合物が挙げられる。

（式２及び式３中、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓは独立に１〜３、Ｑは酸化又は還元が可能な原子団、Ｒはアリール基、置換基を有するアリール基、複素環基、又は置換基を有する複素環基、ＹはＮＨ又はＯを示す。）

更に、本発明の化合物としては、希土類イオンと下記式４、式５又は式６のいずれかで表される配位性化合物との錯化合物も好ましい。

（式４、式５及び式６中、ｌ、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓは独立に１〜３、Ａはアンテナ基、Ｑは酸化又は還元が可能な原子団、Ｙ^１、Ｙ^２は独立にＮＨ又はＯを示す。）

本発明の酸化又は還元可能な原子団は、酸化状態又は還元状態でラジカル体であるものが好ましい。このような原子団は、ラジカル体では大きな消光能を示し、非ラジカル体となるとその消光能は低下する。この消光能の変化を利用して、生体試料を含む様々な試料のレドックス状態及びその変化を計測、診断又はイメージングすることができる。

このような酸化又は還元可能な原子団で、酸化状態又は還元状態でラジカル体であるものの例として、ニトロキシルラジカル類（及びその還元体であるヒドロキシルアミン類、及びその酸化体であるオキソアンモニウム類）、キノン類（及びその還元体であるセミキノンラジカル類、ヒドロキノン類、カテコール類）、ｄｉｐｈｅｎｙｌｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌラジカル（ＤＰＰＨ^・）誘導体、及びガルビノキシルラジカル誘導体を挙げることができる。特に好ましい例としては、ニトロキシルラジカル類を挙げることができる。

ニトロキシルラジカル類は、通常の空気・水中ではラジカルとして安定であるが、生体中ではアスコルビン酸等の生体内抗酸化物質により還元され、対応するヒドロキシルアミン体に変化する。このヒドロキシルアミン体は、活性酸素種と反応すると再酸化され、元のニトロキシルラジカル体に戻る。このように、ニトロキシルラジカル体←→ヒドロキシルアミン体の酸化還元はほぼ可逆であり、かつ生体レドックス状態の変化に対応した電位で起こる。このような変化を利用した酸化ストレス計測は、実際に、前記したようにＥＳＲを用いて行われており（特許文献１及び２、並びに非特許文献６）、ニトロキシルラジカル類のレドックス状態の計測用プローブとしての有効性は、ＥＳＲ計測を通して確立している。更に、ニトロキシルラジカル類は、発光体の良いクエンチャーになり得るが、その還元体であるヒドロキシルアミン類にはそのような性質はない（非特許文献１９）。

そこで、ニトロキシルラジカル類と適当な発光体を結合させた化合物は、レドックス応答性蛍光プローブとして特に好ましいと期待される。ニトロキシルラジカル類としては、基本骨格にｐｉｐｅｒｉｄｉｎ−１−ｙｌｏｘｙｌ、ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎ−１−ｙｌｏｘｙｌ、及びｏｘａｚｏｌｉｄｉｎ−３−ｙｌｏｘｙｌを持つものを好ましい例として挙げることができる。

これらの代表例としては、ピペリジニルオキシル骨格を有する下記式７の２、２、６、６−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒｉｄｉｎ−１−ｙｌｏｘｙｌラジカル（ＴＥＭＰＯ^・）がある。

また、ピロリジニルオキシル骨格を有する下記式８の２、２、５、５−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎ−１−ｙｌｏｘｙｌラジカル（ＰＲＯＸＹＬ^・）がある。

また、オキサゾリジニルオキシル骨格を有する下記式９の４、４−ｄｉｍｅｔｈｙｌｏｘａｚｏｌｉｄｉｎ−３−ｙｌｏｘｙｌラジカル（ＤＯＸＹＬ^・）がある。式７〜９の誘導体も好ましい。

一方、発光ランタニドキレートは、長い発光寿命を持つという特長がある。そこで、フラッシュ光照射後に時間分解測定を行うことにより、寿命の短いバックグラウンド蛍光を除去することができ、高感度な測定が可能である。この性質は実際に、イムノアッセイを代表とするバイオ分析に応用され、様々な分析物の高感度検出を可能にしてきた（例えば、非特許文献２０）。そこで、発光ランタニドキレート原子団とニトロキシルラジカル等の酸化又は還元が可能な原子団を組み合わせることにより、これまでにないバックグラウンド蛍光フリーなレドックス状態計測プローブが実現される。

本発明における発光ランタニドキレート原子団は、更に、励起光を受けるアンテナ部、希土類イオンをキレートするキレート配位子部、及び希土類イオンに分けることができる。ここで、それぞれの部分は理解をしやすくするため分けたものであり、実際はアンテナ部やレドックス原子団がキレートの役割を兼ねる等の重複があっても構わない。

アンテナ部としては、３００〜４５０ｎｍの光を吸収し、それ自体蛍光性である原子団を用いることができる。このような例としては、クマリン、キノロン（カルボスチリル等）、ビフェニル、テルフェニル、ビピリジン、テルピリジン、ビス（ピラゾリル）ピリジン、ビス（ピリジル）トリアゾール、ビス（ピリジル）チアゾール、ビス（チアゾリル）ピリジン、フェナントロリン、ピラゾロン、キノリン、イソキノリン、ヒドロキシイソフタルアミド、及びこれらの誘導体が挙げられる。

希土類元素としては、スカンジウムＳｃ、イットリウムＹ、１５種のランタニドがあるが、本発明の希土類イオンとしては、可視部又は近赤外部に発光を持つものであればどれでも良い。好ましくは、Ｅｕ^３＋（ユウロピウムイオン）、Ｔｂ^３＋（テルビウムイオン）、Ｄｙ^３＋（ジスプロシウムイオン）、Ｓｍ^３＋（サマリウムイオン）を用いることができる。より好ましくは、Ｅｕ^３＋及びＴｂ^３＋である。Ｅｕ^３＋及びＴｂ^３＋のどちらがより好ましいかは、適用する系や使用したい励起波長／検出波長に依存する。また、両方同時に用い、二色アッセイを行っても良い。ただし、ニトロキシルラジカルによる消光はＴｂ^３＋の方が効率が良いので、単色使用の場合はＴｂ^３＋の使用が最も好ましい。

キレート配位子部は、希土類イオンと強く結合する構造を持つ必要がある。そこで、例えば、下記式１０に示すような複数のカルボキシル基を持つ化合物又はその誘導体を用いることができる。

（式１０中、ｌ、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓは独立に１〜３を表す。ｌ＝ｍ＝ｎ＝ｐ＝ｑ＝ｒ＝ｓ＝１の場合は、ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅｐｅｎｔａａｃｅｔａｔｅ（ＤＴＰＡ^５−）に相当する。）

この他、ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔａｔｅ（ＥＤＴＡ^４−）、１、４、７、１０−ｔｅｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｄｏｄｅｃａｎｅ−１、４、７、１０−ｔｅｔｒａａｃｅｔａｔｅ（ＤＯＴＡ^４−）、及びこれらの誘導体も例として挙げることができる。

また、アンテナ部を複数のカルボキシル基で挟んだ骨格を持つ、下記式１１で示される化合物又はその誘導体を「アンテナ部＋キレート配位子部」として用いることもできる。

（式１１中、Ａｒ^１、Ａｒ^２及びＡｒ^３は、希土類イオンに配位可能なヘテロ原子を少なくとも一つ含む複素環であり、Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^３は、それぞれ独立に水素原子、アリール基、置換基を有するアリール基、複素環基、又は置換基を有する複素環基であり、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓは独立に１〜３である。）

前記式１１において、Ａｒ^１、Ａｒ^２及びＡｒ^３の好ましい例として、ピラゾール、ピリジン、イミダゾール、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、１Ｈ−トリアゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、フラザン及びこれらの誘導体を挙げることができる。Ａｒ^１、Ａｒ^２及びＡｒ^３は、お互いに異なっていてもかまわない。

また、前記式１１に含まれる化合物の中で特に好ましい例として、下記式１２と式１３の化合物を挙げることができる。

（式１２及び式１３中、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓは独立に１〜３、Ｒは水素原子、アリール基、置換基を有するアリール基、複素環基、又は置換基を有する複素環基を示す。）

この他、カルボキシル基を持たない構造でも、クリプタンド型構造は希土類イオンと安定な錯体を形成するので、キレート配位子部として用いることができる。例えば、キレート配位子部とアンテナ部が一緒になった、ｔｒｉｓ（ｂｉｐｙｒｉｄｙｌ）ｃｒｙｐｔａｎｄ構造が好ましい例として挙げられる。更にこの他、β−ジケトナト構造もキレート配位子部として用いることができる。その例として、アンテナ部と一緒になった、４、４″−ｂｉｓ（１、１、１、２、２、３、３−ｈｅｐｔａｆｌｕｏｒｏｈｅｘａｎｅ−４、６−ｄｉｏｎ−６−ｙｌ）−１、１′：２′、１″−ｔｅｒｐｈｅｎｙｌ及びその誘導体を挙げることができる。

以上の各部分は、アンテナ部から希土類イオンへのエネルギー移動、及びレドックス原子団によるこのエネルギー移動の阻害（消光作用を示す時）が効率良く行われるように、適切に配置される必要がある。好ましくは、レドックス原子団は、キレート配位子部、若しくはアンテナ部に隣接しているのが良い。より好ましくは、レドックス原子団がキレート配位子部に隣接している構造が良い。例として、ポリカルボキシラト型配位子を用いたキレートの場合は、その一つのカルボニル炭素に、共有結合によりレドックス原子団がつながった構造を挙げることができる。具体的には、前記式１０と１１の場合について述べると、一つのカルボキシル基にレドックス原子団をアミド結合又はエステル結合等で連結させた構造が挙げられる。式１０の場合は、アンテナ部を更にこの骨格に結合させる必要がある。この場合、例えば、残ったカルボキシル基の内の一つにアミド結合又はエステル結合などで連結させることにより、アンテナ部も希土類イオンに隣接して配置させることができる。つまり、式１０の化合物をキレート配位子部に用いた場合には、式４〜６のような構造の配位性化合物と希土類イオンとの錯化合物が好ましい態様となる。また、式１１の化合物を「アンテナ部＋キレート配位子部」に用いた場合には、式１のような構造の配位性化合物と希土類イオンとの錯化合物が好ましい態様となる。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。

Ｌｎ^３＋−Ｌ^３−・（下記式１４）の合成（Ｌｎ^３＋＝Ｅｕ^３＋又はＴｂ^３＋； Ｌ^３−・＝４−（Ｎ−｛［１−（２−｛３−［Ｎ、Ｎ−ｂｉｓ（ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｏｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｍｅｔｈｙｌｐｙｒａｚｏｌ−１−ｙｌ｝−４−ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｉｄｉｎ−６−ｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌ−３−ｙｌ］ｍｅｔｈｙｌ｝−Ｎ−｛ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｏｍｅｔｈｙｌ｝ａｍｉｎｏ）ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−２、２、６、６−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒｉｄｉｎ−１−ｙｌｏｘｙｌ （ＢＰＴＡ^３−−ＴＥＭＰＯ^・） ）について説明する。

先ず、文献（特許文献７及び非特許文献２１）記載の方法により、下記式１５の［１、１′−（４−ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ−２、６−ｄｉｙｌ）ｄｉｐｙｒａｚｏｌｅ−３、３′−ｄｉｙｌ］ｂｉｓ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｎｉｔｒｉｌｏ）ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ （Ｈ_４ＢＰＴＡ）を合成した。

４−ａｍｉｎｏ−２、２、６、６−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒｉｄｉｎ−１−ｙｌｏｘｙｌ（ａｍｉｎｏ−ＴＥＭＰＯ^・）、及びｅｔｈｙｌｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ （ＤＩＰＥＡ）はＡｌｄｒｉｃｈ株式会社より購入したものを用いた。Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＨＯＳｕ）及びｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＤＣＣＩ）は関東化学（株）より購入したものを用いた。

［Ｌｎ^３＋−Ｌ^３−・の合成］
Ｈ_４ＢＰＴＡ ２．３ｍｇ（４．０μｍｏｌ）、ＨＯＳｕ １．１５ｍｇ（１０．０μｍｏｌ）、及びＤＣＣＩ ０．８２ｍｇ（４．０μｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ ２００μＬ中、アルゴン雰囲気下で一晩攪拌し、［１−（２−｛３−［Ｎ−（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）−Ｎ−（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｏｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｍｅｔｈｙｌｐｙｒａｚｏｌ−１−ｙｌ｝−４−ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｉｄｉｎ−６−ｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌ−３−ｙｌ］ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ−Ｎ、Ｎ−ｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ （Ｈ_３ＢＰＴＡ−ＯＳｕ）のＤＭＦ溶液を得た。

次いで、このＨ_３ＢＰＴＡ−ＯＳｕのＤＭＦ溶液（全量反応したと仮定して２０ｍＭ溶液）５０μＬにａｍｉｎｏ−ＴＥＭＰＯ^・の１００ｍＭＤＭＦ溶液５０μＬ及びＤＩＰＥＡ １μＬを加え、アルゴン雰囲気下で更に一晩攪拌した。一晩攪拌した反応液に、蒸留水５０μＬ加え、更に１８５μＬの蒸留水に溶解したＥｕＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ １．８３ｍｇ又はＴｂＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ １．８７ｍｇを加えた。一晩放置した後、以下のごとく逆相ＨＰＬＣによる精製を行った。

［Ｌｎ^３＋−Ｌ^３−・の逆相ＨＰＬＣ精製］
逆相ＨＰＬＣは、分析時は日本分光（株）製ＧＵＬＬＩＶＥＲシリーズＨＰＬＣ装置及び分取時は（株）島津製作所製ＬＣ−８Ａ ＨＰＬＣ装置を用いて行った。条件は以下のとおりである。

（ＨＰＬＣ条件）
使用カラム：ウォーターズ株式会社製Ｘｔｅｒｒａ ＭＳ Ｃ１８カラム（分析時）。
ジーエルサイエンス株式会社製Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＷＰ３００ Ｃ８カラム（分取時）。
溶離液：Ａ、酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）水溶液（１００ｍＭ、ｐＨ＝７．４）。
Ｂ、アセトニトリル。
グラディエント：ｔ = ０ 〜２ｍｉｎ、Ａ：Ｂ＝９５：５。
ｔ = ２〜４５ｍｉｎ、Ａ：Ｂ＝９７−（ｔ／ｍｉｎ）：３＋（ｔ／ｍｉｎ）。
流量：１ｍＬ／ｍｉｎ。
カラム温度：６０℃。
検出法：紫外可視吸収、２６０ｎｍ吸光度。
発光（分析時のみ）、３２０ｎｍ励起 ５４５ｎｍ発光（Ｔｂ^３＋の場合）。
３４０ｎｍ励起 ６１５ｎｍ発光（Ｅｕ^３＋の場合）。

（精製）
前記合工程で得られた反応液を、ＴＥＡＡ水溶液（１００ｍＭ、ｐＨ＝７．４）で１０倍希釈し、ＨＰＬＣを行った。Ｅｕ^３＋及びＴｂ^３＋に対して得られたクロマトグラムをそれぞれ図１（Ｅｕ^３＋の場合）及び図２（Ｔｂ^３＋の場合）に示した。保持時間から、ピークＩ及びピークIIは、それぞれ未反応で残ったａｍｉｎｏ−ＴＥＭＰＯ及び［Ｌｎ^３−ＢＰＴＡ］⁻によるものと決定され、ピークIIIが反応物によるピークと考えられた（図１及び図２のＡ）。そこで、ピークIIIの分取を行った（図１及び図２のＢ）。

ここで、ピークIIIは、よく見ると主ピークであるピークIIIｂの前に、弱いピーク（ピークIIIａ）が観測された。ピークIIIｂはＬｎ−Ｌ^・、そしてピークIIIａは、合成等の過程で、次のような反応で、ニトロキシルラジカルがヒドロキシルアミンに還元されたＬｎ−ＬＨによるピークと考えられる。Ｌｎ−Ｌ^・＋ｅ⁻ → Ｌｎ−Ｌ⁻、Ｌｎ−Ｌ⁻ ＋ Ｈ^＋ → Ｌｎ−ＬＨ。（分取に当たっては、ピークIIIａの強度は非常に小さいので、ピークIIIｂのみを取った。）

ピークIIIの分取した溶液を真空乾燥させ、得られた残渣をエタノールに溶解し保存した。得られたＬｎ−Ｌ^・の量は、そのモル吸光係数が、［Ｌｎ^３−ＢＰＴＡ］⁻のそれとａｍｉｎｏ−ＴＥＭＰＯのそれとの和に等しい（ε_{３２５ｎｍ}＝１０，９９０Ｍ^−１ｃｍ^−１、但し１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーｐＨ＝７．４中）と仮定して、吸光度より算出した。このようにして計算した収率は２８％であった。なお、後述するように、生成物には少量Ｌｎ−ＬＨが混じっていたので、以降Ｌｎ−Ｌ^・／ＬＨと記す。

［Ｌｎ−Ｌ^・／ＬＨのマススペクトルによる確認］
前記のごとくして合成・精製したＬｎ−Ｌ^・／ＬＨを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ測定により確認した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳは、アプライドバイオシステムズ（株）製Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥを用いて測定した。マトリックスとしては、α−ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ（αＣＨＣＡ） （１０ｍｇ／ｍＬ ｉｎ ５０：５０ Ｈ_２Ｏ／ＭｅＣＮ）を用いた。なお、ＬＨは、前述したように（Ｌｎ−Ｌ^・＋ｅ⁻ → Ｌｎ−Ｌ⁻、Ｌｎ−Ｌ⁻ ＋ Ｈ^＋ → Ｌｎ−ＬＨ）、Ｌ^・のニトロキシルラジカル部分が、一電子還元されプロトンが付加したことを示す。このような還元はイオン化の際にも起こることが報告されている（非特許文献２２）。

ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（＋）の結果は以下のとおりであった。
Ｅｕ−Ｌ^・／ＬＨ：ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ^１２Ｃ_３６ ^１Ｈ_４１ ^１５３Ｅｕ^１４Ｎ_９ ^１６Ｏ_８（Ｅｕ^３＋−Ｌ^３−・）、ｍ＝８８０．２３；
ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ＝８８２．３８（１００％）（［Ｅｕ−ＬＨ＋Ｈ］^＋）、
８８１．２６（９５．８％）（［Ｅｕ−Ｌ^・＋Ｈ］^＋）。
Ｔｂ−Ｌ^・／ＬＨ：ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ^１２Ｃ_３６ ^１Ｈ_４１ ^１４Ｎ_９ ^１６Ｏ_８ ^１５９Ｔｂ（Ｔｂ^３＋−Ｌ^３−・）、ｍ＝８８６．２３；
ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ＝８８８．５９（１００％）（［Ｔｂ−ＬＨ＋Ｈ］^＋）、
８８７．４６（９１．２％）（［Ｔｂ−Ｌ^・＋Ｈ］^＋）。

Ｌｎ−Ｌ^・／ＬＨの発光に対するアスコルビン酸（ＶＣ）添加の効果

Ｌｎ−Ｌ^・／ＬＨの発光に対するアスコルビン酸添加の影響を調べた。Ｌｎ^３＋からの発光強度測定は、（株）パーキンエルマー製Ｗａｌｌａｃ１４２０ ＡＲＶＯ ＳＸプレートリーダーを用い、時間分解法により行った。測定条件は以下のとおりである。

（プレートリーダーによる時間分解発光測定条件）
Ｅｕ^３＋測定の場合：励起波長、３４０ｎｍ；検出波長、６１５ｎｍ；Ｄｅｌａｙ ｔｉｍｅ、０．１ｍｓ；Ｗｉｎｄｏｗ ｔｉｍｅ、１．５ｍｓ；Ｃｙｃｌｅ ｔｉｍｅ、２．０ｍｓ。
Ｔｂ^３＋測定の場合：励起波長、３２０ｎｍ；検出波長、５４５ｎｍ；Ｄｅｌａｙ ｔｉｍｅ、０．５ｍｓ；Ｗｉｎｄｏｗ ｔｉｍｅ、１．０ｍｓ；Ｃｙｃｌｅ ｔｉｍｅ、２．０ｍｓ。
共通：使用プレート、ナルジェヌンクインターナショナル（株）製ＮＵＮＣ３８６穴プレート（ブラック）。

実施例１で得られたＬｎ−Ｌ^・／ＬＨのエタノール溶液（８６μＭ）を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ＝７．４、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む)で１００倍希釈し、それを２０μＬずつウェルに分注した。更に、それらのウェルに、ＭＬＱ水（コントロール用）、０．１ｍＭアスコルビン酸水溶液、又は１ｍＭアスコルビン酸水溶液を２μＬ加え、時間分解発光測定を行った。それぞれの終濃度は、［Ｌｎ−Ｌ^・／ＬＨ］＝０．７８μＭ、［ＶＣ］＝０、９．１μＭ、９１μＭとなる。結果を図３に示した。

図３のＡ（Ｔｂ^３＋の場合）とＢ（Ｅｕ^３＋の場合）から、アスコルビン酸によって、
Ｌｎ^３＋−Ｌ^３−・＋１／２ＶＣ（還元型）→Ｌｎ^３＋−ＬＨ^３−＋１／２ＶＣ（酸化型）という反応が起こることにより、Ｌｎ^３＋による発光強度が増加していることが分かる。

Ｌｎ−Ｌ^・／ＬＨの発光に対するＫ_３Ｆｅ（ＣＮ）_６（ＫＦＣ）添加の効果

実施例２の結果では、ＭＬＱ水のみを加えた場合でも比較的高い発光値を示していた。これは、単離した化合物に、還元体Ｌｎ−ＬＨが混じっているためと考えられる。そこで、酸化剤としてＫＦＣを添加した時の発光の変化を調べた。実施例２と同じように、実施例１で得られたＬｎ−Ｌ^・／ＬＨエタノール溶液を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ＝７．４、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む)で１００倍希釈し、２０μＬをウェルに分注した。更に、ウェルに、ＭＬＱ水（コントロール用）又は０．１ｍＭ ＫＦＣ水溶液を２μＬ加え、時間分解発光測定を行った。結果を図４に示した。終濃度は、［Ｌｎ−Ｌ^・／ＬＨ］＝０．７８μＭ、［ＫＦＣ］＝０（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、９．１μＭである。

図４のＡ（Ｔｂ^３＋の場合）とＢ（Ｅｕ^３＋の場合）は、ＫＦＣ添加後１００分経過した時の結果を示している。図４から分かるように、Ｅｕ^３＋錯体についてはほとんど差が見られなかったが、Ｔｂ^３＋錯体では発光強度の減少が観測された。更に一晩おいたが、この後はＴｂ^３＋及びＥｕ^３＋錯体の発光強度は図の値で安定し、殆ど変化は見られなかった（図示せず）。

Ｌｎ−Ｌ^・／ＬＨの発光に対するアスコルビン酸（ＶＣ）添加の効果（２）

ＫＦＣで完全に酸化したＬｎ−Ｌ^・／ＬＨに、アスコルビン酸を添加し発光の変化を調べた。実施例１で得られたＬｎ−Ｌ^・／ＬＨエタノール溶液を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ＝７．４、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む)で１００倍希釈し、２０μＬづつウェルに分注した。更に、それらのウェルに０．１ｍＭ ＫＦＣ水溶液を２μＬ加え、系を十分安定させるため２００分置いた。その間、時間分解発光測定を行った。２００分置いた後、ウェルにＭＬＱ水（コントロール用）又は１ｍＭアスコルビン酸水溶液を２μＬ加え、引き続き時間分解発光測定を行った。結果を図５に示した。終濃度は、［Ｌｎ−Ｌ^・／ＬＨ］＝０．７２μＭ、［ＫＦＣ］＝８．３μＭ、［ＶＣ］＝０（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、８３μＭである。

図５のＡ（Ｔｂ^３＋の場合）とＢ（Ｅｕ^３＋の場合）から、アスコルビン酸による発光強度の増加が観測され、例えば、アスコルビン酸添加１２０分後での発光強度は、アスコルビン酸無添加（コントロール）のそれと比較し、それぞれＴｂ^３＋錯体で１４倍、Ｅｕ^３＋錯体で３．４倍に増強したことが分かる。

Ｌｎ−Ｌ^・／ＬＨの発光に対する過酸化水素添加の効果

Ｌｎ−Ｌ^・／ＬＨに、過酸化水素水を添加した時の発光の変化を調べた。実施例１で得られたＬｎ−Ｌ^・／ＬＨエタノール溶液を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ＝７．４、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む)で１００倍希釈し、２０μＬずつウェルに分注した。更に、ウェルにＭＬＱ水（コントロール用）、１ｍＭ過酸化水素水、１０ｍＭ過酸化水素水、又は１００ｍＭ過酸化水素水を２μＬ加え、時間分解発光測定を行った。９分〜２２時間の間測定を行ったが、基本的に発光強度の変化は見られなかった。過酸化水素水添加１８０分後の結果を、図６のＡ（Ｔｂ^３＋の場合）とＢ（Ｅｕ^３＋の場合）に示した。終濃度は、［Ｌｎ−Ｌ^・／ＬＨ］＝０．７８μＭ、［Ｈ_２Ｏ_２］＝０（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、０．０９１ｍＭ、０．９１ｍＭ、９．１ｍＭである。過酸化水素単独では反応性が低いことが知られているので、この結果は妥当なものである。

Ｌｎ−Ｌ^・／ＬＨの発光に対する過酸化水素及びＦｅ^２＋イオン添加の効果

過酸化水素は、Ｆｅ^２＋イオンが共存すると以下のようなフェントン様反応により、ヒドロキシルアミンの酸化が促進されることが期待される。
Ｈ_２Ｏ_２＋Ｆｅ^２＋ →
ＨＯ^・＋ＨＯ⁻＋Ｆｅ^３＋
ＨＯ^・＋Ｌｎ−ＬＨ → Ｈ_２Ｏ＋Ｌｎ−Ｌ^・
そこで、Ｌｎ−Ｌ^・／ＬＨ溶液にＦｅＳＯ_４と過酸化水素を同時に加え、発光の変化を観測した。

実施例１で得られたＬｎ−Ｌ^・／ＬＨエタノール溶液を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ＝７．４、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む)で１００倍希釈し、２０μＬずつウェルに分注した。そこにＭＬＱ水（コントロール用）、１ｍＭ過酸化水素水、１０ｍＭ過酸化水素水、又は１００ｍＭ過酸化水素水を２μＬ加えた。これらのウェルに、更に、１ｍＭ ＦｅＳＯ_４ 水溶液２μＬを加え、時間分解発光測定を行った。ＦｅＳＯ_４添加後６０分の結果を図７のＡ（Ｔｂ^３＋の場合）とＢ（Ｅｕ^３＋の場合）に示した。終濃度は、［Ｌｎ−Ｌ^・／ＬＨ］＝０．７２μＭ、［Ｆｅ］＝８３μＭ、［Ｈ_２Ｏ_２］＝０（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、０．０８３ｍＭ、０．８３ｍＭ、８．３ｍＭである。

コントロール及び１ｍＭ過酸化水素水添加では、Ｆｅ^２＋による還元の効果が強く現れ発光強度が増加していることが分かる。これに対し、１０ｍＭ及び１００ｍＭ過酸化水素水添加では、酸化の効果の方が大きく現れ、発光強度の減少が観測された。更に、コントロール及び１ｍＭ過酸化水素水添加でも、一日放置すると発光強度の減少が観測された（図示せず）。これは空気中の酸素による酸化のためと考えられる。

［比較例］
Ｔｂ^３＋−ＢＰＴＡ^４−の発光に対するＫ_３Ｆｅ（ＣＮ）_６（ＫＦＣ）及びアスコルビン酸（ＶＣ）添加の効果（コントロール実験）

コントロール実験として、ニトロキシル基を持たない錯体［Ｔｂ−ＢＰＴＡ］⁻について、その発光に対するＫＦＣ及びアスコルビン酸添加の効果を調べた。先ず、１２５ｎＭ Ｎａ［Ｔｂ−ＢＰＴＡ］の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ＝７．４、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む)溶液を２０μＬずつウェルに分注し、更にＭＬＱ水（コントロール１用）又は０．１ｍＭ ＫＦＣ水溶液（コントロール２及びアスコルビン酸添加サンプル用）を２μＬ加えた。系を十分安定させるため１００分置いた後、ウェルにＭＬＱ水（コントロール１及び２）又は１ｍＭアスコルビン酸水溶液を２μＬ加え、時間分解発光測定を行った。結果を図８に示した。終濃度は、［Ｔｂ−ＢＰＴＡ］⁻＝０．１０４μＭ、［ＫＦＣ］＝０（Ｃｏｎｔｒｏｌ１）、８．３μＭ、［ＶＣ］＝０（Ｃｏｎｔｒｏｌ１及びＣｏｎｔｒｏｌ２）、８３μＭである。［Ｔｂ−ＢＰＴＡ］⁻に対しては、ＫＦＣ添加もアスコルビン酸添加も、発光強度に意味のある変化を与えないことが確認された。

Ｔｂ^３＋−ＬＨ^３−のｅｍｉｓｓｉｏｎ及びｅｘｃｉｔａｔｉｏｎスペクトル

アスコルビン酸添加の効果が大きかったＴｂ錯体について、Ｔｂ−ＬＨのｅｍｉｓｓｉｏｎ及びｅｘｃｉｔａｔｉｏｎスペクトル測定を行った。ｅｍｉｓｓｉｏｎ及びｅｘｃｉｔａｔｉｏｎスペクトル測定は、日本分光社製ＦＰ−６６００ Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒを用い以下の条件で行った。

（Ｅｍｉｓｓｉｏｎ及びｅｘｃｉｔａｔｉｏｎスペクトル測定条件）
Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｂａｎｄｗｉｄｔｈ、１０ｎｍ；
Ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｂａｎｄｗｉｄｔｈ、１０ｎｍ；
Ｒｅｓｐｏｎｓｅ、０．５ｓ；
Ｄａｔａ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒｖａｌ、０．２ｎｍ；
Ｓｃａｎ ｒａｔｅ、２００ｎｍ／ｍｉｎ。

実施例１で得られたＬｎ−Ｌ^・／ＬＨエタノール溶液を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ＝７．４、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む)で１００倍希釈した溶液２ｍＬを蛍光測定用セルに注ぎ、測定を行った。その後、その溶液に１０ｍＭアスコルビン酸水溶液２０μＬを加え、再び測定を行った。結果を、図９に示した。終濃度は［Ｔｂ−Ｌ^・／ＬＨ］＝０．８５μＭ、［ＶＣ］＝９９μＭである。

図１Ａは、Ｅｕ−Ｌ^・／ＬＨ合成反応溶液の逆相ＨＰＬＣクロマトグラムであり、図１Ｂは、保持時間＝１９〜２４分の範囲の拡大図である。 図２Ａは、Ｔｂ−Ｌ^・／ＬＨ合成反応溶液の逆相ＨＰＬＣクロマトグラムであり、図２Ｂは、保持時間＝１９〜２４分の範囲の拡大図である。 図３Ａ及びＢは、それぞれＴｂ−Ｌ^・／ＬＨ及びＥｕ−Ｌ^・／ＬＨの発光に対するアスコルビン酸（ＶＣ）添加の影響をみたものである。グラフ縦軸のＲＬＵは相対発光強度単位（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｕｎｉｔ）を示す（以降の図でも同じ）。 図４Ａ及びＢは、それぞれＴｂ−Ｌ^・／ＬＨ及びＥｕ−Ｌ^・／ＬＨの発光に対するＫ３ＦｅＣＮ_６ （ＫＦＣ）添加の影響をみたものである。 図５Ａ及びＢは、それぞれＫ_３ＦｅＣＮ_６（ＫＦＣ）を含むＴｂ−Ｌ^・／ＬＨ及びＥｕ−Ｌ^・／ＬＨ溶液の発光に対するアスコルビン酸（ＶＣ）添加の影響をみたものである。 図６Ａ及びＢは、それぞれＴｂ−Ｌ^・／ＬＨ及びＥｕ−Ｌ^・／ＬＨの発光に対する過酸化水素水添加の影響をみたものである。 図７Ａ及びＢは、それぞれＦｅＳＯ_４を含むＴｂ−Ｌ^・／ＬＨ及びＥｕ−Ｌ^・／ＬＨ溶液の発光に対する過酸化水素水添加の影響をみたものである。 図８は、Ｋ_３ＦｅＣＮ_６ （ＫＦＣ）を添加した［Ｔｂ−ＢＰＴＡ］⁻溶液の発光に対するアスコルビン酸（ＶＣ）添加の影響をみたものである。 図９Ａは、Ｔｂ−Ｌ^・／ＬＨの発光スペクトルに対するアスコルビン酸添加の効果をみたものである。図９Ｂは、アスコルビン酸添加後の発光（λｅｘ＝３２０ｎｍ）及び励起（λｅｍ＝５４５ｎｍ）スペクトル。＊は励起波長の２倍の位置を示す。

Claims (4)

1. 酸化又は還元が可能なニトロキシルラジカル類を含む原子団及び発光ランタニドキレート原子団の両原子団を一分子内に含む、下記式１４で表される化合物からなるレドックス応答性発光プローブ。
   

   

   
   
2. 前記ランタニドイオンが、Ｅｕ^３＋、Ｔｂ^３＋、Ｓｍ^３＋又はＤｙ^３＋である請求項１記載のレドックス応答性発光プローブ。
3. 請求項１又は２記載のレドックス応答性発光プローブを、試料に接触させることによって酸化又は還元させることを特徴とするレドックス状態の計測又はイメージング方法。
4. 請求項１又は２記載のレドックス応答性発光プローブを、酵素又は補酵素又は両者の存在下に、試料に接触させることによって酸化又は還元させることを特徴とする物質の検出又は定量方法。
   

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