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Cyanin-Farbstoffe und damit verwandte
Polymethin-Farbstoffe mit lichtabsorbierenden Eigenschaften sind
bereits in photographischen Filmen verwendet worden. Obgleich solche
Farbstoffe lichtabsorbierende Eigenschaften erfordern, benötigen sie
keine Lumineszenz-(Fluoreszenz- oder Phosphoreszen-)Eigenschaften. Cyanin-Farbstoffe
mit Lumineszenz-Eigenschaften haben bislang eine nur sehr eingeschränkte Verwertung
erfahren. Eine solche Verwendung ist beispielsweise die Markierung
der Sulfhydrylgruppe von Proteinen. In einem Bericht, Salama, G.,
Waggoner, A.S. und Abramson J., wird unter dem Titel "Sulfhydrylreagens-Farbstoffe lösen die
rasche Freisetzung von Ca2
+ aus
Sarcoplasmin-Reticulum-Bläschen
(SR)" aus Biophysical
Journal, 47, 456a (1985), festgestellt, daß Cyanin-Chromophore mit einer
Iodacetylgruppe zur Bildung von kovalenten Bindungen mit Sulfhydrylgruppen
auf dem Sarcoplasmin-Reticulum-Protein bei einem pH-Wert von 6,7,
um die Ca2+-Freisetzung auszulösen, verwendet
wurden. In dem Bericht heißt
es auch, daß Fluoreszenz-Farbstoffe dazu
verwendet wurden, um diese Proteine zu markieren und zu isolieren.
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In einem Bericht von Waggoner, A.S.,
Jenkins, P.L., Carpenter, J.P. und Gupta, R. mit dem Titel "Kinetik von Konformationsveränderungen
in einem Bereich des Rhodopsin-Moleküls, von der Retinyliden-Bindungsstelle
entfernt" in Biophysical
Journal, 33, 292a (1981), stellen die Autoren fest, daß die Sulfhydrylgruppe
auf dem F1-Bereich von Vieh-Rhodopsin mit einem Cyanin-Farbstoff
mit einer Absorption bei 660 nm kovalent markiert worden ist. Auch
gemäß diesem
Bericht werden Cyanin-Farbstoffe zum spezifischen Markieren der Sulfhydrylgruppe
eines Proteins verwendet. Die Verwendung von Fluores zenz-Farbstoffen
wird jedoch in diesem Bericht nicht beschrieben.
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Ein Artikel mit der Überschrift "Internationaler Workshop über die
Anwendung von Fluoreszenz-Photobleichungstechniken auf Probleme
der Zellbiologie" von
Jacobson K., Elson E., Koppel D., Webb W. in Fed. Proc. 42:72–79 (1983),
berichtet über
einen Artikel, der von A. Waggoner eingereicht wurde.
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Dieser bezieht sich auf Fluoreszenz-Sonden
vom Cyanintyp, die an Proteine konjugiert werden können und
die im tieferen Rotbereich des Spektrums angeregt werden können.
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In den obengenannten drei Berichten
werden als einzige Cyanin-Sonden
nur solche erwähnt,
die sich kovalent spezifisch an die Sulfhydrylgruppe eines Proteins
anheften. Die einzige speziell genannte Cyaninverbindung ist eine
solche, die eine Iodacetylgruppe aufweist, welche Gruppe bewirkt,
daß der
Cyanin-Farbstoff gegenüber
der Sulfhydrylgruppe kovalent reaktiv wird. In keinem der obenangegebenen
Berichte wird die kovalente Reaktion eines Cyanin-Farbstoffs mit
irgendeinem anderen Material als einem Protein oder mit irgendeiner
anderen Gruppe auf einem Protein als einer Sulfhydrylgruppe beschrieben.
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Viele Nicht-Proteinmaterialien haben
jedoch keine Sulfhydrylgruppen, und viele Proteine weisen keine genügende Anzahl
von Sulfhydrylgruppen auf, um diese Gruppen für die Zwecke der Fluoreszenz-Sondierung geeignet
zu machen. Dazu kommt noch, daß Sulfhydrylgruppen
(-SHSH-) leicht zu Disulfiden (-S-S-) in Gegenwart von Luft oxidiert
werden und daher für
die kovalente Anheftung an eine Fluoreszenz-Sonde nicht mehr verfügbar werden.
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Erfindungsgemäß wurden nun Cyanin- und damit
verwandte Polymethin-Farbstoffe entwickelt, die Substituentengruppen
besitzen, die unter geeigneten Reaktionsbedingungen nicht nur mit
Sulfhydrylgruppen, sondern auch mit Amin- (-NH2-)
und Hydroxy(-OH-) Gruppen: oder anderen Gruppen, wie Aldehyd- (-CHO-) Gruppen,
auf Proteinen und anderen biologischen Materialien kovalent reaktiv
sind, um eine Fluoreszenz- und Phosphoreszenz-Erfassung dieser Materialien
zu ermöglichen.
Durch die Erfindung werden erhebliche Vorteile gegenüber der
Verwendung der Iodacetyl-Cyanin-Farbstoffe
nach dem Stand der Technik und ihrer spezifischen Reaktivität mit Sulfhydrylgruppen
realisiert. Amin- und Hydroxygruppen herrschen in Proteinen und
anderen biologischen Materialien stärker vor als Sulfhydrylgruppen,
und sie sind stabiler. Wenn daher Fluoreszenz-Cyanin-Farbstoffe
zur Erfassung des Vorhandenseins von, bestimmten Proteinen verwendet
werden, wird ein stärkeres
Fluoreszenz- oder Phosphoreszenz-Lichtintensitätssignal abgegeben, weil eine
größere Anzahl
von Farbstoffmolekülen
an das zu sondierende Protein angeheftet werden kann. Weiterhin
werden Amin- und Hydroxygruppen leichter an Komponenten, die markiert
werden sollen, die von Natur aus weder Sulfhydryl-, Amin- oder Hydroxygruppen
enthalten, angeheftet.
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Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren,
bei dem Lumineszenz-Cyanin-Farbstoffe, die eine Gruppe enthalten,
die mit Amingruppen oder Hydroxygruppen oder anderen reaktionsfähigen Gruppen
kovalent reaktiv sind, dazu verwendet werden, um Proteine oder andere
Materialien mit einer Amin- oder Hydroxygruppe oder einer anderen
Gruppe, die dazu imstande ist, sich mit dem Farbstoff in einem Gemisch
umzusetzen, verwendet, so daß das
Vorhandensein und das Ausmaß des
markierten Proteins oder des anderen biologischen Materials erfasst
werden kann, nachdem die markierten Komponenten durch chromatographische
Methoden abgetrennt worden sind. Nach den obenangegebenen Druckschriften
wurde offenbar die Sulfhydrylgruppe speziell deswegen für die kovalente
Reaktion ausgewählt,
weil sich auf einem Proteinmolekül
so wenige dieser Gruppen befinden und weil in manchen Fällen die
Sulfhydrylgruppe in der Funktion des Proteins eine signifikante
Rolle spielt. Die Autoren konnten daher annehmen, daß der spezielle
Ort einer Sulfhydrylgruppe auf einer Proteinstruktur festgestellt
werden kann. Gemäß diesen
Druckschriften wurde der für
die Sulfhydrylgruppe spezifische Farbstoff auch als Sonde verwendet,
um Strukturveränderungen
in einem speziellen Protein zu erfassen oder zu erzeugen. Um eine
Veränderung
der Lichtabsorption durch den Farbstoff oder das durch die Farbstoffbindung
freigesetzte Calciumion zu interpretieren, war es erforderlich,
zu wissen, wo die Sonde gebunden ist.
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Da auf den meisten Proteinmolekülen so wenige
Sulfhydrylgruppen sind, können
diese Gruppen nicht genügend
zahlreich sein, um eine angemessene Gesamtlumineszenz für Erfassungsuntersuchungen
zu ergeben. Demgegenüber
sind Amin- und Hydroxygruppen signifikant zahlreicher, und sie sind
auf einem Proteinmolekül
weit dispergiert, wodurch es ermöglicht
wird, daß eine
Fluoreszenz-Sonde an vielfache Stellen auf dem Molekül angefügt wird,
wodurch eine Interpretation der Lichtabsorptions- und Fluoreszenzveränderungen durch
Erleichterung der Erfassung des Proteins ausgeschlossen wird.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
die Markierung mit Lumineszenz-Polymethin-Cyanin- und verwandten
Polymethin-Farbstoffen, wie Merocyanin- und Styryl-Farbstoffen,
von Proteinen und anderen biologischen Materialien mit Einschluss
von Nucleinsäuren,
DNA, Arzneimitteln, Toxinen, Blutzellen, mikrobiellen Materialien,
Teilchen, etc. an einer Amin- oder Hydroxystelle auf den genannten
Materialien. Die Farbstoffe sind vorteilhafterweise in einem wäßrigen oder
einem anderen Medium, in dem das markierte Material enthalten ist, löslich. Die
vorliegende Erfindung betrifft ein zweistufiges Markierungsverfahren
zusätzlich
zu einem einstufigen Markierungsverfahren. Bei dem zweistufigen
Markierungsverfahren kann eine primäre Komponente, wie ein Antikörper, an
Stellen darauf mit Einschluß von
Amin-, Hydroxy-, Aldehyd- oder Sulfhydrylstellen, markiert werden,
und die markierte Komponente wird als Sonde für die sekundäre Komponente,
wie ein Antigen, für das
der Antikörper
spezifisch ist, verwendet.
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Gemäß dem oben diskutierten Stand
der Technik wurde die Spezifizität
der Stelle der Anheftung durch eine Cyanin-Sonde dadurch erhalten,
daß eine
Sonde verwendet wurde, die gegenüber
einer Sulfhydrylgruppe kovalent reaktiv ist. Gemäß dem erfindungsgemäßen zweistufigen
Verfahren können
Cyanin- und damit verwandte Sonden in einer ersten Stufe mit Amin-,
Aldehyd-, Sulfhydryl-, Hydroxy- oder anderen Gruppen auf einer ersten
Komponente, wie einem Antikörper,
umgesetzt werden, worauf der Antikörper die gewünschte Spezifizität in einer
zweiten Komponente, wie einem Antigen, in einer zweiten oder Anfärbungsstufe
erhalten kann, wobei die Spezifizität durch die Antigenstelle der
Anheftung an den Antikörper
bestimmt wird.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
auch Lumineszenz-Polymethin-Cyanin-Verbindungen
und damit verwandte Verbindungen, die Gruppen enthalten, die sie
in die Lage versetzen, kovalent an Amin-, Hydroxy-, Aldehyd- oder
Sulfhydrylgruppen auf einem Targetmolekül angeheftet zu werden.
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Wenn das Target eine Zelltype ist,
dann kann die vorliegende Erfindung dazu verwendet werden, die Menge
der markierten Antikörper
zu messen, die an die genannte Zelltype angeheftet ist. Die Messung
kann in der Weise erfolgen, daß man
die relative Helligkeit oder Abschwächung der Lumineszenz der Zellen
erfaßt.
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Die vorliegende Erfindung kann dazu
verwendet werden, die Konzentration eines bestimmten Proteins oder
einer anderen biologischen Komponente in einem System zu bestimmen.
Wenn die Anzahl der reaktiven Gruppen auf einem Protein, das mit
einer Sonde umgesetzt werden kann, bekannt ist, dann ist die Fluoreszenz pro
Molekül
bekannt, und die Konzentration dieser Moleküle in dem System kann anhand
der Gesamt-Lumineszenzintensität
des Systems ermittelt werden.
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Das Verfahren kann dazu angewendet
werden, um eine Vielzahl von Proteinen oder anderen biologischen
Materialien in einem System quantitativ zu bestimmen, indem man
alle eines Gemisches von Proteinen in dem System markiert und sodann
die markierten Proteine durch irgendwelche Maßnahmen, wie chromatographische
Maßnahmen,
abtrennt. Die Menge der abgetrennten Proteine, die lumineszieren,
kann bestimmt werden. In chromatographischen Erfassungssystemen
kann der Ort des Farbstoffs auf dem markierten Material ermittelt
werden.
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Die Erfindung kann auch dazu verwendet
werden, um die Anzahl von verschiedenen Zellen, die mit einem Antikörper etikettiert
sind, zu bestimmen. Diese Bestimmung kann in der Weise erfolgen,
daß man
eine Vielzahl von Typen der Zellen in einem System etikettiert und
sodann die etikettierten Zellen außerhalb des Systems abtrennt.
Auch können
die etikettierten Zellen von nichtetikettierten Zellen außerhalb
des Systems abgetrennt werden.
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Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung umfaßt
ein Multiparameter-Verfahren, bei dem eine Vielzahl von Lumineszenz-Cyanin-
oder verwandten Farbstoffen verwendet wird, die jeweils an eine Vielzahl
von verschiedenen primären
Komponenten, wie Antikörpern,
angeheftet sind, wobei jeder Farbstoff für eine unterschiedliche sekundäre Komponente,
wie ein Antigen, spezifisch ist, um jeden einer Vielzahl der genannten
Antigene in einem Gemisch von Antigenen zu identifizieren. Gemäß dieser
Ausführungsform
wird jeder der genannten Antikörper
gesondert mit einem Farbstoff mit verschiedener Lichtabsorption
und verschiedenen Lumineszenzwellenlängen-Eigenschaften als der Farbstoff, der
zur Markierung der anderen Sonden verwendet wird, markiert. Sodann
werden alle markierten Antikörper
zu einem zu analysierenden biologischen Präparat gegeben, das sekundäre Komponenten,
wie Antigene, enthält,
welche jeweils durch bestimmte markierte Antikörper angefärbt werden können. Irgendwelche
nichtumgesetzten Farbstoffmaterialien können aus dem Präparat beispielsweise
durch Auswaschen entfernt werden, wenn sie die Analyse stören. Das
biologische Präparat
wird sodann einer Vielzahl von Anregungswellenlängen ausgesetzt, wobei jede
verwendete Anregungswellenlänge
die Anregungswellenlänge
eines bestimmten konjugierten Farbstoffs ist. Ein Lumineszenz-Mikroskop
oder ein anderes Lumineszenz-Erfassungssystem, wie ein Fließ-Cytometer
oder ein Fluoreszenz-Spektrophotometer, das Filter oder Monochrometer
zur Auswahl der Strahlen der Anregungswellenlänge und zur Auswahl der Wellenlängen der
Lumineszenz aufweist, wird dazu verwendet, um die Intensität der Strahlen
der Emissionswellenlänge,
die der Anregungswellenlänge
entspricht, zu bestimmen. Die Intensität der Lumineszenz bei Wellenlängen, die
der Emissionswellenlänge
eines bestimmten konjugierten Farbstoffs entspricht, zeigt die Menge
des Antigens an, die an den Antikörper gebunden ist, an den der
Farbstoff angefügt ist.
In bestimmten Fällen
kann eine einzige Wellenlänge
der Anregung dazu verwendet werden, um Lumineszenz von zwei oder
mehreren Materialien in einem Gemisch zu erregen, wobei jede Fluoreszenz
bei einer verschiedenen Wellenlänge
und die Menge jeder markierten Art dadurch gemessen werden kann,
daß man
ihre individuelle Fluoreszenzintensität bei der jeweiligen Fluoreszenzwellenlänge erfaßt. Gewünschtenfalls
kann eine Lichtabsorptions-Erfassungsmethode angewendet werden.
Das erfindungsgemäße Zweistufen-Verfahren
kann auf ein beliebiges System angewendet werden, bei dem ein mit
einem Farbstoff konjugiertes primäres Material und dem Farbstoff
ge- oder Lichtabsorptions-Erfassungssystem verwendet wird, um das
Vorhandensein eines anderen Materials zu erfassen, auf das das Konjugat
aus dem primären
Material in dem Farbstoff gerichtet ist. So kann beispielsweise
der Farbstoff an ein Fragment von DNA oder RNA konjugiert sein, um
ein mit Farbstoff konjugiertes DNA- oder RNA-Fragment zu bilden,
das sodann auf einen Hauptstrang von DNA oder RNA gerichtet wird,
zu dem das Stück
komplementär
ist. Das gleiche Testverfahren kann dazu verwendet werden, um das
Vorhandensein von irgendeinem komplementären Hauptstrang von DNA zu
erfassen.
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Die erfindungsgemäßen Cyanin- und damit verwandten
Farbstoffe sind besonders gut für
die Analyse eines Gemisches von Komponenten geeignet, bei dem Farbstoffe
einer Vielzahl von Anregungs- und Emissionswellenlängen erforderlich
sind, weil spezielle Cyanin- und damit verwandte Farbstoffe synthetisiert
werden können,
die einen weiten Bereich von Anregungs- und Emissionswellenlängen haben.
Spezielle Cyanin- und damit verwandte Farbstoffe mit spezifischen
Anregungs- und Emissionswellenlängen
können
synthetisiert werden, indem die Anzahl der Methingruppen variiert
wird oder indem die Cyanin-Ringstrukturen modifiziert werden. Auf
diese Weise ist es möglich, Farbstoffe
mit besonderen Anregungswellenlängen
zu synthetisieren, um einer besonderen Anregungs-Lichtquelle, wie
einem Laser, zum Beispiel einem HeNe-Laser oder einem Diodenlaser,
zu entsprechen.
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Die Erfindung betrifft die kovalente
Reaktion von hochlumineszenten und hochlichtabsorbierenden Cyanin-
und damit verwandten Farbstoffmolekülen unter Reaktionsbedingungen
mit Amin-, Hydroxy-, Aldehyd-, Sulfhydryl- oder anderen Gruppen
auf Proteinen, Peptiden, Kohlenhydraten, Nucleinsäuren, derivatisierten Nucleinsäuren, Lipiden,
bestimmten anderen biologischen Molekülen und biologischen Zellen.
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Da die Lumineszenz hochempfindliche
optische Techniken umfaßt,
kann die Anwesenheit dieser Farbstoff-"Etiketten" erfaßt und selbst dann quantitativ
bestimmt werden, wenn das "Etikett" nur in sehr geringen Mengen
vorhanden ist. Somit können
die Farbstoffmarkierungs-Reagentien dazu verwendet werden, die Menge
eines Materials, das markiert worden ist, zu messen. Die am besten
geeigneten Farbstoffe sind hoch lichtabsorbierend (ε = 70.000
bis 250.000 l/mol-cm oder höher)
und sehr lumineszent, und sie haben Quantenausbeuten von mindestens
5% bis 80% oder mehr. Die qualitativen Eigenschaften betreffen die
Farbstoffe selbst und Farbstoffe, die an ein markiertes Material
konjugiert sind.
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Eine wichtige Anwendung für diese
Farbmarkierungs-Reagentien ist die Herstellung von lumineszierenden
monoklonalen Antikörpern.
Monoklonale Antikörper
sind Proteinmoleküle,
die sich sehr eng und sehr spezifisch an bestimmte chemische Stellen
oder "Marker" auf Zelloberflächen oder
innerhalb von Zellen binden. Diese Antikörper besitzen daher eine enorme Forschungseignung
und klinische Eignung zur Identifizierung von bestimmten Zelltypen
(zum Beispiel HLA-Klassifizierung, T-Zell-Subsets, Bakterien- und
Virenklassifizierung etc.) und erkrankte Zellen. In der Vergangenheit
ist die Menge des an eine Zelle gebundenen Antikörpers dadurch quantitativ bestimmt
worden, daß man
den Antikörper
auf verschiedene Weise markiert hat. Das Markieren ist mit einer
radioaktiven Markierung (Radioimmuno-Assay), einem Enzym (ELISA-Techniken) oder
einem Fluoreszenz-Farbstoff (gewöhnlich
Fluorescein, Rhodamin, Texasrot® oder
Phycoerythrin) bewerkstelligt worden. Die meisten Hersteller und
Anwender von klinischen Antikörper-Reagentien
möchten
von den mit der Verwendung von radioaktiven Tracern inhärenten Problemen
wegkommen, so daß die
Lumineszenz als eine der vielversprechendsten Alternativen angesehen
wird. Tatsächlich
liefern nunmehr viele Firmen mit Fluorescein, Texasrot®, Rhodamin
und Phycoerythrin markierte monoklonale Antikörper.
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In den letzten Jahren ist die optische/elektronische
Instrumentierung für
die Erfassung von fluoreszierenden Antikörpern auf Zellen komplizierter
geworden. So kann beispielsweise die Fließ-Cytometrie dazu verwendet
werden, um die Menge von fluoreszierendem Antikörper auf individuellen Zellen
mit einer Rate von bis zu 5.000 Zellen pro Sekunde zu bestimmen.
Auch mikroskopische und Lösungs-Fluoreszenztechniken
haben Fortschritte erzielt. Diese Instrumente können eine Fluoreszenz bei vielen
Wellenlängen
des UV-, sichtbaren und nahen IR-Bereichs des Spektrums erregen.
Doch können
die meisten der derzeit verfügbaren,
verwendbaren Fluoreszenz-Markierungs-Reagentien nur im 400- bis 580-nm-Bereich
des Spektrums angeregt werden. Die Ausnahmen sind einige der Pigmente
vom Phycobiliprotein-Typ, die aus Meeresorganismen isoliert worden
sind und die kovalent an Proteine angeheftet werden können. Diese
können
bei etwas niedrigeren Wellenlängen
angeregt werden. Es gibt daher ein großes Spektralfenster im Bereich
von 580 bis ungefähr
900 nm, wo es notwendig ist, daß neue
Markierungs-Reagentien zur Markierung von biologischen Materialien
verfügbar
werden, wobei die Analyse mit der derzeit verfügbaren Instrumentierung durchgeführt werden
soll. Neue Reagentien, die in diesem Spektralbereich anregbar sind,
würden
es ermöglichen,
Multifarb-Lumineszenzanalysen
von Markern auf Zellen durchzuführen,
da Antikörper
mit verschiedenen Spezifizitäten
jeweils mit einem verschieden gefärbten Fluoreszenz-Farbstoff
markiert werden könnten.
Somit könnte
das Vorhandensein von mehreren Markern gleichzeitig für jede analysierte
Zelle bestimmt werden.
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Die Erfindung betrifft auch lumineszierende
(fluoreszierende oder phosphoreszierende) Cyanin-, Merocyanin- und
Styryl-Farbstoffe
selbst, die an biologische Materialien kovalent angeknüpft werden
können.
Merocyanin- und Styryl-Farbstoffe werden für die Zwecke dieser Erfindung
als mit Cyanin-Farbstoffen verwandt angesehen. Die neuen Markierungs-Reagentien
selbst, jedoch insbesondere dann, wenn sie mit einer markierten
Komponente konjugiert sind, können
durch Licht von ersten definierten Wellenlängen, zum Beispiel durch Licht
in Wellenlängenbereichen
des Spektrums von 450 bis 900 nm, angeregt werden. Die Hintergrund-Fluoreszenz
von Zellen erfolgt im allgemeinen bei einer niedrigeren Wellenlänge. Daher
werden sich die Markierungs-Reagentien gegenüber der Hintergrund-Fluoreszenz
unterscheiden. Von besonderem Interesse sind die Derivate, die Licht
bei 633 nm absorbieren, da sie durch billige, intensive, stabile
und langlebige HeNe-Laserquellen
angeregt werden können.
Licht von zweiten definierten Wellenlängen, das durch die markierte
Komponente fluoresziert oder phosphoresziert wird, kann sodann erfaßt werden.
Das fluoreszierte oder phosphoreszierte Licht hat im allgemeinen
eine größere Wellenlänge als
das Anregungslicht. In der Erfassungsstufe kann ein Lumineszenz-Mikroskop
verwendet werden, das einen Filter zur Absorption von Streulicht der
Anregungswellenlänge
und zum Durchgang der Wellenlänge
hat, die der Lumineszenz entspricht, die der jeweiligen Farbstoffmarkierung
entspricht, die mit der Probe verwendet wird. Ein derartiges optisches
Mikroskop ist zum Beispiel in der
US-PS
4 621 911 beschrieben.
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Nicht alle Cyanin- und damit verwandte
Farbstoffe sind lumineszierend. Jedoch schließen die erfindungsgemäßen Farbstoffe
solche Cyanin- und damit verwandte Farbstoffe ein, die lumineszierend
sind. Sie sind relativ photostabil, und viele sind in der Reaktionslösung, vorzugsweise
einer wäßrigen Lösung, löslich. Die
konjugierten Farbstoffe selbst, jedoch insbesondere, wenn sie mit
einer markierten Komponente konjugiert sind, haben molare Extinktionskoeffizieten
(ε) von
mindestens 50.000 und vorzugsweise mindestens 100.000 Liter pro
mol-cm. Der Extinktionskoeffizient ist ein Maß der Fähigkeit der Moleküle, Licht
zu absorbieren. Die erfindungsgemäßen konjugierten Farbstoffe
haben Quantenausbeuten von mindestens 2% und vorzugsweise mindestens
10%. Dazu absorbieren und emittieren die erfindungsgemäßen konjugierten
Farbstoffe Licht im Spektralbereich von 400 bis 900 nm und vorzugsweise
im Spektralbereich von 600 bis 900 nm.
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Arylsulfonierte
Farbstoffe
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Es wurde nun gefunden, daß die hierin
beschriebenen Arylsulfonat- oder Arylsulfonsäure-Farbstoffe ihrer Natur
nach stärker
fluoreszierend sind und verbesserte Photostabilitäts- und
Wasserlöslichkeitseigenschaften
haben als ähnliche
Farbstoffe ohne Arylsulfonat- oder Arylsulfonsäuregruppen. Die hierin verwendeten
Bezeichnungen Arylsulfonat oder Arylsulfon säure sollen Arylsulfonsäuregruppen
oder Arylsulfonatgruppen bezeichnen, wobei die genannten Gruppen
an aromatische Ringstrukturen angefügt sind, mit Einschluß einer einzigen
aromatischen Ringstruktur oder einer kondensierten Ringstruktur,
beispielsweise einer Naphthalinstruktur. Die einzige aromatische
Ringstruktur oder die kondensierte aromatische Ringstruktur kann
in Polymethin-, Cyanin-, Merocyanin- oder Styryl-Farbstoffen vorhanden
sein.
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Viele Farbstoffe mit planaren Molekularstrukturen
mit Einschluß von üblichen
Cyanin-Farbstoffen neigen dazu, in wäßriger Lösung Dimere und Aggregate höherer Ordnung
zu bilden, und zwar insbesondere dann, wenn gleichfalls anorganische
Salze vorhanden sind, wie es beispielsweise in gepufferten Lösungen und physiologischer
Kochsalzlösung
der Fall ist. Diese Aggregate haben gewöhnlich Absorptionsbanden, die
zu der kurzen Wellenlängenseite
der Monomerabsorption verschoben sind, und sie sind im allgemeinen
sehr schwach fluoreszierende Arten. Die Tendenz der Cyanin-Farbstoffe,
in wäßriger Lösung leicht
Aggregate zu bilden, ist insbesondere in der Photographie gut bekannt
(West, W., und Pierce S., J. Phys. Chem., 69:2894 (1965); Sturmer,
D.M., Spec. Top in Heterocyclic Chemistry, 30 (1974)).
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Viele Farbstoffmoleküle und insbesondere
Cyanin-Farbstoffmoleküle
neigen dazu, in wäßriger Lösung Aggregate
zu bilden. Es ist gefunden worden, daß die Arylsulfonat-Farbstoffe
eine minimale Neigung haben, diese Aggregate zu bilden. Bei Verwendung
zur Bildung von fluoreszierenden Markierungs-Reagentien haben die
Arylsulfonat-Farbstoffe eine verminderte Neigung, Aggregate zu bilden,
wenn sie mit hohen Oberflächendichten
an Proteine oder andere Moleküle,
wie Antikörper,
gebunden werden. Die Tendenz eines bestimmten Farbstoffmoleküls, Aggregate
in einer Salzlösung
(zum Beispiel 150mM Natrium- Chlorid-Lösung) zu
bilden, kann als Maß der
Neigung des gleichen Farbstoffmoleküls zur Bildung von Aggregaten
auf der Oberfläche
von Proteinen genommen werden. Für
Farbstoffmoleküle
wird es daher angestrebt, daß sie
eine minimale Neigung haben, in wäßrigen Salzlösungen Aggregate
zu bilden. Die Werte der 2 zeigen,
daß ein
bestimmter arylsulfonierter Farbstoff selbst bei hohen Konzentrationen
in wäßriger Salzlösung nur
eine niedrige Neigung hat, Aggregate zu bilden.
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Die 1 zeigt
das Monomer-Absorptionsspektrum und das Dimer-Absorptionsspektrum
eines typischen Cyanin-Farbstoffs, gelöst in einem wäßrigen Puffer.
Der zur Erzeugung dieser Spektren verwendete Farbstoff, N,N'-Di-sulfobutyl-indodicarbocyanin,
weist keine Arylsulfonatgruppen auf und bildet selbst bei Konzentrationen
im submillimolaren Bereich leicht Dimere. Das Dimer-Spektrum wurde
aus den Spektren des Farbstoffs bei verschiedenen Konzentrationen
errechnet (vgl. die Methode von West und Pearce, 1965). Bei einer
3mM-Konzentration in einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung waren
die Absorptionen der Monomer- und Dimerbanden etwa gleich.
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Das Spektrum des verbesserten Sulfoindodicarbocyanins,
N,N'-Diethyl-indodicarbocyanin-5,5'-disulfonsäure, ist
in Figur 2 gezeigt. Dieser Farbstoff zeigte bei Konzentrationen
bis zu 10mM kein Anzeichen einer Aggregation in der Kochsalzlösung.
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üblicherweise
wird die Wirksamkeit, mit der sich ein bestimmter reaktiver Farbstoff
an ein Protein, beispielsweise einen Antikörper, kuppelt, unter definierten
Reaktionsbedingungen bestimmt. Der getestete Farbstoff war der Bis-N-hydroxysuccinimidester
von N,N'-Di-carboxypentyl-indodicarbocyanin-5,5'disulfonsäure. Die 3 zeigt, daß dieser
aktive Sulfo cyanin-Farbstoff-Ester sich wirksam mit Schaf-Immunoglobulin
in einem Carbonat-Puffer bei einem pH-Wert von 9,2 umsetzt, wodurch
kovalent markierte Antikörpermoleküle gebildet
werden, die ein Molverhältnis
von Farbstoff zu Antikörper
im Bereich von weniger als 1 bis mehr als 20, je nach den relativen
Farbstoff- und Antikörperkonzentrationen,
in der Reaktionslösung
haben. Die Neigung der linearen kleinsten Quadrate der Werte zeigen,
daß unter
diesen Bedingungen die Markierungswirksamkeit dieses Farbstoffs
etwa 80% ist. Bei ähnlichen
Untersuchungen setzte sich Fluorescein-isothiocyanat (FITC) mit
einer Wirksamkeit von etwa 20% um.
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Die Reaktivität des aktiven Esters des neuen
Sulfoindodicarbocyanin-Farbstoffs wurde dadurch untersucht, daß Schaf-Immunoglobulin
(IgG) markiert wurde. Das Protein (4 mg/ml) wurde in 0,1m Carbonat-Puffer (pH=
9,2) aufgelöst.
Aliquote Teile des reaktiven Farbstoffs, gelöst in wasserfreiem Dimethylformamid,
wurden zu den Proteinproben gegeben, um die ursprünglichen
Molverhältnisse
Farbstoff:Protein zu ergeben. Nach 30 Minuten wurde das Protein
von dem unkonjugierten Farbstoff durch Gel-Permeationschromatographie
(Sephadex G-50) abgetrennt. Die resultierenden Molverhältnisse
Farbstoff:Protein wurden spektrophotometrisch bestimmt, und sie
sind in 3 dargestellt.
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Bei niedrigen Verhältnissen
von Farbstoff zu Protein zeigen die Absorptionsspektren der markierten Proteine
Banden, die eng den Spektren des freien monomeren Farbstoffs entsprechen.
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Bei Antikörpermolekülen, die stark markiert worden
sind (hohe Verhältnisse
Farbstoff:Protein) oder die mit Farbstoffen mit großer Neigung
zur Aggregation in wäßrigen Lösungen markiert
worden sind, wird oft festgestellt, daß sie neue Absorptionspeaks
haben, die bei kürzeren
Wellenlängen
erscheinen als die Absorptionsbanden des monomeren Farbstoffs in wäßriger Lösung. Die
Wellenlänge
des neuen Absorptionspeaks fällt häufig in
einen Bereich, der für
das Dimer-Absorptionsspektrum des Farbstoffs charakteristisch ist
(vgl. 1).
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Stärker markierte Antikörper haben
höhere
Verhältnisse
von kurzen zu langen Wellenlängen-Absorptionspeaks.
Dieser kürzere
Wellenlängen-Absorptionspeak
kann in 4 bei ungefähr 590 nm
gesehen werden. Der längere
Wellenlängenpeak
(bei 645 nm) in 4 ist
auf monomere Farbstoffmoleküle
zurückzuführen, die
an den Antikörper
gebunden sind. Das Markierungs-Reagens, das verwendet wurde, um
das Antikörper-Absorptionsspektrum
in 4 herzustellen (der
Bis-N-hydroxysuccinimidester von N,N'-Di-sulfobutyl-indodicarbocyanin-5,5'-essigsäure) besitzt
keine Arylsulfonatgruppen und bildet leicht in wäßrigen Salzlösungen und
auf Antikörpern,
mit denen er umgesetzt worden ist, Dimere. Von entscheidender Bedeutung
ist es, daß die
Fluoreszenz-Anregungsspektren dieser Antikörper zeigen, daß die Anregung
der markierten Antikörper beim
kurzen Wellenlängenpeak
nicht proportional so viel Fluoreszenz erzeugt wie es bei einer
Anregung beim längeren
Wellenlängenpeak
der Fall ist. Diese Beobachtung steht in übereinstimmung mit der Idee,
daß der kürzere Wellenlängen-Absorptionspeak
auf die Bildung von nichtfluoreszierenden Dimeren und Aggregaten auf
den Antikörpermolekülen zurückzuführen ist.
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Es wurde gefunden, daß das zum
Erhalt der, Werte der 3 verwendete
Markierungs-Reagens, bestehend aus einem Arylsulfonat-Cyanin-Farbstoff,
auf den Antikörpermolekülen nicht
ohne weiteres aggregiert. Dies ergibt sich aus dem erheblich kleineren
Absorp ionspeak bei Wellenlängen,
bei denen charakteristischerweise Dimere absorbieren (vgl. 5). Dies ist deswegen von
Wichtigkeit, weil Antikörper
und andere Proteine, die mit diesen "nichtaggregierenden" Markierungs-Reagentien markiert worden
sind, stärker
fluoreszierende markier te Proteine ergeben sollten. Tatsächlich ergeben
die Arylsulfocyanine selbst dann glänzend fluoreszierende Antikörper, wenn
das mittlere Verhältnis
Farbstoff pro Antikörper
relativ hoch ist (vgl. 6).
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Schaf-Immunoglobulin (IgG), das mit
einem Carboxyindodicarbocyanin-Farbstoff markiert worden ist, ist
in 4 gezeigt. Die 5 zeigt das Protein, das
mit dem neuen Sulfiindodicarbocyanin-Farbstoff konjugiert worden
ist. Die Anwesenheit von erhöhtem
Dimeren (vgl. 1) in
der erstgenannten Probe ist offensichtlich. Obgleich das Molverhältnis Farbstoff:Protein
bei beiden Präparaten
ungefähr
gleich war, war das in 5 dargestellte
Protein erheblich stärker
fluoreszierend als die in 4 gezeigte
Probe.
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Um glänzende bzw. hell fluoreszierende
Antikörper
oder andere Proteine, die mit Fluoreszenz-Farbstoffen markiert worden
sind, zu erhalten, ist es von Wichtigkeit, daß die mittlere Quantenausbeute
pro Farbstoffmolekül
auf dem Protein so hoch wie möglich
ist. Es ist allgemein festgestellt worden, daß, wenn die Oberflächendichte
der Farbstoffmoleküle
auf dem Protein zunimmt (d.h., wenn das Verhältnis von Farbstoff zu Protein
zunimmt), dann die mittlere Quantenausbeute der Farbstoffe vermindert
wird. Dieser Effekt ist manchmal dem Auslöschen zugeschrieben worden,
das als Ergebnis einer Farbstoff-Farbstoff-Wechselwirkung auf der Oberfläche von
stärker
markierten Proteinen stattfindet. Die Bildung von nichtfluoreszierenden
Dimeren auf Proteinoberflächen
kann mit Sicherheit zu diesem Auslöschen beitragen. Die 6 zeigt, daß die mittlere Quantenausbeute
eines Arylsulfocyanin-Farbstoffs langsam abnimmt, wenn das Farbstoff/Protein-Verhältnis zunimmt
(Kurve mit Diamantensymbolen). Demgegenüber zeigt die Kurve mit den
runden Symbolen, daß eine sehr
rasche Abnahme der mittleren Quantenausbeute für das Konjugat eines Nicht-Arylsulfocyanin-Farbstoffs (N,N'-Di-sulfobutyl-indodicarbocyanin-5-isothiocyanat)
stattfindet, wenn das Farbstoff/Protein-Verhältnis zunimmt. Daher ergibt
der in Figur 6 gezeigte Sulfocyanin-Farbstoff stärker glänzend fluoreszierende Antikörper als
der andere Farbstoff, und zwar insbesondere im Markierungsbereich
von 1 bis 10 Farbstoffmolekülen
pro Antikörpermolekül.
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Die mittlere Fluoreszenz-Quantenausbeute
der einzelnen Farbstoffmoleküle
auf den markierten Proteinen ist ein Maß des von diesen Biomolekülen erhältlichen
Fluoreszenzsignals. Werte von Schaf-Immunoglobulin (IgG), das mit
dem neuen Sulfoindodicarbocyanin-Farbstoff in phosphatgepufferter
Kochsalzlösung markiert
worden war, sind in der Kurve mit Diamantensymbolen der 6 gezeigt. Die Kurve mit
runden Symbolen der Figur 6 zeigt Proteine, die mit einem reaktiven
Indodicarbocyaninisothiocyanat-Farbstoff zum Vergleich markiert
worden sind. In 6 stellen
die Quantenausbeuten bei einem Verhältnis Farbstoff/Protein von Null
die Werte für
die Methylamin-Addukte der reaktiven Farbstoffe (freier Farbstoff)
im Puffer dar.
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Hintergrund-Verfahren
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Lumineszenz-Sonden sind wertvolle
Reagentien für
die Analyse und Trennung von Molekülen und Zellen und für die Erfassung
und quantitative Bestimmung von anderen Materialien. Eine sehr kleine
Anzahl von lumineszierenden Molekülen kann unter optimalen Umständen erfaßt werden.
Barak und Webb sehen weniger als 50 Fluoreszenz-Lipid-Analoge im
Zusammenhang mit der LDL-Rezeption von Zellen unter Verwendung einer
SIT-Kamera, J. Cell. Biol. 90:595–605 (1981). Die Fließ-Cytometrie
kann dazu verwendet werden, um weniger als 10.000 Fluoresceinmoleküle zu erfassen,
die mit Teilchen oder bestimmten Zellen assoziiert sind (Muirhead,
Horan und Poste, Bio/Technology 3:337–356 (1985)). Einige spezielle
Beispiele für
die Anwendung von Fluoreszenz-Sonden sind (1) die Identifizierung
und Trennung von Subpopulationen von Zellen in einem Gemisch von
Zellen durch die Techniken der Fluoreszenz-Fließ-Cytometrie, der Fluoreszenz-aktivierten
Zellsortierung und der Fluoreszenz-Mikroskopie; (2) die Bestimmung
der Konzentration einer Substanz, die sich an eine zweite Art bindet
(zum Beispiel Antigen-Antikörper-Reaktionen),
bei der Technik des Fluoreszenz-Immunoassays; (3) die Lokalisierung
von Substanzen in Gelen und anderen unlöslichen Trägern durch die Techniken der
Fluoreszenz-Anfärbung.
Diese Techniken werden von Herzenberg et al., "Cellular Immunology", 3. Auflage, Kapitel 22; Blackwell
Scientific Publications, 1978 (Fluoreszenzaktiviertes Zellsortieren);
und von Goldman, "Fluorescence
Antibody Methods",
Academic Press, New York, 1968 (Fluoreszenz-Mikroskopie und Fluoreszenz-Anfärbung);
und in "Applications
of Fluorescence in the Biomedical Sciences", herausgegeben von Taylor et al., Alan
Liss Inc., 1986, beschrieben.
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Bei der Verwendung von Fluoreszenzmitteln
für die
obigen Zwecke bestehen hinsichtlich der Wahl des Fluoreszenzmitteln
viele Beschränkungen.
Eine Beschränkung
besteht in den Absorptions- und Emissionseigenschaften des Fluoreszenzmitteln,
da viele Liganden, Rezeptoren und Materialien in der Testprobe,
zum Beispiel Blut, Urin, Cerebrospinal-Flüssigkeit, fluoreszieren und
die genaue Bestimmung der Fluoreszenz der fluoreszierenden Probe
stören.
Diese Erscheinung wird als Autofluoreszenz oder Hintergrund-Fluoreszenz
bezeichnet. Ein weiterer Gesichtspunkt ist die Fähigkeit des Fluoreszenzmitteln,
mit Liganden und Rezeptoren und anderen biologischen und nichtbiologischen
Materialien zu konjugieren, und der Effekt einer solchen Konjugation
auf das Fluoreszenzmittel. In vielen Situationen kann die Konjugierung
an ein anderes Molekül
zu einer wesentlichen Veränderung
der Fluoreszenz- Eigenschaften
des Fluoreszenzmittels führen
und in manchen Fällen
sogar die Quantenleistung des Fluoreszenzmittels wesentlich zerstören oder
vermindern. Es ist auch möglich,
daß die
Konjugierung mit dem Fluoreszenzmittel die Funktion des zu markierenden
Moleküls
inaktiviert. Eine dritte Erwägung
liegt in der Quantenleistung des Fluoreszenzmittels, die für eine empfindliche
Erfassung hoch sein sollte. Eine vierte Erwägung ist die Lichtabsorptionsfähigkeit
oder der Extinktionskoeffizient des Fluoreszenzmittels, der so groß wie möglich sein
sollte. von Wichtigkeit ist auch, ob sich die Fluoreszenzmoleküle miteinander
umsetzen, wenn sie sich in enger Nähe befinden, was zu einem Selbstauslöschen führen würde. Eine
weitere Befürchtung
geht dahin, ob eine nicht-spezifische
Bindung des Fluoreszenzmittels an andere Verbindungen oder Behälterwände entweder
selbst oder in Verbindung mit der Verbindung, an die das Fluoreszenzmittel
konjugiert wird, erfolgt.
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Die Anwendbarkeit und der Wert der
obenbeschriebenen Methoden sind eng an die Verfügbarkeit von geeigneten fluoreszierenden
Verbindungen gekoppelt. Insbesondere besteht ein Bedarf an fluoreszierenden Substanzen,
die in dem längeren
Wellenlängenbereich
des sichtbaren Bereichs (Gelb bis nahes Infrarot) emittieren, da
die Anregung dieser Chromophoren weniger Autofluoreszenz und auch
vielfache Chromophoren ergibt, die bei verschiedenen Wellenlängen fluoreszieren,
die gleichzeitig analysiert werden können, wenn die gesamten sichtbaren
und die nahen Infrarotbereiche des Spektrums verwendet werden können. Fluorescein, eine
weit verwendete fluoreszierende Verbindung, ist eine geeignete Emissionsverbindung
im grünen
Bereich, obgleich bei bestimmten Immunoassays und Zellanalysensysternen
die Hintergrund-Autofluoreszenz, welche durch Anregung bei Fluorescein-Absorptionswellenlängen erzeugt
wird, die Empfindlichkeit der Erfassung beschränkt. Jedoch hat sich das herkömmliche
rotfluoreszierende Markierungsmittel Rhodamin als weniger wirksam
als Fluorescenn erwiesen. Texasrot® ist
ein geeignetes Markierungsmittel, das bei 578 nm angeregt werden
kann und maximal bei 610 nm fluoresziert.
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Phycobiliproteine haben einen wichtigen
Beitrag wegen ihres hohen Extinktionskoeffizienten und der hohen
Quantenausbeute gemacht. Diese Chromophor enthaltenden Proteine
können
kovalent an viele Proteine gebunden werden, und sie werden in Fluoreszenz-Antikörper-Assays
in der Mikroskopie und der Fließ-Cytometrie
verwendet. Die Phycobiliproteine haben jedoch folgende Nachteile:
(1) die Protein-Markierungsverfahrensweise ist relativ komplex;
(2) die Protein-Markierungsleistung ist gewöhnlich nicht hoch (typischerweise ein
Mittel von 0,5 Phycobiliprotein-Moleküle pro Protein); (3) das Phycobiliprotein
ist ein Naturprodukt, und seine Herstellung und Reinigung ist komplex;
(4) die Phycobiliproteine sind teuer; (5) es sind keine Phycobiliproteine
als Markierungs-Reagentien
verfügbar,
die weiter zum roten Bereich des Spektrums als Allophycocyanin fluoreszieren,
welches maximal bei 680 nm fluoresziert; (6) die Phycobiliproteine
sind chemisch relativ instabil; (7) sie sind leicht einer Photobleichung
unterworfen; (8) die Phycobiliproteine sind große Proteine mit Molekulargewichten
im Bereich von 33.000 bis 240.000, und sie sind größer als
viele Materialien, die markiert werden sollen, wie Metabolite, Arzneimittel,
Hormone, derivatisierte Nucleotide und viele Proteine mit Einschluß von Antikörpern. Der
letztgenannte Nachteil ist von besonderer Wichtigkeit, da Antikörper, Avidin,
DNA-Hybridisierungs-Sonden, Hormone und kleine Moleküle, die
mit den großen
Phycobiliproteinen markiert sind, nicht dazu imstande sein können, sich
an ihre Targets wegen sterischer Begrenzungen zu binden, die durch
die Größe des konjugierten
Komplexes auferlegt werden. Die Bindungsrate von Konjugaten an Targets
ist gegen über
niedermolekularen Konjugaten langsam.
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Durch andere Techniken, wie Histologie
, Cytologie, Immunoassays, würden
auch erhebliche Vorteile durch die Verwendung eines Fluoreszenzmittels
mit hoher Quanteneffizienz, Absorptions- und Emissionseigenschaften bei längeren Wellenlängen und
mit einfacher Durchführung
der Konjugierung, die von einer nichtspezifischen Interferenz im
wesentlichen frei sind, erfahren.
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Gemäß der Erfindung werden reaktive
fluoreszierende arylsulfonierte Cyanin- und damit verwandte Farbstoffe
mit relativ großen
Extinktionskoeffizienten und hohen Quantenausbeuten zum Zwecke der
Erfassung und quantitativen Bestimmung von markierten Komponenten
verwendet.
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Fluoreszierende Cyanin- und damit
verwandte Farbstoffe können
zur Markierung von biologischen Materialien, wie Antikörpern, Antigenen,
Avidin, Streptavidin, Proteinen, Peptiden, derivatisierten Nucleotiden, Kohlenhydraten,
Lipiden, biologischen Zellen, Bakterien, Viren, Blutzellen, Gewebezellen,
Hormonen, Lymphokinen, biologischen Spurenmolekülen, Toxinen und Arzneimitteln,
verwendet werden.
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Die zu markierende Komponente kann
auch in einem Gemisch mit anderen Materialien vorliegen. Das Gemisch,
in dem die Markierungsreaktion stattfindet, kann ein flüssiges Gemisch,
insbesondere ein wäßriges Gemisch,
sein. Die Erfassungsstufe kann mit dem Gemisch in flüssigem oder
trockenem Zustand, beispielsweise einem Objektträger, durchgeführt werden.
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Erfindungsgemäß ist es erforderlich, daß Cyanin-Farbstoffe
durch die Einarbeitung einer reaktiven Gruppe in das Cyaninmolekül modifiziert
werden. Diese reaktive Gruppe heftet sich kovalent an ein Ziel-
bzw. Targetmolekül,
vorzugsweise an eine Amin- oder Hydroxystelle, und. in manchen Fällen an
eine Sulfhydryl- oder Aldehydstelle. Die Erfindung verwendet auch
die Modifizierung oder Verwendung von Cyanin- und damit verwandten
Farbstoffstrukturen, um ihre Löslichkeit
in der Testflüssigkeit
zu erhöhen,
um (1) ihre Handhabung bei Markierungsreaktionen leichter zu machen,
(2) die Aggregation des Farbstoffs auf der Oberfläche der
zu markierenden Proteine zu verhindern helfen und (3) die nichtspezifische
Bindung von markierten Materialien an biologische Materialien und
an Oberflächen
und die Assayvorrichtung zu verhindern helfen.
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Die Cyanin- und die damit verwandten
Farbstoffe bieten einen wichtigen Vorteil über derzeit verfügbare fluoreszierende
Markierungs-Reagentien. Zum ersten sind Cyanin- und damit verwandte
Farbstoffe synthetisiert worden, die in einem Bereich des Spektrums
von 400 bis nahezu 1100 nm absorbieren und emittieren. Somit können reaktive
Derivate dieser Farbstoffe für
Assays hergestellt werden, die eine gleichzeitige Messung einer
Anzahl von markierten Materialien erfordern. Die Vielfarben- (oder
Multiparameter-)analyse dieser Art kann im Interesse der Einfachheit,
der Kostenwirksamkeit oder zur Bestimmung von Verhältnissen
von verschiedenen markierten Arten auf jedem Teilchen in einem komplexen
Gemisch von Teilchen zweckmäßig sein (zum
Beispiel der Verhältnisse
von Antigen-Markern auf individuellen Blutzellen in einem komplexen
Gemisch durch Multiparameter-Fließ-Cytometrie oder Fluoreszenz-Mikroskopie).
Zum zweiten absorbieren und fluoreszieren viele Cyanin- und damit
verwandte Farbstoffe stark.
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Zum dritten sind viele Cyanin- und
damit verwandte Farbstoffe relativ photostabil, und sie bleichen nicht
ohne weiteres im Fluoreszenz-Mikroskop. Zum vierten können Cyanin-
und damit verwandte Derivate hergestellt werden, die einfache und
wirksame Kupplungs-Reagentien sind. Zum fünften sind viele Strukturen und
synthetische Verfahrensweisen verfügbar, und die Klasse der Farbstoffe
ist vielfältig.
Es können
daher viele Strukturmodifikationen durchgeführt werden, um die Reagentien
mehr oder weniger wasserlöslich
zu machen. Ihre Ladung kann verändert
werden, so daß sie
das Molekül
nicht stören,
an das sie angefügt
sind, wodurch die nichtspezifische Bindung reduziert werden kann.
Zum sechsten sind im Gegensatz zu den Phycobiliproteinen die Cyanin-Farbstoffe
relativ klein (Molekulargewicht = 1000), so daß sie nicht nennenswerterweise mit
der Fähigkeit
des markierten Moleküls
sterisch interferieren, ihre Bindungsstelle rasch zu erreichen oder ihre
Funktion auszuüben.
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Somit bringen Cyanin-Farbstoff-Markierungsmittel
viele potentielle Vorteile mit sich. Diese Farbstoffe können dazu
verwendet werden, um ein oder mehrere Komponenten in einer Flüssigkeit,
insbesondere einer wäßrigen Flüssigkeit,
selektiv zu markieren. Die markierten Komponenten können sodann
durch optische oder Lumineszenzmethoden erfaßt werden. Alternativ kann
die markierte Komponente dazu verwendet werden, um eine zweite Komponente
anzufärben,
für die
sie eine starke Affinität
besitzt. Die Anwesenheit der zweiten Komponente wird sodann durch
optische oder Lumineszenzmethoden festgestellt. In diesem Fall wird
der Farbstoff mit einer Amin-, Hydroxy-, Aldehyd- oder Sulfhydrylgruppe
auf der markierten Komponente umgesetzt. So kann beispielsweise
die markierte Komponente ein Antikörper sein, und die angefärbte Komponente,
für die sie
eine starke Affinität
hat, kann eine biologische Zelle, ein Antigen oder ein Hapten oder
eine biologische Zelle oder ein Teilchen, das das genannte Antigen
oder Hapten enthält,
sein. Gemäß einem
weiteren Beispiel ist die markierte Komponente Avidin, und die angefärbte Komponente
kann ein biotinyliertes Material sein. Auch können Lectine, die mit Polymethin-Cyanin-Farbstoffen
konjugiert sind, dazu verwendet werden, um spezielle Kohlenhydratgruppen
zu erfassen und quantitativ zu bestimmen. Weiterhin können Lumineszenz-Cyanin-
und damit verwandte Farbstoffe an Fragmente. von DNA oder RNA angeheftet
werden. Die markierten Fragmente von DNA oder RNA können als
Fluoreszenz-Hybridisierungssonden verwendet werden, um das Vorhandensein
und die Menge von spezifischen komplementären Nucleotid-Sequenzen in
Proben, die DNA oder RNA enthalten, zu identifizieren. Auch kann
der Farbstoff an ein Hormon oder an einen Liganden (zum Beispiel ein
Hormon, ein Protein, ein Peptid, ein Lymphokin, einen Metaboliten);
angefügt
werden, das bzw. der danach an einen Rezeptor angefügt wird.
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Für andere Zwecke in Patentschriften
beschriebene reaktive Cyanin-Farbstoffe
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Gemäß den
US-PSen 4 337 063 (Miraha et al.),
4 404 289 ,
4 405 711 und
4 414 325 (Masuda et al.) ist eine
Vielzahl von Cyanin-Farbstoffen synthetisiert worden, die aktive
N-Hydroxy-succinimidester-Gruppen enthalten.
Diese Patente zeigen, daß diese
Reagentien als photographische Sensibilisatoren verwendet werden
können.
Die möglichen
Fluoreszenz-Eigenschaften dieser Reagentien sind in den Patenten
nicht genannt. Tatsächlich
sind auch für
diese Prozesse keine Fluoreszenz-Eigenschaften erforderlich. Die
meisten der in diesen Patentschriften genannten Farbstoffe sind
nur schwach fluoreszierend, und sie sind nicht besonders photostabil.
Weiterhin sind ihre Löslichkeitseigenschaften
für viele
Anwendungszwecke nicht optimal, die eine Fluoreszenzerfassung von
markierten Materialien beinhalten würden.
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In der
GB-PS
1 529 202 (Exekiel et al.) werden zahlreiche Cyanin-Farbstoffderivate
beschrieben, die als kovalent reagierende Moleküle verwendet werden. Die in
diesen Reagentien verwendete reaktive Gruppe ist eine Azingruppe,
zu der Mono- und Dichlortriazingruppen gehören. Diese Druckschrift bezieht
sich auf die Entwicklung und die Verwendung dieser Reagentien als
Sensibilisatoren für
photographische Filme. Für
dieses Verfahren ist keine Fluoreszenz erforderlich, und die meisten
der darin beschriebenen Reagentien sind nicht fluoreszierend. Schließlich bezieht
sich diese Druckschrift nicht auf die Entwicklung und Verwendung
von reaktiven Cyanin-Farbstoffen zum Zwecke der Erfassung und quantitativen
Bestimmung von markierten Materialien.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
Methoden zum kovalenten Anheften von lumineszierenden Cyanin- und
cyaninartigen Farbstoffen an biologische Materialien, Makromoleküle und Teilchen,
damit diese Materialien lumineszierend markiert werden. Auf diese
Weise kann das markierte Material durch Lumineszenz-Erfassungsmethoden
erfaßt
und/oder quantitativ bestimmt werden.
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren
zur Erfassung einer Komponente in einer Flüssigkeit, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß man
zu der genannten Flüssigkeit
einen Farbstoff zusetzt, der aus der Gruppe bestehend aus Cyanin-,
Merocyaninund Styryl-Farbstoffen ausgewählt ist und der in der Flüssigkeit
löslich
ist und einen Substituenten enthält,
damit er mit Amin- und Hydroxygruppen und möglicherweise mit Aldehyd- und Sulfhydrylgruppen
auf der genannten Komponente kovalent reaktiv wird, so daß die genannte
Komponente markiert wird. Die markierte Komponente wird sodann durch
Lumineszenz- oder
Lichtabsorptionsmethoden erfaßt
und/oder quantitativ bestimmt. Wenn die markierte Komponente ein
Antikörper,
ein DNA-Fragment, ein Hormon, ein Lymphokin oder ein Arzneimittel
ist, dann kann die markierte Komponente dazu verwendet werden, um
das Vorhandensein einer zweiten Komponente, an die es gebunden wird,
zu identifizieren, worauf die zweite Komponente erfaßt und/oder
quantitativ bestimmt werden kann.
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Jede beliebige Lumineszenz- oder
Lichtabsorptions-Erfassungsstufe kann angewendet werden. So kann
beispielsweise die Erfassungsstufe eine optische Erfassungsstufe
sein, bei der die Flüssigkeit
mit Licht von ersten definierten Wellenlängen bestrahlt wird. Licht
mit zweiten definierten Wellenlängen,
das durch die markierte Komponente fluoresziert oder phosphoresziert
wird, wird hierauf erfaßt.
Die Erfassung kann auch durch optische Lichtabsorption erfolgen.
So kann beispielsweise die Erfassungsstufe in der Weise durchgeführt werden,
daß man
Licht mit ersten definierten Wellenlängen durch die Flüssigkeit
leitet und sodann die Wellenlänge
des Lichts, das durch die Flüssigkeit
hindurchgelassen wird, bestimmt.
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Gewünschtenfalls kann die Erfassungsstufe
auch eine chemische Analyse umfassen, um chemisch eine Anheftung
des Cyanins oder eines verwandten Chromophors an die Komponente
zu erfassen.
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Die Grundstrukturen der Cyanin-,
Merocyanin- und Styryl-Farbstoffe, die modifiziert werden können, um
kovalente Markierungs-Reagentien zu erzeugen, sind nachfolgend gezeigt:
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Spezifischere Beispiele von Polymethin-Cyanin-Farbstoffen
sind wie folgt:
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In diesen Strukturen sind
X
und Y aus der Gruppe, O, S und
ausgewählte
Z ist aus der Gruppe
O und S ausgewählt
und
m ist eine ganze Zahl, die aus der Gruppe bestehend aus
1, 2, 3 und 4 ausgewählt
ist.
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In den obigen Formeln bestimmt die
Anzahl der Methingruppen zum Teil die Anregungsfarbe. Die cyclischen
Azinstrukturen können
auch zum Teil die Anregungsfarbe bestimmen. Oftmals tragen höhere Wert von
m zu einer gesteigerten Lumineszenz und Absorption bei. Bei Werten
von m oberhalb 4 wird die Verbindung instabil. Eine weitere Lumineszenz
kann durch Modifikationen der Ringstrukturen verliehen werden. wenn
m = 2, dann ist die Anregungswellenlänge etwa 650 nm, und die Verbindung
ist sehr stark fluoreszierend. Maximale Emissionswellenlängen sind
im allgemeinen 15 bis 100 nm höher
als die maximalen Anregungswellenlängen.
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Mindestens einer, vorzugsweise nur
einer, und möglicherweise
zwei oder mehr der genannten Gruppen R1,
R2, R3, R4, R5, R6 und
R7 in jedem Molekül ist bzw. sind eine reaktive
Gruppe zur Anheftung des Farbstoffs an die markierte Komponente.
Für bestimmte
Reagentien kann mindestens eine der Gruppen R1,
R2, R3, R4, R5, R6 und
R7 auf jedem Molekül auch eine Gruppe sein, die
die Löslichkeit
des Chromophors erhöht
oder die Selektivität
der Markierung der markierten Komponente beeinträchtigt oder die Position der
Markierung der markierten Komponente durch den Farbstoff beeinträchtigt.
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In den genannten Formeln umfaßt mindestens
eine der genannten Gruppen R8, R9 (wenn vorhanden) und R10 (wenn
vorhanden) mindestens eine Sulfonatgruppe. Die Bezeichnung Sulfonat
soll Sulfonsäure
einschließen,
da die Sulfonatgruppe nur eine ionisierte Sulfonsäure darstellt.
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Reaktive Gruppen, die direkt oder
indirekt an den Chromophor angefügt
werden können,
um die Gruppen R1, R2,
R3, R4, R5, R6 und R7 zu bilden, können reaktive Gruppierungen
einschließen,
beispielsweise Gruppen, die Isothiocyanat, Isocyanat, Monochlortriazin,
Dichlortriazin, Mono- oder Dihalogen-substituiertes Pyridin, Mono-
oder Dihalogen-substituiertes Diazin, Maleimid, Aziridin, Sulfonylhalogenid,
Säurehalogenid,
Hydroxysuccinimidester, Hydroxysulfosuccinimidester, Imidoester,
Hydrazin, Azidonitrophenyl, Azid, 3-(2-Pyridyldithio)-proprionamid, Glyoxal
und Aldehyd enthalten.
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Spezielle Beispiele für die Gruppen
R
1, R
2, R
3, R
4, R
5,
R
6 und R
7, die besonders
gut für
Markierungskomponenten mit verfügbaren
Amino-, Hydroxy- und Sulfhydrylgruppen geeignet sind, sind die folgenden Gruppen:
wobei mindestens eines von
Q oder W eine Austrittsgruppe, wie I, Br, Cl ist:
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Spezielle Beispiele von Gruppen R
1, R
2, R
3,
R
4, R
5, R
6 und R
7, die besonders
gut zum Markieren von Komponenten mit verfügbaren Sulfhydrylgruppen geeignet
sind und die in einem Zweistufen-Verfahren zur Markierung von Antikörpern verwendet
werden können,
sind die folgenden Gruppen:
worin Q eine Austrittsgruppe,
wie I oder Br, ist:
worin n 0 oder eine ganze
Zahl ist.
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Spezielle Beispiele für die Gruppen
R
1, R
2, R
3, R
4, R
5,
R
6 und R
7, die besonders
gut zum Markieren von Komponenten durch lichtaktiviertes Vernetzungsverknüpfen geeignet
sind, sind die folgenden Gruppen:
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Zum Zwecke der Erhöhung der
Wasserlöslichkeit
oder der Verminderung einer unerwünschten nichtspezifischen Bindung
der markierten Komponente an ungeeignete Komponenten in der Probe
oder zur Verminderung von Reaktionen zwischen zwei oder mehreren
reaktiven Chromophoren auf der markierten Komponente, was zum Auslöschen der
Fluoreszenz führen
könnte,
können
die Gruppen R1, R2,
R3, R4, R5, R6 und R7 aus den gut bekannten polaren und elektrisch
geladenen chemischen Gruppen ausgewählt werden. Beispiele hierfür sind -E-F,
wobei F Hydroxy, Sulfonat, Sulfat, Carboxylat, substituiertes Amino
oder quaternäres
Amino ist und wobei E eine Abstandsgruppe, wie -(CH2)n- ist, wobei n 0, 1, 2, 3 oder 4 ist. Geeignete
Beispiele sind zum Beispiel Alkylsulfonat, -(CH2)3SO3 ⊝ und
(CH2)4-SO3 ⊝.
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Die Polymethinkette der Lumineszenz-Farbstoffe
gemäß der Erfindung
kann auch eine oder mehrere cyclische chemische Gruppen enthalten,
die Brücken
zwischen zwei oder mehreren der Kohlenstoffatome der Polymethinkette
bilden. Diese Brücken
könnten
dazu dienen, die chemische oder die Photostabilität des Farbstoffs
zu erhöhen,
und sie könnten
dazu verwendet werden, die Absorptions- und Emissionswellenlängen des Farbstoffes
zu verändern
oder seinen Extinktionskoeffizienten oder seine Quantenausbeute
zu verändern. Verbesserte
Löslichkeitseigenschaften
könnten
durch diese Modifizierung erhalten werden.
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Erfindungsgemäß kann die markierte Komponente
aus folgenden Substanzen ausgewählt
werden: Antikörpern,
Proteinen, Peptiden, Enzymsubstraten, Hormonen, Lymphokinen, Metaboliten,
Rezeptoren; Antigenen, Haptenen, Lectinen, Avidin, Streptavidin,
Toxinen, Kohlenhydraten, Oligosacchariden, Polysacchariden, Nucleinsäuren, Deoxynucleinsäuren, derivatisierten
Nucleinsäuren,
derivatisierten Deoxynucleinsäuren, DNA-Fragmenten,
RNA-Fragmenten, derivatisierten DNA-Fragmenten, derivatisierten
RNA-Fragmenten, natürlichen
Arzneimitteln, Virusteilchen, Bakterienteilchen, Viruskomponenten,
Hefekomponenten, Blutzellen, Blutzelllcomponenten, biologischen
Zellen, nichtzellulären
Blutkomponenten, Bakterien, bakteriellen Komponenten, natürlichen
und synthetischen Lipidbläschen,
synthetischen Arzneimitteln, Giften und umweltverschmutzenden Stoffen.
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Ein Cyanin oder ein damit verwandter
Chromophor kann auch hergestellt werden, der, wenn er mit einer
Komponente umgesetzt wird, Licht bei 633 nm absorbieren kann. In
der Erfassungsstufe kann ein Helium-Neon-Laser verwendet werden,
der Licht bei dieser Wellenlänge
des Spektrums emittiert. Auch kann ein Cyanin- oder damit verwandter
Farbstoff hergestellt werden, der, wenn er mit einer Komponente
umgesetzt wird, Licht maximal zwischen 700 nm und 900 nm absorbieren
kann. In diesem Fall kann in der Erfassungsstufe eine Laserdiode
verwendet werden, die Licht in diesem Bereich des Spektrums emittiert.
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Selektivität
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Die obenangegebenen reaktiven Gruppen
sind relativ spezifisch für
die Markierung bestimmter funktioneller Gruppen auf Proteinen und
anderen biologischen oder nichtbiologischen Molekülen, Makromolekülen, Oberflächen oder
Teilchen, vorausgesetzt, daß geeignete
Reaktionsbedingungen, mit Einschluß von geeigneten pH-Bedingungen
angewendet werden.
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Eigenschaften der reaktiven
Cyanin-, Merocyanin- und Styryl-Farbstoffe
und ihrer Produkte
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Die Spektraleigenschaften der erfindungsgemäßen Farbstoffe werden
durch die hierin beschriebene Funktionalisierung nicht nennenswert
verändert.
Die Spektraleigenschaften der markierten Proteine und der anderen
Verbindungen sind gleichfalls nicht sehr verschieden von denjenigen
des Grund-Farbstoffmoleküls, das
nicht an ein Protein oder ein anderes Material konjugiert worden
ist. Die hierin beschriebenen Farbstoffe haben, allein oder an ein
markiertes Material konjugiert, im allgemeinen große Extinktionskoeffizienten
(ε = 100.000
bis 250.000), hohe Quantenausbeuten so hoch wie 0,4 in bestimmten
Fällen,
und sie absorbieren und emittieren Licht im Spektralbereich von
400 bis 900 nm. Somit sind sie von besonderem Wert als Markierungs-Reagentien
für die
Lumineszenz-Erfassung.
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Optische Erfassungsmethoden
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Zur Erfassung bzw. Bestimmung einer
markierten oder gefärbten
Komponente kann jede beliebige Methode angewendet werden.
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Die Erfassungsmethode kann eine Lichtquelle
verwenden, die das Gemisch, welches das markierte Material enthält, mit
Licht mit ersten definierten Wellenlängen bestrahlt. Bekannte Vorrichtungen
werden verwendet, die Licht mit zweiten Wellenlängen erfassen, welches Licht
durch das Gemisch hindurchgelassen worden ist oder das durch das
Gemisch fluoresziert oder luminesziert wird. Solche Erfassungsvorrichtungen
sind beispielsweise Fluoreszenz-Spektrometer, Absorptions-Spektrophotometer,
Fluoreszenz-Mikroskope, Lichtdurchlässigkeits-Mikroskope und Fließ-Cytometer, optische Fasersensoren
und Immunoassay-Instrumente.
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Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
können
auch chemische Analysenmethoden verwendet werden, um die Anheftung
des Farbstoffs an die markierte Komponente oder die markierten Komponenten
zu erfassen. Beispiele für
chemische Analysenmetho den sind die Infrarot-Spektrometrie, die
NMR-Spektrometrie, die Absorptions-Spektrometrie, die Fluoreszenz-Spektrometrie,
die Massen-Spektrometrie und die Chromatographie.
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Die Erfindung wird in den Beispielen
erläutert.
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Beispiel 1
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Effekt des pH-Werts auf
die Konjugierung von Sulfoindodicarbocyanin mit Protein
-
Proben von Schaf-γ-Globulin (4 mg/ml) in 0,1m
Carbonat-Puffern (pH = 8,5, 8,9 und 9,4) wurden bei Raumtemperatur
mit einem 10fachen molaren überschuß des folgenden
aktiven Sulfoindodicarbo-cyaninesters (m = 2) vermischt.
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Zu geeigneten Zeitpunkten, die sich
von 5 Sekunden bis 30 Mi nuten erstreckten, wurden Proteinproben
von nichtkovalent angeheftetem Farbstoff durch Gel-Permeationschromatographie
auf Sephadex
® G-50 abgetrennt.
Die maximale Markierung des Proteins erfolgte nach 10 Minuten und
ergab End-Molverhält nisse von
Farbstoff/Protein von 5,8, 6,4 und 8,2 für die Proben, die bei pH-Werten
von 8,5, 8,9 bzw. 9,4 inkubiert worden waren. Die Zeiten, die erforderlich
waren, um ein Farbstoff/Protein-Verhältnis von 5 und Quantenausbeuten
der Produkte bei den verschiedenen pH-Werten zu ergeben, sind in
der folgenden Tabelle zusammengestellt:
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Diese Werte zeigen, daß die Protein-Markierung
mit diesem Farbstoff bei einem pH-Wert von 9,4 besser ist als bei
einem pH-Wert von unterhalb 9. In dem Puffer mit höherem pH-Wert
war die Konjugierungsreaktion sehr rasch, doch war die Markierungswirksamkeit
ausgezeichnet, und das Produkt war stärker fluoreszierend. Der Wert
der Quantenausbeute gibt die mittlere Quantenausbeute pro Farbstoffmolekül auf dem
markierten Protein wieder.
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Beispiel 2
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Konjugation des aktiven
Sulfoindocarbocyaninesters mit Protein
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Schaf-γ-Globulin (1 mg/ml), gelöst in phosphatgepufferter
Kochsalzlösung
(PBS) mit einem pH-Wert von 7,4, wurde mit 0,1m Natriumcarbonat
auf einen pH-Wert von 9,4 eingestellt. Ein Cyanin-Farbstoff-Markierungsmittel
(Struktur in Beispiel 1, m = 1) wurde zu aliquoten Teilen dieser
Proteinlösung
zugegeben, um verschiedene Molverhältnisse von Farbstoff/Protein
zu ergeben. Nach 30minütiger
Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Gemische durch Gel-Permeationschromatographie auf
Sephadex® G-50
unter Elution mit PBS aufgetrennt. Das Molverhältnis der Farbstoffe, die kovalent
an die Proteine in den Produkten angeheftet worden waren, war 1,2,
3,5, 5,4, 6,7 und 11,2 für
Anfangsverhältnisse
von Farbstoff/Protein von 3, 6, 12, 24 bzw. 30.
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Beispiel 3 Markierung
von AECM-Dextran mit einem Sulfoindodicarbocyanin
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N-Aminoethyl-carboxamidomethyl-(AECM=)Dextran
mit einem Mittelwert von 16 Aminogruppen pro Dextranmolekül wurde
aus Dextran mit einem mittleren MW von 70.000 synthetisiert (Inman,
J.K., J. Immunol. 114: 704–709
(1975)). Ein Teil des AECM-Dextrans (1 mg/250 μl), gelöst in 0,1m Carbonat-Puffer,
mit einem pH-Wert von 9,4 wurde zu 0,2 mg des aktiven Sulfoindodicarbocyaninesters
(Struktur in Beispiel 1, m = 2) gegeben, wobei ein Farbstoff/Protein-Molverhältnis von
10 erhalten wurde. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur
gerührt.
Das Dextran wurde sodann von nichtkonjugiertem Farbstoff durch Sephadex® G-50-Gel-Permeationschromatographie
unter Verwendung von Ammoniumacetat (50mM) als Elutions-Puffer abgetrennt.
Ein Durchschnitt von 2,2 Farbstoffmolekülen war kovalent an jedes Dextranmolekül gebunden.
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Beispiel 4 Markierung
eines spezifischen Antikörpers
mit aktivem Sulfoindodicarbocyaninesters
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Gegen Murin IgG spezifisches Schaf-γ-Globulin
(1 mg/ml) in 0,1m Carbonat-Puffer (pH = 9,4) wurde mit dem aktiven
Sulfoindodicarbocyaninester (Struktur in Beispiel 1, m = 2) mit
einem Verhältnis
von 8 Farbstoffmolekülen
pro Proteinmolekül vermischt.
Nach 30minütigem
Inkubieren bei Raumtemperatur wurde das Markierungsgemisch durch
Gelfiltration auf Sephadex G-50, das mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH =
7,4) ins Gleichgewicht gebracht worden war, aufgetrennt. Das gewonnene
Protein enthielt einen Mittelwert von 4,5 Farbstoffmolekülen, die
kovalent an jedes Proteinmolekül
angeheftet waren.
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Beispiel 5
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Anfärbung und mikroskopische Sichtbarmachung
von Human-Lymphozyten
mit Sulfoindodicarbocyanin-Farbstoff, der an Schaf-Anti-Maus-IgG-Antikörper kunjugiert
war
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Frisch isolierte periphere Blutlymphozyten
wurden bei 0°C
30 Minuten lang mit Maus-Anti-ß2-Mikroglobulin
(0,25 μg/106 Zellen) behandelt. Die Zellen wurden zweimal
mit DMEM-Puffer gewaschen und sodann mit dem mit Sulfoindodicarbocyanin
markierten Schaf-Anti-Maus-IgG-Antikörper (1 μg/106 Zellen)
behandelt. Nach 30minütiger
Inkubierung bei 0°C
wurde überschüssiger Antikörper durch
Zentrifugieren der Zellen entfernt, und die Zellen wurden erneut
zweimal mit DMEM-Puffer gewaschen. Aliquote Teile der Zellen wurden auf
Objektträgern
zur Analyse durch Fluoreszenz-Mikroskopie befestigt. Unter dem Mikroskop
wurden die Lymphozyten auf dem Objektträger mit Licht mit 610 bis 630
nm bestrahlt, und die Fluoreszenz bei 650 bis 700 nm wurde mit einer
rotempfindlichen verstärkten
COHU-Fernsehkamera erfaßt,
welche an einen Bilddigitalisierer und einen Fernsehmonitor angeschlossen
war. Die nach dieser Methode angefärbten Zellen zeigten unter
dem Mikroskop eine Fluoreszenz. In einem Kontrollexperiment wurde
die Verwendung des primären Maus-Anti-β2-Mikroglobulin-Antikörpers weggelassen,
doch wurde die Färbung
und die Analyse sonst wie oben beschrieben durchgeführt. Die
Kontrollprobe zeigte unter dem Mikroskop keine Fluoreszenz, was
darauf hinweist, daß der
mit Sulfoindocyanin markierte Schaf-Anti-Maus-Antikörper keine
signifikante nichtspezifische Bindung an Lymphozyten ergibt.