DE69535353T2

DE69535353T2 - Langlebige anisotropie-(polarisations-)sonden für die klinische chemie, immunoassays, affinitätsassays und die biomedizinische forschung

Info

Publication number: DE69535353T2
Application number: DE69535353T
Authority: DE
Inventors: R. Joseph Ellicott City LAKOWICZ; Henryk Baltimore SZMACINSKI; Ewald Baltimore TERPETSCHNIG
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1994-10-28
Filing date: 1995-10-27
Publication date: 2008-07-03
Anticipated expiration: 2015-10-28
Also published as: CA2203772A1; AU4279796A; EP0788601B1; WO1996013722A1; JPH10508103A; EP0788601A1; EP0788601A4; DE69535353D1; US5660991A; AU686490B2; ATE349696T1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet fluoreszenter Anisotropie (Polarisation) Sonden für Immunoassays und ähnlichem und insbesondere ein Verfahren zur Durchführung eines Immunoassays unter Verwendung eines fluoreszierenden Metall-Ligandkomplexes, der an Proteine gekoppelt werden kann und der auch eine lange Lebensdauer und eine hohe anfängliche Anisotropie oder polarisierte Fluoreszenz zeigt.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Derzeit werden Fluoreszenzpolarisations-(Anisotropie)-Immunoassays, die auf der Polarisation oder Anisotropie von emittiertem Licht, wenn eine Probe mit vertikal polarisiertem Licht angeregt wird, in klinischer Chemie viel verwendet, sind jedoch beschränkt auf die Analyse von Antigenen mit niedrigem molekularem Gewicht, wie Arzneimitteln. Diese Einschränkung besteht, da die kurze Lebensdauer der fluoreszierenden Sonden ihre Verwendung mit größeren Antigenen mit höherem molekularen Gewicht, die langsamer in Lösung rotieren als kleinere Antigene, ausschließen.
In Bezug auf Metall-Ligandenkomplexe hat es viele Berichte gegeben, die versuchen abzuschätzen, ob der angeregte Zustand unter den organischen Liganden auf einem eher symmetrischen Komplex verteilt ist oder ob er zwischen dem Metall und einem der Liganden lokalisiert ist. Dies ist eine wichtige Unterscheidung, da das frühere Modell eine niedrige Anisotropie voraussagt, während das letztere Modell eine höhere Anisotropie voraussagt. Der Fachmann würde eine niedrige Anisotropie voraussagen, da symmetrische Moleküle typischerweise niedrige Anisotropie zeigen und Metallionen in Lösung typischerweise Null an Isotropie zeigen. Wenn die Möglichkeit verschiedener Wirkungen, die für den Verlust der Anisotropie zählen können, gegeben ist, war es nicht klar, dass Komplexe, wie Ru-Metall-Ligandenkomplexe (Ru-MLC) zweckmäßige Anisotropiewerte zeigen würden. Auch selbst wenn die Anisotropie ungleich Null war, war es nicht klar, ob Komplexe, wie Ru-MLC Anisotropien zeigen, die von der molekularen Größe abhängen, wie es für ein Fluoreszenzpolarisations-Immunoassay (FPI) benötigt wird oder ob sie durch Übertragung des angeregten Energiezustands unter den Liganden depolarisiert werden würden und somit unabhängig von der molekularen Größe oder Rotationsdiffusion unabhängig sein würden. Deshalb gab es in Bezug auf Metall-Ligandkomplexe keine Erkennung ihrer Verwendung als fluoreszierende Sonden für biomedizinische Anwendungen.
Die folgenden Literaturhinweise stellen den Stand der Technik von fluoreszierenden Polarisationsimmunoassays dar:

Measurement of Angiotensinogen in Human Serum By Fluorescence Polarization Immunoassay, David B. Gordon, Clin. & Exper. Hyper. -Theory and Practice, A10(3), 1988, Seiten 485–503.
Immunoassay-Innovations in Label Technology, Joan H. Howanitz, M. D., Arch. Pathol. Lab. Med., Band 112, August 1988, Seiten 775–779.
Four Fluorescent Polarization Immunoassays for Therapeutic Durg Monitoring Evaluated, Virginia M. Havre et al., Clinical Chemistry, Band 35, Nr. 1, 1989, Seiern 138–140.
New Fluorescent Derivatives of Cyclosporin for Use in Immunoassays, M. T. French et al., Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis, Band 10, Nr. 1, 1992, Seiten 23–30.
A Decade of Development of Immunoassay Methodology, James P. Gosling, Clinical Chemistry, Band 36, Nr. 8, 1990, Seiten 1408–1427.
Fluoroimmunoassay: Present Status and Key Problems, Erkki Soini et al., Clinical Chemistry, Band 25, Nr. 3, 1979, Seiten 353–361.
Fluorescent Excitation Transfer Immunoassay, Edwin F. Ullman et al., The Journal of Biological Chemistry, Band 251, Nr. 14, 25. Juli 1976, Seiten 4172–4178.
Florescence Polarization in Immunochemistry, W. B. Dandliker et al., Immunochemistry, Band 7, 1970, Seiten 799–828.
Photophysics of Ruthenium Complexes Bound to Double Helical DNA, Challa V. Kumar et al., Journal American Chemical Society, Band 107, Nr. 19, 1985, Seiten 5518–5523.

Die folgenden Literaturhinweise stellen den Stand der Technik zeitaufgelöster Immunoassays dar:

Time-Resolved Fluorometry in Immunoassay, T. Lovgren et al., Alternative Immunoassays, 1985, Seiten 203–217.
Current Concepts and Future Developments, R. P. Ekins, Alternative Immunoassays, 1985, Seiten 219–237.
Immunoassays with Time-Resolved Fluorescence Spectroscopy: Principles and Applications, Eleftherios P. Diamandis, Clinical Biochemistry, Band 21, Juni 1988, Seiten 139–150.
Europium Chelate Labels in Time-Resolved Fluorescence Immunoassays and DNA Hybridization Assays, Eleftherios P. Diamandis et al., Analytical Chemistry, Band 62, Nr. 22, 15. November 1990, Seiten 1149–1157.
Europium as a Label in Time-Resolved Immunofluorometric Assays, Ilkka Hemmila et al., Analytical Biochemistry, 137 (1984), Seiten 335–343.
Phosphorescent Immunoassay, Are Metalloporphyrins an Alternative to Rare Earth Fluorescent Labels?, A. P. Savitskii et al., Doklady Akademii Nauk SSSR, 1989, Seiten 48–51.
Fiber-Optic Time-Resolved Fluorimetry for Immunoassays, Randy D. Petrea et al., Talanta, Band 35, Nr. 2, 1988, Seieten 139–144.
Applications of Lanthanide Chelates for Time-Resolved Fluoroimmunoassay, Philip Mottram et al., American Chemical Laborstory, Mai/Juni 1990, Seiten 34–38.

U.S. 4,374,120	15/2/83	Soini et al.
U.S. 4,745,076	17/5/88	Muller et al.

Die folgenden Literaturhinweise offenbaren die bekannten spektralen Eigenschaften von Übergangsmetall-Ligandkomplexen:

Design and Applications of Highly Luminescent Transition Metal Complexes, J. N. Demas et a., Analytical Chemistry, Band 63, Nr. 17, 1. September 1991, Seiten 829–837.
Novel Fluorescent Label for Time-Resolved Fluorescence Immunoassay, Richard B. Thompson et al., SPIE, Band 909, Time-Resolved Laser Spectroscopy in Biochemistry, 1988, Seiten 426–433.
Redox Properties of Ruthenium(II) Tris Chelate Complexes Containing the Ligands 2,2'-Bipyrazine, 2,2'-Bipyridine, and 2,2'-Bipyrimidine, D. Paul Rillema et al., Inorganic Chemistry, Band 22, Nr. 11, 1983, Seiten 1617–1622.
Localization of Electronic Excitation Energy In Ru(2,2'-Bipyridine), (2,2'-Bipyridine-4,4'-Dicarboxylic Acid)²⁺ and Related Complexes, James Ferguson et al., Chemical Physics Letters, Band 68, Nr. 1, Seiten 21–24.
Energy Transfer from Luminescent Transition Metal Complexes to Oxygen, J. N. Demas et al., Journal of the American Chemical Society, 25. Mai 1977, Seiten 3547–3551.

Die folgenden Literaturhinweise sind ein weiterer interessierender Hintergrund bezüglich der vorliegenden Erfindung:

U.S. 4,565,790	21/1/86	Hemmila et al.
U.S. 4,837,169	6/6/89	Toner
U.S. 4,962,045	9/10/90	Picozza et al.
U.S. 5,089,423	18/2/92	Diamandis et al.
U.S. 5,202,270	13/4/93	Ungemach et al.
U.S. 5,221,605	22/6/93	Bard et al.
U.S. 5,221,611	22/6/93	Stenglein et al.
U.S. 5,061,857	29/10/91	Thompson et al.
U.S. 5,083,852	28/1/92	Thompson
U.S. 5,094,819	10/3/92	Yager et al.

Thin Lagers of Depolarizers and Sensitizers, Lasovsky et al., Chem. Abstract 106, 1987: 95354n.
Time-Resolved Photoselections of [Ru(bpv)₂]²⁺-exciton Hopping in the Excited State, Myrick et al., J. Amer. Chem. Soc. 109, 1987: 2841–2842.
Circularly Polarized Luminescence of Tris-Bipyridine Ruthenium (II) Complexes at Low Temperature, Tsubomura et al., Chem. Abstract 112, 1990: 65776h.

Die vorliegenden Erfinder wollen betonen, dass keiner der oben angeführten Experten Komplexe wie Ru oder Os Metall-Ligandkomplexe zur Verwendung in Fluoreszenzpolarisations-Immunoassays vorgeschlagen hat. Wir beziehen uns auf die Aussendung von diesen Komplexen als Fluoreszenz hauptsächlich der Einfachheit halber.
Die exakte Art des angeregten Zustands ist unbekannt, und die Aussendung kann als Fluoreszenz oder Phosphoreszenz betrachtet werden.
Wie oben angegeben, sind FPIs derzeit auf Analyte mit niedrigem molekularem Gewicht, wie Arzneimittel und Hormone beschränkt, wie in Urios et al., "Adaptation of Fluorscence Polarization Immunoassay to the Assay of Macromolecules", Analytical Biochemistry, 185, 308–312 (1990) (die F_ab Fragmente mit einem Molekulargewicht bei 40.000 benutzten, im Gegensatz zu einem vollen IgG (Immunglobulin G, human Molekül mit einem Molekulargewicht bei 150.000) und Tsuruoka et al., "Fluorescence Polarization Immunoassay Employing Immobilized Antibody", Biosensors & Bioelectronics, 6, 501–505 (1991) (wobei das Ab an kolloidales Gold gebunden wird, um sein molekulares Gewicht zu vergrößern in einem Versuch, die Korrelationszeit der größeren Antigene zu verändern).
In Bezugnahme insbesondere auf Tsuruoka betrachten die vorliegenden Erfinder seinen Ansatz nicht als nützlich, da das Molekulargewicht des Antikörpers schon zu hoch ist für die Lebensdauer der Markierung. In dieser Hinsicht ist bekannt, dass die Lebensdauer der Sonden bei 4 ns liegen.
Die Einschränkung auf Analyte mit niedrigem Molekulargewicht ergibt sich, da die FPIs von einer Änderung in dem offensichtlichen Molekulargewicht eines fluoreszenzmarkierten Antigens auf Binden an den Antikörper abhängt. Eine Änderung in "offensichtlichem Molekulargewicht" ergibt sich auf ein Binden an die großen Antikörpermoleküle, da das kleinere Antigen nun an das größere Antikörpermolekül gebunden wird. Typische Molekulargewichte von Antigen und Antikörper sind 1.000 bzw. 160.000 Dalton. Die Beschränkung auf Antigene mit niedrigem Molekulargewicht besteht aufgrund der kurzen Lebensdauer der Sonden, die in derzeitigen FPIs verwendet werden, und kann durch Verwenden von Fluorophoren mit längerer Lebenszeit umgangen werden. Jedoch sind wenige solcher langlebigen Sonden bekannt. Die Review Artikel erwähnen Pyren Derivat, die Lebensdauern bei 100 ns zeigen. Jedoch benötigt Pyren UV-Anregung bei 320 nm, ist photosensitiv und zeigt eine geringe Polarisation. UV Anregung führt zu signifikanter Autofluoreszenz von biologischen Proben. Ein weiterer Vorteil der RuMLCs ist ihre hohe chemische und fotochemische Stabilität.
Um das Verständnis der oben beschriebenen Einschränkungen und der vorliegenden Erfindung zu fördern, werden einige Beispiele nachstehend dargelegt. Die Notwendigkeit für eine Änderung im offensichtlichen Molekulargewicht kann aus der folgenden Beispielberechnung ersehen werden. Angenommen hat das markierte Antigen ein Molekulargewicht von 1.000 Dalton, was zu einer Rotationskorrelationszeit von ungefähr 0,5 ns führt. Das Molekulargewicht des Antikörper IgG beträgt 160.000, was zu einer Rotationskorrelationszeit bei 100 ns führt (v + h ≈ 1,5, siehe Gl. 8 unten). Die Anisotropie eines Fluorophors oder markierten Makromoleküls ist gegeben durch
wobei r₀ eine Konstante typischerweise bei 0,3 ist, τ die Lebensdauer ist und θ die Rotationskorrelationszeit ist.
Für derzeitige Immunoassays liegt die Lebensdauer der Sonden bei 4 ns. Die Anisotropie der freien und Antikörper gebundenen Antigene beträgt somit wie folgt:
Daher wird eine starke Änderung in der Anisotropie nach Binden von Ag an Ab für Antigene mit niedrigem Molekulargewicht nachgewiesen.
Die oben beschriebene vorteilhafte Änderung wird für Antigene mit hohem Molekulargewicht nicht erhalten. Es wird angenommen, dass das Molekulargewicht des Antigens ungefähr 160.000 beträgt mit einer Korrelationszeit von 100 ns und das Molekulargewicht des Antikörpers ungefähr 450.000 beträgt mit einer Korrelationszeit von 300 ns. Die Korrelationszeit des Antigen-Antikörper Komplex wird nahe 400 ns liegen. Für die derzeit verwendeten Fluorophore mit kurzer Lebensdauer werden die Anisotropiewerte wie folgt lauten:
Diese Änderung der Anisotropie ist klein, da die Lebensdauer viel kürzer ist als die Korrelationszeit des Antigens.
Die vorliegende Erfindung stellt eine langlebige Markierung mit guten r₀ Werten. Insbesondere zeigen die Daten Lebensdauern bei 400 ns. Für die Ag–Ab Komplexe mit größerem Molekulargewicht (θ = 400 ns) lauten die erwarteten Anisotropiewerte wie folgt:
Die Änderung der Anisotropie für die 400 ns Lebensdauer beträgt 150%, was im Vergleich zu nur 3% für die 4 ns Lebensdauer stark verbessert ist. Auch viele interessierenden Antigene (z. B. IgM) sind noch größer (MW = 950.000, θ ≥ 600 ns), was noch höhere Anisotropie (r = 0,180,% Änderung = 200%) ergeben wird. Es sollte beachtet werden, dass die% Änderung in Anisotropie wichtiger ist als die absoluten Werte.
Um Verwirrung zu vermeiden sollte beachtet werden, dass Polarisation (P) und Anisotropie (r) dasselbe Phänomen beschreiben und wie folgt in Beziehung stehen:
wobei I_II und I_⊥ die vertikal und horizontal polarisierten Bestandteile der Aussendung sind, wenn mit vertikal polarisiertem Licht angeregt wird. Die Polarisation und Anisotropie stehen miteinander in Beziehung durch
Die Parameter P und r sind beide in allgemeiner bzw. gemeinsamer Verwendung. Die Werte von P werden in FPI häufiger verwendet, da sie traditionell fest verwurzelt sind und leicht größer sind als die Anisotropiewerte. Der Parameter r ist bevorzugt auf der Grundlage der Theorie. Sowohl P als auch r stehen mit der Korrelationszeit und/oder dem molekularen Volumen wie folgt in Beziehung:
In diesen Gleichungen ist k die Boltzmann Konstante, T ist die Temperatur (K), η ist die Viskosität und V ist das molekulare Volumen. Die Korrelationszeit steht mit dem Molekulargewicht (M) des Proteins wie folgt in Beziehung:
wobei R die ideale Gaskonstante ist, v das spezifische Volumen des Proteins ist und h die Hydration ist, typischerweise 0,2 g H₂O pro Gramm Protein.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Wir haben einen neuen Typus von Protein markierender Reagens oder Sonde synthetisiert, der erwünschte Merkmale zur Verwendung in Immunoassays, klinischer Chemie und biomedizinischer Forschung, d. h. ein fluoreszierender Metall-Ligandkomplex, der an Proteine gekoppelt werden kann und der auch eine lange Lebensdauer und hohe Anisotropie oder Polarisation der Abwesenheit von Rotationsdiffusion zeigt. Auf den Wert wird häufig Bezug genommen als die anfängliche oder grundlegende Anisotropie (r₀) oder Polarisation (P₀). Dieses Reagens oder diese Sonde hat auch den Vorteil einer fluoreszierenden Emulsion in dem roten Bereich des Spektrums und kann mit einfachen Lichtquellen oder sichtbaren Wellenlängenlasern angeregt werden, wobei beide davon vom Standpunkt des Reduzierens von Autofluoreszenz und Gerätekosten und Komplexität wünschenswert sind. Die spektralen Merkmale und lange Lebensdauer solcher Sonden erlauben auch Fluoreszenzlebensdauermessungen mit einfachen Anregungslichtquellen, wie einer Blitzlampe, laseriode, blauen LED oder einer blauen Elektrolumineszenzlampe. Die lange Lumineszenzlebensdauer ermöglicht es, dass die Sone für immunochemische Polarisation oder Intensitätsassays von Arten mit hohem molekularen Gewicht verwendet werden können. Die Verwendung von Komplexen wie Ru oder Os Metall-Ligandenkomplexen, ermöglicht es, dass Fluoreszenzpolarisations-Immunoassays auf Antigenen mit hohem molekularem Gewicht (MW > 1000) durchgeführt werden können, was routinemäßig mit anderen Fluorophoren nicht möglich ist.
Somit stellt unsere Erfindung eine lange Lumineszenzlebensdauer, die wiederum den Assay von Antigenen mit höherem Molekulargewicht durch das Polarisations- oder Anisotropieverfahren ermöglicht. Die Verwendung von lumineszenten Metall-Ligandkomplexen für Fluoreszenzpolarisations-Assays ist unseres Wissens nicht früher vorgeschlagen worden, da solche Komplexe typischerweise niedrige Anisotropien (Polarisationen) zeigen. Auch war nicht bekannt, ob die Lumineszenz dieser Komplexe aufgrund Rotationsbewegung depolarisiert wurde, was für einen Fluoreszenzpolarisations-Immunoassay benötigt wird, oder aufgrund interner Randomisierung des angeregten Energiezustands innerhalb des Komplexes. Das letztere Verhalten macht eine Sonde ungeeignet zur Verwendung in einem Fluoreszenzpolarisations-Immunoassay. Im Gegensatz dazu zeigt der in unserer Erfindung verwendete asymmetrische Komplex eine hohe Polarisation, aufgrund der Anwesenheit von nicht identischer Liganden.
Ein anderer Vorteil unserer Erfindung liegt darin, dass ein Fluoreszenzpolarisations-Immunoassay in einer Weise durchgeführt werden kann, die mit sogenannten "zeitaufgelösten Immunoassays" vergleichbar ist. Somit wird Hintergrund Autofluoreszenz durch Torschaltungsauftasten des Fluoreszenzdetektors für eine lange Zeit nach Abklingen der anfänglichen Autofluoreszenz, die typischerweise in 5 ns abklingt. Mit den kurzlebigeren Sonden aus dem Stand der Technik ist solches Torschaltungsauftasten technologisch nicht durchführbar, und es ist nicht vorteilhaft, da die Sonde in derselben Zeitskala wie Autofluoreszenz abklingt. Torschaltungsauftasten ist sehr vorteilhaft und durchführbar, wenn die langlebigen Lumineszenzmetallkomplexe unserer Erfindung verwendet werden.
Somit entwickelt unsere Erfindung eine neue Klasse von Fluoreszenzpolarisations-Immunoassays zur Verwendung mit Antigenen mit hohem Molekulargewicht, während Autofluoreszenz durch Zeitgating des Fluoreszenzdetektors unterdrückt wird. Diese neuen Sonden finden Verwendung in biochemischer und biomedizinischer Forschung zum Messen der Rotationsdynamik von Arten mit hohem Molekulargewicht, insbesondere Membran gebundenen Proteinen. Vorteile schließen die Verwendung einer kostengünstigen Lichtquelle und einfache Ausstattung aufgrund der langen Lebensdauer, wodurch außerdem klinische Chemie und der Assay von Antigenen mit hohem Molekulargewicht möglich werden.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Durchführung eines Immunoassays einer interessierenden Probe, das die Schritte aufweist:
Koppeln eines lumineszenten asymmetrischen Übergangsmetall-Ligandkomplexes mit einer interessierenden Prbe, um einen gekoppelten Analyten zu bilden;
Anregen des gekoppelten Analyten mit linear polarisierter elektromagnetischer Energie, um den gekoppelten Analyten zu veranlassen, teilweise polarisiertes fluoreszierendes Licht auszusenden; und
Messen der Polarisation der fluoreszierenden Lichtemission als eine Messung eines biologischen Merkmals der interessierenden Probe.
Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung einen Fluoreszenzpolarisations-Assay zur Quantifizierung der Menge eines Analyten in eine Probe, das die Schritte aufweist:

(a) Mischen (1) eines zu einem Molekül konjugierten asymmetrischen Metall-Ligandkomplexes, das speziell mit dem Analyten mit (2) der Probe bindet;
(b) Anregen des Gemischs aus Schritt (a) mit linear polarisiertem Licht, um ein Komplex zu veranlassen, polarisiertes Licht auszusenden;
(c) Messen der Polarisation des von diesem Komplex emittierten Lichtes;
(d) Berechnen der Analytmenge in der Probe durch Korrelieren der in Schritt (c) gemessenen Polarisation des von der Kontrollprobe emittierten Lichtes, die eine bekannte Menge des Analyten enthält.

Die vorliegende Erfindung stellt auch einen kompetitiven Fluoreszenzpolarisations-Immunoassay zur Quantifizierung der Menge eines Analyten in einer Probe bereit, das die Schritte aufweist:

(a) Mischen (1) einer Kontrollprobe, die eine bekannte Menge eines zu einem Molekül konjugierten asymmetrischen Metall-Ligandkomplexes enthält mit (2) einem Molekül, das speziell den Analyten bindet;
(b) Anregen des Gemischs aus Schritt (a) mit linear polarisiertem Licht, um den Komplex zu veranlassen, polarisiertes Licht auszusenden;
(c) Messen der Polarisation des vom Komplex emittierten Lichtes;
(d) Hinzufügen der Probe zum Gemisch, um ein neues Gemisch einschließlich eines nicht konjugierten Analyten zu bilden, der mit dem zum asymmetrischen Metall-Ligandkomplex konjugierten Analyten um die Bindung mit dem Analyten speziell bindenden Molekül konkurriert, wodurch eine Änderung der Polarisation bewirkt wird;
(e) Messen der Polarisationsänderung;
(f) Berechnen der Analytmenge in der Probe durch Korrelieren der Polarisationsänderung mit der Kontrollprobe, die eine bekannte Menge des Analyten enthält.

Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Durchführung eines Affinitätspolarisationsassays einer interessierenden Probe zur Quantifizierung der Menge eines Analyten in der Probe bereit, das die Schritte aufweist:

(a) Mischen (1) einer Kontrollprobe, die eine bekannte Menge eines zu einem Analyten konjugierten asymmetrischen Metall-Ligandkomplexes enthält mit (2) einem Molekül, das eine Affinität für den Analyten hat;
(b) Anregen des Gemischs aus Schritt (a) mit linear polarisiertem Licht, um den Komplex zu veranlassen, polarisiertes Licht auszusenden;
(c) Messen der Polarisation des vom Komplex emittierten Lichtes;
(d) Hinzufügen der Probe zum Gemisch, um ein neues Gemisch einschließlich eines nicht konjugierten Analyten zu bilden, der mit dem zum asymmetrischen Metall-Ligandkomplex konjugierten Analyten zusammen mit dem Molekül, mit der Affinität für den Analyten konkurriert, wodurch eine Änderung der Polarisation bewirkt wird;
(e) Messen der Änderung der Polarisation;
(f) Berechnen der Analytmenge in der Probe durch Korrelieren der Polarisationsänderung mit der Kontrollprobe, die eine bekannte Menge des Analyten enthält.

KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1 ist ein schematisches Blockdiagramm einer Vorrichtung zum Implementieren der vorliegenden Erfindung unter Verwendung eines stationären Polarisationszustands oder Anisotropiemessungen. POL1 und POL2 sind Polarisatoren.
2 ist ein schematisches Blockdiagramm einer Vorrichtung zum Implementieren der vorliegenden Erfindung unter Verwendung zeitaufgelöster Messungen.
3 beschreibt die Synthese eines Ru Metall-Ligandkomplexes, der geeignet ist zum kovalenten Anheften an Proteine.
4 zeigt Absorptionsspektren des Komplexes, wenn er kovalent an humanes Serumalbumin (HSA) gebunden wird bei pH 7,0, und komplexfrei in Lösung bei pH 0,1 und 7,0. "Bpy" bezieht sich auf 2,2'-Bipyridin und "dcpby" bezieht sich auf 4,4'-Dicarboxy-2,2'-bipyridin.
5 zeigt die Emissionsspektren des Komplexes frei in Lösung (pH 0,1 und 7,0) und gebunden an HSA. Zum Vergleich sind Emissionsspektren symmetrische Ru Komplexe eingeschlossen.
6 zeigt die Anregungsanisotropiespektren von Ru (dkbpy)₂(dcbpy) frei und gebunden an HSA in Glycerol/Wasser (9:1, v/v) bei –55°C. Zum Vergleich sind auch die Anisotropiespektren der symmetrischen Ru Komplexe Ru(bpy)₃ ²⁺ und Ru(dcbpy)₃ ^4– eingeschlossen.
7 zeigt die temperaturabhängige Emissionsanisotropie des freien Komplexes und der Proteinkonjugate in Glycerol/Wasser (6:1, v/v). Die Emissionswellenlänge für [Ru8bpy)₃]²⁺ war 600 nm und 650 nm für das Ru(bpy)₂(dcbpy) und Ru markierte Proteine.
8 zeigt das Intensitätsabklingen von [Ru(bpy)₂(dcbpy)] konjugiert an ConA (Concanavalin A). Ähnliches Abklingen der Intensität wurde für [Ru(bpy)₂(dcbpy)] frei und konjugiert an andere Proteine erhalten. Diese Daten wurden unter Verwendung einer Vorrichtung, die ähnlich der in 2 gezeigten ist.
9 zeigt das Abfallen der Anisotropien von freiem [Ru(bpy)₂(dcbpy)] in Glycerol/Wasser (60/40, v/v) bei den angegebenen Temperaturen, erhalten unter Verwendung einer Vorrichtung, die ähnlich zu der in 2 gezeigten ist.
10 zeigt das Abklingen der Anisotropien von [Ru(bpy)₂(dcbpy)] frei und an Proteine konjugiert in einem Puffer. Das Abklingen der Anisotropie ist sichtlich langsamer für Proteine mit höherem Molekulargewicht.
11A und 11B zeigen das Abklingen der Anisotropie von [Ru(bpy)₂(dcbpy)], konjugiert an ConA bzw. IgG. Ansteigende Viskosität oder ansteigende% Glycerol führen zu langsameren Abklingen der Anisotropien.
12A und 12B zeigen das temperaturabhängige Abklingen der Anisotropien von [Ru(bpy)₂(dcbpy)], konjugiert an HSA bzw. Ferritin. Die Anisotropie klingt langsamer ab bei niedrigeren Temperaturen aufgrund langsamerer Rotationsdiffusion.
13 zeigt die Fluoreszenzpoarisations-Immunoassays von HSA.
14 zeigt das zeitaufgelöste Abklingen der Anisotropien des an HSA konjugierten Komplex in der Abwesenheit und Anwesenheit verschiedener Konzentrationen HSA spezifischer Antikörper.
15 zeigt einen konkurrierenden Immunoassay für HSA. In diesem Fall sind die Anwesenheit von unmarkiertem HSA in der Probe die Fluoreszenzpolarisation, die für das Gemisch von markiertem HSA und Antikörper beobachtet wird.
16 zeigt das Abklingen der Anisotropien von markiertem HSA in der Abwesenheit und Anwesenheit von Antikörper und mit unmarkiertem HSA. Die Anisotropie klingt schneller ab mit größeren Konzentrationen von unmarkiertem HSA in diesem konkurrierenden Immunoassay, was konsistent mit den in 15 dargestellten Daten ist.
17 zeigt die Absorption und das Anisotropiespektrum von einem OS Komplex, OS(bpy)₂(dcbpy).
18 zeigt das Emissionsspektrum des OS Komplexes.
19 zeigt das Absorptionsspektrum eines Rhenium (Re) Komplexes.
20 zeigt das Anregungsanisotropiespektrum eines Re Komplexes.
21 zeigt die Emissionsspektren eines Re Komplexes.
22 zeigt einen Fluoreszenzpolarisations-Immunoassay beruhend auf einem Osmiummetall-Ligandkomplex. Dieser Komplex kann mit hoher Polarisation bei 500 oder 700 nm ausgeführt werden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Es gibt eine Anzahl von Metall-Ligandkomplexen, die Lumineszenz zeigen, einschließlich Komplexe, die CO, Cr, Cu, Mo, Ru, RH, W, Re, Os, Ir und Pt enthalten. Besonders Übergangsmetallkomplexe, besonders solche mit Ru, Os, Re, Rh, Ir, W und Pt, können verwendet werden. Das Metall in dem Metall-Ligandkomplex ist besonders bevorzugt aus der Gruppe, bestehend aus Ruthenium, Osmium und Rhenium ausgewählt. Ein geeigneter Ligand in dem Metall-Ligandkomplex kann Polypyridin, Bipyridin oder ein verwandter Bestandteil sein, und der Ligand kann eine reaktive Gruppe enthalten, die häufig für eine Bindung an biologische Moleküle, wie N-Hydroxysuccinimidester einer Carboxysäure, Haloacetylgruppen, Maleimide, Sulfonylchloride und Isothiocyanate, verwendet wird. Andere Liganden für solche Metall-Ligandkomplexe sind Bipyrazyl, Phenanthrolin und zugehörige ersatzweise Derivate oder anorganische Liganden, wie CO, Cl, Nitril und Isonitril.
Geeignete Metall-Ligandkomplexe (MLCs) zur Verwendung in erfindungsgemäßen Fluoreszenzpolarisations-Immunoassays und Affinitätsassays werden unten dargelegt.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Komplexe können entsprechend dem in 3 dargelegten Schema synthetisiert werden. Eine Diskussion dieser Figur und der anderen Figuren ist unten dargelegt.
1 zeigt ein schematische Diagramm für L-Formatmessungen von fluoreszierender Anisotropie. In Figur, stellten POL1 und POL2 Polarisatoren dar.
2 zeigt eine typische zeitkorrelierte Einzelphotonenvorrichtung.
3 stellt dar, wie die reaktiven Metall-Ligandkomplexe die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, synthetisiert werden können.
4 zeigt Absorptionsspektren von [Ru(bpy)₂(dcbpy)] bei pH 0,1 und 7 und wenn es an HSA konjugiert ist. Ähnliche Absorptionsspektren wurden für andere konjugierte Proteine gefunden.
5 zeigt Emissionsspektren von [Ru(bpy)₃]²⁺ und [Ru(dcbpy)₃]^4– bei pH 7,0 und [Ru(bpy)₂(dcbpy)] bei pH 0,1 und 7 und wenn es an HSA konjugiert ist. Ähnliche Emissionsspektren wurden für andere Proteinkonjugate nachgewiesen.
6 zeigt Anregungsanisotropiespektren von Metall-Ligandkomplexen in Glycerol/Wasser (9:1, v/v) bei –55°C. 6 zeigt das in gefrorener Lösung, wo Rotationsbewegung nicht vorkommt, die Anisotropie des erfindungsgemäßen Komplexes höher ist als für einen symmetrischen [Ru(bpy)₃]²⁺ und (Ru(dcbpy)₃]^4– Komplexe.
7 stellt die temperaturabhängige Emissionsanisotropie von Metall-Ligandkomplexen und Proteinkonjugaten dar. Die Emissionswellenlänge von [Ru(bpy)₃]²⁺ betrug 600 nm. 7 zeigt, dass die Anisotrope von Ru(bpy)₂(dcbpy) höher ist, wenn es an Proteine gebunden ist, was anzeigt, dass die Anisotropie von dem Molekulargewicht abhängen wird.
8 stellt das Abklingen der Intensitäten von [Ru(bpy)₂(dcbpy)], konjugiert an ConA, dar. Ähnliches Abklingen der Intensitäten wurde für [Ru(bpy)₂(dcbpy)], konjugiert an andere Proteine, erhalten. 8 zeigt, dass die Lebensdauer des Komplexes, wenn er an ein Protein (Concanavalin A) gebunden ist, bei 400 ns liegt, und er somit geeignet ist zur Verwendung in FPI von Antigenen mit hohem Molekulargewicht.
9 stellt das Abklingen von Anisotropien von freien [Ru(bpy)₂(dcbpy)] in Glycerol/Wasser (60/40, v/v) bei verschiedenen dort angegebenen Temperaturen dar. 9 zeigt, dass das Abklingen der Anisotropie der Komplexe von der Rotationsgeschwindigkeit der Sonde, wie benötigt für FPI, abhängt.
10 stellt das Abklingen von Anisotropien von [Ru(bpy)₂(dcbpy)] in einen Puffer dar, und 10 zeigt, dass die Anisotropie von [Ru(bpy)₂(dcbpy)] langsamer abklingt mit Proteinen mit höherem Molekulargewicht. Diese Sensitivität gegenüber dem Molekulargewicht ist wesentlich für eine Verwendung in FPI.
11A und 11B stellen viskositätsabhängiges Abklingen der Anisotropien von [Ru(bpy)₂(dcbpy)], konjugiert an ConA bzw. IgG. 11A und 11B zeigen, dass die Anisotropien langsamer abklingen auf Erhöhen der Viskosität durch Zugeben von Glycerol. Dieses Ergebnis zeigt wieder, dass die Anisotropie des Komplexes von der Rotationsgeschwindigkeit und somit vom Molekulargewicht abhängt.
12A und 12B stellen temperaturabhängiges Abklingen von Anisotropien von [Ru(bpy)₂(dcbpy)], konjugiert an HSA bzw. Ferritin dar. 12A und 12B zeigen wieder, dass Anisotropie langsamer abnimmt, da die Rotationsgeschwindigkeit abnimmt, in diesem Fall durch Abnehmen der Temperatur.
13 stellt einen Fluoreszenzpolarisations-Immunoassay von HSA unter Verwendung des [Ru(bpy)₂(dcbpy)] Komplexes dar mit der Zugabe von HSA speziellen (spezifischem) Antikörper (geschlossene Kreise) und mit der Zugabe von nicht spezifischem Antikörper (offene Kreise). Eine signifikante Zunahme der Polarisation wird auf Binden von HSA markiertem Komplex an Anti-HSA beobachtet.
14 stellt das zeitaufgelöste Abklingen der Anisotropien des an HSA konjugierten Komplexes in der Abwesenheit und Anwesenheit von HSA spezifischem Antikörper dar. Es wird gezeigt, dass das Abklingen der Korrelation sehr von der Menge von Anti-HSA abhängt. Die Zunahme der Korrelationszeit, die vom Abklingen der Anisotropien beobachtet wird, bestätigt die Zunahme der in 13 beobachteten Polarisation.
15 stellt einen konkurrierenden Immunoassay für HSA dar. In diesem Fall verringert die Anwesenheit von unmarkiertem HSA in der Probe die Fluoreszenzpolarisation, die für das Gemisch von markiertem HSA und Antikörper beobachtet wird.
Die Abnahme der Polarisation erfolgt aufgrund konkurrierendem Binden von markiertem HSA und unmarkiertem HSA an Anti-HSA.
16 stellt das Abklingen der Anisotropien von markiertem HSA in der Abwesenheit von Antikörper und mit unmarkiertem HSA dar. Die Anisotropie klingt mit höheren Konzentrationen von unmarkiertem HSA in diesem konkurrierenden Immunoassay schneller ab, was konsistent mit Daten, die in 15 dargestellt werden ist.
17 stellt die Absorption und das Anisotropiespektrum eines Os Komplexes, Os(bpy)₂(dcbpy), dar. Dieser Komplex zeigt hohe Anisotropie in gefrorener Lösung. Dies gibt an, dass diese Verbindung auch als eine Sonde von Proteinrotation, d. h. Affinitätsassays, nützlich sein kann.
18 stellt das Emissionsspektrum des Os Komplexes dar.
Ein wichtiges Merkmal des Os Komplexes ist seine Langwellenabsorption und Emission. Er kann mit Laserdioden von 600 bis über 700 nm oder möglicherweise einer aussendenden Diode oder einem elektrolumineszenten Gerät angeregt werden. Das Ausmaß der Autofluoreszenz sinkt bei längeren Wellenlängen.
Die Lebensdauer des Os Komplexes kann bei 50 ns liegen. Diese Lebensdauer kann besser als die Ru Komplexes (400 ns) sein für Substanzen wie Serumalbumin (MW 70.000) mit Korrelationszeiten bei 50 ns. Der Ru Komplex kann besser sein für Antigene mit höherem Molekulargewicht. Jedoch sollte beachtet werden, dass einige Osmium-Ligandkomplexe dafür bekannt sind, längere Lebensdauern bei 400 ns zu zeigen. In diesem Fall wird die Verwendung von Osmiummetall-Ligandkomplexen die kombinierten Vorteile der langen Lebensdauer, die für Rutheniummetall-Ligandkomplexe beschrieben werden, und wird zusätzlich Langwellabsorption und Emission zeigen. Die Langwellenabsorption ermöglicht Anregung mit Laserdioden und anderen einfachen Lichtquellen.
19 und 20 stellen die Absorptions- und Anisotropiespektren eines Rhenium (Re) Komplexes dar. Der Re Komplex zeigt gute Polarisation in einem weiten Bereich der Anregungswellenlängen, und er sollte in Immunoassays und Affinitätsassays nützlich sein.
21 zeigt die Emissionspektren für einen Re Komplex. Die Quantenausbeute und Lebensdauer eines Re Komplexes hängen von der Temperatur ab.
22 zeigt einen Immunoassay, der auf einem Langwellen absorbierende Osmium Komplex beruht. Wie gezeigt in 17, zeigt dieser Komplex hohe Anisotropie, wenn er bei 500 oder 700 nm angeregt wird. In 22 zeigen wir einen Immunoassay zwischen dem Osmiummetall-Ligandkomplex, der mit HSA markiert ist, und monoklonalen und polyklonalen Antikörpern. Die Daten in 22 wurden mit 500 nm Anregung erhalten. Wir haben ähnliche Daten mit Langwellenanregung bei 600 und 700 nm erhalten. Solche Wellenlängen sind von Laserdioden und anderen einfachen Lichtquellen lieferbar. Die Daten in 22 kombiniert mit dem konkurrierenden Assay in 15 zeigen, dass der konkurrierende Immunoassay möglicherweise auf diesen Osmium metall-Ligandkomplex oder ähnlichen Metall-Ligandkomplexen unter Verwenden langer Wellenlängenanregungen beruht.
In einem erfindungsgemäßen direkten Polarisationsassay kann der asymmetrische Metall-Ligandkomplex an einen Rezeptor, Antikörper oder Lectin konjugiert werden. Ein Rezeptor, Antikörper oder Lectin kann auch in einem erfindungsgemäßen konkurrierenden Immunoassay, d. h. als das Molekül, das spezifisch den Analyten bindet, verwendet werden.
In der vorliegenden Erfindung kann die interessierende Probe eine antigene Substanz oder ein anderer Analyt mit einem Molekulargewicht über 2000 sein. Die Antigensubstanz kann ein Protein, eine Nukleinsäure, ein Polysaccharid oder eine Kombination dieser Substanzen sein. Die antigene Substanz kann auch ein zellulares oder Zelloberfiächenantigen, Glykopeptid, Lipoprotein oder Glykolipid sein, was natürlicherweise oder aufgrund eines fremden Objektes (wie Bakterien oder Viren) anwesend sein.
Die anregende elektromagnetische Energie, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann ein linear polarisierter Lichtpuls sein, und das Verfahren kann ferner den Schritt des Messens der Polarisation des gekoppelten Analyten sein. Der Anregungsschritt kann durch eine Lichtquelle, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Blitzlampe, einer modulierten Lampe, einem Elektrolumineszenzgerät, einer Licht aussenden Diode und einem Laser (wie einem Diodenlaser oder einem amplitudenmodulierten Laser) implementiert werden. Die Lichtimpulse und das fluoreszierende Licht kann durch optische Fasern übertragen werden. Der Messschritt in der vorliegenden Erfindung kann unter Verwendung eines implantierten Pflasters, das den gekoppelten Analyten enthält, erfolgen. In dem erfindungsgemäßen Verfahren kann der stationäre Zustand des linear polarisierten Lichts von einem Merkmal der gekoppelten Probe oder irgendeines ungekoppelten Analyten, der anwesend ist, abhängen. Auch kann das Abklingen der Intensität oder Abklingen der Polarisation von der gekoppelten Probe abhängen. Auch kann die Menge des Analyten aus dem Abklingen der Emissionsanisotropie abgeschätzt werden, die mit amplitudenmodulierter Anregung durch Phasenmodulationsfluorometrie gemessen wird.
In einer besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist der Immunoassay ein kompetitiver Immunoassay.
Eine andere bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform ist ein Affinitätsassay. In dem Affinitätsassay kann das Molekül, das Affinität für den Analyten aufweist, ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Streptavidin, Avidin, Biotin und Lectinen. Ein erwünschter Typus von Affinitätsassay verwendet Proteine (z. B. Proteine, die Glucose und Polysaccharide, wie Concanavalin A, binden).
Die Erfindung kann auch in Affinitätsassays, die auf spezifischen Binden zwischen Makromolekülen beruhen, verwendet werden. Zum Beispiel hat Concanavalin A Affinität für Dextran und wird durch Glucose verdrängt. Von der Polarisation eines Gemischs von markierten ConA und Dextran kann erwartet werden, dass es Polarisationswerte, die von einer Glucosekonzentration abhängen, zeigen.
Die vorliegende Erfindung wird nun weiter im Detail durch die folgende Experimentierung beschrieben. Wenn nicht anders angegeben sind alle Anteile, Prozente, Verhältnisse und ähnliches bezogen auf das Gewicht.
EXPERIMENTIERUNG
MATERIALIEN UND METHODEN
RuCl₂, Ru(bpy)₂Cl₂ und Ru(bpy)₃Cl₂ wurden von Aldrich Chemical Company bezogen. Chemische Synthese des NHS-Esters von [Ru(bpy)₂(dcbpy)]²⁺ und des mehr symmetrischen Komplexes [Ru(dcbpy)₃]²⁺ wurde wie in 3 beschrieben durchgeführt.
Synthese von Ru bis(2,2'-Biypridin)(2,2'-Bipyridin-4,4'-dicarboxylsäure) bis(Hexafluorphosphat) (1):[Ru(bpy)₂C1₂ (0,4 g), NaHCO₃ (0,4 g) und 2,2'-Bipyridin-4,4'-dicarboxylsäure (0,3 g) wurden in MeOH:H₂O = 4:1 für 8 bis 10 Stunden erhitzt. Die Lösung wurde in einem Eisbad für 2 Stunden gekühlt, und der pH wurde mit konzentrierter H₂SO₄ auf 4,4 angeglichen. Das gebildete Präzipitat wurde filtriert und dann mit MeOH gewaschen, das Filtrat wurde mit 5 g NaPF₆ in 25 ml H₂O behandelt und dann in einem Eisbad gekühlt, und das Präzipitat wurde durch Filtration gesammelt. Ausbeute: 0,6 g (77%).
Synthese Ru tris(2,2'-Biypridin-4,4'-dicarboxylsäure) bis-(Hexafluorphosphat) (2):RuCl2 (0,1 g) und 2,2'-Bipyridin-4,4'dicarboxylsäure (3,67 g) wurde in 15 ml Ethylenglykol suspendiert und für 2 Stunden rückgeflossen. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur gekühlt und filtriert. Nach der Zugabe von 2,5 g NaPF₆ in 25 ml H₂O wurde der pH des Filtrats auf 1,0 mit konzentrierter H₂SO₄ angeglichen, und die Lösung wurde für ein paar Stunden gekühlt. Das Präzipitat wurde gesammelt und im MeOH resuspendiert, filtriert und über P₄O₁₀ getrocknet. Ausbeute: 0,38 g (68%).
Synthese des NHS-Esters: Ru tris(2,2'-Bipyridin-4,4'-dicarboxylsäure) N-Hydroxysuccinimidester (4):0,46 g DCC und 0,238 N-Hydroxysuccinimid wurde in 3 ml DMF mit Rühren gelöst und in einem Eisbad gekühlt. Eine Lösung von 0,38 g Ru tris(2,2'-Bipyridin-4,4'-dicarboxylsäure) (2) wurde zugegeben und das Gemisch wurde für ein paar Stunden gerührt. Das gebildete Präzipitat wurde durch Filtration durch einen Spritzenfilter entfernt, das Filtrat, das den aktiven Ru Komplex enthält, wurde zum Markieren der Substrate verwendet.
Die Proteine HSA, IgG, ConA und Ferritin wurden von Sigma Chemical Company erhalten und ohne weitere Reinigung verwendet. Die Proteine (10 mg Portionen) wurden markiert durch Zugeben eines 100-fach molaren Überschusses des Ru-NHS Esters in 50 μl von DMF 1 ml gerührter Proteinlösung (0,2 M Carbonatpuffer, pH 8,3–9,1), gefolgt durch eine 2–6 stündige Inkubation und Reinigung des markierten Proteins durch Gelfiltrationschromatographie auf Sephadex G-25 oder G-50 unter Verwendung von 0,1 M PBS, pH 7,2.
Abklingen von Fluoresozenzintensitäten und Anisotropien wurde durch zeitkorreliertes Einzelphotonzählen (engl.: time-correlated single photon counting (TCSPC)). Die hauptsächliche Lichtquelle war ein Hohlraum ladender (1 MHz) Pyridin 1 Farbstofflaser mit einer auf 360 nm verdoppelten Frequenz. Dieser Farbstofflaser wurde durch einen Modelocked ND:YAG Laser gepumpt. Die 360 nm Ausgabe war weniger nützlich zur Anregung des Ru Komplexes, wegen der niedrigeren Anisotropie bei dieser Anregungswellenlänge. Da die 360 nm Laserpulse im Allgemeinen dazu verwendet werden, um einen nahezu gesättigte Lösung von Perylen in Cyclohexan zu beleuchten und ein 483 nm Interferenzfilter, um die Perylenemission zu isolieren, die dazu verwendet wurde, um die Ru Komplexe anzuregen. Die ungefähr 5 ns Abklingzeit der "Lampe" war leicht kurz genug für die 200–500 ns Abklingzeiten, die durch die erfindungsgemäßen Proben gezeigt wurden. Bestimmen der Emission wurde mit einer Hammamatsu R2809 Mikrokanalplatte (engl.: microchannel plate (MCP)) PMT und der gewöhnlichen Elektronik für TCSPC durchgeführt. Einige der zeitaufgelösten Intensitätsabfälle (14 und 16) wurden unter Verwendung von 360 nm Anregung erhalten.
Die zeitaufgelösten Intensitätsabfälle (I(t)) wurden auf die Einzel- und Doppelexponentialmodelle angepasst,
wobei α₁ die präexponentiellen Faktoren und τ_i die Abfallzeiten unter Verwendung von Software von IBH Software (Edingburgh, Schottland). Die "Lampen" Funktion wurde als die Antwort genommen, die von einer Streuungslösung bei 483 nm mit der Perylen "lampe" beobacht wird.
Die zeitaufgelösten Anisotropieabfälle wurden durch Messen der zeitabhängigen Abfälle der vertikalen (I_II(t)) und horizontalen (I_⊥(t)) Bestandteilen der Emission erhalten:
Diese Daten wurden auf ein einfaches Korrelationszeitmodell angepasst wiederum unter Verwendung von Standardsoftware.
wobei r_oi die Amplituden sind und θ_i die Rotationskorrelationszeiten sind.
Stationäre Zustandsfluoreszenzdaten wurden unter Verwendung eines Spektrofluorometers von SLM Instruments mit Magic-Angle Polarisatorbedingungen und einem Hamamatsu R-928 Detektor erhalten. Die Emissionsspektren sind nicht korreliert.
ERGEBNISSE
Absorptionsspektren von [Ru(bpy)₂(dcbpy)], hier bezeichnet als Ru Komplex, werden in 4 gezeigt. Diese Spektren sind zur Vereinheitlichung normalisiert, um einen Vergleich zu erleichtern. Die Absorptionsspektren des Ru Komplexes hängen von pH ab. Bei pH 7 wird erwartet, dass die Nettoladung auf dem Komplex Null beträgt, mit zwei positiven Ladungen auf dem Ru und zwei negativen Ladungen von den zwei dcpby Liganden. Die langwelligen Absorptionsspektren der Ru-markierten Proteine sind ähnlich und scheinen zwischen denen zu liegen, die für den Ru Komplex bei pH 7 und 0,1 beobachtet wurden. Durch diese Absorptionswellenlängen ist es möglich, eine einfache blaue LED, blaue Elektrolumineszenzlichtquellen oder frequenzverdoppelte Laserdioden zu verwenden.
Emissionspektren von [Ru(bpy)₂(dcbpy)] in wässriger Lösung werden in 5 gezeigt. Das Emissionsspektrum des Ru Komplexes bei pH 7 ist vergleichbar zu dem, das für [Ru (dcbpy)₃]^4– mit einer geringfügigen Rotverschiebung (5 nm) und signifikant rot verschoben relativ zu [Ru(bpy)₃]²⁺ um 28 nm. Dies weist darauf hin, dass die spektralen Eigenschaften des Ru Komplexes durch die Anwesenheit eines einzigen dcbpy Liganden bestimmt werden. Folglich kann die Anisotropie von [Ru(bpy)₂(dcbpy)] höher sein als die symmetrischerer Komplexe, da der Anregungszustand zwischen einem Metall und einem einzelnen Liganden lokalisiert sein kann eher als zwischen den drei Liganden delokalisiert zu sein. Die Emissionsspektren des Ru markierten Proteins sind ähnlich und scheinen auch zwischen dem, der für den Ru Komplex bei pH 7 und 0,1 beobachtet wurde, zu liegen (siehe 5). Ähnliche Spektren und Quantenausbeuten wurden für jedes der markierten Proteine festgestellt. Eine etwas geringere Quantenausbeute wurde für markiertes Ferritin festgestellt, was wahrscheinlich durch langwellieg Absorption von Ferritin und die Möglichkeit eines Förster und/oder Dexter Übergangs von dem Ru auf das Protein verursacht wird.
Die Wirkung des Sauerstoffquenschens auf die Quantenausbeute wurde auch untersucht. In der Abwesenheit von Sauerstoff, luftäquilibrierter und sauerstoffäquilibrierter Pufferlösungen betrugen die relativen fluoreszierenden Intensitäten 1, 0,77, 0,44 bzw. 1, 0,89, 0,65, für [Ru(bpy)₂(dcbpy)] und Ru-HSA. Während diese Sonde sensitiv gegenüber gelöstem Sauerstoff ist, ist die Sensitivität Ru Komplex markierter Proteine mäßig und wird keinen Ausfluss von Sauerstoff benötigen, um die Emission zu beobachten.
Die stationären Zustandsanregungsanisotropiespektren wurden für [Ru(bpy)₃]²⁺, [Ru(dcbpy)₃]^4– und [Ru(bpy)₂(dcbpy)] frei und markiert an HSA (siehe 6) in verglaster Lösung, in Rotationsdiffusion während der angeregten Zustandslebensdauer nicht vorkommt. Im Wesentlichen zeigten der asymmetrische Komplex [Ru(bpy)₂(dcbpy)] uns seine konjugierten Proteine Anisotropien von 0,25 bis 0,3 für Anregung bei 480–490 nm. Im Gegensatz dazu zeigten die Anisotropiespektren von [Ru(bpy)₃]²⁺ und [Ru(dcbpy)₃]^4– beachtenswert kleinere Werte bei allen Anregungswellenlängen über 450 nm. Offensichtlich ist die Anwesenheit eines nicht identischen Liganden zum Erhalten einer nützlichen Anisotropiesonde wichtig.
Der stationäre Anisotropiezustand der markierten Proteine und des Ru Komplexes wurden über einen Bereich von Temperaturen und/oder Viskositäten untersucht (siehe 7). Das Lösungsmittel war 60% Glycerol/40% Puffer, was ein optisch klares Glas bei –55°C bildet. Bei niedrigen Temperaturen (–55°C) waren die Anisotropien beinahe identisch für den freien Ru Komplex und für Ru markierten Proteine. Die Anisotropiewerte betrugen ungefähr 0,25, was nahe bei 0,28 liegt, das bei –70°C erhalten wird. Im Gegensatz dazu blieben die stationären Anisotropiezustände von [Ru(bpy)₃]²⁺ und [Ru(bpy)₃]^4– gering bei allen Temperaturen.
Für den Ru Komplex und die Ru markierten Proteine geben die temperaturabhängigen an, dass die Anisotropien sensitiv gegenüber Rotationsbewegungen sind (siehe 7). Die stationäre Anisotropie des freien Ru Komplexes sind über –50°C schnell, wobei die Anisotropien der Ru markierten Proteine langsamer sinken mit der Temperatur und sogar bei 20°C relativ hoch bleiben. Die stationären Zustandswerte waren nur mäßig abhängig von dem Molekulargewicht: Ferritin = 500.000, IgG = 160.000; ConA = 102.000; HSA = 65.000 Dalton. Wie unten gezeigt, wird einiges der Anisotropie des Ru Proteinkomplexes durch schnelle Bewegungen der Sonde zusätzlich zur Rotationsbewegung der Proteine verloren. Im Wesentlichen waren die Anisotropien der markierten Proteine immer größer als die des freien Ru Komplexes (siehe 7), was anzeigt, dass Proteinhydrodynamik zur Anisotropie beiträgt. Der Nachweis von Rotationsbewegung unter Verwendung dieser Komplexe ist kein offensichtliches Ergebnis. Eine große Anzahl veröffentlichter Berichte haben darauf hingewiesen, dass die Anisotropie und der Anisotropieabfall des Ru Metall-Ligandkomplexes auf die intermolekularen Vorgänge zurückzuführen ist, wie Randomisierung des angeregten Zustands zwischen den drei organischen Liganden und/oder Interaktionen mit dem Lösungsmittel, was zu einer Lokalisation des angeregten Zustands nach Randomisierung führt.

Der Zeitbereich der Anisotropieabfallsmessungen wird durch die Lebensdauer des angeregten Zustands bestimmt. Wir verwendeten TCSPC um die Lumineszenzlebensdauer des Ru Komplexes und der Ru markierten Proteine zu bestimmen. Die Intensitätsabfälle wurden durch eine einzige Abfallzeit eng geschätzt (siehe 8). Die Abfallzeiten der markierten Proteine waren zu der, des Ru Komplexes allein unter einer vergleichbaren experimentellen Bedingung vergleichbar, wie unten in Tabelle I gezeigt. Tabelle I. Fluoreszenzlebensdauer von [Ru(bpy)₂(dcbpy)] und der markierten Proteine.^a

Protein	Puffer pH 7,0 20°C τ (ns)	60% Glycerol 20°C τ (ns)	30% Glycerol^b
Protein	Puffer pH 7,0 20°C τ (ns)	60% Glycerol 20°C τ (ns)	20°C τ (ns)	5°C τ (ns)	–15°C τ (ns)
Keines^a	375	521	472	459	466
ConA	341	509	416	418	416
HSA	336	467	392	467	485
IgG	348	618	427	472	510
Ferritin	250	424	291	369	373

^a Anregung 483 nm, Emission über 540 nm, (Corning 3–67 Filter), luftäquilibriert.
^b Volumen-% Glycerol mit Puffer.
^c Ru frei bezieht sich auf [Ru(bpy)₂(dcbpy)]

Die Abfallszeiten stiegen etwas in der Anwesenheit von Glycerol und bei niedrigeren Temperaturen, aber der gesamte Bereich betrug nur ungefähr das Zweifache (250 bis 500 ns). Wie erwartet werden konnte, war die Lebensdauer des Ru markierten Ferritin etwas kleiner als die der anderen Proteine, was wahrscheinlich auf den Energieübergang auf die Langwellenabsorption von Ferritin zurückzuführen war. Die lange Lebensdauer dieser Markierungen weist darauf hin, dass der Ru Komplex dazu verwendet werden kann, um Rotationskorrelationszeiten so lange wie 1,5 μs, ungefähr dreimal die Lumineszenzlebensdauer, zu messen.
Man kann bemerken, dass das Signal/Rauschenverhältnis in diesen Daten nur mäßig ist (siehe 8), was auf eine Kombination von Faktoren zurückzuführen ist, welche die ineffiziente "Perylenlampe" und die langsame Emissionsgeschwindigkeit des Komplexes, was zu einer relativ geringen Anzahl von Quanten pro Zeitkanal (von ungefähr 1000 bis 3000 Quanten) führt. Nichtsdestotrotz sind diese Daten für diese Studien geeignet, um die Nützlichkeit dieses Metall-Ligandkomplexes als Anisotropiesonden zu bestimmen. Es wird darauf hingewiesen, dass während die Anzahl der Photonenzahlen pro Kanal niedrig ist, die Gesamtanzahl der Zahlen hoch ist, bei 10⁶, und die Abfallzeiten dieser Daten genau bestimmt sind.
Um zu zeigen, dass die zeitabhängige Anisotropie von der Rotationsdiffusion abhängt, wurde die Anisotropie von freien [Ru(bpy)₂(dcbpy)] in 60% Glycerol-Wasser (v/v) bei verschiedenen Temperaturen und Viskositäten untersucht (siehe 9). Bei 20°C fiel die Anisotropie mit einer Korrelationszeit bei 8 ns schnell ab. Da die Temperatur sank, fiel die Anisotropie langsamer ab mit der Korrelationszeit, die auf 240 ns bei –30°C und auf über 1 μs bei –51°C stieg (siehe 9). Da die Lebensdauer des Ru Komplexes bei 500 ns liegt, fällt die Intensität nur auf ungefähr 60% des anfänglichen Werts bei 240 ns. Deshalb sollte es möglich sein, noch längere Korrelationszeiten zu messen. Bei –51°C betrug die Korrelationszeit mehr als 1 μs mit einem gewissen Hinweis auf einen schnelleren Bestandteil bei 115 ns. Der Ursprung dieses kürzeren Bestandteils ist unbekannt und kann die Rolle der Lösungsmittelrelaxation in der Lokalisation des angeregten Zustands innerhalb des Komplexes wiederspiegeln. Nichtsdestotrotz fällt die nahe einzelne exponentielle Anisotropie und die offensichtliche Aktivierungsenergie für Rotationsdiffusion nahe 9,46 kcal/mol (unter Verwendung von Daten von 9) unterstützt die Verwendung des Ru Komplexes als eine Rotationsdiffusionssonde.
Zeitabhängige Anisotropieabfälle des freien Ru Komplexes und der Ru markierten Proteine werden in 10 g zeigt. Für den Ru Komplex allein in einem Puffer (d. h. nicht an ein Protein gekoppelt) fällt die Anisotropie innerhalb der 5 ns Pulsdauer der "Perylenlampe" ab. Im Gegensatz dazu, fällt die Anisotropie für die Ru markierten Proteine viel langsamer ab. Im Wesentlichen wird die zeitabhängige Verringerung der Anisotropie langsamer, da das Molekulargewicht des markierten Proteins steigt. Spezifisch zeigt Ru markiertes Ferritin den langsamsten Anisotropieabfall, ConA zeigt den schnellsten Anisotropieabfall und IgG zeigt einen dazwischenliegenden Abfall. Während man erwarten könnte, dass der Anisotropieabfall von ConA (MQ 102.000 für das Tetramer) langsamer ist als von HSA (MW 65.000), ist es nicht bekannt, ob die ConA Untereinheiten auf dieser Zeitskala dissoziieren und die Formen dieser zwei Proteine sich unterscheiden können. Auf jeden Fall zeigen die Daten in 10, dass die Anisotropieabfälle der Ru markierten Proteine sensitiv gegenüber der Größe und/oder Form der Proteine sind. In der Tat sind diese Daten schon auf die Anwesenheit eines multiexponentiellen Anisotropieabfalls für IgG im Gegensatz zu den einfachen exponentiellen Anisotropieabfällen von HSA und ConA hingewiesen.
Zusätzliche Anisotropieabfälle werden in den 11A, 11B, 12A und 12B gezeigt. Die Daten für ConA und IgG legen dar, dass der Ru Komplex einen langsameren Anisotropieabfall zeigt, da Proteinrotationsdiffusion durch Zugeben von Glycerol verlangsamt wird (11A und 11B). Bei einer gegebenen Glycerolkonzentration ist der Anisotropieabfall langsamer bei geringeren Temperaturen (12A und 12B). Die längste gemessene Korrelationszeit betrug 807 ns, wie von dem Anisotropieabfall von Ferritin in 30% Glycerol bei 5°C abgeschätzt wird. Korrelationszeiten länger als 1 μs wurden beobachtet, wie unten in Tabelle II dargelegt, sie sind aber nicht gut aufgelöst.
13 zeigt ein Polarisationsimmunoassay von humanem Serumalbumin. In diesem Fall wurde das HSA mit [Ru(bpy)₂(dcbpy)]. Das markierte HSA wurde mit HSA spezifischem IgG titriert. Die Polarisation stieg bis ungefähr 200% auf Binden an Antikörper. Die offenen Kreise zeigen Polarisation, die gemessen wurde, wenn das markierte HSA mit dem nicht spezifischen Antikörper titriert wurde. In diesem Fall blieb die Fluoreszenzpolarisation unverändert.
14 zeigt die zeitabhängigen Anisotropieabfälle von markiertem HSA in der Abwesenheit und Anwesenheit von HSA spezifischem Antikörper. Man beachte, dass der Anisotropieabfall in der Anwesenheit von HSA spezifischem IgG viel langsamer war als für markiertes HSA allein. Diese Beobachtung gibt an, dass Binden von IgG an HSA die Rotationsbewegungen des Ru Komplexes verringerte.
15 zeigt einen kompetitiven Immunoassay für HSA. In diesem Fall wurde HSA mit dem Ru Komplex markiert und dieses markierte HSA war teilweise mit Antikörper gesättigt. Die Anwesenheit von unmarkiertem HSA in der Probe wurde durch ein Sinken in der Fluoreszenzpolarisation beobachtet. Das Sinken in der Polarisation ergibt sich aus dem kompetitiven Binden von markiertem und unmarkiertem HSA an den Antikörper.
16 zeigt den zeitabhängigen Anisotropieabfall für den kompetitiven Immunoassay. Die Anisotropie fiel schneller als die Konzentration des Analyten (unmarkiertes HSA) erhöht wurde. Diese Wirkung wurde beobachtet, da das unmarkierte HSA um Binden an den Antikörper konkurriert, wobei das Binden von markiertem HSA an den Antikörper verhindert wird.
17 zeigt das Absorptions- und Anisotropiespektrum eines Os Komplexes, Os(bpy)₂(dcbpy). Dieser Komplex zeigt hohe Anisotropie in gefrorener Lösung. Dies gibt an, dass dieser Bestandteil auch als eine Sonde zur Messung von Proteinrotationen, d. h. Affinitätsassays, nützlich ist. Ein wichtiges Merkmal des Os Komplexes ist seine Langwellenabsorption und Emission. Er kann mit Laserdioden von 600 bis über 700 nm oder möglicherweise einer Licht aussendenden Diode oder einem Elektrolumineszenzgerät angeregt werden. Das Ausmaß der Autofluoreszenz von biologischen Proben sinkt bei längeren Anregungswellenlängen.
18 zeigt das Emissionsspektrum des Os Komplexes. Die Lebensdauer des Os Komplexes liegt nahe 50 ns. Diese Lebensdauer kann besser sein als der Ru Komplex (400 ns) für Substanzen wie Serumalbumin (MW 70.000) mit Korrelationszeiten nahe 50 ns. Der Ru Komplex kann für Antigene mit höherem Molekulargewicht besser sein. Wieder bemerken wir, dass es Os Komplexe gibt mit Abfallzeiten nahe 400 ns, die die kombinierten Vorteile von Langwellenanregung und Emission und langer Abfallzeit aufweisen.

19 und 20 zeigen die Absorptions- und Anisotropiespektren eines Rhenium (Re) Komplexes. 21 zeigt sein Emissionsspektrum. Der Re Komplex zeigt gute Polarisation und sollte in Immunoassays und Affinitätsassays nützlich sein. Tabelle II. Anisotropieabfälle von [Ru(bpy)₂(dcbpy)] und Ru markierten Proreinen.^a

Protein	Puffer pH 7,0 20°C θ (ns)	60% Glycerol 20°C θ (ns)	30% Glycerol^b
Protein	Puffer pH 7,0 20°C θ (ns)	60% Glycerol 20°C θ (ns)	20°C θ (ns)	5°C θ (ns)	–15°C θ (ns)
Keines^a	3,9	8,3	4,4	5,8	12,1
HSA	51 - -	139 15 212	120 14 136	117 13 213	73 -^b -
ConA	33 - -	121 21 296	90 15 96	109 9 165	165 19 218
IgG	76 9 78	120 14 317	131 15 200	92 38 480	167 37 > 1 μs
Ferritin	89 24 165	133 15 > 1 μs	120 20 351	107 28 807	112 34 > 1 μs

^a Anregung 483 nm, Emission über 540 nm, (Corning 3–67 Filter), luftäquilibriert. Die Viskositäten bei 20°C wie abgeschätzt betragen 1,02, 3,0 und 17 cP für Puffer, 30% bzw. 60% Glycerol.
^b Passt nicht zu zwei Bestandteilen.
^c Ru frei bezieht sich auf Ru(bpy)₂(dcbpy).

Wie aus obigem ersehen werden kann, bietet die polarisierte Emission von Metall-Ligandkomplexen zahlreiche experimentelle Möglichkeiten in der Biophysik und klinischen Chemie. Ein weiter Bereich von Lebensdauern, Absorptions- und Emissionsmaxima kann durch sorgfältige Auswahl des Metalls und des Liganden erhalten werden. Absorptionswellenlängen so lang wie 700 nm kann unter Verwendung von Osmium erhalten werden und Lebensdauern so lang wie 100 μs kann unter Verwendung von Rhenium als das Metall in solchen Komplexen erhalten werden. Die Rhenium Komplexe zeigen auch gute Quantenausbeuten in wässriger Lösung.
Die oben gezeigten Anisotropieabfälle zeigen eine beachtenswerte Mobilität des vorliegenden Ru Komplexes an, die unabhängig von der Gesamtrotationsdiffusion ist. Wenn die unabhängigen Bewegungen in der Amplitude verringert werden können, wird ein höherer Anteil der gesamten Anisotropie verfügbar, um die gesamte Hydrodynamik der Proteine zu bestimmen. Dies könnte durch strukturelle Varianten des [Ru(bpy)₂(dcbpy)]²⁺ Komplex durchgeführt werden.
Es sollte auch bemerkt werden, dass solch langlebige Sonden für Studien von diffusiven Vorgängen nützlich sein können in einer Zeitskala, die derzeit durch die herkömmlichen Fluoreszenzsonden nicht erreichbar ist. Zum Beispiel gibt es beachtenswertes Interesse in den Geschwindigkeiten und Amplituden von Domäne-zu-Domäne-Bewegungen in Proteinen, und es hat wiederholte Versuche gegeben, solche Bewegungen durch zeitaufgelösten Fluoreszenzresonanzenergieübergang (engl.: fluorescence resonance engery transfer (FREI)) zu untersuchen. Diese Messungen sind meist erfolglos gewesen aufgrund der 5–10 ns Abfallzeiten und des beschränkten Ausmaßes der Interdomänenbewegungn auf dieser Zeitskala. Die Verwendung von langlebigerer MLC Emission kann Messungen dieser Bewegungen ermöglichen.
Schließlich wird bemerkt, dass der MLC beachtenswerte Information über Rotationsvorgänge bereitstellen unter Verwendung nur von stationären Zustandsdaten. Die Emission dieser Komplexe kann durch eine Vielfalt von Molekülen und Ionen gequenscht werden, typischerweise durch fotoinduzierten Elektronenübergang auf dem Quenscher. Die langen Lebensdauern dieser Komplexe weisen darauf hin, dass die Lebensdauern der markierten Makromoleküle über einen weiten Bereich variiert werden kann mit mäßigen Konzentrationen des Quenschers. Messungen des stationären Anisotropiezustands als eine Funktion der Lebensdauer oder Quenscherkonzentrationen kann verwendet werden, um die Anisotropieabfallgesetze von membran- und proteingebundenen Fluorophoren zu bestimmen.

Claims

Verfahren zur Durchführung eines Immunoassays einer interessierenden Probe, das die Schritte aufweist: (a) Koppeln eines lumineszenten asymmetrischen Übergangsmetall-Ligandkomplexes mit einem Analyten in der interessierenden Probe, um einen gekoppelten Analyten zu bilden; (b) Anregen des gekoppelten Analyten mit linear polarisierter elektromagnetischer Lichtenergie, um den gekoppelten Analyten zu veranlassen, polarisiertes fluoreszierendes Licht auszusenden; und (c) Messen der Polarisation der fluoreszierenden Lichtemission, wobei der interessierende Analyt eine antigene Substanz oder ein anderer Analyt mit einem Molekulargewicht über 1.000 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die anregende elektromagnetische Energie ein linear polarisierter Lichtimpuls ist, und das Verfahren ferner den Schritt des Messens der Polarisation des fluoreszierenden Lichts erst nach dem Abklingen der Hintergrund-Autofluoreszenz des gekoppelten Analyten aufweist.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem der Anregungsschritt durch eine Lichtquelle implementiert wird, die aus einer Gruppe bestehend aus einer Blitzlampe, einer modulierten Lampe, einem Elektrolumineszenzgerät, einer Leuchtdiode, einem Diodenlaser und einem amplitudenmodulierten Laser gewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem der Lichtimpuls und das fluoreszierende Licht über Lichtleitfasern übertragen werden.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Messschritt unter Verwendung eines implantierten Pflasters (Patch), das den gekoppelten Analyten enthält, erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem ein stationärer Polarisationszustand von einem Merkmal des gekoppelten Analyten oder eines eventuell vorhandenen nicht gekoppelten Analyten abhängt.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Abklingen der Intensität oder der Polarisation vom gekoppelten Analyten abhängt.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die antigene Substanz ein Protein, eine Nukleinsäure oder ein Polysaccharid ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die antigene Substanz ein zellulares oder Zelloberflächen-Antigen, Glykopeptid, Lipoprotein oder Glykolipid ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Analytmenge aus dem zeitabhängigen Abklingen der Anisotropie geschätzt wird, gemessen nach der gepulsten Anregung.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Analytmenge aus dem Abklingen der Emissionsanistropie geschätzt wird, gemessen mit amplitudenmodulierter Anregung durch Phasenmodulationsfluorometrie.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Immunoassay ein kompetitiver Immunoassay ist.
Verfahren zur Durchführung eines Fluoreszenzpolarisations-Assays zur Quantifizierung der Menge eines Analyten in einer Probe, das die Schritte aufweist: (a) Mischen (1) eines zu einem Molekül konjugierten asymmetrischen Übergangsmetall-Ligandkomplexes, das spezifisch den Analyten mit (2) der Probe bindet; (b) Anregen des Gemischs aus Schritt (a) mit linear polarisiertem Licht, um den Komplex zu veranlassen, polarisiertes Licht auszusenden; (c) Messen der Polarisation des von diesem Komplex emittierten Lichtes; und (d) Berechnen der Analytmenge in der Probe durch Korrelieren der in Schritt (c) gemessenen Polarisation mit dem von einer Kontrollprobe emittierten Lichtes, die eine bekannte Menge des Analyten enthält.
Verfahren zur Durchführung eines kompetitiven Fluoreszenzpolarisations-Assays zur Quantifizierung der Menge eines Analyten in einer Probe, das die Schritte aufweist: (a) Mischen (1) einer Kontrollprobe, die eine bekannte Menge eines zu einem asymmetrischen Übergangsmetall-Ligandkomplexes konjugierten Analyten enthält mit (2) einem Molekül, das spezifisch den Analyten bindet; (b) Anregen des Gemischs aus Schritt (a) mit linear polarisiertem Licht, um den Komplex zu veranlassen, polarisiertes Licht auszusenden; (c) Messen der Polarisation des vom Komplex emittierten Lichtes; (d) Hinzufügen der Probe zum Gemisch, um ein neues Gemisch einschließlich eines nicht konjugierten Analyten zu bilden, der mit dem zum asymmetrischen Übergangsmetall-Ligandkomplex konjugierten Analyten um die Bindung mit dem den Analyten spezifisch bindenden Molekül konkurriert, wodurch eine Änderung der Polarisation bewirkt wird; (e) Messen der Polarisationsänderung; und (f) Berechnen der Analytmenge in der Probe durch Korrelieren der Polarisationsänderung mit der Kontrollprobe, die eine bekannte Menge des Analyten enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13 oder 14, bei dem der Liganad im Metall-Ligandkomplex aufweist: – Polypyridin, Bipyridin; oder – ein Bipyrazyl, ein Phenantrolin und ferner CO, Cl, Phosphin-, Nitril- oder Isonitrilgruppen aufweisen kann; oder – eine reaktive Gruppe, die aus der Gruppe bestehend aus einem N-Hydroxysuccimidester einer Carbonsäure, Haloacetylgruppen, Sulfonylchloriden, Maleimiden und Isothiocyanaten gewählt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13 oder 14, bei dem das Molekül ein Rezeptor, Antikörper oder Lectin ist.
Verfahren zur Durchführung eines Affinitätspolarisationsassays einer interessierenden Probe zur Quantifizierung eines Analyten in der Probe, die Schritte aufweisend: (a) Mischen (1) einer Kontrollprobe, die eine bekannte Menge eines zu einem asymmetrischen Übergangsmetall-Ligandkomplexes konjungierten Analyten enthält mit (2) einem Molekül, das eine Affinität für den Analyten hat; (b) Anregen des Gemischs aus Schritt (a) mit linear polarisiertem Licht, um den Komplex zu veranlassen, polarisiertes Licht auszusenden; (c) Messen der Polarisation des vom Komplex emittierte Lichtes; (d) Hinzufügen der Probe zum Gemisch, um ein neues Gemisch einschließlich eines nicht konjugierten Analyten zu bilden, der mit dem zum asymmetrischen Übergangsmetall-Ligandkomplex konjugierten Analyten zusammen mit dem Molekül mit der Affinität für den Analyten konkurriert, wodurch eine Änderung der Polarisation bewirkt wird; (e) Messen der Änderung der polarisierten Emission; und (f) Berechnen der Analytmenge in der Probe durch Korrelieren der Polarisationsänderung mit der Kontrollprobe, die eine bekannte Menge des Analyten enthält.
Verfahren nach Anspruch 17, bei dem das Molekül mit der Affinität für den Analyten aus der Gruppe bestehend aus Strepavidin, Avidin, Biotin und Lectinen gewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 17, bei dem das Molekül mit der Affinität für den Analyten ein Protein ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 13, 14 oder 17, bei dem das Metall im Metall-Ligandkomplex aus der Gruppe bestehend aus Ruthenium, Osmium, Rhodium, Iridium, Wolfram und Platin gewählt wird.