DE3943817C2

DE3943817C2 - Lumineszierende Cyanin-, Merocyanin- und Stryryl-Farbstoffe

Info

Publication number: DE3943817C2
Application number: DE3943817A
Authority: DE
Inventors: Alan S Waggoner
Original assignee: Carnegie Mellon University
Current assignee: Carnegie Mellon University
Priority date: 1988-09-02
Filing date: 1989-04-12
Publication date: 2001-07-12
Anticipated expiration: 2009-04-13
Also published as: DE3943862B4; DE3943870B4

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zum Markieren einer Komponente einer wäßrigen Flüssigkeit, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man DOLLAR A (a) zu der die genannte Komponente enthaltenden Flüssigkeit einen Lumineszenz-Farbstoff aus der Gruppe Cyanin-, Merocyanin- und Styryl-Farbstoffe, der an einen aromatischen Kern angeheftet mindestens eine Sulfonsäure oder Sulfonatgruppe enthält, zusetzt, wobei der genannte Farbstoff mit der genannten Komponente reaktiv ist, und DOLLAR A (b) den Farbstoff mit der genannten Komponente umsetzt, so daß der Farbstoff die genannte Komponente markiert.

Description

Cyanin-Farbstoffe und damit verwandte Polymethin-Farbstoffe mit lichtabsorbierenden Eigenschaften sind bereits in photographischen Filmen verwendet worden. Obgleich solche Farbstoffe lichtabsorbierende Eigenschaften erfordern, be nötigen sie keine Lumineszenz-(Fluoreszenz- oder Phosphores zen-)Eigenschaften. Cyanin-Farbstoffe mit Lumineszenz-Eigen schaften haben bislang eine nur sehr eingeschränkte Verwer tung erfahren. Eine solche Verwendung ist beispielsweise die Markierung der Sulfhydrylgruppe von Proteinen. In einem Bericht, Salama, G., Waggoner, A. S. und Abramson J., wird unter dem Titel "Sulfhydrylreagens-Farbstoffe lösen die rasche Freisetzung von Ca²⁺ aus Sarcoplasmin-Reticulum-Bläs chen (SR)" aus Biophysical Journal, 47, 456a (1985), festge stellt, daß Cyanin-Chromophore mit einer Iodacetylgruppe zur Bildung von kovalenten Bindungen mit Sulfhydrylgruppen auf dem Sarcoplasmin-Reticulum-Protein bei einem pH-Wert von 6,7, um die Ca²⁺-Freisetzung auszulösen, verwendet wurden. In dem Bericht heißt es auch, daß Fluoreszenz-Farbstoffe dazu ver wendet wurden, um diese Proteine zu markieren und zu isolie ren.

In einem Bericht von Waggoner, A. S., Jenkins, P. L., Carpenter, J. P. und Gupta, R. mit dem Titel "Kinetik von Konformations veränderungen in einem Bereich des Rhodopsin-Moleküls, von der Retinyliden-Bindungsstelle entfernt" in Biophysical Journal, 33, 292a (1981), stellen die Autoren fest, daß die Sulfhydrylgruppe auf dem F1-Bereich von Rinder(cattle)-Rhodopsin mit einem Cyanin-Farbstoff mit einer Absorption bei 660 nm ko valent markiert worden ist. Auch gemäß diesem Bericht werden Cyanin-Farbstoffe zum spezifischen Markieren der Sulfhydryl gruppe eines Proteins verwendet. Die Verwendung von Fluoreszenz-Farbstoffen wird jedoch in diesem Bericht nicht beschrie ben.

Ein Artikel mit der Überschrift "Internationaler Workshop über die Anwendung von Fluoreszenz-Photobleichungstechniken auf Probleme der Zellbiologie" von Jacobson K., Elson E., Koppel D., Webb W. in Fed. Proc. 42: 72-79 (1983), berichtet über einen Artikel, der von A. Waggoner eingereicht wurde. Dieser bezieht sich auf Fluoreszenz-Sonden vom Cyanintyp, die an Proteine konjugiert werden können und die im tieferen Rotbereich des Spektrums angeregt werden können.

In den obengenannten drei Berichten werden als einzige Cyanin- Sonden nur solche erwähnt, die sich kovalent spezifisch an die Sulfhydrylgruppe eines Proteins anheften. Die einzige speziell genannte Cyaninverbindung ist eine solche, die eine Iodacetylgruppe aufweist, welche Gruppe bewirkt, daß der Cyanin-Farbstoff gegenüber der Sulfhydrylgruppe kovalent reak tiv wird. In keinem der obenangegebenen Berichte wird die kovalente Reaktion eines Cyanin-Farbstoffs mit irgendeinem anderen Material als einem Protein oder mit irgendeiner ande ren Gruppe auf einem Protein als einer Sulfhydrylgruppe be schrieben.

Viele Nicht-Proteinmaterialien haben jedoch keine Sulfhydryl gruppen, und viele Proteine weisen keine genügende Anzahl von Sulfhydrylgruppen auf, um diese Gruppen für die Zwecke der Fluoreszenz-Sondierung geeignet zu machen. Dazu kommt noch, daß Sulfhydrylgruppen (-SHSH-) leicht zu Disulfiden (-S-S-) in Gegenwart von Luft oxidiert werden und daher für die kova lente Anheftung an eine Fluoreszenz-Sonde nicht mehr verfüg bar werden.

Erfindungsgemäß wurden nun Cyanin- und damit verwandte Poly methin-Farbstoffe entwickelt, die Substituentengruppen besit zen, die unter geeigneten Reaktionsbedingungen nicht nur mit Sulfhydrylgruppen, sondern auch mit Amin-(-NH₂-) und Hydroxy- (-OH-)Gruppen oder anderen Gruppen, wie Aldehyd-(-CHO-)Grup pen, auf Proteinen und anderen Materialien kovalent reaktiv sind, um eine Fluoreszenz- und Phosphoreszenz-Erfassung dieser Materialien zu ermöglichen. Durch die Erfindung werden erhebliche Vorteile gegenüber der Verwendung der Iodacetyl- Cyanin-Farbstoffe nach dem Stand der Technik und ihrer spezi fischen Reaktivität mit Sulfhydrylgruppen realisiert. Amin- und Hydroxygruppen herrschen in Proteinen und anderen Materia lien stärker vor als Sulfhydrylgruppen, und sie sind stabiler. Wenn daher Fluoreszenz-Cyanin-Farbstoffe zur Erfassung des Vorhandenseins von bestimmten Proteinen verwendet werden, wird ein stärkeres Fluoreszenz- oder Phosphoreszenz-Licht intensitätssignal abgegeben, weil eine größere Anzahl von Farbstoffmolekülen an das zu sondierende Protein angeheftet werden kann. Weiterhin werden Amin- und Hydroxygruppen leich ter an Komponenten, die markiert werden sollen, wie Polymer teilchen, die von Natur aus weder Sulfhydryl-, Amin- oder Hydroxygruppen enthalten, angeheftet.

Die erfindungsgemäßen Lumines zenz-Cyanin-Farbstoffe, die eine Gruppe enthalten, die mit Amingruppen oder Hydroxygruppen oder anderen reaktionsfähigen Gruppen kovalent reaktiv sind, können dazu verwendet werden, um Proteine oder andere Materialien mit einer Amin- oder Hydroxy gruppe oder einer anderen Gruppe, die dazu imstande ist, sich mit dem Farbstoff in einem Gemisch umzusetzen, zu markieren, so daß das Vorhandensein und das Ausmaß des markierten Proteins oder des anderen Materials erfaßt werden kann, nach dem die markierten Komponenten durch chromatographische Methoden abgetrennt worden sind. Nach den obenangegebenen Druckschriften wurde offenbar die Sulfhydrylgruppe speziell deswegen für die kovalent Reaktion ausgewählt, weil sich auf einem Proteinmolekül so wenige dieser Gruppen befinden und weil in manchen Fällen die Sulfhydrylgruppe in der Funk tion des Proteins eine signifikante Rolle spielt. Die Autoren konnten daher annehmen, daß der spezielle Ort einer Sulf hydrylgruppe auf einer Proteinstruktur festgestellt werden kann. Gemäß diesen Druckschriften wurde der für die Sulf hydrylgruppe spezifische Farbstoff auch als Sonde verwendet, um Strukturveränderungen in einem speziellen Protein zu erfas sen oder zu erzeugen. Um eine Veränderung der Lichtabsorption durch den Farbstoff oder das durch die Farbstoffbindung frei gesetzte Calciumion zu interpretieren, war es erforderlich, zu wissen, wo die Sonde gebunden ist.

Da auf den meisten Proteinmolekülen so wenige Sulfhydrylgrup pen sind, können diese Gruppen nicht genügend zahlreich sein, um eine angemessene Gesamtlumineszenz für Erfassungsunter suchungen zu ergeben. Demgegenüber sind Amin- und Hydroxy gruppen signifikant zahlreicher, und sie sind auf einem Proteinmolekül weit dispergiert, wodurch es ermöglicht wird, daß eine Fluoreszenz-Sonde an vielfache Stellen auf dem Molekül angefügt wird, wodurch eine Interpretation der Licht absorptions- und Fluoreszenzveränderungen durch Erleichterung der Erfassung des Proteins ausgeschlossen wird.

Die erfindungsgemäßen Lumines zenz-Polymethin-Cyanin- und verwandten Polymethin-Farbstoffe, wie Merocyanin- und Styryl-Farbstoffe, können zur Markierung von Proteinen und anderen Materialien mit Einschluß von Nucleinsäuren, DNA, Arzneimitteln, Toxinen, Blutzellen, mikrobiellen Materialien, Teilchen, Kunststoff- oder Glasoberflächen, Polymermembranen etc. an einer Amin- oder Hydroxystelle auf den genannten Ma terialien verwendet werden. Die Farbstoffe sind vorteilhafterweise in einem wäßrigen oder einem anderen Medium, in dem das markierte Material enthalten ist, löslich. Die erfindungsgemäßen Farbstoffe können in einem zweistufigen Markierungsverfahren zusätzlich zu einem einstufigen Markierungsverfahren verwendet werden. Bei dem zweistufigen Markierungsverfahren kann eine primäre Komponente, wie ein Antikörper, an Stellen darauf mit Einschluß von Amin-, Hydroxy-, Aldehyd- oder Sulfhydrylstellen, markiert werden, und die markierte Komponente wird als Sonde für die sekundäre Komponente, wie ein Antigen, für das der Antikörper spezifisch ist, verwendet.

Gemäß dem oben diskutierten Stand der Technik wurde die Spe zifizität der Stelle der Anheftung durch eine Cyanin-Sonde dadurch erhalten, daß eine Sonde verwendet wurde, die gegen über einer Sulfhydrylgruppe kovalent reaktiv ist. Gemäß dem zweistufigen Verfahren können Cyanin- und damit verwandte Sonden in einer ersten Stufe mit Amin-, Aldehyd-, Sulfhydryl-, Hydroxy- oder anderen Gruppen auf einer ersten Komponente, wie einem Antikörper, umgesetzt wer den, worauf der Antikörper die gewünschte Spezifizität in einer zweiten Komponente, wie einem Antigen, in einer zweiten oder Anfärbungsstufe erhalten kann, wobei die Spezifizität durch die Antigenstelle der Anheftung an den Antikörper be stimmt wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch Lumineszenz-Polymethin- Cyanin-Verbindungen und damit verwandte Verbindungen, die Gruppen enthalten, die sie in die Lage versetzen, kovalent an Amin-, Hydroxy-, Aldehyd- oder Sulfhydrylgruppen auf einem Targetmolekül angeheftet zu werden. Mit den erfindungsgemäßen Lumineszenz-Cyanin-Verbindungen können monoklonale Antikörper und andere Komponenten markiert werden, die dazu imstande sind, Sonden für Antigene zu sein. Wenn das Target eine Zelltype ist, dann kann die Menge der markierten Antikörper, die an die genannte Zelltype angeheftet ist, gemessen werden. Die Messung kann in der Weise erfolgen, daß man die relative Helligkeit oder Abschwächung der Lumines zenz der Zellen erfaßt.

Zudem kann die Kon zentration eines bestimmten Proteins oder einer anderen Kom ponente in einem System bestimmt werden. Wenn die Anzahl der reaktiven Gruppen auf einem Protein, das mit einer Sonde umgesetzt werden kann, bekannt ist, dann ist die Fluoreszenz pro Molekül bekannt, und die Konzentration dieser Moleküle in dem System kann anhand der Gesamt-Lumineszenzintensität des Systems ermittelt werden.

Das Verfahren kann dazu angewendet werden, um eine Vielzahl von Proteinen oder anderen Materialien in einem System quan titativ zu bestimmen, indem man alle eines Gemisches von Proteinen in dem System markiert und sodann die markierten Proteine durch irgendwelche Maßnahmen, wie chromatographische Maßnahmen, abtrennt. Die Menge der abgetrennten Proteine, die lumineszieren, kann bestimmt werden. In chromatographischen Erfassungssystemen kann der Ort des Farbstoffs auf dem mar kierten Material ermittelt werden.

Weiterhin kann die Anzahl von verschiedenen Zellen, die mit einem Antikörper etiket tiert sind, bestimmt werden. Diese Bestimmung kann in der Weise erfolgen, daß man eine Vielzahl von Typen der Zellen in einem System etikettiert und sodann die etikettierten Zellen außerhalb des Systems abtrennt. Auch können die etikettier ten Zellen von nichtetikettierten Zellen außerhalb des Systems abgetrennt werden.

In einem Multiparameter-Verfahren kann eine Vielzahl der erfindungsgemäßen Lumineszenz-Cyanin- oder verwandten Farbstoffen verwendet werden, die jeweils an eine Vielzahl von verschiedenen primären Komponenten, wie Antikörpern, angeheftet sind, wobei jeder Farbstoff für eine unterschiedliche sekundäre Komponente, wie ein Antigen, spezifisch ist, um jeden einer Vielzahl der ge nannten Antigene in einem Gemisch von Antigenen zu identifi zieren. Jeder der genannten Antikörper wird gesondert mit einem Farbstoff mit verschiede ner Lichtabsorption und verschiedenen Lumineszenzwellenlängen- Eigenschaften als der Farbstoff, der zur Markierung der an deren Sonden verwendet wird, markiert. Sodann werden alle markierten Antikörper zu einem zu analysierenden biologischen Präparat gegeben, das sekundäre Komponenten, wie Antigene, enthält, welche jeweils durch bestimmte markierte Antikörper angefärbt werden können. Irgendwelche nichtumgesetzten Farb stoffmaterialien können aus dem Präparat beispielsweise durch Auswaschen entfernt werden, wenn sie die Analyse stören. Das biologische Präparat wird sodann einer Vielzahl von Anregungs wellenlängen ausgesetzt, wobei jede verwendete Anregungswel lenlänge die Anregungswellenlänge eines bestimmten konjugier ten Farbstoffs ist. Ein Lumineszenz-Mikroskop oder ein ande res Lumineszenz-Erfassungssystem, wie ein Fließ-Cytometer oder ein Fluoreszenz-Spektrophotometer, das Filter oder Mono chrometer zur Auswahl der Strahlen der Anregungswellenlänge und zur Auswahl der Wellenlängen der Lumineszenz aufweist, wird dazu verwendet, um die Intensität der Strahlen der Emis sionswellenlänge, die der Anregungswellenlänge entspricht, zu bestimmen. Die Intensität der Lumineszenz bei Wellenlän gen, die der Emissionswellenlänge eines bestimmten konjugier ten Farbstoffs entspricht, zeigt die Menge des Antigens an, die an den Antikörper gebunden ist, an den der Farbstoff an gefügt ist. In bestimmten Fällen kann eine einzige Wellenlänge der Anregung dazu verwendet werden, um Lumineszenz von zwei oder mehreren Materialien in einem Gemisch zu erregen, wobei jede Fluoreszenz bei einer verschiedenen Wellenlänge und die Menge jeder markierten Art dadurch gemessen werden kann, daß man ihre individuelle Fluoreszenzintensität bei der je weiligen Fluoreszenzwellenlänge erfaßt. Gewünschtenfalls kann eine Lichtabsorptions-Erfassungsmethode angewendet werden. Das Zweistufen-Verfahren kann auf ein belie biges System angewendet werden, bei dem ein mit einem Farb stoff konjugiertes primäres Material und dem Farbstoff ge- oder Lichtabsorptions-Erfassungssystem verwendet wird, um das Vorhandensein eines anderen Materials zu erfassen, auf das das Konjugat aus dem primären Material in dem Farbstoff ge richtet ist. So kann beispielsweise der Farbstoff an ein Fragment von DNA oder RNA konjugiert sein, um ein mit Farb stoff konjugiertes DNA- oder RNA-Fragment zu bilden, das so dann auf einen Hauptstrang von DNA oder RNA gerichtet wird, zu dem das Stück komplementär ist. Das gleiche Testverfahren kann dazu verwendet werden, um das Vorhandensein von irgend einem komplementären Hauptstrang von DNA zu erfassen.

Die erfindungsgemäßen Cyanin- und damit verwandten Farbstoffe sind besonders gut für die Analyse eines Gemisches von Kompo nenten geeignet, bei dem Farbstoffe einer Vielzahl von An regungs- und Emissionswellenlängen erforderlich sind, weil spezielle Cyanin- und damit verwandte Farbstoffe synthetisiert werden können, die einen weiten Bereich von Anregungs- und Emissionswellenlängen haben. Spezielle Cyanin- und damit ver wandte Farbstoffe mit spezifischen Anregungs- und Emissions wellenlängen können synthetisiert werden, indem die Anzahl der Methingruppen variiert wird oder indem die Cyanin-Ring strukturen modifiziert werden. Auf diese Weise ist es möglich, Farbstoffe mit besonderen Anregungswellenlängen zu syntheti sieren, um einer besonderen Anregungs-Lichtquelle, wie einem Laser, zum Beispiel einem HeNe-Laser oder einem Diodenlaser, zu entsprechen.

Hochlumines zente und hochlichtabsorbierende Cyanin- und damit verwandte Farbstoffmoleküle können unter Reaktionsbedingungen mit Amin-, Hydroxy-, Aldehyd-, Sulfhydryl- oder anderen Gruppen auf Proteinen, Peptiden, Kohlenhydraten, Nucleinsäuren, derivati sierten Nucleinsäuren, Lipiden, bestimmten anderen biologi schen Molekülen, biologischen Zellen sowie nichtbiologischen Materialien, beispielsweise löslichen Polymeren, Polymerteil chen, Polymeroberflächen, Polymermembranen, Glasoberflächen und anderen Teilchen und Oberflächen kovalent reagieren. Da die Lumineszenz hochempfindliche optische Techniken umfaßt, kann die Anwesen heit dieser Farbstoff-"Etiketten" erfaßt und selbst dann quantitativ bestimmt werden, wenn das "Etikett" nur in sehr geringen Mengen vorhanden ist. Somit können die Farbstoffmar kierungs-Reagentien dazu verwendet werden, die Menge eines Materials, das markiert worden ist, zu messen. Die am besten geeigneten Farbstoffe sind hoch lichtabsorbierend (ε = 70.000 bis 250.000 l/mol-cm oder höher) und sehr lumineszent, und sie haben Quantenausbeuten von mindestens 5% bis 80% oder mehr. Die qualitativen Eigenschaften betreffen die Farbstoffe selbst und Farbstoffe, die an ein markiertes Material konju giert sind.

Eine wichtige Anwendung für diese Farbmarkierungs-Reagentien ist die Herstellung von lumineszierenden monoklonalen Anti körpern. Monoklonale Antikörper sind Proteinmoleküle, die sich sehr eng und sehr spezifisch an bestimmte chemische Stel len oder "Marker" auf Zelloberflächen oder innerhalb von Zellen binden. Diese Antikörper besitzen daher eine enorme Forschungseignung und klinische Eignung zur Identifizierung von bestimmten Zelltypen (zum Beispiel HLA-Klassifizierung, T-Zell-Subsets, Bakterien- und Virenklassifizierung etc.) und erkrankte Zellen. In der Vergangenheit ist die Menge des an eine Zelle gebundenen Antikörpers dadurch quantitativ be stimmt worden, daß man den Antikörper auf verschiedene Weise markiert hat. Das Markieren ist mit einer radioaktiven Mar kierung (Radioimmuno-Assay), einem Enzym (ELISA-Techniken) oder einem Fluoreszenz-Farbstoff (gewöhnlich Fluorescein, Rhodamin, Texasrot® oder Phycoerythrin) bewerkstelligt worden. Die meisten Hersteller und Anwender von klinischen Antikör per-Reagentien möchten von den mit der Verwendung von radio aktiven Tracern inhärenten Problemen wegkommen, so daß die Lumineszenz als eine der vielversprechendsten Alternativen angesehen wird. Tatsächlich liefern nunmehr viele Firmen mit Fluorescein, Texasrot®, Rhodamin und Phycoerythrin markier te monoklonale Antikörper.

In den letzten Jahren ist die optische/elektronische Instru mentierung für die Erfassung von fluoreszierenden Antikörpern auf Zellen komplizierter geworden. So kann beispielsweise die Fließ-Cytometrie dazu verwendet werden, um die Menge von fluoreszierendem Antikörper auf individuellen Zellen mit ei ner Rate von bis zu 5.000 Zellen pro Sekunde zu bestimmen. Auch mikroskopische und Lösungs-Fluoreszenztechniken haben Fortschritte erzielt. Diese Instrumente können eine Fluores zenz bei vielen Wellenlängen des UV-, sichtbaren und nahen IR-Bereichs des Spektrums erregen. Doch können die meisten der derzeit verfügbaren, verwendbaren Fluoreszenz-Markierungs- Reagentien nur im 400- bis 580-nm-Bereich des Spektrums an geregt werden. Die Ausnahmen sind einige der Pigmente vom Phycobiliprotein-Typ, die aus Meeresorganismen isoliert wor den sind und die kovalent an Proteine angeheftet werden kön nen. Diese können bei etwas niedrigeren Wellenlängen angeregt werden. Es gibt daher ein großes Spektralfenster im Bereich von 580 bis ungefähr 900 nm, wo es notwendig ist, daß neue Markierungs-Reagentien zur Markierung von biologischen und nichtbiologischen Materialien verfügbar werden, wobei die Analyse mit der derzeit verfügbaren Instrumentierung durch geführt werden soll. Neue Reagentien, die in diesem Spektral bereich anregbar sind, würden es ermöglichen, Multifarb- Lumineszenzanalysen von Markern auf Zellen durchzuführen, da Antikörper mit verschiedenen Spezifizitäten jeweils mit einem verschieden gefärbten Fluoreszenz-Farbstoff markiert werden könnten. Somit könnte das Vorhandensein von mehreren Markern gleichzeitig für jede analysierte Zelle bestimmt wer den.

Die Erfindung betrifft lumineszierende (fluoreszierende oder phosphoreszierende) Cyanin-, Merocyanin- und Styryl- Farbstoffe, die an biologische und nichtbiologische Materialien kovalent angeknüpft werden können. Merocyanin- und Styryl-Farbstoffe werden für die Zwecke dieser Erfindung als mit Cyanin-Farbstoffen verwandt angesehen. Die neuen Markierungs-Reagentien selbst, jedoch insbesondere dann, wenn sie mit einer markierten Komponente konjugiert sind, können durch Licht von ersten definierten Wellenlängen, zum Beispiel durch Licht in Wellenlängenbereichen des Spektrums von 450 bis 900 nm, angeregt werden. Die Hintergrund-Fluoreszenz von Zellen erfolgt im allgemeinen bei einer niedrigeren Wellen länge. Daher werden sich die Markierungs-Reagentien gegenüber der Hintergrund-Fluoreszenz unterscheiden. Von besonderem Inter esse sind die Derivate, die Licht bei 633 nm absorbieren, da sie durch billige, intensive, stabile und langlebige HeNe- Laserquellen angeregt werden können. Licht von zweiten defi nierten Wellenlängen, das durch die markierte Komponente fluoresziert oder phosphoresziert wird, kann sodann erfaßt werden. Das fluoreszierte oder phosphoreszierte Licht hat im allgemeinen eine größere Wellenlänge als das Anregungs licht. In der Erfassungsstufe kann ein Lumineszenz-Mikroskop verwendet werden, das einen Filter zur Absorption von Streu licht der Anregungswellenlänge und zum Durchgang der Wellen länge hat, die der Lumineszenz entspricht, die der jeweili gen Farbstoffmarkierung entspricht, die mit der Probe verwen det wird. Ein derartiges optisches Mikroskop ist zum Beispiel in der US-PS 4 621 911 beschrieben.

Nicht alle Cyanin- und damit verwandte Farbstoffe sind lumines zierend. Jedoch schließen die erfindungsgemäßen Farbstoffe solche Cyanin- und damit verwandte Farbstoffe ein, die lumines zierend sind. Sie sind relativ photostabil, und viele sind in der Reaktionslösung, vorzugsweise einer wäßrigen Lösung, löslich. Die konjugierten Farbstoffe selbst, jedoch insbeson dere, wenn sie mit einer markierten Komponente konjugiert sind, haben molare Extinktionskoeffizieten (ε) von mindestens 50.000 und vorzugsweise mindestens 100.000 Liter pro mol . cm. Der Extinktionskoeffizient ist ein Maß der Fähigkeit der Moleküle, Licht zu absorbieren. Die erfindungsgemäßen konju gierten Farbstoffe haben Quantenausbeuten von mindestens 2% und vorzugsweise mindestens 10%. Dazu absorbieren und emit tieren die erfindungsgemäßen konjugierten Farbstoffe Licht im Spektralbereich von 400 bis 900 nm und vorzugsweise im Spektralbereich von 600 bis 900 nm.

Arylsulfonierte Farbstoffe

Es wurde nun gefunden, daß die hierin beschriebenen Arylsul fonat- oder Arylsulfonsäure-Farbstoffe ihrer Natur nach stärker fluoreszierend sind und verbesserte Photostabilitäts- und Wasserlöslichkeitseigenschaften haben als ähnliche Farb stoffe ohne Arylsulfonat- oder Arylsulfonsäuregruppen. Die hierin verwendeten Bezeichnungen Arylsulfonat oder Arylsulfonsäure sollen Arylsulfonsäuregruppen oder Arylsulfonatgruppen bezeichnen, wobei die genannten Gruppen an aromatische Ringstrukturen angefügt sind, mit Einschluß einer einzigen aromatischen Ringstruktur oder einer kondensierten Ringstruk tur, beispielsweise einer Naphthalinstruktur. Die einzige aromatische Ringstruktur oder die kondensierte aromatische Ringstruktur kann in Polymethin-, Cyanin-, Merocyanin- oder Styryl-Farbstoffen vorhanden sein.

Viele Farbstoffe mit planaren Molekularstrukturen mit Ein schluß von üblichen Cyanin-Farbstoffen neigen dazu, in wäß riger Lösung Dimere und Aggregate höherer Ordnung zu bilden, und zwar insbesondere dann, wenn gleichfalls anorganische Salze vorhanden sind, wie es beispielsweise in gepufferten Lösungen und physiologischer Kochsalzlösung der Fall ist. Die se Aggregate haben gewöhnlich Absorptionsbanden, die zu der kurzen Wellenlängenseite der Monomerabsorption verschoben sind, und sie sind im allgemeinen sehr schwach fluoreszieren de Arten. Die Tendenz der Cyanin-Farbstoffe, in wäßriger Lösung leicht Aggregate zu bilden, ist insbesondere in der Photographie gut bekannt (West, W., und Pierce S., J. Phys. Chem., 69: 2894 (1965); Sturmer, D. M., Spec. Top in Hetero cyclic Chemistry, 30 (1974)).

Viele Farbstoffmoleküle und insbesondere Cyanin-Farbstoffmole küle neigen dazu, in wäßriger Lösung Aggregate zu bilden. Es ist gefunden worden, daß die Arylsulfonat-Farbstoffe eine minimale Neigung haben, diese Aggregate zu bilden. Bei Ver wendung zur Bildung von fluoreszierenden Markierungs-Reagen tien haben die Arylsulfonat-Farbstoffe eine verminderte Nei gung, Aggregate zu bilden, wenn sie mit hohen Oberflächen dichten an Proteine oder andere Moleküle, wie Antikörper, ge bunden werden. Die Tendenz eines bestimmten Farbstoffmoleküls, Aggregate in einer Salzlösung (zum Beispiel 150 mM Natriumchlorid-Lösung) zu bilden, kann als Maß der Neigung des glei chen Farbstoffmoleküls zur Bildung von Aggregaten auf der Oberfläche von Proteinen genommen werden. Für Farbstoffmole küle wird es daher angestrebt, daß sie eine minimale Neigung haben, in wäßrigen Salzlösungen Aggregate zu bilden. Die Werte der Fig. 2 zeigen, daß ein bestimmter arylsulfonier ter Farbstoff selbst bei hohen Konzentrationen in wäßriger Salzlösung nur eine niedrige Neigung hat, Aggregate zu bil den.

Die Fig. 1 zeigt das Monomer-Absorptionsspektrum und das Dimer-Absorptionsspektrum eines typischen Cyanin-Farbstoffs, gelöst in einem wäßrigen Puffer. Der zur Erzeugung dieser Spektren verwendete Farbstoff, N,N'-Di-sulfobutyl-indodicarbo cyanin, weist keine Arylsulfonatgruppen auf und bildet selbst bei Konzentrationen im submillimolaren Bereich leicht Dimere. Das Dimer-Spektrum wurde aus den Spektren des Farbstoffs bei verschiedenen Konzentrationen errechnet (vgl. die Methode von West und Pearce, 1965). Bei einer 3 mM-Konzentration in einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung waren die Absorptio nen der Monomer- und Dimerbanden etwa gleich.

Das Spektrum des verbesserten Sulfoindodicarbocyanins, N,N'- Diethyl-indodicarbocyanin-5,5'-disulfonsäure, ist in Fig. 2 gezeigt. Dieser Farbstoff zeigte bei Konzentrationen bis zu 10 mM kein Anzeichen einer Aggregation in der Kochsalz lösung.

Üblicherweise wird die Wirksamkeit, mit der sich ein bestimm ter reaktiver Farbstoff an ein Protein, beispielsweise einen Antikörper, kuppelt, unter definierten Reaktionsbedingungen bestimmt. Der getestete Farbstoff war der Bis-N-hydroxysuccin imidester von N,N'-Di-carboxypentyl-indodicarbocyanin-5,5'- disulfonsäure. Die Fig. 3 zeigt, daß dieser aktive Sulfocyanin-Farbstoff-Ester sich wirksam mit Schaf-Immunoglobulin in einem Carbonat-Puffer bei einem pH-Wert von 9,2 umsetzt, wodurch kovalent markierte Antikörpermoleküle gebildet wer den, die ein Molverhältnis von Farbstoff zu Antikörper im Bereich von weniger als 1 bis mehr als 20, je nach den rela tiven Farbstoff- und Antikörperkonzentrationen, in der Reak tionslösung haben. Die Neigung der linearen kleinsten Qua drate der Werte zeigen, daß unter diesen Bedingungen die Mar kierungswirksamkeit dieses Farbstoffs etwa 80% ist. Bei ähn lichen Untersuchungen setzte sich Fluorescein-isothiocyanat (FITC) mit einer Wirksamkeit von etwa 20% um.

Die Reaktivität des aktiven Esters des neuen Sulfoindodicarbo cyanin-Farbstoffs wurde dadurch untersucht, daß Schaf-Immuno globulin (IgG) markiert wurde. Das Protein (4 mg/ml) wurde in 0,1 m Carbonat-Puffer (pH = 9,2) aufgelöst. Aliquote Teile des reaktiven Farbstoffs, gelöst in wasserfreiem Dimethyl formamid, wurden zu den Proteinproben gegeben, um die ursprüng lichen Molverhältnisse Farbstoff : Protein zu ergeben. Nach 30 Minuten wurde das Protein von dem unkonjugierten Farbstoff durch Gel-Permeationschromatographie (Sephadex G-50) abge trennt. Die resultierenden Molverhältnisse Farbstoff : Protein wurden spektrophotometrisch bestimmt, und sie sind in Fig. 3 dargestellt.

Bei niedrigen Verhältnissen von Farbstoff zu Protein zeigen die Absorptionsspektren der markierten Proteine Banden, die eng den Spektren des freien monomeren Farbstoffs entsprechen. Bei Antikörpermolekülen, die stark markiert worden sind (hohe Verhältnisse Farbstoff : Protein) oder die mit Farbstof fen mit großer Neigung zur Aggregation in wäßrigen Lösungen markiert worden sind, wird oft festgestellt, daß sie neue Absorptionspeaks haben, die bei kürzeren Wellenlängen erschei nen als die Absorptionsbanden des monomeren Farbstoffs in wäßriger Lösung. Die Wellenlänge des neuen Absorptionspeaks fällt häufig in einen Bereich, der für das Dimer-Absorptions spektrum des Farbstoffs charakteristisch ist (vgl. Fig. 1).

Stärker markierte Antikörper haben höhere Verhältnisse von kurzen zu langen Wellenlängen-Absorptionspeaks. Dieser kür zere Wellenlängen-Absorptionspeak kann in Fig. 4 bei ungefähr 590 nm gesehen werden. Der längere Wellenlängenpeak (bei 645 nm) in Fig. 4 ist auf monomere Farbstoffmoleküle zurückzuführen, die an den Antikörper gebunden sind. Das Markierungs-Reagens, das verwendet wurde, um das Antikörper-Absorptionsspektrum in Fig. 4 herzustellen (der Bis-N-hydroxysuccinimidester von N,N'-Di-sulfobutyl-indodicarbocyanin-5,5'-essigsäure) besitzt keine Arylsulfonatgruppen und bildet leicht in wäßrigen Salz lösungen und auf Antikörpern, mit denen er umgesetzt worden ist, Dimere. Von entscheidender Bedeutung ist es, daß die Fluoreszenz-Anregungsspektren dieser Antikörper zeigen, daß die Anregung der markierten Antikörper beim kurzen Wellen längenpeak nicht proportional so viel Fluoreszenz erzeugt wie es bei einer Anregung beim längeren Wellenlängenpeak der Fall ist. Diese Beobachtung steht in Übereinstimmung mit der Idee, daß der kürzere Wellenlängen-Absorptionspeak auf die Bildung von nichtfluoreszierenden Dimeren und Aggregaten auf den Antikörpermolekülen zurückzuführen ist.

Es wurde gefunden, daß das zum Erhalt der Werte der Fig. 3 verwendete Markierungs-Reagens, bestehend aus einem Aryl sulfonat-Cyanin-Farbstoff, auf den Antikörpermolekülen nicht ohne weiteres aggregiert. Dies ergibt sich aus dem erheblich kleineren Absorptionspeak bei Wellenlängen, bei denen charak teristischerweise Dimere absorbieren (vgl. Fig. 5). Dies ist deswegen von Wichtigkeit, weil Antikörper und andere Pro teine, die mit diesen "nichtaggregierenden" Markierungs-Rea gentien markiert worden sind, stärker fluoreszierende markierte Proteine ergeben sollten. Tatsächlich ergeben die Aryl sulfocyanine selbst dann glänzend fluoreszierende Antikör per, wenn das mittlere Verhältnis Farbstoff pro Antikörper relativ hoch ist (vgl. Fig. 6).

Schaf-Immunoglobulin (IgG), das mit einem Carboxyindodicarbo cyanin-Farbstoff markiert worden ist, ist in Fig. 4 gezeigt. Die Fig. 5 zeigt das Protein, das mit dem neuen Sulfiindo dicarbocyanin-Farbstoff konjugiert worden ist. Die Anwesen heit von erhöhtem Dimeren (vgl. Fig. 1) in der erstgenann ten Probe ist offensichtlich. Obgleich das Molverhältnis Farbstoff : Protein bei beiden Präparaten ungefähr gleich war, war das in Fig. 5 dargestellte Protein erheblich stärker fluoreszierend als die in Fig. 4 gezeigte Probe.

Um glänzende bzw. hell fluoreszierende Antikörper oder ande re Proteine, die mit Fluoreszenz-Farbstoffen markiert worden sind, zu erhalten, ist es von Wichtigkeit, daß die mittlere Quantenausbeute pro Farbstoffmolekül auf dem Protein so hoch wie möglich ist. Es ist allgemein festgestellt worden, daß, wenn die Oberflächendichte der Farbstoffmoleküle auf dem Protein zunimmt (d. h., wenn das Verhältnis von Farbstoff zu Protein zunimmt), dann die mittlere Quantenausbeute der Farb stoffe vermindert wird. Dieser Effekt ist manchmal dem Aus löschen zugeschrieben worden, das als Ergebnis einer Farb stoff-Farbstoff-Wechselwirkung auf der Oberfläche von stärker markierten Proteinen stattfindet. Die Bildung von nicht fluoreszierenden Dimeren auf Proteinoberflächen kann mit Sicherheit zu diesem Auslöschen beitragen. Die Fig. 6 zeigt, daß die mittlere Quantenausbeute eines Arylsulfocyanin-Farb stoffs langsam abnimmt, wenn das Farbstoff/Protein-Verhält nis zunimmt (Kurve mit Diamantensymbolen). Demgegenüber zeigt die Kurve mit den runden Symbolen, daß eine sehr rasche Abnahme der mittleren Quantenausbeute für das Konjugat eines Nicht-Arylsulfocyanin-Farbstoffs (N,N'-Di-sulfobutyl-indodi carbocyanin-5-isothiocyanat) stattfindet, wenn das Farb stoff/Protein-Verhältnis zunimmt. Daher ergibt der in Fig. 6 gezeigte Sulfocyanin-Farbstoff stärker glänzend fluoreszie rende Antikörper als der andere Farbstoff, und zwar insbeson dere im Markierungsbereich von 1 bis 10 Farbstoffmolekülen pro Antikörpermolekül.

Die mittlere Fluoreszenz-Quantenausbeute der einzelnen Farb stoffmoleküle auf den markierten Proteinen ist ein Maß des von diesen Biomolekülen erhältlichen Fluoreszenzsignals. Werte von Schaf-Immunoglobulin (IgG), das mit dem neuen Sulfoindo dicarbocyanin-Farbstoff in phosphatgepufferter Kochsalzlösung markiert worden war, sind in der Kurve mit Diamantensymbolen der Fig. 6 gezeigt. Die Kurve mit runden Symbolen der Fig. 6 zeigt Proteine, die mit einem reaktiven Indodicarbocyanin isothiocyanat-Farbstoff zum Vergleich markiert worden sind. In Fig. 6 stellen die Quantenausbeuten bei einem Verhältnis Farbstoff/Protein von Null die Werte für die Methylamin-Adduk te der reaktiven Farbstoffe (freier Farbstoff) im Puffer dar.

Hintergrund-Verfahren

Lumineszenz-Sonden sind wertvolle Reagentien für die Analyse und Trennung von Molekülen und Zellen und für die Erfassung und quantitative Bestimmung von anderen Materialien. Eine sehr kleine Anzahl von lumineszierenden Molekülen kann unter optimalen Umständen erfaßt werden. Barak und Webb sehen weni ger als 50 Fluoreszenz-Lipid-Analoge im Zusammenhang mit der LDL-Rezeption von Zellen unter Verwendung einer SIT-Kamera, J. Cell. Biol. 90: 595-605 (1981). Die Fließ-Cytometrie kann dazu verwendet werden, um weniger als 10.000 Fluoresceinmole küle zu erfassen, die mit Teilchen oder bestimmten Zellen assoziiert sind (Muirhead, Horan und Poste, Bio/Technology 3: 337-356 (1985)). Einige spezielle Beispiele für die Anwen dung von Fluoreszenz-Sonden sind (1) die Identifizierung und Trennung von Subpopulationen von Zellen in einem Gemisch von Zellen durch die Techniken der Fluoreszenz-Fließ-Cytometrie, der Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung und der Fluores zenz-Mikroskopie; (2) die Bestimmung der Konzentration einer Substanz, die sich an eine zweite Art bindet (zum Bei spiel Antigen-Antikörper-Reaktionen), bei der Technik des Fluoreszenz-Immunoassays; (3) die Lokalisierung von Substan zen in Gelen und anderen unlöslichen Trägern durch die Tech niken der Fluoreszenz-Anfärbung. Diese Techniken werden von Herzenberg et al., "Cellular Immunology", 3. Auflage, Kapi tel 22; Blackwell Scientific Publications, 1978 (Fluoreszenz aktiviertes Zellsortieren); und von Goldman, "Fluorescence Antibody Methods", Academic Press, New York, 1968 (Fluores zenz-Mikroskopie und Fluoreszenz-Anfärbung); und in "Appli cations of Fluorescence in the Biomedical Sciences", heraus gegeben von Taylor et al., Alan Liss Inc., 1986, beschrieben.

Bei der Verwendung von Fluoreszenzmitteln für die obigen Zwecke bestehen hinsichtlich der Wahl des Fluoreszenzmittels viele Beschränkungen. Eine Beschränkung besteht in den Ab sorptions- und Emissionseigenschaften des Fluoreszenzmittels, da viele Liganden, Rezeptoren und Materialien in der Test probe, zum Beispiel Blut, Urin, Cerebrospinal-Flüssigkeit, fluoreszieren und die genaue Bestimmung der Fluoreszenz der fluoreszierenden Probe stören. Diese Erscheinung wird als Autofluoreszenz oder Hintergrund-Fluoreszenz bezeichnet. Ein weiterer Gesichtspunkt ist die Fähigkeit des Fluoreszenzmit tels, mit Liganden und Rezeptoren und anderen biologischen und nichtbiologischen Materialien zu konjugieren, und der Effekt einer solchen Konjugation auf das Fluoreszenzmittel. In vielen Situationen kann die Konjugierung an ein anderes Molekül zu einer wesentlichen Veränderung der Fluoreszenz- Eigenschaften des Fluoreszenzmittels führen und in manchen Fällen sogar die Quantenleistung des Fluoreszenzmittels we sentlich zerstören oder vermindern. Es ist auch möglich, daß die Konjugierung mit dem Fluoreszenzmittel die Funktion des zu markierenden Moleküls inaktiviert. Eine dritte Erwägung liegt in der Quantenleistung des Fluoreszenzmittels, die für eine empfindliche Erfassung hoch sein sollte. Eine vierte Erwägung ist die Lichtabsorptionsfähigkeit oder der Extink tionskoeffizient des Fluoreszenzmittels, der so groß wie möglich sein sollte. Von Wichtigkeit ist auch, ob sich die Fluoreszenzmoleküle miteinander umsetzen, wenn sie sich in enger Nähe befinden, was zu einem Selbstauslöschen führen würde. Eine weitere Befürchtung geht dahin, ob eine nicht spezifische Bindung des Fluoreszenzmittels an andere Verbin dungen oder Behälterwände entweder selbst oder in Verbindung mit der Verbindung, an die das Fluoreszenzmittel konjugiert wird, erfolgt.

Die Anwendbarkeit und der Wert der obenbeschriebenen Methoden sind eng an die Verfügbarkeit von geeigneten fluoreszierenden Verbindungen gekoppelt. Insbesondere besteht ein Bedarf an fluoreszierenden Substanzen, die in dem längeren Wellenlängen bereich des sichtbaren Bereichs (Gelb bis nahes Infrarot) emittieren, da die Anregung dieser Chromophoren weniger Auto fluoreszenz und auch vielfache Chromophoren ergibt, die bei verschiedenen Wellenlängen fluoreszieren, die gleichzeitig analysiert werden können, wenn die gesamten sichtbaren und die nahen Infrarotbereiche des Spektrums verwendet werden kön nen. Fluorescein, eine weit verwendete fluoreszierende Ver bindung, ist eine geeignete Emissionsverbindung im grünen Bereich, obgleich bei bestimmten Immunoassays und Zellanaly sensystemen die Hintergrund-Autofluoreszenz, welche durch An regung bei Fluorescein-Absorptionswellenlängen erzeugt wird, die Empfindlichkeit der Erfassung beschränkt. Jedoch hat sich das herkömmliche rotfluoreszierende Markierungsmittel Rhodamin als weniger wirksam als Fluorescein erwiesen. Texas rot® ist ein geeignetes Markierungsmittel, das bei 578 nm angeregt werden kann und maximal bei 610 nm fluoresziert.

Phycobiliproteine haben einen wichtigen Beitrag wegen ihres hohen Extinktionskoeffizienten und der hohen Quantenausbeute gemacht. Diese Chromophor enthaltenden Proteine können ko valent an viele Proteine gebunden werden, und sie werden in Fluoreszenz-Antikörper-Assays in der Mikroskopie und der Fließ-Cytometrie verwendet. Die Phycobiliproteine haben je doch folgende Nachteile: (1) die Protein-Markierungsverfah rensweise ist relativ komplex; (2) die Protein-Markierungs leistung ist gewöhnlich nicht hoch (typischerweise ein Mit tel von 0,5 Phycobiliprotein-Moleküle pro Protein); (3) das Phycobiliprotein ist ein Naturprodukt, und seine Herstellung und Reinigung ist komplex; (4) die Phycobiliproteine sind teuer; (5) es sind keine Phycobiliproteine als Markierungs- Reagentien verfügbar, die weiter zum roten Bereich des Spek trums als Allophycocyanin fluoreszieren, welches maximal bei 680 nm fluoresziert; (6) die Phycobiliproteine sind chemisch relativ instabil; (7) sie sind leicht einer Photobleichung unterworfen; (8) die Phycobiliproteine sind große Proteine mit Molekulargewichten im Bereich von 33.000 bis 240.000, und sie sind größer als viele Materialien, die markiert werden sollen, wie Metabolite, Arzneimittel, Hormone, derivatisier te Nucleotide und viele Proteine mit Einschluß von Antikör pern. Der letztgenannte Nachteil ist von besonderer Wichtig keit, da Antikörper, Avidin, DNA-Hybridisierungs-Sonden, Hor mone und kleine Moleküle, die mit den großen Phycobilipro teinen markiert sind, nicht dazu imstande sein können, sich an ihre Targets wegen sterischer Begrenzungen zu binden, die durch die Größe des konjugierten Komplexes auferlegt werden. Die Bindungsrate von Konjugaten an Targets ist gegenüber niedermolekularen Konjugaten langsam.

Durch andere Techniken, wie Histologie, Cytologie, Immunoassays, würden auch erhebliche Vorteile durch die Verwendung eines Fluoreszenzmittels mit hoher Quanteneffizienz, Absorptions- und Emissionseigenschaften bei längeren Wellenlängen und mit einfacher Durchführung der Konjugierung, die von einer nichtspezifischen Interferenz im wesentlichen frei sind, er fahren.

Die erfindungsgemäßen reaktiven fluoreszierenden arylsul fonierten Cyanin- und damit verwandte Farbstoffe mit relativ großen Extinktionskoeffizienten und hohen Quantenausbeuten werden zum Zwecke der Erfassung und quantitativen Bestimmung von markierten Komponenten verwendet.

Fluoreszierende Cyanin- und damit verwandte Farbstoffe kön nen zur Markierung von biologischen Materialien, wie Antikör pern, Antigenen, Avidin, Streptavidin, Proteinen, Peptiden, derivatisierten Nucleotiden, Kohlenhydraten, Lipiden, bio logischen Zellen, Bakterien, Viren, Blutzellen, Gewebezellen, Hormonen, Lymphokinen, biologischen Spurenmolekülen, Toxinen und Arzneimitteln, verwendet werden. Fluoreszenz-Farbstoffe können auch zur Markierung von nichtbiologischen Materialien, wie löslichen Polymeren und polymeren und Glasteilchen, Arz neimitteln, Leitern, Halbleitern, Glas- und Polymeroberflächen, Polymermembranen und anderen festen Teilchen, verwendet wer den. Die zu markierende Komponente kann auch in einem Gemisch mit anderen Materialien vorliegen. Das Gemisch, in dem die Markierungsreaktion stattfindet, kann ein flüssiges Gemisch, insbesondere ein wäßriges Gemisch, sein. Die Erfassungsstufe kann mit dem Gemisch in flüssigem oder trockenem Zustand, beispielsweise einem Objektträger, durchgeführt werden.

Erfindungsgemäß ist es erforderlich, daß Cyanin-Farbstoffe durch die Einarbeitung einer reaktiven Gruppe in das Cyanin molekül modifiziert werden. Diese reaktive Gruppe heftet sich kovalent an ein Ziel- bzw. Targetmolekül, vorzugsweise an eine Amin- oder Hydroxystelle, und in manchen Fällen an eine Sulfhydryl- oder Aldehydstelle. Die Erfindung verwendet auch die Modifizierung oder Verwendung von Cyanin- und damit verwandten Farbstoffstrukturen, um ihre Löslichkeit in der Testflüssigkeit zu erhöhen, um (1) ihre Handhabung bei Markierungsreaktionen leichter zu machen, (2) die Aggregation des Farbstoffs auf der Oberfläche der zu markierenden Pro teine zu verhindern helfen und (3) die nichtspezifische Bin dung von markierten Materialien an biologische Materialien und an Oberflächen und die Assayvorrichtung zu verhindern helfen.

Die Cyanin- und die damit verwandten Farbstoffe bieten einen wichtigen Vorteil über derzeit verfügbare fluoreszierende Markierungs-Reagentien. Zum ersten sind Cyanin- und damit verwandte Farbstoffe synthetisiert worden, die in einem Bereich des Spektrums von 400 bis nahezu 1100 nm absorbieren und emittieren. Somit können reaktive Derivate dieser Farb stoffe für Assays hergestellt werden, die eine gleichzeitige Messung einer Anzahl von markierten Materialien erfordern. Die Vielfarben-(oder Multiparameter-)analyse dieser Art kann im Interesse der Einfachheit, der Kostenwirksamkeit oder zur Bestimmung von Verhältnissen von verschiedenen markier ten Arten auf jedem Teilchen in einem komplexen Gemisch von Teilchen zweckmäßig sein (zum Beispiel der Verhältnisse von Antigen-Markern auf individuellen Blutzellen in einem kom plexen Gemisch durch Multiparameter-Fließ-Cytometrie oder Fluoreszenz-Mikroskopie). Zum zweiten absorbieren und fluores zieren viele Cyanin- und damit verwandte Farbstoffe stark. Zum dritten sind viele Cyanin- und damit verwandte Farbstoffe relativ photostabil, und sie bleichen nicht ohne weiteres im Fluoreszenz-Mikroskop. Zum vierten können Cyanin- und damit verwandte Derivate hergestellt werden, die einfache und wirksame Kupplungs-Reagentien sind. Zum fünften sind vie le Strukturen und synthetische Verfahrensweisen verfügbar, und die Klasse der Farbstoffe ist vielfältig. Es können da her viele Strukturmodifikationen durchgeführt werden, um die Reagentien mehr oder weniger wasserlöslich zu machen. Ihre Ladung kann verändert werden, so daß sie das Molekül nicht stören, an das sie angefügt sind, wodurch die nicht spezifische Bindung reduziert werden kann. Zum sechsten sind im Gegensatz zu den Phycobiliproteinen die Cyanin-Farb stoffe relativ klein (Molekulargewicht = 1000), so daß sie nicht nennenswerterweise mit der Fähigkeit des markierten Moleküls sterisch interferieren, ihre Bindungsstelle rasch zu erreichen oder ihre Funktion auszuüben.

Somit bringen Cyanin-Farbstoff-Markierungsmittel viele po tentielle Vorteile mit sich. Diese Farbstoffe können dazu verwendet werden, um ein oder mehrere Komponenten in einer Flüssigkeit, insbesondere einer wäßrigen Flüssigkeit, selek tiv zu markieren. Die markierten Komponenten können sodann durch optische oder Lumineszenzmethoden erfaßt werden. Alter nativ kann die markierte Komponente dazu verwendet werden, um eine zweite Komponente anzufärben, für die sie eine starke Affinität besitzt. Die Anwesenheit der zweiten Komponente wird sodann durch optische oder Lumineszenzmethoden festge stellt. In diesem Fall wird der Farbstoff mit einer Amin-, Hydroxy-, Aldehyd- oder Sulfhydrylgruppe auf der markierten Komponente umgesetzt. So kann beispielsweise die markierte Komponente ein Antikörper sein, und die angefärbte Komponen te, für die sie eine starke Affinität hat, kann eine biolo gische Zelle, ein Antigen oder ein Hapten oder eine biologi sche Zelle oder ein Teilchen, das das genannte Antigen oder Hapten enthält, sein. Gemäß einem weiteren Beispiel ist die markierte Komponente Avidin, und die angefärbte Komponente kann ein biotinyliertes Material sein. Auch können Lectine, die mit Polymethin-Cyanin-Farbstoffen konjugiert sind, dazu verwendet werden, um spezielle Kohlenhydratgruppen zu erfas sen und quantitativ zu bestimmen. Weiterhin können Lumines zenz-Cyanin- und damit verwandte Farbstoffe an Fragmente von DNA oder RNA angeheftet werden. Die markierten Fragmen te von DNA oder RNA können als Fluoreszenz-Hybridisierungs sonden verwendet werden, um das Vorhandensein und die Menge von spezifischen komplementären Nucleotid-Sequenzen in Proben, die DNA oder RNA enthalten, zu identifizieren. Auch kann der Farbstoff an ein Hormon oder an einen Liganden (zum Beispiel ein Hormon, ein Protein, ein Peptid, ein Lymphokin, einen Metaboliten); angefügt werden, das bzw. der danach an einen Rezeptor angefügt wird.

Für andere Zwecke in Patentschriften beschriebene reaktive Cyanin-Farbstoffe

Gemäß den US-PSen 4 337 063 (Miraha et al.), 4 404 289, 4 405 711 und 4 414 325 (Masuda et al.) ist eine Vielzahl von Cyanin-Farbstoffen synthetisiert worden, die aktive N-Hydroxy succinimidester-Gruppen enthalten. Diese Patente zeigen, daß diese Reagentien als photographische Sensibilisatoren ver wendet werden können. Die möglichen Fluoreszenz-Eigenschaften dieser Reagentien sind in den Patenten nicht genannt. Tatsäch lich sind auch für diese Prozesse keine Fluoreszenz-Eigen schaften erforderlich. Die meisten der in diesen Patent schriften genannten Farbstoffe sind nur schwach fluoreszierend, und sie sind nicht besonders photostabil. Weiterhin sind ihre Löslichkeitseigenschaften für viele Anwendungszwecke nicht optimal, die eine Fluoreszenzerfassung von markierten Materialien beinhalten würden.

In der GB-PS 1 529 202 (Exekiel et al.) werden zahlreiche Cyanin-Farbstoffderivate beschrieben, die als kovalent rea gierende Moleküle verwendet werden. Die in diesen Reagentien verwendete reaktive Gruppe ist eine Azingruppe, zu der Mono- und Dichlortriazingruppen gehören. Diese Druckschrift be zieht sich auf die Entwicklung und die Verwendung dieser Reagentien als Sensibilisatoren für photographische Filme. Für dieses Verfahren ist keine Fluoreszenz erforderlich, und die meisten der darin beschriebenen Reagentien sind nicht fluoreszierend. Schließlich bezieht sich diese Druckschrift nicht auf die Entwicklung und Verwendung von reaktiven Cyanin-Farbstoffen zum Zwecke der Erfassung und quantitati ven Bestimmung von markierten Materialien.

Die erfindungsgemäßen lumineszierenden Cyanin- und cyaninartigen Farbstoffe können bei Methoden zum kovalenten Anheften dieser Verbindungen an biologische Materialien, nichtbiologische Materialien und Makromoleküle und Teilchen, damit diese Materialien lumineszierend markiert werden, verwendet werden. Auf diese Weise kann das markierte Material durch Lumineszenz-Erfassungsmethoden erfaßt und/oder quantitativ bestimmt werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können bei einem Verfahren zur Erfassung einer Komponente in einer Flüssigkeit verwendet werden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man zu der genannten Flüssigkeit einen Farbstoff zusetzt, der aus der Gruppe bestehend aus Cyanin-, Merocyanin- und Styryl-Farbstoffen ausgewählt ist und der in der Flüssig keit löslich ist und einen Substituenten enthält, damit er mit Amin- und Hydroxygruppen und möglicherweise mit Alde hyd- und Sulfhydrylgruppen auf der genannten Komponente ko valent reaktiv wird, so daß die genannte Komponente markiert wird. Die markierte Komponente wird sodann durch Lumineszenz- oder Lichtabsorptionsmethoden erfaßt und/oder quantitativ bestimmt. Wenn die markierte Komponente ein Antikörper, ein DNA-Fragment, ein Hormon, ein Lymphokin oder ein Arzneimittel ist, dann kann die markierte Komponente dazu verwendet wer den, um das Vorhandensein einer zweiten Komponente, an die es gebunden wird, zu identifizieren, worauf die zweite Kom ponente erfaßt und/oder quantitativ bestimmt werden kann.

Jede beliebige Lumineszenz- oder Lichtabsorptions-Erfassungs stufe kann angewendet werden. So kann beispielsweise die Erfassungsstufe eine optische Erfassungsstufe sein, bei der die Flüssigkeit mit Licht von ersten definierten Wellenlän gen bestrahlt wird. Licht mit zweiten definierten Wellen längen, das durch die markierte Komponente fluoresziert oder phosphoresziert wird, wird hierauf erfaßt. Die Erfas sung kann auch durch optische Lichtabsorption erfolgen. So kann beispielsweise die Erfassungsstufe in der Weise durch geführt werden, daß man Licht mit ersten definierten Wellen längen durch die Flüssigkeit leitet und sodann die Wellen länge des Lichts, das durch die Flüssigkeit hindurchgelassen wird, bestimmt.

Gewünschtenfalls kann die Erfassungsstufe auch eine chemische Analyse umfassen, um chemisch eine Anheftung des Cyanins oder eines verwandten Chromophors an die Komponente zu erfas sen.

Die Grundstrukturen der Cyanin-, Merocyanin- und Styryl-Farb stoffe, die modifiziert werden können, um kovalente Markie rungs-Reagentien zu erzeugen, sind nachfolgend gezeigt:

Spezifischere Beispiele von Polymethin-Cyanin-Farbstoffen sind wie folgt:

In diesen Strukturen sind
X und Y aus der Gruppe, O, S und

ausgewählt;
Z ist aus der Gruppe O und S ausgewählt und
m ist eine ganze Zahl, die aus der Gruppe bestehend aus 1, 2, 3 und 4 ausgewählt ist.

In den obigen Formeln bestimmt die Anzahl der Methingruppen zum Teil die Anregungsfarbe. Die cyclischen Azinstrukturen können auch zum Teil die Anregungsfarbe bestimmen. Oftmals tragen höhere Wert von m zu einer gesteigerten Lumineszenz und Absorption bei. Bei Werten von m oberhalb 4 wird die Verbindung instabil. Eine weitere Lumineszenz kann durch Mo difikationen der Ringstrukturen verliehen werden. Wenn m = 2, dann ist die Anregungswellenlänge etwa 650 nm, und die Ver bindung ist sehr stark fluoreszierend. Maximale Emissions wellenlängen sind im allgemeinen 15 bis 100 nm höher als die maximalen Anregungswellenlängen.

Mindestens eine, vorzugsweise nur eine und möglicherweise zwei oder mehr der genannten Gruppen R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ und R₇ in jedem Molekül ist bzw. sind eine reaktive Gruppe zur Anheftung des Farbstoffs an die markierte Komponente. Für bestimmte Reagentien kann mindestens eine der Gruppen R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ und R₇ auf jedem Molekül auch eine Gruppe sein, die die Löslichkeit des Chromophors erhöht oder die Selektivität der Markierung der markierten Komponente beein trächtigt oder die Position der Markierung der markierten Komponente durch den Farbstoff beeinträchtigt.

In den genannten Formeln umfaßt mindestens eine der genannten Gruppen R₈, R₉ (wenn vorhanden) und R₁₀ (wenn vorhanden) mindestens eine Sulfonatgruppe. Die Bezeichnung Sulfonat soll Sulfonsäure einschließen, da die Sulfonatgruppe nur eine ionisierte Sulfonsäure darstellt.

Reaktive Gruppen, die direkt oder indirekt an den Chromophor angefügt werden können, um die Gruppen R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ und R₇ zu bilden, können reaktive Gruppierungen ein schließen, beispielsweise Gruppen, die Isothiocyanat, Iso cyanat, Monochlortriazin, Dichlortriazin, Mono- oder Dihalo gen-substituiertes Pyridin, Mono- oder Dihalogen-substituier tes Diazin, Maleimid, Aziridin, Sulfonylhalogenid, Säure halogenid, Hydroxysuccinimidester, Hydroxysulfosuccinimid ester, Imidoester, Hydrazin, Azidonitrophenyl, Azid, 3-(2- Pyridyldithio)-proprionamid, Glyoxal und Aldehyd enthalten.

Spezielle Beispiele für die Gruppen R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ und R₇, die besonders gut für Markierungskomponenten mit ver fügbaren Amino-, Hydroxy- und Sulfhydrylgruppen geeignet sind, sind die folgenden Gruppen:

wobei mindestens eines von Q oder W eine Austrittsgruppe, wie I, Br, Cl, ist:

Spezielle Beispiele von Gruppen R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ und R₇, die besonders gut zum Markieren von Komponenten mit ver fügbaren Sulfhydrylgruppen geeignet sind und die in einem Zweistufen-Verfahren zur Markierung von Antikörpern verwen det werden können, sind die folgenden Gruppen:

worin Q eine Austrittsgruppe, wie I oder Br, ist:

worin n 0 oder eine ganze Zahl ist.

Spezielle Beispiele für die Gruppen R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ und R₇, die besonders gut zum Markieren von Komponenten durch lichtaktiviertes Vernetzungsverknüpfen geeignet sind, sind die folgenden Gruppen:

Zum Zwecke der Erhöhung der Wasserlöslichkeit oder der Ver minderung einer unerwünschten nichtspezifischen Bindung der markierten Komponente an ungeeignete Komponenten in der Probe oder zur Verminderung von Reaktionen zwischen zwei oder meh reren reaktiven Chromophoren auf der markierten Komponente, was zum Auslöschen der Fluoreszenz führen könnte, können die Gruppen R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ und R₇ aus den gut bekann ten polaren und elektrisch geladenen chemischen Gruppen ausgewählt werden. Beispiele hierfür sind -E-F, wobei F Hydroxy, Sulfonat, Sulfat, Carboxylat, substituiertes Amino oder quaternäres Amino ist und wobei E eine Abstandsgruppe, wie -(CH₂)_n- ist, wobei n 0, 1, 2, 3 oder 4 ist. Geeignete Beispiele sind zum Beispiel Alkylsulfonat, -(CH₂)₃SO^3⊖ und (CH₂)₄-SO^3⊖.

Die Polymethinkette der Lumineszenz-Farbstoffe gemäß der Er findung kann auch eine oder mehrere cyclische chemische Grup pen enthalten, die Brücken zwischen zwei oder mehreren der Kohlenstoffatome der Polymethinkette bilden. Diese Brücken könnten dazu dienen, die chemische oder die Photostabilität des Farbstoffs zu erhöhen, und sie könnten dazu verwendet werden, die Absorptions- und Emissionswellenlängen des Farb stoffes zu verändern oder seinen Extinktionskoeffizienten oder seine Quantenausbeute zu verändern. Verbesserte Löslich keitseigenschaften könnten durch diese Modifizierung erhal ten werden.

Erfindungsgemäß kann die markierte Komponente aus folgenden Substanzen ausgewählt werden: Antikörpern, Proteinen, Peptiden, Enzymsubstraten, Hormonen, Lymphokinen, Metaboliten, Rezep toren, Antigenen, Haptenen, Lectinen, Avidin, Streptavidin, Toxinen, Kohlenhydraten, Oligosacchariden, Polysacchariden, Nucleinsäuren, Deoxynucleinsäuren, derivatisierten Nuclein säuren, derivatisierten Deoxynucleinsäuren, DNA-Fragmenten, RNA-Fragmenten, derivatisierten DNA-Fragmenten, derivatisier ten RNA-Fragmenten, natürlichen Arzneimitteln, Virusteilchen, Bakterienteilchen, Viruskomponenten, Hefekomponenten, Blut zellen, Blutzellkomponenten, biologischen Zellen, nichtzel lulären Blutkomponenten, Bakterien, bakteriellen Komponen ten, natürlichen und synthetischen Lipidbläschen, syntheti schen Arzneimitteln, Giften, umweltverschmutzenden Stoffen, Polymeren, Polymerteilchen, Glasteilchen, Glasoberflächen, Kunststoffteilchen, Kunststoffoberflächen, Polymermembranen, Leitern und Halbleitern.

Ein Cyanin oder ein damit verwandter Chromophor kann auch hergestellt werden, der, wenn er mit einer Komponente umge setzt wird, Licht bei 633 nm absorbieren kann. In der Erfas sungsstufe kann ein Helium-Neon-Laser verwendet werden, der Licht bei dieser Wellenlänge des Spektrums emittiert. Auch kann ein Cyanin- oder damit verwandter Farbstoff hergestellt werden, der, wenn er mit einer Komponente umgesetzt wird, Licht maximal zwischen 700 nm und 900 nm absorbieren kann. In diesem Fall kann in der Erfassungsstufe eine Laserdiode verwendet werden, die Licht in diesem Bereich des Spektrums emittiert.

Selektivität

Die obenangegebenen reaktiven Gruppen sind relativ spezifisch für die Markierung bestimmter funktioneller Gruppen auf Proteinen und anderen biologischen oder nichtbiologischen Molekülen, Makromolekülen, Oberflächen oder Teilchen, voraus gesetzt, daß geeignete Reaktionsbedingungen mit Einschluß von geeigneten pH-Bedingungen angewendet werden.

Eigenschaften der reaktiven Cyanin-, Merocyanin- und Styryl- Farbstoffe und ihrer Produkte

Die Spektraleigenschaften der erfindungsgemäßen Farbstoffe werden durch die hierin beschriebene Funktionalisierung nicht nennenswert verändert. Die Spektraleigenschaften der markier ten Proteine und der anderen Verbindungen sind gleichfalls nicht sehr verschieden von denjenigen des Grund-Farbstoff moleküls, das nicht an ein Protein oder ein anderes Material konjugiert worden ist. Die hierin beschriebenen Farbstoffe haben, allein oder an ein markiertes Material konjugiert, im allgemeinen große Extinktionskoeffizienten (ε = 100.000 bis 250.000), hohe Quantenausbeuten so hoch wie 0,4 in bestimm ten Fällen, und sie absorbieren und emittieren Licht im Spektralbereich von 400 bis 900 nm. Somit sind sie von be sonderem Wert als Markierungs-Reagentien für die Lumineszenz- Erfassung.

Optische Erfassungsmethoden

Zur Erfassung bzw. Bestimmung einer markierten oder gefärbten Komponente kann jede beliebige Methode angewendet werden. Die Erfassungsmethode kann eine Lichtquelle verwenden, die das Gemisch, welches das markierte Material enthält, mit Licht mit ersten definierten Wellenlängen bestrahlt. Bekannte Vorrichtungen werden verwendet, die Licht mit zweiten Wellen längen erfassen, welches Licht durch das Gemisch hindurchge lassen worden ist oder das durch das Gemisch fluoresziert oder luminesziert wird. Solche Erfassungsvorrichtungen sind beispielsweise Fluoreszenz-Spektrometer, Absorptions-Spektro photometer, Fluoreszenz-Mikroskope, Lichtdurchlässigkeits- Mikroskope und Fließ-Cytometer, optische Fasersensoren und Immunoassay-Instrumente.

Es können auch chemische Ana lysenmethoden verwendet werden, um die Anheftung des Farb stoffs an die markierte Komponente oder die markierten Kom ponenten zu erfassen. Beispiele für chemische Analysenmethoden sind die Infrarot-Spektrometrie, die NMR-Spektrometrie, die Absorptions-Spektrometrie, die Fluoreszenz-Spektrometrie, die Massen-Spektrometrie und die Chromatographie.

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert.

Beispiel 1 Effekt des pH-Werts auf die Konjugierung von Sulfoindodicarbocyanin mit Protein

Proben von Schaf-γ-Globulin (4 mg/ml) in 0,1 m Carbonat-Puffern (pH = 8,5, 8,9 und 9,4) wurden bei Raumtemperatur mit einem 10fachen molaren Überschuß des folgenden aktiven Sulfoindo dicarbo-cyaninesters (m = 2) vermischt.

Zu geeigneten Zeitpunkten, die sich von 5 Sekunden bis 30 Mi nuten erstreckten, wurden Proteinproben von nichtkovalent angeheftetem Farbstoff durch Gel-Permeationschromatographie auf Sephadex® G-50 abgetrennt. Die maximale Markierung des Proteins erfolgte nach 10 Minuten und ergab End-Molverhältnisse von Farbstoff/Protein von 5,8, 6,4 und 8,2 für die Pro ben, die bei pH-Werten von 8,5, 8,9 bzw. 9,4 inkubiert wor den waren. Die Zeiten, die erforderlich waren, um ein Farb stoff/Protein-Verhältnis von 5 und Quantenausbeuten der Produkte bei den verschiedenen pH-Werten zu ergeben, sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt:

Diese Werte zeigen, daß die Protein-Markierung mit diesem Farbstoff bei einem pH-Wert von 9,4 besser ist als bei einem pH-Wert von unterhalb 9. In dem Puffer mit höherem pH-Wert war die Konjugierungsreaktion sehr rasch, doch war die Mar kierungswirksamkeit ausgezeichnet, und das Produkt war stärker fluoreszierend. Der Wert der Quantenausbeute gibt die mittlere Quantenausbeute pro Farbstoffmolekül auf dem mar kierten Protein wieder.

Beispiel 2 Konjugation des aktiven Sulfoindocarbocyaninesters mit Protein

Schaf-γ-Globulin (1 mg/ml), gelöst in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit einem pH-Wert von 7,4, wurde mit 0,1 m Natriumcarbonat auf einen pH-Wert von 9,4 eingestellt. Ein Cyanin-Farbstoff-Markierungsmittel (Struktur in Beispiel 1, m = 1) wurde zu aliquoten Teilen dieser Proteinlösung zu gegeben, um verschiedene Molverhältnisse von Farbstoff/Pro tein zu ergeben. Nach 30minütiger Inkubation bei Raumtempera tur wurden die Gemische durch Gel-Permeationschromatographie auf Sephadex® G-50 unter Elution mit PBS aufgetrennt. Das Molverhältnis der Farbstoffe, die kovalent an die Proteine in den Produkten angeheftet worden waren, war 1,2, 3,5, 5,4, 6,7 und 11,2 für Anfangsverhältnisse von Farbstoff/Protein von 3, 6, 12, 24 bzw. 30.

Beispiel 3 Markierung von AECM-Dextran mit einem Sulfoindo dicarbocyanin

N-Aminoethyl-carboxamidomethyl-(AECM-)Dextran mit einem Mittelwert von 16 Aminogruppen pro Dextranmolekül wurde aus Dextran mit einem mittleren MW von 70.000 synthetisiert (Inman, J. K., J. Immunol. 114: 704-709 (1975)). Ein Teil des AECM-Dextrans (1 mg/250 µl), gelöst in 0,1 m Carbonat-Puffer, mit einem pH-Wert von 9,4 wurde zu 0,2 mg des aktiven Sulfo indodicarbocyaninesters (Struktur in Beispiel 1, m = 2) gege ben, wobei ein Farbstoff/Protein-Molverhältnis von 10 erhal ten wurde. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das Dextran wurde sodann von nichtkonjugiertem Farb stoff durch Sephadex® G-50-Gel-Permeationschromatographie unter Verwendung von Ammoniumacetat (50 mM) als Elutions-Puf fer abgetrennt. Ein Durchschnitt von 2,2 Farbstoffmolekülen war kovalent an jedes Dextranmolekül gebunden.

Beispiel 4 Markierung eines spezifischen Antikörpers mit aktivem Sulfoindodicarbocyaninester

Gegen Murin IgG spezifisches Schaf-γ-Globulin (1 mg/ml) in 0,1 m Carbonat-Puffer (pH = 9,4) wurde mit dem aktiven Sulfo indodicarbocyaninester (Struktur in Beispiel 1, m = 2) mit ei nem Verhältnis von 8 Farbstoffmolekülen pro Proteinmolekül vermischt. Nach 30minütigem Inkubieren bei Raumtemperatur wur de das Markierungsgemisch durch Gelfiltration auf Sephadex® G-50, das mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH = 7,4) ins Gleichgewicht gebracht worden war, aufgetrennt. Das ge wonnene Protein enthielt einen Mittelwert von 4,5 Farbstoff molekülen, die kovalent an jedes Proteinmolekül angeheftet waren.

Beispiel 5 Anfärbung und mikroskopische Sichtbarmachung von Human- Lymphozyten mit Sulfoindodicarbocyanin-Farbstoff, der an Schaf-Anti-Maus-IgG-Antikörper kunjugiert war

Frisch isolierte periphere Blutlymphozyten wurden bei 0°C 30 Minuten lang mit Maus-Anti-β2-Mikroglobulin (0,25 µg/10⁶ Zellen) behandelt. Die Zellen wurden zweimal mit DMEM-Puffer gewaschen und sodann mit dem mit Sulfoindodicarbocyanin mar kierten Schaf-Anti-Maus-IgG-Antikörper (1 µg/10⁶ Zellen) be handelt. Nach 30minütiger Inkubierung bei 0°C wurde über schüssiger Antikörper durch Zentrifugieren der Zellen entfernt, und die Zellen wurden erneut zweimal mit DMEM-Puffer gewaschen. Aliquote Teile der Zellen wurden auf Objektträgern zur Ana lyse durch Fluoreszenz-Mikroskopie befestigt. Unter dem Mikroskop wurden die Lymphozyten auf dem Objektträger mit Licht mit 610 bis 630 nm bestrahlt, und die Fluoreszenz bei 650 bis 700 nm wurde mit einer rotempfindlichen verstärkten COHU-Fernsehkamera erfaßt, welche an einen Bilddigitalisierer und einen Fernsehmonitor angeschlossen war. Die nach dieser Methode angefärbten Zellen zeigten unter dem Mikroskop eine Fluoreszenz. In einem Kontrollexperiment wurde die Verwendung des primären Maus-Anti-β2-Mikroglobulin-Antikörpers wegge lassen, doch wurde die Färbung und die Analyse sonst wie oben beschrieben durchgeführt. Die Kontrollprobe zeigte unter dem Mikroskop keine Fluoreszenz, was darauf hinweist, daß der mit Sulfoindocyanin markierte Schaf-Anti-Maus-Antikörper keine signifikante nichtspezifische Bindung an Lymphozyten ergibt.

Claims

1. Lumineszenz-Farbstoff aus der Gruppe:
wobei
X und Y aus der Gruppe 0, S und
ausgewählt sind;
m eine ganze Zahl aus der Gruppe 1, 2, 3 und 4 ist;
mindestens eine der genannten Gruppen R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ und R₇ mindestens eine Gruppierung aus der Gruppe Isothiocyanat, Isocyanat, Monochlortriazin, Dichlortriazin, Mono- oder Dihalogen-substituiertes Pyridin, Mono- oder Di halogen-substituiertes Diacin, Maleimid, Aziridin, Sulfonyl halogenid, Säurehalogenid, Hydroxysuccinimidester, Hydroxy sulfosuccinimidester, Imidoester, Hydrazin, Azidonitrophe nyl, Azid, 3-(2-Pyridyl-dithio)-propionamid, Glyoxal und Aldehyd enthält; und wobei
mindestens eine der genannten Gruppen R₈ und R₉ minde stens eine Arylsulfonyl- oder Arylsulfonat-Gruppierung ent hält.

2. Lumineszenz-Farbstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er wasserlöslich ist.

3. Lumineszenz-Farbstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er in Wasser einen mola ren Extinktionskoeffizienten von mindestens 50.000 l pro mol.cm, eine Quantenausbeute von mindestens 2% hat und daß er im Spektralbereich von 400 bis 900 nm Licht absorbiert und emittiert.

4. Lumineszenz-Farbstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er in Wasser einen mola ren Extinktionskoeffizienten von mindestens 100.000 l pro mol.cm, eine Quantenausbeute von mindestens 10% hat und daß er im Spektralbereich von 600 bis 900 nm Licht absorbiert bzw. emittiert.

5. Lumineszenz-Farbstoff aus der Gruppe:
worin
X und Y aus der Gruppe O, S und
ausgewählt sind;
Z aus der Gruppe O und S ausgewählt ist;
m eine ganze Zahl aus der Gruppe 1, 2, 3 und 4 ist und wobei mindestens eine der Gruppen R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ und R₇ mindestens eine Gruppierung aus der Gruppe:
enthält, wobei
mindestens eines von Q oder W aus der Gruppe I, Br und Cl ausgewählt ist und n 0 oder eine ganze Zahl ist;
und wobei
mindestens eine der genannten Gruppen R₈ und R₉ (wenn vorhanden) mindestens eine Sulfonat-Gruppierung enthält.

6. Lumineszenz-Farbstoff aus der Gruppe:
wobei
X und Y aus der Gruppe O, S und
ausgewählt sind;
Z aus der Gruppe O und S ausgewählt ist;
m eine ganze Zahl aus der Gruppe 1, 2, 3 und 4 ist;
mindestens eine der Gruppen R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ und R₇ mindestens eine Gruppierung aus der Gruppe:
enthält, wobei
n 0 oder eine ganze Zahl ist; und wobei
mindestens eine der genannten Gruppen R₈, R₉, R₁₀ (wenn vorhanden) und R₁₁ (wenn vorhanden) mindestens eine Sulfon säure oder Sulfonatgruppierung enthält.

7. Lumineszenz-Farbstoff aus der Gruppe:
wobei
X und Y aus der Gruppe 0, S und
ausgewählt sind;
m eine ganze Zahl aus der Gruppe 1, 2, 3 und 4 ist;
mindestens eine der Gruppen R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ und R₇ mindestens eine Gruppierung aus der Gruppe:
enthält; und wobei
mindestens eine der Gruppen R₈ und R₉ mindestens eine Arylsulfonsäure- oder Arylsulfonat-Gruppierung enthält.

8. Lumineszenz-Farbstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der Gruppen R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ und R₇ auch Gruppierungen zur Erhöhung der Wasserlöslichkeit und zur Verminderung der nichtspezifischen Bindung enthält, wobei die Gruppierungen aus Hydroxy-, Sulfonat-, Sulfat-, Carboxylat- und substi tuierten Amin- oder quaternären Amingruppen ausgewählt sind.