JP5512764B2 - 複素環化合物、金属錯体及び蛍光プローブ - Google Patents
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Description
下記の化学式(V)に示すように、レゾルフィン(1)と両端がハロゲン化したハロゲン化アルキル(2)とを、Williamsonエーテル合成法により反応させて、レゾルフィンとハロゲン化アルキルとのエーテル(3)を合成する。なお、X1及びX2は同一又は異なるハロゲン原子であり、好ましくは両方とも臭素原子である。
下記の化学式(VI)に示すようにエーテル(3)のハロゲン原子X1によって、2-ニトロベンゼンスルホニル基によって保護された第二級アミン(4)をN-アルキル化し、第三級アミン(5)を合成する。
下記化学式(VII)に示すように、炭酸カリウムやトリエチルアミンなどの弱塩基存在下で、第三級アミン(5)をチオフェノールなどのチオールを使用して脱保護し、第二級アミン(6)を得る。
下記化学式(VIII)に示すように、脱保護ざれた第二級アミン(6)を、複素環を有するハロゲン化アルキル(7)によって、N-アルキル化することにより、この発明の複素環化合物(8)が得られる。なお、X3はハロゲン原子であり、好ましくは臭素原子である。
この発明の蛍光プローブ及びこの蛍光プローブによって標識した抗体は、その用途を特に限定することなく、あらゆる用途に使用できる。例えば、この蛍光プローブ又はこの蛍光プローブによって標識した抗体と公知の試薬等とを組み合わせて、バイオアッセイ用キット、バイオイメージング用キット、臨床検査用キットなどを構築し、バイオアッセイ、バイオイメージング、臨床検査などに使用することが可能である。これらのキットは蛍光プローブが蛍光するまでの反応時間が短く、阻害剤による影響を受け難い。そのため、これらのキットを使用することによって、従来からあるキットと比べて、検査時間を短縮でき、精度の高い検査結果が得られる。
この発明に係る金属錯体を調製した。具体的には、図1の反応経路に沿って配位子を合成したのち、鉄錯体を調製した。なお、理解しやすくするため、以下の説明では、同じ化合物については図1と同じ記号を使用した。
N-(2-Nitrobenzenesulfonyl)-2-(aminomethyl)pyridine(以下、化合物cと省略する。)は既報(D. Schols et al., J. Med. Chem., 2010, 53, 1250-1260.)に従って合成したもの、8-Aminoquinolyl-2-bromoacetoamide(以下、化合物fと省略する。)は他の既報(Y. Hitomi et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2012, 51(14), 3448-3452.)に従って合成したものを使用した。これ以外の試薬については市販のものを使用した。
窒素雰囲気下、resorufin (以下、化合物aと省略する。250 mg, 1.2 mmol)及びK2CO3 (243 mg, 1.8 mmol)のDMF溶液(5 mL)に1,3-dibromopropane (711 mg, 3.5 mmol)を加え、60℃で一晩撹拌した。反応終了後、溶液を濃縮及び真空乾燥して赤色の油状物質を得えた。油状物質をカラムクロマトグラフィー(SiO2, AcOEt:hexane = 1:3-2:1)によって精製して、橙色の固体を得た(119 mg, 収率30%)。なお、この化合物は核磁気共鳴分光法(1H NMR)の測定結果から同定した。その結果を以下に示す。
窒素雰囲気下,化合物b (100 mg, 0.3 mmol)、化合物c(106 mg, 0.36 mmol)及びK2CO3 (54 mg, 0.4 mmol)のMeCN溶液(15 mL)を一晩加熱還流した。反応終了後、反応溶液をCelite(Celite Corporation)を使用してろ過して、ろ液を濃縮・真空乾燥し、赤褐色の油状物質を得た。油状物質をカラムクロマトグラフィー(Al2O3, AcOEt:hexane = 1:2-1:0)によって精製し、橙色の固体を得た(100 mg, 収率92%)。なお、この化合物は核磁気共鳴分光法(1H NMR)の測定結果から同定した。その結果を以下に示す。
窒素雰囲気下,化合物d (100 mg, 0.18 mmol)、thiopehnol (22.2 mg, 0.2 mmol)及びK2CO3(38 mg, 0.28 mmol)のDMF溶液(4 mL)を常温で一晩撹拌した。反応終了後、溶液を濃縮して赤褐色の油状物質を得た。油状物質をカラムクロマトグラフィー(SiO2,CHCl3:MeOH = 100:1-50:1)によって精製し、橙色の固体を得た(24 mg, 収率37%)。なお、この化合物は核磁気共鳴分光法(1H NMR)の測定結果から同定した。その結果を以下に示す。
窒素雰囲気下、化合物e (24 mg, 66 μmol)、K2CO3 (17 mg, 120 μmol)のMeCN溶液(15 mL)に、氷浴下で化合物f(26 mg, 100 μmol)を加え、そのまま一晩撹拌した。反応終了後、反応溶液をCeliteを使用してろ過したのち、ろ液を濃縮して赤褐色の油状物質を得た。油状物質をカラムクロマトグラフィー(Al2O3, AcOEt:hexane = 1:1-1:0)によって精製し、赤色の固体を得た(17 mg, 収率47%)。なお、この化合物は核磁気共鳴分光法(1H NMR)の測定結果から同定した。その結果を以下に示す。
FeCl3・6H2O (4.2 mg, 15.4 μmol)のMeOH溶液(250μL)に、L1 (7 mg, 12.8 μmol)及びNEt3 (2.3 μL, 16.6 μmol)のMeCN/MeOH混合溶液(v/v = 1/1, 1mL)をゆっくり加え、常温で一晩撹拌した。反応終了後、析出した緑色の固体をメンブランフィルターでろ過したのち、真空乾燥して黄土色の固体を得た(8 mg, 収率93%)。なお、この化合物は、高分解能質量分析計(HRMS)の測定結果から同定した。その結果、HRMS(ESI,pos) m/z = 635.0(M2+)であり、その計算値 calcd for C32H26ClFeN5O4 = 635.1と同じであった。
MBFh2 (5μM)の50 mM HEPES緩衝液(pH = 7.2)を4面セルにて調製した。これに、過酸化水素溶液を終濃度が50μMとなるように添加し、日立分光蛍光光度計 F-7000(励起波長 570 nm)を使用して、25℃で180秒ごとに蛍光スペクトルの経時変化を測定した。その結果を図2に示す。
従来からある金属錯体であるMBFh1と、この発明の金属錯体であるMBFh2の水中での安定性及び反応速度を比較した。具体的には、つぎのようにして比較した。なお、MBFh1は特許文献3に従って合成したものを使用した。
Claims (15)
- Rxが水素原子であり、n=1である請求項2に記載の複素環化合物。
- 下記一般式(III)で表される金属錯体。
- Rxが水素原子、Lが塩素イオン、n=1である請求項5に記載の金属錯体。
- 請求項4〜6の何れかに記載の金属錯体を含む蛍光プローブ。
- 過酸化水素の検出に使用する請求項7に記載の蛍光プローブ。
- 請求項7に記載の蛍光プローブを含むバイオアッセイ用キット。
- 請求項7に記載の蛍光プローブを含むバイオイメージング用キット。
- 請求項7に記載の蛍光プローブを含む臨床分析用キット。
- 請求項7に記載の蛍光プローブで標識した標識抗体。
- 請求項12に記載の標識抗体を含むバイオアッセイ用キット。
- 請求項12に記載の標識抗体を含むバイオイメージング用キット。
- 請求項12に記載の標識抗体を含む臨床分析用キット。
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