JP5800816B2 - 金属錯体、蛍光プローブ - Google Patents
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- C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
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- C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
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- C07D213/36—Radicals substituted by singly-bound nitrogen atoms
- C07D213/38—Radicals substituted by singly-bound nitrogen atoms having only hydrogen or hydrocarbon radicals attached to the substituent nitrogen atom
Description
この発明に係る金属錯体を調製した。具体的には、図1の反応経路に沿って配位子を合成したのち、鉄錯体を調製した。なお、理解しやすくするため、以下の説明では、同じ化合物については図1と同じ記号を使用した。
N,N,N'-Tris(2-pyridyl-methyl)propane-1,3-diamine(以下、化合物dと省略する。)は既報(Hureau, C.; Groni, S.; Guillot, R.; Blondin, G.; Duboc, C.; Anxolabehere-Mallart, E. "Syntheses, X-ray Structures, Solid State High-Field Electron Paramagnetic Resonance, and Density-Functional Theory Investigations on Chloro and Aqua MnII MononucleaR3COmplexes with Amino-Pyridine Pentadentate Ligands", Inorg. Chem. 2008, 47, 9238-9247.)に従って合成したものを使用した。これ以外の試薬については市販のものを使用した。
窒素雰囲気下、Resazurinナトリウム塩(化合物a,1.50g,5.97mmol)の氷酢酸溶液(10ml)に亜鉛粉末(1.29g,29.6mmol)を加え、一時間攪拌した。反応液から溶媒を除去して、N,N-dimethyl-4-aminopyridine(DMAP,0.73g,5.97mmol)を加え、アセトン(40ml)に溶解した。反応溶液に無水酢酸(1.21g,11.9mmol)を加え、室温で攪拌した。反応終了はTLCにて確認した(Rf=0.28,SiO2,酢酸エチル:ヘキサン=1:2)。
窒素雰囲気下、化合物b(1.0g,3.34mmol)及び炭酸ナトリウム(0.425g,4.07mmol)の乾燥アセトニトリル溶液(40ml)にbromoacetylbromide(318μl,3.68mmol)を加え、3時間攪拌した。溶液の色が淡黄色から深緑色へ変化した。反応終了後、Celiteにより反応溶液をろ過し、ろ液を濃縮・真空乾燥して深緑色固体を得た(1.3g,収率94%)。この化合物は精製せずに次の反応に使用した。なお、この化合物は核磁気共鳴分光法(1H NMR及び13C NMR)、フーリエ変換赤外分光光度計(FT-IR) の測定結果から同定した。その結果を以下に示す。
窒素雰囲気下、化合物c(67mg,0.16mmol)及び炭酸カリウム(19mg,0.18mmol)の乾燥アセトニトリル溶液(10ml)に化合物d(50mg,0.14mmol)を徐々に加え、室温で24時間攪拌した。Celiteにより反応溶液をろ過し、ろ液を濃縮・真空乾燥させ、赤褐色の油状物質を得た。油状物質をカラムクロマトグラフィー(Rf=0.10,SiO2,酢酸エチル:ヘキサン=1:1)を使用して精製し、赤褐色固体を得た(76mg,収率71%)。なお、この化合物は核磁気共鳴分光法(1H NMR)の測定結果から同定した。その結果を以下に示す。
化合物e(22mg,0.032mmol)及び亜硫酸ナトリウム(8.2mg,0.065mmol)を1,4-dioxane/水混合溶液(2ml)に溶解し、24時間加熱還流した。反応溶液は赤色蛍光を発していた。溶媒を濃縮したのち、水を1ml加えて、再結晶し、赤色固体を得た(15mg,収率82%)。なお、この化合物は核磁気共鳴分光法(1H NMR及び13C NMR)の測定結果から同定した。その結果を以下に示す。
化合物f(60mg,0.1mmol)のメタノール/アセトニトリル溶液(2ml, v/v = 1/1)にFeII(OTf)2・2CH3CN(46mg,0.1mmol)を加え、1時間撹拌した。溶液の色は褐色へと変化した。1時間後、ジエチルエーテル(2ml)を加え、析出した沈殿をろ過したのち、真空乾燥して茶褐色の固体を得た(38mg,収率35%)。なお、この化合物は、高分解能質量分析計(HRMS)の測定結果から同定した。その結果、HRMS(ESI,pos)m/z=329.1(M2+)であった。
この発明に係る蛍光プローブ(以下、MBFh1と省略する。)の反応速度を調べた。具体的には以下のようにして調べた。MBFh1(5μM)の20mM MOPS buffer溶液(pH=7.2,2.5% DMSO)を4面セルに調製した。これに、終濃度が2.5μM,5μM,50μM,500μMとなるように過酸化水素水を添加して、最大蛍光波長である590nm(励起波長:570nm)における蛍光強度の時間変化を25℃で測定した。その結果を図2に示す。
MBFh1の反応速度をより精密に調べた。具体的には以下のようにして調べた。MBFh1 (5μM)の20mM MOPS buffer溶液(pH=7.2,2.5% DMSO)を4面セルに調製した。これに、終濃度が1.25μM,3.75μM,5μM,12.5μM,25μMとなるように過酸化水素水を添加して、590nm(励起波長:570nm)における蛍光強度の時間変化を25℃で測定した。その結果を図3に示す。
酵素によって発生した過酸化水素が検出できるかどうか調べた。具体的には以下のようにして調べた。MBFh1(5μM)の20mM MOPS buffer溶液(pH=7.2,2.5% DMSO,125μM D-グルコース)を4面セルに調製した。これに、終濃度が0.008mg/mlとなるようにグルコースオキシダーゼを添加したのち、590 nm(励起波長:570nm)における蛍光強度の時間変化を25℃で測定した。また、MBFh1のMOPS buffer溶液にグルコースオキシダーゼを添加してから、100秒後に終濃度が0.08mg/mlとなるようにカタラーゼを添加し、蛍光強度の時間変化を同様にして測定した。これらの測定結果を図4に示す。
MBFh1が、D−グルコースを検出できることは、実施例4で確認した。そこで、MBFh1のD−グルコースの検出感度について調べた。具体的には次のようにして調べた。MBFh1(50μM)の20mM MOPS buffer溶液(pH=7.2,2.5% DMSO)に、終濃度が2.5μM、5μM、19μM、25μMとなるようにグルコースを添加し、添加した溶液を4面セルに収納した。これに、終濃度が0.008mg/mlとなるようにグルコースオキシダーゼを添加して50秒撹拌したのち、590nmにおける蛍光強度(励起波長:570nm)を25℃で測定した。その結果を図5に示す。
MBFh1の反応性と、従来技術である非特許文献11に記載のAmplex Red(登録商標)酵素アッセイキットの反応性とを、他のペルオキシダーゼ基質の存在下で比較した。具体的には次のようにして比較した。
MBFh1と、非特許文献11に記載のAmplex Red(登録商標)酵素アッセイキットの活性酸素種に対する反応性を調べた。具体的には、次のようにして調べた。
発明者らは、MBFh1が蛍光プローブとして優れている理由について、MBFh1が鉄錯体と蛍光色素Amplex Redモチーフとが共有結合している化合物だからである、と考えた。そこで、MBFh1を使用した場合と、Amplex Red及びMBFh1の鉄錯体部分と構造的に類似する化合物[Fe(5)](OTf)3を使用した場合の蛍光強度の時間変化の違いを比較して調べた。具体的には、次のようにして調べた。
Claims (10)
- 請求項1に記載の金属錯体を含む蛍光プローブ。
- 過酸化水素の検出に使用する請求項2に記載の蛍光プローブ
- 請求項2に記載の蛍光プローブを含むバイオアッセイ用キット。
- 請求項2に記載の蛍光プローブを含むバイオイメージング用キット。
- 請求項2に記載の蛍光プローブを含む臨床分析用キット。
- 請求項2に記載の蛍光プローブで標識した標識抗体。
- 請求項7に記載の標識抗体を含むバイオアッセイ用キット。
- 請求項7に記載の標識抗体を含むバイオイメージング用キット。
- 請求項7に記載の標識抗体を含む臨床分析用キット。
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