DE112005002636T5 - Hochempfindliche homogene Analyse auf der Grundlage einer FRET-Messung mit Anti-Stokes-Verschiebung - Google Patents

Hochempfindliche homogene Analyse auf der Grundlage einer FRET-Messung mit Anti-Stokes-Verschiebung Download PDF

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Abstract

Verbesserte, zeitlich aufgelöste Energietransfer-basierte Bioaffinitäts-Analyse unter Anwendung einer ersten Gruppe, die mit mindestens einem Lanthanid-Donator markiert ist, und einer zweiten Gruppe, die mit mindestens einer nicht überlappenden lumineszenten Akzeptor-Verbindung markiert ist, wobei ein Energietransfersignal von dem Akzeptor gemessen wird.

Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Verbesserung einer bioanalytischen Untersuchungstechnik bzw. einer bioanalytischen Analysetechniken auf der Grundlage eines Energietransfers unter Anwendung von Lanthanid-Chelaten als Markierungen. Die Verbesserungen betreffen die Verwendung nicht überlappender Akzeptor-Flurophore, die ihr Absorbtionsmaximum energetisch auf einem höheren Niveau als die wesentlichen Emissionsübergänge des Donators aufweisen. Erfindungsgemäß ermöglicht die Verwendung der nicht überlappenden Akzeptoren eine FRET-Messung mit Anti-Stokes-Verschiebung, wobei die FRET-verstärkte Akzeptoremission bei einer kleineren Wellenlänge als die tatsächliche Donatoremission gemessen wird.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Verfahren auf der Grundlage des Fluoreszenzresonanzenergietransfers (FRET) haben zahlreiche Anwendungen auf dem Gebiet der Grundlagenforschung, der diagnostischen Analyse bzw. Untersuchungen und der Bioreihenuntersuchung gewonnen. Im Allgemeinen ist die FRET-Technik mit einem Förster-artigen Energietransfer verknüpft, in welchem ein fluoreszierender Donator Energie über eine nicht strahlende Dipol-Dipol-Wechselwirkung auf ein Akzeptormolekül in unmittelbarer Nähe überträgt (das fluoreszierend oder nicht fluoreszierend sein kann)1. Der Förster-artige Energietransfer wurde ursprünglich in den späten 40er Jahren des 20. Jahrhunderts eingeführt und die Theorie zusammen mit den zugehörigen mathematischen Gleichungen sind seither gut verstanden und allgemein akzeptiert2. Eine Reihe von Publikationen wurden über die Theorie Försters und über FRET-basierte Anwendungen geschrieben3-7. Zu den Haupterfordernissen für den Förster-Mechanismus gehören eine spektrale Überlappung zwischen der Emission des Donators und der Absorption des Akzeptors, was als eine Faustregel bisher erachtet wurde, wenn geeignete Donator-Akzeptor-(D-A)Paare für FRET-Messungen ausgewählt werden. Des Weiteren ist gut bekannt, dass im Falle von Dona toren mit langen Lebensdauern und (fluoreszierenden) Akzeptoren mit kurzer Lebensdauer (τD » τA), die Lebensdauer der durch FRET-verstärkten Akzeptoremission als Funktion der Donatorlebensdauer und der Energiatransfereffizienz bestimmt ist8. Diese Eigenheit ermöglicht Zeit aufgelöste bzw. in der Zeit unterscheidbare Energietransfer(TR-FRET)Messungen, wenn Donatoren (beispielsweise Lanthanide) mit Lebensdauern von Mikro- bis Millisekunden zusammen mit regulären, organischen Fluorophoren als Akzeptoren verwendet werden.
  • Die Überwachung der Akzeptoremission in zeitlich aufgelöster Weise ist ein sehr empfindliches Verfahren, um FRET zu messen, da unter idealen Unständen das Akzeptorsignal nur für den Energietransfer spezifisch ist (Akzeptoren, die aufgrund des Energietransfers angeregt werden). Das Problem in Bezug auf die Donatoremissionsmessungen besteht darin, dass das Donatorsignal stets mindestens zwei unterschiedliche Populationen enthält (Donatoren, die an dem Energietransfer teilnehmen und freie Donatoren), die nicht direkt aufgelöst bzw. unterschieden werden können. Die Akzeptorfluoreszenzüberwachung hilft auch dabei, Probleme zu vermeiden, die mit der unvollständigen Markierung der FRET-Sonden in Zusammenhang stehen, da das Vorhandensein sowohl des Donators als auch des Akzeptors für ein nachweisbares Signal erforderlich ist. Bioanalytische FRET-Analysen bzw. Untersuchungen auf der Grundlage herkömmlich spektral überlappender D-A-Paare ermöglichen einen effizienten Energietransfer, um Messungen auf der Grundlage einer induzierten Akzeptoremission duchzuführen. Aufgrund des Überlappungsprinzips emittiert der Donator jedoch immer einen gewissen Hintergrund bei der Akzeptormesswellenlänge und die Akzeptormessempfindlichkeit wird durch die Donatorfluoreszenz reduziert.
  • Einige so genannte Nicht-FRET-Energietransferverfahren wurden ebenso publiziert. Diese Verfahren verwenden Akzeptormolekühle, die im Wesentlichen keine Absorption oder gar keine Absorption aufweisen, die mit dem Donatoremissionsspektrum überlappt. Beispielsweise wurden kommerzielle nicht-fluoreszierende Markierungen „Dabcyl und QSY 7" verwendet, um in effizienter Weise die Donatorfluoreszens zu löschen, ohne dass eine vollständige spektrale Überlappung mit den Donatoremissionen vorhanden ist9;10.
  • Das US-Patent 5,998,146 offenbart eine Bioaffinität-Analyse auf der Grundlage eines Energietransfers, wobei die Lanthanide-Energie-Emission und die Akzeptorenergieabsorption nicht überlappen. In dieser Veröffentlichung werden die Akzeptoren als Löscher verwendet und das Donatorsignal wird in einer zeitlich aufgelösten Analyse in einem zeitlichen Bereich von Mikrosekunden gemessen.
  • Das US-Patent 6,150,097 offenbart Hybridisierungssonden, die mit einem Nicht-FRET-Paar markiert sind, das aus organischen Fluorophor-Donatoren (Zerfallszeit in Nanosekunden) und einem chromophoren Akzeptor (fluoreszierend oder nicht fluoreszierend) besteht. In dieser Veröffentlichung werden die Akzeptoren als Löscher verwendet und es wird die Änderung im Donatorsignal gemessen.
  • Diese Nicht-FRET-Verfahren stehen im Zusammenhang mit den Fluoreszenzlöschanalysen (FQA), in denen die Energietransfer basierte Donatoremissionslöschung gemessen wird. Die Verwendung von nichtüberlappenden Akzeptoren erweitert die Anzahl der verwendbaren Akzeptormolekühle in diesen Untersuchungen, löst jedoch nicht die Probleme, die mit dem Donatorhintergrund im Zusammenhang stehen.
  • Überblick über die Erfindung
  • Die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine verbesserte zeitaufgelöste Energietransferuntersuchung unter Anwendung mindestens eines Lanthaniddonators und mindestens einem nicht überlappenden Akzeptor-Fluorophor bereitzustellen, wobei ein Energietransfersignal von dem Akzeptor gemessen wird und wobei die Akzeptoremission bei einer kleineren Wellenlänge als die Donatoremission auftritt. Die Lebensdauer dieses Akzeptorsignals ist keine direkte Funktion der Gesamtenergietransfereffizienz und der Strahlungszerfallszeit des Donators. Der Energietransfer von den unterschiedlichen höheren angeregten Energieniveaus des Donators erzeugt unterschiedliche Zerfallspopulationen für das durch den Energietransfer verstärkte Akzeptorsignal.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform beruht die Analyse bzw. Untersuchung auf einer Antikörpertrennungsreaktion, auf einer Rezeptor-Liganden-Bindung, auf einer Proteinbindung, auf einer DNA-Hybridisierung, auf einer DNA-Abspaltung oder einer Peptidabspaltung. Eine sehr vorteilhafte Ausführungsform umfasst homogene Untersuchungen und Multianalyten-Untersuchungen. Multianalyten-Untersuchungen bzw. Analysen können auf einem oder mehreren Donatoren beruhen, die mit mehr als einem Akzeptor kombiniert werden.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Donator-Akzeptor-Paare bereitzustellen, die in Analysen gemäß der vorliegenden Erfindung anwendbar sind. Höchst vorteilhafte Donatoren sind Lanthanid-Chelate, die lumneszierend oder nicht-lumniszierend sein können. Äußerst vorteilhafte Akzeptoren sind fluoreszierende Verbindungen, etwa organische Fluorophore.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt den Aufbau des Eu-Chelat-Phosphoramidit-Blocks.
  • 2 ist ein normiertes Emissionsspektrum des Eu-Donators und der Anregungsemissionsspektren eines Alexa-Fluor 546 Akzeptors.
  • 3 zeigt eine FRET unter Anwendung von Alexa-Fluor 546 als Akzeptor. In unmittelbarer Nähe von dem Donator emittiert Alexa-Fluor 546 ein starkes Energietransfersignal mit einer zweifach exponentiellen Zerfallszeit.
  • 4: normierte Eu-Donatoremission (7) und Alexa-Fluor-Absorptionen. (1) Alexa-Fluor 488, (2) Alexa-Fluor 514, (3) Alexa-Fluor 532, (4) Alexa-Fluor 555, (5) Alexa-Fluor 546 und (6) Alexa-Fluor 647.
  • 5: Zerfallskurven für unterschiedliche Akzeptoremissionssignale unter Anwendung eines Eu-Donators. Die Kurven zeigen von oben nach unten: Alexa-Fluor 546 (nicht gefülltes Quadrat), Alexa-Fluor 555 (nicht gefülltes Diamantsymbol), Alexa-Fluor 533 (gestrichelte Linie), Alexa-Fluor 514 (Sternchen), Alexa-Fluor 488 (nicht gefüllter Kreis) und Alexa-Fluor 647 (durchgezogene Linie).
  • 6: vereinfachte Darstellung von Eu-Energieniveaus und Akzeptorabsorptionen. Für Akzeptoren entspricht der schwarze Punkt der Wellenlänge des Absorptionsmaximums und die halbe Breite des Absorptionsspektrums ist mit den entsprechenden Fehlerbalken dargestellt.
  • 7: Verdünnungskurve für homogene εF508 DNA-Untersuchung zur Anwendung eines Eu-Donators und Alexa-Fluor 546 Akzeptors. Dedektionsgrenze 2,5 pM.
  • 8A und 8B zeigen das Prinzip der dualen Analyten-Erfassung unter Anwendung des nicht überlappenden Energietransferverfahrens der Erfindung.
  • 9: normierte Sm-Donator-Emission (5) und Alexa-Fluor-Absorptionsspektren und (1) Alexa-Fluor 488, (2) Alexa-Fluor 514, (3) Alexa-Fluor 532 und (4) Alexa-Fluor 647.
  • 10 zeigt Zerfallskurven für unterschiedliche Akzeptoremissionssignale unter Anwendung eines Sm-Donators. (1) Alexa-Fluor 532, (2) Alexa-Fluor 514, (3) Alexa-Fluor 488 und (4) Alexa-Fluor 647.
  • 11: vereinfachte Darstellung des Sm-Energieniveaus und der Akzeptorabsorption. Für Akzeptoren entsprechen die schwarzen Punkte der Wellenlänge des Absorptionsmaximums und es ist die halbe Breite des Absorptionsspektrums mit den Fehlerbalken dargestellt.
  • 12: Verdünnungskurve für die homogene εF508 DNA-Untersuchung unter Anwendung eines Sm-Donators und eines Alexa-Fluor 532-Akzeptors. Die Erfassungsgrenze liegt bei 11,2 pM.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Es wurde nunmehr überraschend herausgefunden, dass durch Verwendung von nicht überlappenden Donator-Akzeptor-Paaren es möglich ist, Nicht-FRET-Messungen in bioanalytischen Untersuchungen anzuwenden, wobei die Detektion auf einem Akzeptorsignal beruht und die induzierte Akzeptoremission bei einer kürzeren Wellenlänge als das Donator-Emissionspektrum gemessen wird. Eine derartige Untersuchung bzw. Analyse gemäß der vorliegenden Erfindung besitzt eine erhöhte Empfindlichkeit aufgrund des reduzierten Hintergrundsignals.
  • Die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, eine verbesserte zeitlich aufgelöste Energietransferuntersuchung auf Basis von Lanthaniden bereitzustellen, wobei nicht überlappende Donator-Akzeptor-Paare verwendet werden, die eine FRET-Messung mit Anti-Stockes-Verschiebung ermöglichen, wobei die Akzeptoremission erzeugt und bei einer kürzeren Wellenlänge als die eigentliche Donatoremission gemessen wird.
  • Der Begriff „Lumineszenz", wie er hierin verwendet ist, soll Fluoreszenz, Phosphoreszenz, Chemielumineszenz, Biolumineszenz und elektrisch erzeugte Lumineszenz, Photolumineszenz, Radiolumineszenz, Sonolumineszenz, Thermolumineszenz und Tribolumineszenz mit einschließen.
  • Der Begriff „Chelat" ist als Koordinationskomplex definiert, wobei das zentrale Ion mit mindestens zwei Koordinationsbindungen an einem einzelnen Liganden (Multidentat-Ligand) verbunden ist. Diese können durch unterschiedliche Prinzipien benannt werden, und Ausdrücke wie Chelate, supramulekulare Verbindungen, Komplexe, Komplexone, etc. werden verwendet. Zu speziellen Arten von Chelaten gehören makrozyklische Komplexe, Kronenether, Cryptate, Calixarene usw.
  • Die Begriffe „erste Gruppe" und „zweite Gruppe" sollen so verstanden werden, dass diese eine beliebige Komponente miteinschließen, etwa eine Bioaffinität-Erkennungskomponente (in Reaktionen, in denen der Abstand zwischen den Gruppen kleiner oder größer wird, beispielsweise in Bioaffinitätsreaktionen), oder in einem Teil eines Moleküls oder eines Substrats (beispielsweise abgewandtes Ende eines Peptidmoleküls, dessen Spaltung die beiden markierten Gruppen voneinander trennt).
  • Der Begriff „Hauptemissionsenergieniveau" soll als ein Energieniveau verstanden werden, von welchem aus die meisten emittierenden Übergänge eines Lanthanid-Ions hervorgehen. Beispielsweise ist für das Eu-(III)-Ion das Hauptemissionsenergieniveau das 5Do-Niveau und die Emissionsmaxima in einem typischen Eu-(III)-Emissionsspektrum werden ein durch die 5Do → 7FX-Übergänge gebildet.
  • Der Begriff „oberes oder höheres Energieniveau" oder „oberes oder höheres angeregtes Energieniveau" soll als ein Energieniveau verstanden werden, das energetisch über dem Hauptemissionsenergieniveau eines Lanthanid-Ions liegt und in der Lage ist, Energie über direkte Anregung oder von einer angeregten Liganden-Struktur aufzunehmen. Ein oberes Energieniveau kann auch ein emittierender Zustand sein, aber die Emissionsintensität dieser Zustände ist gering und/oder besitzt eine derartig kurze Zerfallszeit, dass die Emission normalerweise in konventionellen zeitlich auflösenden Messungen unter Anwendung einer Zerfallszeit in Mikro- bis Millisekundenbereich nicht erfasst wird.
  • Der Begriff „nicht überlappender Akzeptor" soll als ein Akzeptor verstanden werden, der sein Absorptionsmaximum energetisch auf einem höheren Niveau als das Hauptemissionsenergieniveau des Donators besitzt.
  • Der Begriff „Energietransfer verstärkte Akzeptoremission" oder „induzierte Akzeptoremission" soll als eine Akzeptoremission (oder Signal) verstanden werden, das sich als Ergebnis eines Energietransfers von einem angeregten Donator zu der fluoreszierenden Akzeptor-Verbindung bildet.
  • Der Begriff „Zerfallskomponente" soll als eine einzelne Zerfallspopulation in einer mehrfach exponentiellen Zerfallskurve verstanden werden (beispielsweise erzeugt eine Verbindung A und B mit unterschiedlichen Verfallszeiten τA und τB jeweils ihre eigene Zerfallskomponente für die resultierende Verfallskurve, wenn gleichzeitig gemessen wird).
  • Der Begriff „geringe Quantenausbeute" soll als eine Quantenausbeute kleiner als 1 % verstanden werden.
  • Der Begriff „Zerfallsprofil" soll als ein Synonym für die Zerfallskurve einer lumineszierenden Probe verstanden werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beruht die Untersuchung bzw. Analyse auf nichtüberlappenden lumineszenten Akzeptormolekülen, die ihr Absorptionsmaximum energetisch bei einem höheren Niveau im Vergleich zu dem Hauptemissionsenergieniveau des Donators besitzen. Die Energietransfereffizienz hängt von dem D-A-Abstand ab, und eine unmittelbare Nähe des Donators und des Akzeptors führt zu einem Energietransfer, der als eine energietransferverstärkte Emission des nicht überlappenden Akzeptors erhalten wird. Die nFRET-basierte Akzeptoremission zeichnet sich durch besondere Zerfallseigenschaften aus. Die induzierte Akzeptoremission folgt nicht strikt den üblicherweise akzeptierten Förster-Gleichungen, die die Beziehung zwischen der Energietransfereffizienz und der Fluoreszenzzerfallszeit definieren. In dem nFRET stammt der Energietransfer von dem angeregten Energieniveaus über dem Hauptemissionsenergieniveau des Donator-Lanthanids.
  • Die Zerfallszeit des induzierten Akzeptorsignals ist keine direkte Funktion der Energietransferrate und der Donatorzerfallszeit. Des Weiteren erzeugt der Energietransfer von den unterschiedlichen oberen Energieniveaus des Lanthanid-Donators unterschiedliche Lebensdauerpopulationen für das induzierte Akzeptorsignal. In einer Untersuchung bzw. Analyse gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht die Verwendung von nicht überlappenden Akzeptoren auch die FRET-Messung mit Anti-Stockes-Verschiebung, wobei die Akzeptoremission erzeugt und bei einer kurzen Wellenlänge im Vergleich zu den Hauptemissionsübergängen des Donators gemessen wird. Unserer Kenntnis nach ist dies eine neue Art, Energietransfermessungen auszuführen.
  • Die Analyse gemäß der vorliegenden Erfindung beinhaltet einen nichtstrahlenden Resonanzenergietransfer und sollte als ein FRET betrachtet werden; um aber einen Unterschied zu dem Förster-artigen Energietransfer herzustellen, wird das System hierin im Weiteren als nFRET (nicht überlappender FRET) bezeichnet. In ähnlicher Weise werden nicht überlappende Akzeptor-Fluorophore als nFRET-Akzeptoren bezeichnet. Weiterhin werden angeregte Energieniveaus des Donators, die energetisch über dem Hauptemissionsenergieniveau des Donators liegen, als obere angeregte Energieniveaus des Donators bezeichnet.
  • In einer äußerst vorteilhaften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Donator ein Chelat, das aus einer Liganden-Struktur und einem Lanthanid-Metall-Zentralion besteht. Beispielsweise können Lanthanid-Metalle des Europiums, Samariums, Dysprosiums, Terbiums, Neodymiums, Erbiums oder Thuliums verwendet werden. Lanthanidionen zeichnen sich durch ihre 4fn Elektronenkonfiguration aus, wobei die Orbitale von der Umgebung gut abgeschirmt sind und bei der Bindung minimal beteiligt sind und somit besitzen die Lanthanide gut definierte Energieniveaus. Gemessene Energieniveaudaten für Ln(III)-Ionen können aus vielen Publikationen entnommen werden. Typischerweise besitzen Lanthanide gewisse Emissionsenergieniveaus (von denen die Photonenemission erfolgt) und viele andere, praktisch nicht emittierende Energieniveaus über dem Emissionsenergieniveau. In dem nFRET-Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird der Akzeptor so ausgewählt, dass sein Absorptionsmaximum bei einer höheren Energie ist als das Hauptemissionsenergieniveau des Donators, d.h. die Akzeptoremission überlappt energetisch mit angeregten Energieniveaus, die über dem Hauptemissionsenergieniveaus des Donators liegen.
  • Lanthanid-Ionen können direkt mit intensiven Anregungslicht angeregt werden. Jedoch ist die Lichtabsorption von Lanthaniden sehr schwach und daher würden normalerweise Ligandenstrukturen verwendet, um das Anregungslicht zu absorbieren und um ferner Anregungsenergie für ein gewisses Energieniveau des Lanthanid-Ions bereitzustellen. Für den Schutzbereich der Erfindung ist es wichtig, dass die oberen Energieniveaus des Donators unter Anwendung geeigneter Ligandenstrukturen oder durch direkte Anregung angeregt werden können.
  • Geeignete Ligandenstrukturen für Chelate gemäß dieser Erfindung sind beispielsweise in WO 98/15830 und dem US-Patent 5,998,146 und in den darin zitierten Schriften beschrieben. Bevorzugte Eigenschaften eines Chelats gemäß dieser Erfindung beinhalten eine hohe Stabilität, eine hohe Absorptionsfähigkeit und einen effizienten Energietransfer von den Liganden zu den oberen Energieniveaus des zentralen Ions. Jedoch ist eine hohe Gesamtquantenausbeute des Chelats nicht erforderlich, da Energie von den oberen Energieniveaus übertragen wird, und das Hauptemissionsenergieniveau des Donators ist nicht direkt abhängig von der Energietransfereffizienz.
  • Der Donator der vorliegenden Erfindung ist nicht auf Lanthanid-Chelate beschränkt. Der Donator kann auch ein aufwärts konvertierendes Phosphor (auch als aufwärtskonvertierende Chelate bezeichnet) sein, der aus einem gewissen Lanthanid (Emitter) besteht, der in einem kristallinen Substratgitter (Absorber) eingebettet ist. Das aufwärts konvertierende Phosphor kann als Donator gemäß der vorliegenden Erfindung fungieren, wenn der Akzeptor so ausgewählt wird, dass dieser sein Absorptionsmaximum bei einer höheren Energie als dem Hauptemissionsenergieniveau des Lanthanid-Emittors besitzt. Aufwärts konvertierende Phosphorelemente sind beispielsweise in US 5891656 beschrieben, und deren Verwendung in herkömmlichen homogenen Energietransferuntersuchungen ist beispielsweise in WO 2004086049 beschrieben. Aufwärtskonvertierende Phosphorelemente können typischerweise bei Wellenlängen über 600 nm angeregt werden, und zeigen Lumineszenz, was charakteristisch ist für den Lanthanid-Emitter.
  • Ferner ist in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung der Akzeptor ein organisches Fluorophor, etwa Alexa-Fluor 546, oder ein anorganischer Kristall, etwa CdSe-, CdS- und CdTe-Halbleiterkristalle. Zu bevorzugten Eigenschaften des Akzeptors gehören eine kurze fluoreszierende Zerfallszeit (τ < 1 μs) eine hohe Quantenausbeute, ein scharfes Emissionsspektrum, eine kurze Stokes-Verschiebung, ein hoher Absorptionskoeffizient und die Fähigkeit einer effizienten Anhaftung des Akzeptors an einer Untersuchungskomponente. Beispielsweise kann ein geeigneter Akzeptor für die vorliegende Erfindung aus den unterschiedlichen Gruppen ausgewählt werden, die in WO 98/15830 und dem US-Patent 5,998,146 und den darin zitierten Schriften beschrieben sind, etwa Xanthen-Farbstoffe, Carbozyanin-Farbstoffe, Squarain-Farbstoffe und Porphyrine. Halbleiterkristalle sind detailliert in früheren Publikationen beschrieben.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird der Akzeptor so gewählt, dass das Absorptionsmaximum des Akzeptors energetisch bei einem höheren Niveau als das Emissionsspektrum des Donator-Lanthanid-Chelats, d.h. das Akzeptor-Absorptionsmaximum überlappt energetisch mit den angeregten Energieniveaus, die über dem Hauptemissionsenergienievau des Lanthanid-Chelats liegen. Ein Beweis für das Prinzip des nFRET- Mechanismus und eine nFRET-basierte Analyse gemäß der vorliegenden Erfindung sind detailliert im Bespiel 1 beschrieben, in welchem die DNA-Sonden mit einem Eu-Donator und Alexa-Fluor 546 markiert sind und mit einer speziellen Zielobjekt-DNA hybridisieren, um einen Energietransferkomplex zu bilden. Die Struktur des Eu-Donators, d.h. ein Eu-Terphyridrin-Chelat, das an einem modifizierten Nukleotid angeordnet ist, ist in 1 gezeigt. Die normierten Emissionsspektren des Eu-Donators zusammen mit der Anregung und den Emissionsspektren des Alexa-Fluor 546-Akzeptors sind in 2 gezeigt. Alexa-Fluor 546 besitzt einen geringen spektralen Überlapp mit dem 5Do → 7F0-Übergang des Eu-Donators. In der Untersuchung bringt die Hybridizierung der mit Donator und Akzeptor markierten Sonden mit der Zielobjekt-DNA die Markierungen in unmittelbarer Nähe zueinander und führt zu einer starken induzierten Akzeptoremission, die das nicht überlappende Energietransferschema als korrekt erweisen.
  • Aufgrund des spektralen Schemas der vorliegenden Erfindung liegt auch das Emissionsmaximum des Akzeptors bei einer höheren Energie als das Emissionsspektrum des Donators, wenn Akzeptoren mit relativ kleiner Stokes-Verschiebung (beispielsweise übliche organische Fluorphore) als nFRET-Akzeptoren verwendet werden. Ein derartiges spektrales Schema eines nicht überlappenden Energietransfers ermöglicht die Messung eines Akzeptorsignals unter Anwendung von Wellenlängen, die im Vergleich zu dem Donator-Emissionsspektrum blau-verschoben sind, was als FRET-Messung mit anti-Stokes-Verschiebung bezeichnet wird. Dies ist ein neuer Aspekt in Energietransfermessungen, und in FRET-Messungen mit Anti-Stokes-Verschiebung kann das Übersprechen des Donator-Emissionsverhaltens in den Akzeptorkanal deutlich verringert werden. In herkömmlichen Förster-artigen Messungen unter Anwendung spektral überlappender Markierungspaaren begrenzt das Übersprechen der Donator-Emission in dem Akzeptor-Emissionskanal hinein stets die Empfindlichkeit der Messung. Wie in 2 gezeigt ist, liegt das Emissionsmaximum des Alexa Fluor 546 bei einer kleineren Wellenlänge als der 5Do → 7F0-Übergang des Eu-Donators. In der Messung (Beispiel 1) wurde ein Bandpassfilter 572/7 nm (Bandbreite 7 nm) verwendet, um die nFRET-induzierte Akzeptoremission zu messen, d.h. eine Wellenlänge unter dem Emissionsspektrum des Eu-Donators. Jedoch ist die FRET-Messung mit Anti-Stokes-Verschiebung nicht für den nFRET-Akzeptor erforderlich, und die nFRET-induzierte Akzeptoremission kann unter Anwendung einer beliebigen geeigneten Wellenlänge gemessen werden.
  • Die Verwendung von Lanthanid-Donatoren liefert damit eine verbesserte Empfindlichkeit im Vergleich zur Verwendung der organischen Donator-Fluorphore aufgrund des TR-FRET-Prinzips und der schmalen Emissionslinien der Lanthanide. Die FRET-Messung mit Anti-Stokes-Verschiebung liefert einen zusätzlichen Weg, um die Donator-Hintergrundstrahlung zu unterdrücken.
  • Das nFRET-Verfahren der Erfindung ist vorteilhaft mit einem Lanthanid-Donator, der angeregte Energieniveaus über dem Hauptemissionsenergieniveau besitzt. Beispielsweise ergibt ein Sm-Terpyridin-Chelat, das mit nFRET-Akzeptoren verwendet wird, einen starken Energietransfer, siehe Beispiel 6.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht somit darin, Donator-Akzeptor-Paare bereitzustellen, die in Analysen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, wobei die Donator-Akzeptor-Paare entsprechend den zuvor beschriebenen Prinzipien ausgewählt werden.
  • Das Energieniveauschema der nFRET-Untersuchung gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugt eine induzierte Akzeptoremission, die eine neue Art an Zerfallseigenschaften im Vergleich zu dem konventionellen Förster-artigen (überlappenden) Energietransfer aufweist. Bei dem nFRET resultiert der Energietransfer aus den oberen angeregten Energieniveaus des Donators, und jedes dieser Niveaus kann seine eigene Zerfallskomponente in dem induzierten Akzeptorsignal erzeugen, d.h. der Zerfall des induzierten Akzeptorsignals ist nicht nur eine Funktion der Gesamt-Energietransfereffizienz und der Donator-Zerfallszeit, sondern hängt auch von der Anzahl und den Eigenschaften der unterschiedlichen Energieniveaus ab, von denen die Energie übertragen wird. Der Zerfall der induzierten Akzeptoremission kann ein mehrfach-exponentialer Zerfall sein, wenn zwei oder mehr obere angeregte Energieniveaus gleichzeitig an dem Energietransfer teilnehmen (jeder Energietransferprozess erzeugt eine Zerfallskomponente in dem induzierten Akzeptorsignal). Dies ist ein neuer Aspekt in Energietransfer-basierten Akzeptoremissionsmessungen. In Beispiel 2 erzeugen die angelegten Niveaus des Eu-Donators 5D2 und 5D1 eine kurze und eine lange Zerfallskomponente in dem induzierten Akzeptorsignal. Mit einem Sm-Donator ergibt das induzierte nFRET-Signal einen einzelnen exponentiellen Zerfall (Beispiel 5), was andeutet, dass wahrscheinlich nur ein oberes angeregtes Niveau des Sm-Ions an dem Energietransfer teilnimmt. Es ist auch möglich, dass die zusätzlichen Energietransferprozesse zu schnell sind, als dass sie mit der üblichen Instrumentenausstattung erfasst werden können.
  • Das Zerfallsverhalten des nFRET-induzierten Akzeptorsignals kann auch in grundlegenden zeitlich aufgelösten Messungen eingesetzt werden, d.h. in Untersuchungen auf Lebensdauerbasis und in Untersuchungen auf der Grundlage der Erfassung mittels Zeitfenstern. Ferner kann das Zerfallsverhalten in Multi-Analyten-Anwendungen eingesetzt werden. Wie in Beispiel 2 gezeigt ist, ist das Zerfallsprofil der induzierten Akzeptoremission teilweise dadurch bestimmt, welche angelegten oberen Energieniveaus des Donators energetisch mit der Akzeptorabsorption überlappen. Es können Multi-Analyten-Untersuchungen ausgeführt werden, wobei das gleiche Donator-Chelat für alle Analyten und Analyten-spezifische nFRET-Akzeptoren verwendet werden, die eine unterschiedliche Art an energetischer Überlappung mit den oberen angelegten Energieniveaus des Donators aufweisen. Der Energieübertrag von unterschiedlichen angelegten oberen Energieniveaus führt zu divergierenden Zerfällen für unterschiedliche Akzeptoren, selbst wenn der D-A-Abstand in den unterschiedlichen Analyten spezifischen Energietransferkomplexen identisch ist. Multi-Analyten-Untersuchungen können ausgeführt werden, indem eine Messung auf Basis von Zeitfenstern oder einer Fluoreszenz-Lebensdauermessung für unterschiedliche Analyten eingesetzt wird. Wie in Beispiel 4 gezeigt ist, kann eine Zwei-Analyten-Untersuchung beispielsweise unter Anwendung eines Eu-Donators für beide Analyten und spezielle Alexa Fluor 514- und 546-markierte Sonden für unterschiedliche Analyten ausgeführt werden. Alexa Fluor 514 akzeptiert Energie lediglich vom 5D2-Energieniveau und zeigt ein einzelnes exponentiell zerfallendes Signal mit kurzer Zerfallszeit. Alexa Fluor 546 akzeptiert Energie vom 5D2- und 5D1-Energieniveau und zeigt ein zweifach exponentielles Signal, das eine kurzlebige und eine langlebige Zerfallskomponente aufweist. Das Alexa Fluor 546-Signal kann ohne ein Übersprechen von Alexa Fluor 514 unter Anwendung einer geeigneten Verzögerungszeit in der Messung mit Zeitfenster gemessen werden. Das Übersprechen von Alexa Fluor 546 in das Zeitfenster bei der Messung mit Alexa Fluor 514 kann unter Anwendung geeigneter optischer Filter vermieden werden.
  • Die nFRET-Technik gemäß der vorliegenden Erfindung ist auch in anderen Multi-Analyten-Anwendungen geeignet. Grundsätzlich gibt es zwei Möglichkeiten, auf Energietransfer basierte Multi-Analyten-Untersuchungen auszuführen. Eine Option besteht darin, unterschiedliche Markierungspaare (beispielsweise Eu und Tb mit geeigneten Akzeptoren) für jeden Analyten zu verwenden. Eine andere Option besteht darin, einen Basisdonator und mehrere Akzeptoren zu verwenden, die mit den gleichen oder unterschiedlichen emittierenden Übergängen des Lanthanid-Donators überlappen (beispielsweise 5D0 → 7F2 und 5D0 → 7F4). Die Anzahl der Analyten und geeigneter Akzeptoren kann unter Anwendung nicht überlappender Akzeptoren erhöht werden, d.h. die nFRET-Technik kann in traditionelle FRET-Verfahren integriert werden.
  • Ein höchst vorteilhaftes Untersuchungsschema gemäß der vorliegenden Erfindung beruht auf der Verwendung von Nukleinsäuresonden, die mit Donator-Akzeptor-Paaren gemäß der vorliegenden Erfindung markiert sind. Das nFRET-Verfahren der vorliegenden Erfindung ist jedoch auch in gleicher Weise in anderen Analyseschemata einsetzbar, in Untersuchungen, in denen eine Dissoziation danach zu erfolgen hat, oder in Assoziations-basierten Untersuchungen, in der die Komplexbildung nachher aufzutreten hat, d.h. eine Änderung im Markierungsabstand muss anschließend auftreten. Zu Beispielen derartiger Untersuchungsschemata gehören, ohne einschränkend zu sein, Untersuchungen bzw. Analysen auf der Grundlage einer Antikörper-Erkennungsreaktion, einer Proteinbindung, einer Rezeptor-Liganden-Bindung, einer DNA-Hybridisierung, einer DNA-Abspaltung und einer Peptidabspaltung. Der Schutzbereich der Erfindung soll alle derartigen Schemata umfassen.
  • Somit stellt die vorliegende Erfindung eine neue Energietransferanalyse unter Anwendung lumineszenter FRET-Akzeptoren bereit, die das Absorptionsmaximum energetisch über dem Haupt-Emissionsenergieniveau des Donators besitzen. Die Untersuchung zeichnet sich dadurch aus, dass sie eine Energietransfer-verstärkte Akzeptoremission erzeugt, die nicht der Förster-Theorie entspricht. Das spektrale Schema des nFRET ermöglicht auch die FRET-Messung mit Anti-Stokes-Verschiebung, wobei die Akzeptoremission bei einer kürzeren Wellenlänge als das Donator-Emissionsspektrum auftritt. Dies führt zu einem sehr geringen Donator-Hintergrund in der Akzeptormessung und verbessert die Erfassungsempfindlichkeit. Es wird vorgeschlagen, dass in dem nicht-überlappenden Falle der Energietransfer von den oberen angelegten Energieniveaus des Lanthanid-Donators herrührt. Diese Annahme wird durch die Korrelation des Akzeptor-Emissionsverhaltens mit dem vereinfachten Energieniveauthema der Lanthanid-Donatoren und der Akzeptoren gestützt.
  • Analysen gemäß der vorliegenden Erfindung besitzen das Potenzial zum Ausführen neuer, äußerst empfindlicher homogener Analysen, und sind anwendbar in der klinischen Diagnostik und in anderen Biountersuchungen, die eine hohe Empfindlichkeit erfordern.
  • Die folgenden Beispiele werden angegeben, um weitere bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darzustellen, wobei diese jedoch nicht den Schutzbereich der Erfindung beschränken sollen. Der Fachmann erkennt, dass bei einem Fortschreiten der Technologie das erfindungsgemäße Konzept auf diverse Weisen verwirklicht werden kann. Die Erfindung und ihre Ausführungsformen sind nicht auf die Beispiele, die zuvor beschrieben sind, eingeschränkt, sondern können innerhalb des Schutzbereichs der Patentansprüche variieren.
  • Beispiele
  • Beispiel 1
  • Dieses Beispiel demonstriert die Gültigkeit des Prinzips für nFRET-Messungen und FRET-Messungen mit Anti-Stokes-Verschiebung.
  • Es wurde eine homogene Modellanalyse für ein synthetisches ΔF508 (cystische Fibrose) mutiertes DNA-Zielobjekt
    5'-TTAAAGAAAATATCATTGGTGTTTCCTATGATGAATATAGATACAGAAGCGTCA-3' entwickelt. Der Mutant und eine für das Zielobjekt spezifische störartige Donatorsonde (3'-TACTTATATCTATGTCTTC-5') wurden mit ihrem 3'-Ende mit Eu-Terpyridin-Chelat W8044 (PerkinElmer, Wallac, Finnland) markiert. Die ΔF508-mutationsspezifische Akzeptorsonde (3'-AAATTATAGTAACCACAAA-5) wurde mit ihrem 5'-Ende mit Alexa Fluor 546-Farbstoff (molekulare Sonden, USA) markiert. Die unterstrichenen Buchstaben der Sequenz bedeuten Basen, die nicht-komplementär zu der Zielobjektsequenz sind und verhindern, dass die Sonde als Markierung während des PCR fungiert. Die Hybridisierung wurde bei Raumtemperatur in einem Gesamtvolumen von 200 μl mit 15 mM Tris-HCl (pH 8), 2,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 100 mM NaCl und 0,1 % Triton X-100 ausgeführt. Die hybridisierten Proben wurden auf Mikrotitrations-Plättchen (1508-0010, PerkinElmer, Wallac) mit 25 μl pro Vertiefung in 4 Proben verteilt. Es wurden zeitlich auflösende Messungen in einem im Labor aufgebauten TR-Fluorometer unter Anwendung eines Stickstofflasers (Modell 79111, Oriel, USA, < 10 ns Pulsbreite, 45 Hz), einer Fotovervielfacherröhre (Mamamatsu, Japan) und einem Turbo-MCS-Vielkanalmessgerät (EG&G, USA) mit einer Zeitauflösung von 0,1 μs durchgeführt. Die Energietransferbasierte Emission wurde durch ein 572/7 nm-Emissionsfilter (Bandbreite 7 nm, Omega Optical, USA) gemessen.
  • Alexa Fluor 546 besitzt lediglich eine kleine spektrale Überlappung mit dem 5D0 → 7F0-Übergang des Europiums, wie in 2 gezeigt ist. Des Weiteren ist der zweite Maximalwert bei 596 nm mit dem 5D0 → 7F1-Übergang verknüpft, der durch einen magnetischen Dipolübergang definiert ist und der nicht zu der Förster-artigen Energieübertragung über eine lange Distanz beitragen kann. Der nFRET wurde durch Vergleichen der Akzeptoremissionssignale zwischen einer positiven Probe (1 nM DNA-Zielobjekt + 10-facher Überschuss an Donator- und Akzeptor-Sonden) und einer negativen Kontrolle (10 nM Donator- und Akzeptor-Sonden) gemessen. Die Fluoreszenz-Zerfallskurven für die Proben sind in 3 gezeigt. Im Gegensatz zur negativen Kontrollprobe erzeugte die positive Probe ein sehr starkes Alexa Fluor 546-Signal mit einer relativ langen Lebensdauer als Folge des nFRET. Die Zerfallsdaten für den Energietransfer wurden am Besten mit einem doppelt exponentiellen Verhalten mit Zerfallskomponenten von 0,64 μs und 48,4 μs angepasst. Die Zerfallsdaten bestätigen, dass das gemessene Alexa Fluor 546-Signal ein Energietransfer-verstärktes Signal ist und nicht aufgrund der direkten Anregung von Akzeptormolekülen resultiert. Die natürliche Lebensdauer von Alexa Fluor 546 ist < 10 ns, aber die lange Zerfallszeit des Eu-Donators (τD = 1169 μs, die Daten sind nicht gezeigt) ermöglicht das Auftreten der induzierten Akzeptoremission einen zeitlichen Bereich von Mikrosekunden.
  • In der entwickelten nFRET-Untersuchung tritt die induzierte Akzeptoremission bei einer kürzeren Wellenlänge als das Donator-Emissionsspektrum auf und ermöglicht das Messen des Akzeptorsignals unter Anwendung einer Wellenlänge, die im Vergleich zu dem Donator-Emissionsspektrum blau-verschoben ist. Dies ist ein neues Merkmal in Energietransferuntersuchungen und das Phänomen wird als FRET-Messung mit Anti-Stokes-Verschiebung bezeichnet. In diesem Beispiel liegt das Emissionsmaximum von Alexa Fluor 546 bei einer kürzeren Wellenlänge als der strahlende Übergang 5D0 → 7Fx von Eu3+ (2), und es wird ein schmaler Bandpassfilter bei 572/7 nm verwendet, d.h. einem Wellenlängenband unter der Donator-Emission, um den nFRET zu messen.
  • Beispiel 2
  • Testen unterschiedlicher nFRET-Akzeptoren
  • Dieses Beispiel zeigt, dass unterschiedliche obere Energieniveaus des Eu-Donators unterschiedliche Zerfallspopulationen in dem induzierten nFRET-Akzeptorsignal hervorrufen.
  • Es wurde eine weitere Serie aus nFRET-Akzeptoren in die gleiche Modellanalyse, wie sie in Beispiel 1 beschrieben ist, eingeführt. Die Alexa Fluor-Substanzen 555, 532, 514 und 488 (molekulare Sonden), die als Akzeptoren verwendet werden, besitzen jeweils leicht unterschiedliche Absorptionseigenschaften und sind spektral stärker blau-verschoben als Alexa Fluor 546 (4). Es wurde eine Referenzzerfallskurve eines Försterartigen Energietransfers unter Anwendung eines Alexa Fluor 647-Akzeptors (molekulare Sonden) gemessen, der eine starke spektrale Überlappung mit dem EU-Donator aufwies (4). In dem Platten-Fluorometer wurde ein Bandpassfilter 530/7 nm für Alexa Fluorstoffe 488 und 514 und ein Filter mit 572/7 nm für Alexa Fluorstoffe 532, 546 und 555 verwendet. Alexa Fluor 647 wurde unter Anwendung eines 665/7 nm Bandpassfilters gemessen.
  • Zerfallskurven mit subtrahiertem Hintergrund für unterschiedliche positive Proben sind in 5 gezeigt, und die angepassten Fluoreszenzzerfallszeiten (τAD) sind in Tabelle 1 aufgeführt. Beide Lebensdauerkomponenten (τAD1/τAD2) sind für zweifach exponentielle Lebensdauer-Anpassungen gezeigt.
  • Jeder nFRET-Akzeptor in der Reihe emittiert eine Energietransfer-verstärkte Fluoreszenz und besitzt eine deutliche unterschiedliche Zerfallsantwort im Vergleich zu dem Förster-artigen Akzeptor Alexa Fluor 647. Die nFRET-Akzeptoren können grob in zwei Kategorien auf der Grundlage des Zerfallsverhaltens des induzierten Signals eingeteilt werden. Alexa Fluor-Substanzen 488 und 514 besitzen einen einfach exponentiellen Zerfall (nur eine Zerfallskomponente mit kurzer Lebensdauer), wohingegen die Alexa Fluor-Substanzen 532, 546 und 555 eine zweifach exponentiellen Fluoreszenzzerfall (kurze und lange Zerfallskomponenten) aufweisen. Die beobachteten Zerfallskomponenten stehen nicht mit der Zerfallszeit des Alexa Fluor 647 in Beziehung. Ferner sind die Zerfallszeiten für die Zerfallskomponenten unterschiedlicher nFRET-Akzeptoren im Wesentlichen konstant (d.h. τkurz ~ 1 μs und τlang ~ 50 μs). Auf der Grundlage dieses Ergebnisses wurde berechnet, dass der Energietransfer sowohl von den 5D1 und 5D2-Energieniveaus von Eu auftritt, und dass die erhaltenen Zerfallskomponenten mit den Zerfallszeiten dieser Energieniveaus in Beziehung stehen.
  • Tabelle 1
    Figure 00170001
  • Es wurde ein halb-quantitatives Energieniveauschema (6) verwendet, um die energetischen Eigenschaften des Eu-Donators und der nFRET-Akzeptoren zu untersuchen. In 6 sind Akzeptor-Singlet-Niveaus zusammen mit der halben Breite des Absorptionsspektrums gezeigt, da die energetischen Niveaus organischer Fluorophore nicht so gut definiert sind wie die linienartigen Energieniveaus von Lanthanid-Ionen. Eine gute Korrelation kann zwischen dem Energieniveauschema und den experimentellen Ergebnissen gefunden werden. Alexa Fluor-Substanzen 488 und 541 sind zum größten Teil über dem 5D1-Energieniveau aber unter dem 5D2-Energieniveau angeordnet und können daher Energie lediglich von dem 5D2-Niveau aufnehmen (einzel-exponentieller Zerfall). Die Alexa Fluor-Substanzen 555 und 546 liegen unter dem 5D2- und 5D1-(aber über dem 5D0)Energieniveaus und können Energie von den 5D2- und 5D1-Energieniveaus aufnehmen, was einem zweifach-exponentiellen Zerfall entspricht. Das Singlet-Niveau des Alexa Fluor 532 ist nahezu auf gleicher Höhe mit dem 5D1 und es scheint auch eine Zwischenform eines Energietransfersignals zu besitzen (zweifach exponentiell, aber mit gemischten Zerfallszeiten), wenn es mit anderen nFRET-Akzeptoren verglichen wird. Energieniveaus, die höher als der 5D2-Zustand sind, wurden nicht als mögliche energiespendende Niveaus betrachtet, da der Triplet-Zustand des Liganden bei 22500 cm–1 11 liegt und lediglich Lanthanid-Energieniveaus unter dem Liganden-Triplet-Zustand können Energie von dem Liganden aufnehmen.
  • Als Schlussfolgerung ergibt sich, dass die Zerfallszeit des induzierten nFRET-Akzeptorsignals von dem Donator-Energieniveau abhängt, von welchem aus der Energietransfer stattfindet. Der Zerfall des induzierten Signals kann mit den energetischen Eigenschaften des nFRET-Akzeptors eingestellt werden, und der nFRET erzeugt ein Signal, das eine unterschiedliche Art des Zerfallsverhaltens als der Förster-artige Energietransfer aufweist.
  • Beispiel 3
  • Dieses Beispiel zeigt, dass die Zerfallszeit und das Zerfallsprofil des durch nFRET-induzierten Akzeptorsignals keine direkte Funktion der Gesamt-Energietransfereffizienz und der Donator-Zerfallszeit ist.
  • In dem Förster-artigen Energietransfer ist die gesamte Energietransfereffizienz durch die Gleichung bestimmt E = 1 – τDA/τD = 1 – τAD/τD [1]wobei τD die Zerfallszeit des freien Donators ist, τDA die Zerfallszeit des Donators bei Anwesenheit des Akzeptors ist, und τAD die Zerfallszeit der Energietransfer-induzierten Akzeptoremission ist. Der letzte Teil der Gleichung gilt nur, wenn τD » τA (τD = 1169 μs und τA < 10 ns für die Markierungen dieses Beispiels).
  • Der direkte Vergleich der Energietransfereffizienzen mit unterschiedlichen nFRET-Akzeptoren ist auf der Grundlage der gemessenen Akzeptorsignale schwierig, da die ausgewählten Wellenlängenbänder, Filterdurchlassdifferenzen und unterschiedlichen Quantenausbeuten der Akzeptoren einen signifikanten Anteil an der gemessenen Signalintensität besitzen können. Die Gesamt-Energietransfereffizienz wurde für die nFRET-Akzeptorreihe, die in Beispiel 2 beschrieben ist, durch Messen der gesamten Donatorlöschung Qtot während des Energietransfers gemessen, Tabelle 2. Es wurde eine theoretische Zerfallszeit für das induzierte Akzeptorsignal unter Anwendung der Gleichung [1] berechnet, siehe Tabelle 2. Die Donator-Intensitätsmessung ist unabhängig von den zuvor erwähnten Parametern und kann verwendet werden, um die Gesamt-Energietransfereffizienz unter ausgewählten Bedingungen zu messen. Um eine vollständige Hybridisierung der Donator-Sonde zu gewährleisten, verwendeten wir 1 nM Eu-Sonde + 5 nM DNA-Zielobjek + 20 nM Akzeptor-Sonde, und die Donator-Intensität wurde unter Anwendung eines Bandpassfilters 700/10 nm gemessen, um eine Reststörung der Akzeptoremission bei der Erkennung mit Zeitfenster unter Anwendung einer Verzögerung von 500 μs und einer Integrationszeit von 400 μs zu vermeiden.
  • Tabelle 2
    Figure 00190001
  • Wie in Tabelle 2 gezeigt ist, besitzen alle nFRET-Akzeptoren eine ähnliche Löscheffizienz im Bereich von 80 bis 88 %, unabhängig von Unterschieden in den Zerfallsprofilen zwischen den unterschiedlichen Akzeptoren. Die theoretische Zerfallszeit auf der Grundlage der Donator-Lösung ist nicht korreliert mit der gemessenen Akzeptor-Zerfallszeit (Tabelle 1) von einem der getesteten nFRET-Akzeptoren. Dieses Ergebnis unterstreicht weiterhin das Nicht-Förster-Verhalten der induzierten nFRET-Emission.
  • Beispiel 4
  • Dieses Beispiel zeigt die Empfindlichkeit der nFRET-Technik. Die in Beispiel 1 beschriebene Analyse wurde verwendet, um eine Verdünnungskurve für das Mutanten-ΔF508-DNA-Zielobjekt zu messen. Die homogene Detektionsmischung enthielt 10 nm Donator- und Akzeptor-Sonden und die Intensität mittels Zeitfenster wurde gemessen unter Anwendung eines 572/7 nm Bandpassfilters mit einer Verzögerungszeit von 10 μs und einer Zählzeit von 20 μs. Das Analyseergebnis ist in 7 gezeigt. Die Analyse erzeugte eine lineare Antwort für den Analyten und eine Erfassungsgrenze (S/B = 2) von 2,5 pM wurde erreicht. Dies zeigt, dass der nicht überlappende Energietransfer sehr effizient ist und eine hohe Empfindlichkeit zusammen mit der FRET-Messung mit Anti-Stokes-Verschiebung liefert.
  • Beispiel 5
  • Dieses Beispiel zeigt, wie die außergewöhnliche Zerfallszeit des nFRET-Signals in homogenen Multi-Analyten-Untersuchungen eingesetzt werden kann. In diesem Beispiel werden die ΔF508-mutanten- und störungsartigen DNA-Zielobjekte gleichzeitig aus der gleichen Reaktion erfasst.
  • Die ΔF508-mutanten- und störungsartige Zielobjekt-spezifische Donator-Sonde (3'-TACTTATATCTATGTCTTC-5') ist mit ihrem 3'-Ende mit Eu-Terpyridin-Chelat W8044 (PerkinElmer, Wallac) markiert. Die mutantenspezifische Akzeptor-Sonde (3'-AAATTATAGTAACCACAAA-5') ist mit ihrem 5'-Ende mit Alexa Fluor 546 markiert, und die störungsartige spezifische Akzeptor-Sonde (3'-AATTAGTAGAAACCACAAA-5') ist mit ihrem 5'-Ende mit Alexa Fluor 514 markiert. Störungsartige ΔF508 (5'-AAGAAAATATCATCTTTGGTGTTTCCTATGATGAATATAGATACAGAAGCGTCA-3') und Mutanten ΔF508 (5'-TTAAAGAAAATATCATTGGTGTTTCCTATGATGAATATAGATACAGAAGCGTCA-3') Zielobjekte werden mit den Erfassungssonden bei Raumtemperatur in einem Gesamtvolumen mit 200 μl hybridisiert, das 15 mM Tris-HCl (pH 8), 2,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 100 mM NaCl und 0,1 % Triton X-100 enthält. Nach der Hybridisierung wurden die Energietransfersignale in einer zeitlich aufgelösten Weise unter Anwendung eines optischen Kanals 570/10 nm mit einer Verzögerung von 10 μs und einer Integrationszeit von 30 μs für Alexa Fluor 546 und mit einem optischen Kanal 535/15 nm, einer Verzögerung von 1 μs und einer Integrationszeit von 5 μs für Alexa Fluor 514 gemessen.
  • Emissionsspektren und die optischen Kanäle für Alexa Fluor 514 und 546 sind in 8A gezeigt. Die hypothetischen Zerfallskurven und die Messfenster für die zeitlich aufgelöste Messung sind in 8B gezeigt. Die Zerfallskurve für das induzierte Alexa Fluor 546-Signal ist die gleiche wie in Beispiel 1 (gleiche DNA-Sonden). Die Zerfallskurve für das induzierte Alexa Fluor 514-Signal wird in dieser Doppel-Analyse als ähnlich zu dem Zerfall angenommen, der für die Alexa Fluor 514-Sonde im Beispiel 2 beobachtet wurde. Dies liegt daran, dass der D-A-Abstand in der hybridisierten Probe dieser Untersuchung der gleiche ist wie in der hybridisierten Probe im Beispiel 2. Alexa Fluor 514 emittiert Fluoreszenz für den optischen Kanal von Alexa Fluor 546 (ch2), es wird jedoch ein Übersprechen durch eine geeignete zeitgesteuerte Messfensterauswahl (W2) vermieden, siehe 8A und 8B. Das Übersprechen von Alexa Fluor 546 in dem Messfenster mit der Zeitsteuerung des Alexa Fluor 514 (W1) wird vermieden, indem eine geeignete optische Filterung (ch1) verwendet wird, siehe 8a und 8b.
  • Beispiel 6
  • Dieses Beispiel zeigt, dass auch andere Lanthanide als Eu für nFRET geeignet sind.
  • Es wurde ein Sm-Terpyridin-Donator in die gleiche Modellanalyse eingeführt, wie sie im Beispiel 1 beschrieben ist, und wurde mit Alexa Fluor 532-, 514- und 488-Akzeptoren getestet. Es wurde eine Referenzzerfallskurve des Förster-artigen Energietransfers unter Anwendung eines Alexa Fluor 647-Akzeptors gemessen. Der Energietransfer wurde gemessen, indem die Akzeptor-Emissionssignale zwischen einer positiven Probe (1 nM DNA-Zielobjekt + 10-facher Überschuss an Donator- und Akzeptor-Sonden) und einer negativen Kontrollprobe (10 nM Donator- und Akzeptor-Sonden) verglichen wurden. In dem Platten-Fluorometer wurde ein 530/7 nm-Bandpassfilter für Alexa Fluor 488 verwendet, und ein Bandpassfilter mit 545/7 nm für Alexa Fluor Substanzen 514 und 532, und ein Bandpassfilter mit 665/7 nm wurde für Alexa Fluor 647 verwendet. Das spektrale Schema der D-A-Paare ist in 9 gezeigt. Die Alexa Fluor Substanzen 532, 514 und 488 besitzen eine vernachlässigbare Überlappung mit der Sm-Emission und können als nFRET-Akzeptoren für Sm betrachtet werden.
  • Die Zerfallskurven mit subtrahiertem Hintergrund für die induzierten Akzeptorsignale sind in 10 gezeigt und die angepassten Zerfallszeiten sind in Tabelle 3 dargestellt. Alle nFRET-Akzeptoren emittieren einzelexponentielle Energietransfer-verstärkte Emissionen. Die Alexa Fluor 532- und 514-Signale waren sehr stark, wohingegen das Alexa Fluor 488-Signal nur schwach nachweisbar war. Wie auch für den Eu-Donator im Beispiel 2 waren auch die Zerfallzeiten der nFRET-Signale deutlich unterschiedlich zu der Zerfallszeit des Förster-artigen Energietransfers (Alexa Fluor 647). Ferner ist die Zerfallszeit nahezu gleich für alle nFRET-Akzeptoren. Die Ergebnisse besitzen ähnliche Merkmale wie die Ergebnisse, die unter Anwendung eines Eu-Donators erhalten wurden und zeigen damit, dass der nFRET-Mechanismus auch bei anderen Lanthaniden als Eu anwendbar ist.
  • Tabelle 3
    Figure 00210001
  • Ein vereinfachtes Energieniveauschema für nFRET auf Basis eines Sm-Donators ist in 11 gezeigt. Auf Grundlage des Schemas und der gemessenen Ergebnisse scheint es, dass der Energietransfer von dem Sm-Donator zu den untersuchten nFRET-Akzeptoren über das 4G7/2-Energieniveau (4G2/5 ist das emittierende Energieniveau von Sm) auftritt. Alexa Fluor 488 ist energetisch geringfügig über dem 4G7/2-Niveau und erzeugt ein sehr schwaches induziertes Signal, da der Energietransfer nach oben nicht begünstigt ist. Alexa Fluor Substanzen 514 und 632 liegen unter dem 4G7/2-Niveau und erzeugen ein starkes einzelexponentielles Signal.
  • Beispiel 7
  • Dieses Beispiel zeigt, dass die Empfindlichkeit einer nFRET-Untersuchung nicht direkt mit der Quantenausbeute des Donator-Chelats in Beziehung steht.
  • Das Sm-Alexa Fluor 532-Paar wurde verwendet, um eine Verdünnungskurve für das Mutanten-ΔF508-DNA-Zielobjekt zu messen. Die homogene Detektionsmischung enthielt 10 nm Donator- und Akzeptor-Sonden und die Intensität mit Zeitfenster wurde unter Anwendung eines 545/7 nm-Bandpassfilters mit einer Verzögerungszeit von 2,5 μs und einer Zählzeit von 10 μs gemessen.
  • Das Analyseergebnis ist in 12 gezeigt. Die Analytenantwort ist linear und es wurde eine Erfassungsgrenze (S/B = 2) von 11,2 pM erreicht. Die Differenz in der Analyseempfindlichkeit im Vergleich zu der entsprechenden Analyse mit einem Eu-Terpyridin-Donator (Beispiel 4) ist kleiner als der 5-fache Wert. Dies ist bemerkenswert, da die Quantenausbeute des Sm-Terpyridin-Chelats ungefähr um das 100-fache kleiner ist als die Quantenausbeute des Eu-Terpyridin-Chelats (Daten nicht gezeigt). Im Falle des nicht überlappenden Energietransfers ist die Quantenausbeute des Donators nicht besonders wichtig, da der Energietransfer von den oberen angeregten Energieniveaus anstatt von dem emittierenden Energieniveau stattfindet. Eine effiziente Absorptionsfähigkeit des Liganden und ein effizienter intra-molekularer Energietransfer von dem Liganden zu den oberen Energieniveaus des zentralen Ions sind die wesentlichen Prozesse in nFRET. Auf der Grundlage des Ergebnisses wird angenommen, dass Lanthaniden mit tatsächlich geringer Quantenausbeute (Quantenausbeute ~ 0) gute Donatoren für nFRET-Analysen bzw. Untersuchungen sein können.
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  • Zusammenfassung
  • Diese Erfindung betrifft eine neuartige, zeitlich aufgelöste Energietransferanalyse auf Grundlage eines Lanthanids unter Anwendung nicht-überlappender Akzeptor-Fluorophore, die das Absorptionsmaximum in energetisch höheren Niveaus besitzen als das Haupt-Emissions-Energieniveau des Donators. In dieser Untersuchung ist die Lebensdauer des Energietransfer-verstärkten Akzeptorsignals teilweise unabhängig von der Energietransferrate. Die Verwendung von nicht überlappenden Akzeptoren ermöglicht eine FRET-Messung mit Anti-Stokes-Verschiebung, wobei die Akzeptoremission erzeugt und bei einer kürzeren Wellenlänge als die eigentliche Donator-Emission gemessen wird.

Claims (14)

  1. Verbesserte, zeitlich aufgelöste Energietransfer-basierte Bioaffinitäts-Analyse unter Anwendung einer ersten Gruppe, die mit mindestens einem Lanthanid-Donator markiert ist, und einer zweiten Gruppe, die mit mindestens einer nicht überlappenden lumineszenten Akzeptor-Verbindung markiert ist, wobei ein Energietransfersignal von dem Akzeptor gemessen wird.
  2. Analyse nach Anspruch 1, wobei die Lebensdauer des Akzeptorsignals keine direkte Funktion der Gesamt-Energietransfereffizienz und der Lumineszenz-Zerfallszeit des Donators ist.
  3. Analyse nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei der Energietransfer von unterschiedlichen oberen angeregten Energieniveaus des Donators unterschiedliche Zerfallspopulationen für die Energietransfer-verstärkte Akzeptoremission erzeugt.
  4. Analyse nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Akzeptoremission bei einer kürzeren Wellenlänge als die Emission von dem Haupt-Emissions-Energieniveau des Donators auftritt.
  5. Analyse nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Analyse auf einer Nukleinsäure-Hybridisierung, einer Antigen-Antikörper-Erkennung, einer Proteinbindung, einer Rezeptor-Liganden-Bindung, einer DNA-Spaltung oder einer Peptid-Spaltung basiert.
  6. Analyse nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Analyse als eine homogene Analyse ausgeführt wird.
  7. Analyse nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Analyse eine Multi-Analyten-Analyse ist.
  8. Analyse nach Anspruch 7, wobei ein allgemeiner Donator für alle Analyten und unterschiedliche fluoreszierende Akzeptoren für jeden Analyten verwendet werden.
  9. Donator-Akzeptor-Paar zur Verwendung in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6.
  10. Donator-Akzeptor-Paar nach Anspruch 9, wobei der Donator ein Lanthanid-Chelat oder ein aufwärts konvertierendes Phosphor ist, und wobei der Akzeptor ein Fluorophor ist.
  11. Donator-Akzeptor-Paar nach Anspruch 10, wobei der Donator ein Lanthanid-Chelat mit geringer Quantenausbeute ist.
  12. Donator-Akzeptor-Paar nach Anspruch 10, wobei der Donator ein nicht-lumineszierendes Lanthanid-Chelat ist.
  13. Donator-Akzeptor-Paar nach Anspruch 10, wobei das Lanthanid-Chelat ausgewählt wird aus Chelaten der Gruppe: Europium, Smarium, Dysprosium, Terbium, Neodynium, Erbium und Thulium.
  14. Donator-Akzeptor-Paar nach Anspruch 11, wobei das Fluorophor ausgewählt wird aus der Gruppe: Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 514 und Alexa Fluor 488.
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