DE69226989T2 - Markierter Komplex - Google Patents
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft einen markierten Komplex für die Mikroanalyse unter Anwendung von nahen Infrarotstrahlen. Die vorliegende Erfindung betrifft genauer einen markierten Komplex, der für den spezifischen Nachweis einer bestimmten besonderen Komponente in einer zusammengesetzten Mischung mit einer höheren Empfindlichkeit geeignet ist.
- Bei der Bestrahlung einer Spurensubstanz, die mit Farbstoffen und dergleichen markiert ist, mit einem Laserstrahl werden auf die Substanz zurückzuführende Informationen wie z. B. Streulicht, Lichtabsorption, Fluoreszenzlicht und ferner photoakustische Effekte erzeugt. Es ist auf dem Fachgebiet der Analyse unter Laseranwendung allgemein bekannt, daß solche Informationen nachgewiesen werden, um eine Mikroanalyse schnell und mit einer höheren Genauigkeit durchzuführen.
- Als Laserlichtquelle sind üblicherweise ausschließlich Gaslaser, für die Argonlaser und Heliumlaser stehen, angewendet worden. In den letzten Jahren sind jedoch Halbleiterlaser entwickelt worden, und wegen ihrer typischen Merkmale wie z. B. niedriger Kosten, geringer Größe und einfacher Steuerung der Ausgangsleistung ist nun die Anwendung eines Halbleiterlasers als Lichtquelle erwünscht.
- Wenn diagnostisch brauchbare Substanzen aus lebenden Organismen mittels der Wellenlänge im Ultraviolettbereich und im sichtbaren Bereich, die üblicherweise angewendet worden ist, analysiert werden, ist es wahrscheinlich, daß die Untergrundstrahlung (Leerstrahlung) zunimmt, die auf die Eigenfluoreszenz natürlich vorkommender Produkte wie z. B. Flavin, Pyridin-Coenzym und Se rumproteine, die im allgemeinen in Proben enthalten sind, zurückzuführen ist. So eine Untergrundstrahlung aus natürlich vorkommenden Produkten kann nur in dem Fall, daß eine Lichtquelle in einem nahen Infrarotbereich angewendet werden kann, ausgeschlossen werden, so daß folglich die Empfindlichkeit gegen zu messende Substanzen erhöht werden könnte.
- Die Schwingungswellenlänge eines Halbleiterlasers liegt jedoch im allgemeinen im roten Bereich und im nahen Infrarotbereich (670 bis 830 nm), wo nicht sehr viele Farbstoffe über Absorption oder Anregung Fluoreszenz erzeugen. Ein typisches Beispiel für solche Farbstoffe ist ein Polymethinfarbstoff, der eine längere konjugierte Kette hat. Von K. Sauda, T. Imasaka u. a. wird in einer Mitteilung in Anal. Chem., 58, 2649-2653 (1986), über Beispiele für die Markierung von Substanzen aus lebenden Organismen mit einem Polymethinfarbstoff und die Anwendung der markierten Substanzen zur Mikroanalyse berichtet, und zwar darüber, daß Plasmaprotein für die Analyse durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit einem Cyaninfarbstoff, der eine Sulfonatgruppe hat, (beispielsweise Indocyaningrün) markiert wird.
- In der Japanischen Offengelegten Patentanmeldung Nr. 2-191674 ist offenbart, daß verschiedene Cyaninfarbstoffe, die Sulfonsäuregruppen oder Sulfonatgruppen haben, angewendet werden, um Substanzen aus lebenden Organismen zu markieren und die Fluoreszenz nachzuweisen.
- Diese bekannten Cyaninfarbstoffe, die über Absorption oder Anregung im nahen Infrarotbereich Fluoreszenz emittieren, sind jedoch im allgemeinen unter Einwirkung von Licht oder Wärme nicht sehr stabil.
- Wenn die Farbstoffe als Markierungsmittel angewendet und zur Herstellung von Komplexen an Substanzen aus lebenden Organismen wie z. B. an Antikörper gebunden werden, ist es wahrscheinlich, daß die Komplexe durch Umwelteinflüsse wie z. B. Licht, Wärme, Feuchtigkeit, atmosphärischen Sauerstoff und dergleichen leicht oxidiert werden oder einer Modifizierung wie z. B. der Bildung einer Vernetzung unterzogen werden. Vor allem in Wasser wird ferner nachteiligerweise eine Modifizierung wie z. B. Hydrolyse beschleunigt. Infolgedessen ist die praktische Anwendung dieser Komplexe als Nachweisreagenzien bei der Durchführung der Mikroanalyse der Komponenten lebender Organismen wegen der schlechten Lagerungsbeständigkeit auf Schwierigkeiten gestoßen.
- Andererseits ist in der US-A 4 738 908 ein Aufzeichnungsmedium mit photothermischer Umwandlung für die Aufzeichnung von Informationen und die Wiedergabe der aufgezeichneten Informationen mittels eines Laserstrahls u. dgl. offenbart. Bei dem Aufzeichnungsmedium wird ein Azuleniumsalz verwendet, um die absorbierte Energie des Laserstrahls in Wärmeenergie umzuwandeln und einen Schreibvorgang durch Bildung von Löchern (Grübchen) auf der Oberfläche des Aufzeichnungsmediums durchzuführen. Es gibt jedoch weder einen Hinweis auf die Fähigkeit der beschriebenen Azuleniumverbindungen zur Bildung eines substratspezifischen Komplexes mit einem lebenden Organismus noch auf die Möglichkeit des Nachweises und der Analyse einer Zielsubstanz über so einen Komplex durch Absorption und Fluoreszenz im nahen Infrarotbereich.
- Infolgedessen sind die vorstehend erwähnten Verbindungen zur Lösung der erörterten Probleme, auf die man nach dem Stand der Technik stößt, nicht geeignet.
- Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben verschiedene Untersuchungen durchgeführt, um die vorstehend erwähnten Probleme zu lösen, und haben gefunden, daß ein Farbstoff mit einer besonderen Struktur, genauer ein bestimmter Polymethinfarbstoff, und unter anderem ein Farbstoff mit einem Azulengerüst sogar nach ihrer Immobilisierung als Markierungsmittel an Substanzen aus lebenden Organismen äußerst beständig sind. Auf diese Weise haben die Erfinder die vorliegende Erfindung gemacht. Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen markierten Kom plex mit ausgezeichneter Lagerungsbeständigkeit bereitzustellen, der die vorstehend erwähnten Probleme überwinden kann.
- Gemäß einer Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung wird ein markierter Komplex für den Nachweis einer zu analysierenden Zielverbindung durch ein optisches Mittel unter Anwendung von nahen Infrarotstrahlen bereitgestellt, wobei dieser Komplex eine Substanz aus einem lebenden Organismus und ein Markierungsmittel, das an der Substanz fixiert ist, umfaßt und an die zu analysierende Zielverbindung gebunden wird, wobei das Markierungsmittel eine Verbindung umfaßt, die durch die allgemeine Formel (I), (II) oder (III) wiedergegeben wird:
- worin R&sub1; bis R&sub7; wie in Anspruch 1 angegeben definiert sind; F&sub1; einen zweiwertigen organischen Rest und X&sub1; ein Anion bedeutet;
- worin R&sub8; bis R&sub1;&sub4; wie in Anspruch 1 angegeben definiert sind und F&sub2; einen zweiwertigen organischen Rest bedeutet;
- worin R&sub1;&sub5; bis R&sub2;&sub1; wie in Anspruch 1 angegeben definiert sind; F&sub3; einen zweiwertigen organischen Rest und X&sub1; ein Anion bedeutet.
- Gemäß einer anderen Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung wird ein markierter Komplex für den Nachweis einer zu analysierenden Zielverbindung durch ein optisches Mittel unter Anwendung von nahen Infrarotstrahlen bereitgestellt, wobei dieser Komplex eine Substanz aus einem lebenden Organismus und ein Markierungsmittel, das an der Substanz fixiert ist, umfaßt und an die zu analysierende Zielverbindung gebunden wird, wobei das Markierungsmittel eine Verbindung umfaßt, die durch die allgemeine Formel (IV) wiedergegeben wird:
- worin A, B, D und E unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Wasserstoffatom, einer substituierten oder einer unsubstituierten Alkylgruppe mit zwei oder mehr Kohlenstoffatomen, Alkenylgruppe, Aralkylgruppe, Arylgruppe und Styrylgruppe besteht; r&sub1;' und r&sub2;' einzeln aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Wasserstoffatom, einer substituierten oder einer unsubstituierten Alkylgruppe, cyclischen Alkylgruppe, Alkenylgruppe, Aralkylgruppe und Arylgruppe besteht; k 0 oder 1 ist; l 0, 1 oder 2 ist und X&sub2; ein Anion bedeutet.
- Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis einer zu analysierenden Zielverbindung durch ein optisches Mittel bereitgestellt, wobei bei diesem Verfahren ein markierter Komplex angewendet wird, der aus einer Substanz aus einem lebenden Organismus und einem Markierungsmittel, das an der Substanz fixiert ist, besteht, und der Komplex an die zu analysierende Zielverbindung gebunden wird, wobei das Markierungsmittel eine Verbindung umfaßt, die durch die allgemeine Formel (I), (II) oder (III) wiedergegeben wird.
- Gemäß noch einer weiteren Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis einer zu analysierenden Zielverbindung durch ein optisches Mittel bereitgestellt, wobei bei diesem Verfahren ein markierter Komplex angewendet wird, der aus einer Substanz aus einem lebenden Organismus und einem Markierungsmittel, das an der Substanz fixiert ist, besteht, und der Komplex an die zu analysierende Zielverbindung gebunden wird, wobei das Markierungsmittel eine Verbindung umfaßt, die durch die allgemeine Formel (IV) wiedergegeben wird.
- Fig. 1 stellt ein Beispiel für die Fluoreszenzemissions-Wellenform eines Markierungsmittels dar.
- Die vorliegende Erfindung wird nun nachstehend näher erläutert. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird als Markierungsmittel die Verbindung der allgemeinen Formel (I), (II) oder (III) verwendet, worin R&sub1; bis R&sub2;&sub1; einzeln Wasserstoffatom, Halogenatom (Chloratom, Bromatom und Iodatom) oder einen einwertigen organischen Rest und andere funktionelle Gruppen, die vorstehend beschrieben werden, bedeuten. Der einwertige organische Rest kann aus einer großen Vielfalt solcher Reste ausgewählt sein.
- Die Alkylgruppe ist eine gerade Kette oder verzweigte Kette mit einer Kohlenstoffzahl von 1 bis 12 wie z. B. Methylgruppe, Ethylgruppe, n-Propylgruppe, Isopropylgruppe, n-Butylgruppe, sek.-Butylgruppe, Isobutylgruppe, t-Butylgruppe, n-Amylgruppe, t-Amylgruppe, n-Hexylgruppe, n-Octylgruppe, t-Octylgruppe u. dgl.
- Die Arylgruppe hat eine Kohlenstoffzahl von 6 bis 20 wie z. B. Phenylgruppe, Naphthylgruppe, Methoxyphenylgruppe, Diethylaminophenylgruppe, Dimethylaminophenylgruppe u. dgl.
- Die substituierte Aralkylgruppe hat eine Kohlenstoffzahl von 7 bis 19 wie z. B. Carboxybenzylgruppe, Sulfobenzylgruppe, Hydroxybenzylgruppe u. dgl.
- Die unsubstituierte Aralkylgruppe hat eine Kohlenstoffzahl von 7 bis 19 wie z. B. Benzylgruppe, Phenethylgruppe, α-Naphthylmethylgruppe, β-Naphthylmethylgruppe u. dgl.
- Die substituierte oder unsubstituierte Aminogruppe hat vorzugsweise eine Kohlenstoffzahl von 10 oder weniger wie z. B. Aminogruppe, Dimethylaminogruppe, Diethylaminogruppe, Dipropylaminogruppe, Acetylaminogruppe, Benzoylaminogruppe u. dgl.
- Die substituierte oder unsubstituierte Styrylgruppe hat eine Kohlenstoffzahl von 8 bis 14 wie z. B. Styrylgruppe, Dimethylaminostyrylgruppe, Diethylaminostyrylgruppe, Dipropylaminostyrylgruppe, Methoxystyrylgruppe, Ethoxystyrylgruppe, Methylstyrylgruppe u. dgl.
- Die Arylazogruppe hat eine Kohlenstoffzahl von 6 bis 14 wie z. B. Phenylazogruppe, α-Naphthylazogruppe, β-Naphthylazogruppe, Dimethylaminophenylazogruppe, Chlorphenylazogruppe, Nitrophenylazogruppe, Methoxyphenylazogruppe u. dgl.
- Von den Kombinationen von R&sub1; und R&sub2;, R&sub2; und R&sub3;, R&sub3; und R&sub4;, R&sub4; und R&sub5;, R&sub5; und R&sub6; und R&sub6; und R&sub7; der allgemeinen Formel (I) kann mindestens eine Kombination einen substituierten oder einen unsubstituierten kondensierten Ring bilden. Der kondensierte Ring kann fünf-, sechs- oder siebengliedrig sein einschließlich eines aromatischen Ringes (Benzol, Naphthalin, Chlorbenzol, Brombenzol, Methylbenzol, Ethylbenzol, Methoxybenzol, Ethoxybenzol u. dgl.); eines heterocyclischen Ringes (Furanring, Benzofuranring, Pyrrolring, Thiophenring, Pyridinring, Chinolinring, Thiazolring u. dgl.) und eines aliphatischen Ringes (Dimethylen, Trimethylen, Tetramethylen u. dgl.). Dies ist bei den allgemeinen Formeln (II) und (III) der Fall.
- Bei der allgemeinen Formel (II) kann von den Kombinationen von R&sub8; und R&sub9;, R&sub9; und R&sub1;&sub0;, R&sub1;&sub0; und R&sub1;&sub1;, R&sub1;&sub1; und R&sub1;&sub2;, R&sub1;&sub2; und R&sub1;&sub3; und R&sub1;&sub3; und R&sub1;&sub4; mindestens eine Kombination einen substituierten oder einen unsubstituierten kondensierten Ring bilden.
- Ferner kann bei der allgemeinen Formel (III) von den Kombinationen von R&sub1;&sub5; und R&sub1;&sub6;, R&sub1;&sub6; und R&sub1;&sub7;, R&sub1;&sub7; und R&sub1;&sub6;, R&sub1;&sub8; und R&sub1;&sub9;, R&sub1;&sub9; und R&sub2;&sub0; und R&sub2;&sub0; und R&sub2;&sub1; mindestens eine Kombination einen substituierten oder einen unsubstituierten kondensierten Ring bilden.
- Von den vorstehend beschriebenen allgemeinen Formeln (I) bis (IV) ist vor allem die allgemeine Formel (I) vorzuziehen; einzeln werden ferner im Fall von R&sub1; bis R&sub7; Wasserstoffatom, Alkylgruppe und Sulfonatgruppe; im Fall von R&sub8; bis R&sub1;&sub4; Wasserstoffatom, Alkylgruppe und Sulfonatgruppe; im Fall von R&sub1;&sub5; bis R&sub2;&sub1; Wasserstoffatom, Alkylgruppe und Sulfonatgruppe; im Fall von A, B, D und E Alkylgruppe und Arylgruppe und im Fall von r&sub1;' und r&sub2;' Wasserstoffatom und Alkylgruppe bevorzugt.
- In der allgemeinen Formel (I) bedeutet F&sub1; einen zweiwertigen organischen Rest, der über eine Doppelbindung gebunden ist. Besondere Beispiele für eine Verbindung, die so ein F&sub1; enthält und im Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verwenden ist, umfassen diejenigen, die durch die folgenden allgemeinen Formeln (1) bis (12) wiedergegeben werden, worin Q den folgenden Azuleniumsalzkern bedeutet und die rechte Seite außer Q F&sub1; bedeutet. Azuleniumsalzkern (Q ) Allgemeine Formel
- wobei die Beziehung zwischen dem Azuleniumsalzkern, der durch Q wiedergegeben wird, und dem Azulensalzkern an der rechten Seite in der Formel (3) symmetrisch oder asymmetrisch sein kann.
- (8)
- Q CH rR&sub2;&sub4;
- tX&sub1;
- (9)
- Q CH rR&sub2;&sub5;
- tX&sub1;
- (11)
- Q CH r-C C-R&sub2;&sub4;
- In den vorstehenden Formeln (I) bis (12) bedeuten R&sub1;' bis R&sub7;' und R&sub1;" bis R7" wie im Fall von R&sub1; bis R&sub7; unabhängig Wasserstoffatom, Halogenatom, Alkylgruppe, Arylgruppe, Aralkylgruppe, Aminogruppe, Styrylgruppe, Nitrogruppe, Hydroxylgruppe, Carboxylgruppe, Cyanogruppe oder Arylazogruppe, während R&sub1;' bis R&sub7;' und R&sub1;" bis R7" unabhängig einen substituierten oder einen unsubstituierten kondensierten Ring bilden können; n ist 0, 1 oder 2; r ist eine ganze Zahl von 1 bis 8; s bedeutet 0 oder 1; und t bedeutet 1 oder 2.
- M&sub2; bedeutet eine Nichtmetallatomgruppe, die für die Vervollständigung eines stickstoffhaltigen heterocyclischen Ringes erforderlich ist.
- Besondere Beispiele für M&sub2; sind Atomgruppen, die für die Vervollständigung eines stickstoffhaltigen heterocyclischen Ringes einschließlich Pyridin, Thiazol, Benzothiazol, Naphthothiazol, Oxazol, Benzoxazol, Naphthoxazol, Imidazol, Benzimidazol, Naphthoimidazol, 2-Chinolin, 4-Chinolin, Isochinolin oder Indol erforderlich sind, und sie können durch Halogenatom (Chloratom, Bromatom, lodatom u. dgl.), Alkylgruppe (Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl u. dgl.), Arylgruppe (Phenyl, Tolyl, Xylyl u. dgl.) und Aralkylgruppe (Benzyl, p-Trimethyl u. dgl.) substituiert sein.
- R&sub2;&sub2; bedeutet Wasserstoffatom, Nitrogruppe, Sulfonatgruppe, Cyanogruppe, Alkylgruppe (Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl u. dgl.) oder Arylgruppe (Phenyl, Tolyl, Xylyl u. dgl.). R&sub2;&sub3; bedeutet Alkylgruppe (Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl u. dgl.), eine substituierte Alkylgruppe (2-Hydroxyethyl, 2-Methoxyethyl, 2-Ethoxyethyl, 3-Hydroxypropyl, 3-Methoxypropyl, 3-Ethoxypropyl, 3-Chlorpropyl, 3-Brompropyl, 3-Carboxylpropyl u. dgl.), eine cyclische Alkylgruppe (Cyclohexyl, Cyclopropyl), eine Aralkylgruppe (Benzyl, 2-Phenylethyl, 3-Phenylpropyl, 3-Phenylbutyl, 4-Phenylbutyl, α-Naphthylmethyl, β-Naphthylmethyl), eine substituierte Aralkylgruppe (Methylbenzyl, Ethylbenzyl, Dimethylbenzyl, Trimethylbenzyl, Chlorbenzyl, Brombenzyl u. dgl.), eine Arylgruppe (Phenyl, Tolyl, Xylyl, α-Naphthyl, β-Naphthyl) oder eine substituierte Arylgruppe (Chlorphenyl, Dichlorphenyl, Trichlorphe nyl, Ethylphenyl, Methoxybiphenylyl, Dimethoxyphenyl, Aminophenyl, Sulfonatophenyl, Nitrophenyl, Hydroxyphenyl u. dgl.).
- R&sub2;&sub4; bedeutet eine substituierte oder eine unsubstituierte Arylgruppe oder eine Kationgruppe davon und schließt im einzelnen eine substituierte oder eine unsubstituierte Arylgruppe (Phenyl, Tolyl, Xylyl, Biphenylyl, Aminophenyl, α-Naphthyl, β-Naphthyl, Anthryl, Pyrenyl, Methoxyphenyl, Dimethoxyphenyl, Trimethoxyphenyl, Ethoxyphenyl, Diethoxyphenyl, Chlorphenyl, Dichlorphenyl, Trichlorphenyl, Bromphenyl, Dibromphenyl, Tribromphenyl, Ethylphenyl, Diethylphenyl, Nitrophenyl, Dimethylaminophenyl, Diethylaminophenyl, Dibenzylaminophenyl, Dipropylaminophenyl, Morpholinophenyl, Piperidylphenyl, Piperidinophenyl, Diphenylaminophenyl, Acetylaminophenyl, Benzoylaminophenyl, Acetylphenyl, Benzoylphenyl, Cyanophenyl, Sulfonatophenyl, Carboxylatophenyl u. dgl.) ein.
- R&sub2;&sub5; bedeutet einen heterocyclischen Ring oder eine Kationgruppe davon und schließt im einzelnen einen einwertigen heterocyclischen Ring, der von heterocyclischen Ringen wie z. B. Furan, Thiophen, Benzofuran, Thionaphthen, Dibenzofuran, Carbazol, Phenothiazin, Phenoxazin, Pyridin u. dgl. abgeleitet ist, ein.
- R&sub2;&sub6; bedeutet Wasserstoffatom, Alkylgruppe (Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl u. dgl.) oder eine substituierte oder eine unsubstituierte Arylgruppe (Phenyl, Tolyl, Xylyl, Biphenylyl, Ethylphenyl, Chlorphenyl, Methoxyphenyl, Ethoxyphenyl, Nitrophenyl, Aminophenyl, Dimethylaminophenyl, Diethylaminophenyl, Acetylaminophenyl, α-Naphthyl, β-Naphthyl, Anthryl, Pyrenyl, Sulfonatophenyl, Carboxylatophenyl u. dgl.
- In Formel (12) bedeutet Z&sub7; eine Atomgruppe, die für die Vervollständigung von Pyran, Thiapyran, Selenapyran, Telluropyran, Benzopyran, Benzothiapyran, Benzoselenapyran, Benzotelluropyran, Naphthopyran, Naphthothiapyran, Naphthoselenapyran oder Naphthotelluropyran erforderlich ist.
- L&sub7; bedeutet Schwefelatom, Sauerstoffatom oder Selenatom oder Telluratom.
- R&sub2;&sub7; und R&sub2;&sub8; bedeuten einzeln Wasserstoffatom, Alkoxygruppe, eine substituierte oder eine unsubstituierte Arylgruppe, Alkenylgruppe und eine heterocyclische Gruppe.
- Genauer bedeuten R&sub2;&sub7; und R&sub2;&sub8; einzeln Wasserstoffatom, Alkylgruppe (Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl u. dgl.), Alkylsulfonatgruppe, Alkoxygruppe (Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Ethoxyethyl, Methoxyethyl u. dgl.), Arylgruppe (Phenyl, Tolyl, Xylyl, Sulfonatophenyl, Chlorphenyl, Biphenylyl, Methoxyphenyl u. dgl.), eine substituierte oder eine unsubstituierte Styrylgruppe (Styryl, p-Methylstyryl, o-Chlorstyryl, p-Methoxystyryl u. dgl.), eine substituierte oder eine unsubstituierte 4-Phenyl-1,3-butadienylgruppe [4-Phenyl-1,3-butadienyl, 4-(p-Methylphenyl)-1,3- butadienyl u. dgl.] oder eine substituierte oder eine unsubstituierte heterocyclische Gruppe (Chinolyl, Pyridyl, Carbazolyl, Furyl u. dgl.).
- Wie im Fall von F&sub1; gilt dasselbe für F&sub2; und F&sub3; der allgemeinen Formel (II) bzw. (III).
- Bei F&sub2; entsprechen dann die Symbole R&sub8;' bis R&sub1;&sub4;' einzeln R&sub1;' bis R&sub7;' und entsprechen R&sub8;" bis R&sub1;&sub4;" einzeln R&sub1;" bis R7"; bei F&sub3; entsprechen R&sub1;&sub5;' bis R&sub2;&sub1;' einzeln R&sub1;' bis R&sub7; und entsprechen R&sub1;&sub5;" bis R&sub2;&sub1;" einzeln R&sub1;" bis R&sub7;".
- Von den Azuleniumkernen der vorstehend beschriebenen Formeln (1) bis (12) werden diejenigen, die durch die Formeln (3), (9) und (10) wiedergegeben werden, mehr bevorzugt verwendet, wobei vor allem die Formel (3) vorzuziehen ist.
- R&sub1; bis R&sub2;&sub8;, R&sub1;' bis R&sub2;&sub1;' und R&sub1;" bis R&sub2;&sub1;" enthalten vorzugsweise eine oder mehr als eine bekannte polare Gruppe, damit einer Verbindung (Markierungsmittel), die durch die allgemeine Formel (I), (II) oder (III) wiedergegeben wird, Wasserlöslichkeit verliehen wird. Die polaren Gruppen schließen beispielsweise Hydroxylgruppe, Alkylhydroxylgruppe, Sulfonatgruppe, Alkylsulfonatgruppe, Carboxylatgruppe, Alkylcarboxylatgruppe, Tetraammoniumbase u. dgl. ein. R&sub1; bis R&sub2;&sub8;, R&sub1;' bis R&sub2;&sub1;' und R&sub1;" bis R&sub2;&sub1;" enthalten vorzugsweise eine oder mehr als eine bekannte reaktive Gruppe, damit die Verbindung der allgemeinen Formel (I) mit einer Substanz aus einem lebenden Organismus eine kovalente Bindung bilden kann.
- Die reaktiven Gruppen schließen die reaktiven Stellen von Isocyanat, Isothiocyanat, Succinimidester, Sulfosuccinimidester, Imidester, Hydrazin, Nitroarylhalogenid, Piperidindisulfid, Maleinimid, Thiophthalimid, Säurehalogenid, Sulfonylhalogenid, Aziridin, Azidnitrophenyl, Azidamino, 3-(2-Pyridyldithio)-propionamid u. dgl. ein. In diesen reaktiven Stellen können die folgenden Abstandsgruppen eingefügt sein:
- (n = 0, 1 bis 6), um eine sterische Behinderung der Bindung eines Markierungsmittels und einer Substanz aus einem lebenden Organismus zu verhindern.
- Solche reaktiven Gruppen schließen vorzugsweise Isothiocyanat, Sulfosuccinimidester, Succinimidester, Maleinimid u. dgl. ein. X&sub1; bedeutet ein Anion und schließt Chloridion, Bromidion, Iodidion, Perchloration, Benzolsulfonation, p-Toluolsulfonation, Methylsulfation, Ethylsulfation, Propylsulfation, Tetrafluoroboration, Tetraphenylboration, Hexafluorophosphation, Benzolsulfinsäuresalzion, Acetation, Trifluoracetation, Propionation, Benzoation, Oxalation, Succination, Malonation, Oleation, Stearation, Citration, Monohydrogendiphosphation, Dihydrogenmonophosphation, Pentachlorostannation, Chlorsulfonation, Fluorsulfonation, Trifluormethansulfonation, Hexafluoroantimonation, Molybdation, Wolframation, Titanation, Zirkonation u. dgl. ein.
- Besondere Beispiele für diese Markierungsmittel werden in Tabellen 1, 2 und 3 veranschaulicht, jedoch sind sie nicht darauf eingeschränkt.
- Das Verfahren zur Synthese dieser Azulenfarbstoffe wird in US- PS 4 738 908 beschrieben. Tabelle 1
- *G: allgemeine Formel Tabelle 1 (Fortsetzung)
- *G: allgemeine Formel Tabelle 1 (Fortsetzung)
- *G: allgemeine Formel Tabelle 2
- *G: allgemeine Formel Tabelle 3
- *G: allgemeine Formel Tabelle 3 (Fortsetzung)
- *G: allgemeine Formel Tabelle 1 (Fortsetzung)
- G: allgemeine Formel
- Diese als Beispiele erwähnten Markierungsmittel absorbieren Licht in einem nahen Infrarot-Wellenlängenbereich von 670 bis 900 nm, und der molare Absorptionskoeffizient liegt im Bereich von 50.000 bis 300.000 l/mol · cm. Die als Beispiele erwähnten Markierungsmittel schließen die ein, die starke Fluoreszenz erzeugen.
- Tabelle 4 zeigt jeweils von den Markierungsmitteln, die im Wellenlängenbereich des Halbleiterlasers Fluoreszenz erzeugen, die Wellenlänge maximaler Absorption (λmax) und die Wellenlänge maximaler Fluoreszenz (λem) (Medium: Ethanol/Dichlormethan = 1/4). Tabelle 4
- Fig. 1 zeigt die Fluoreszenzemissions-Wellenform beim Auftreffen eines Halbleiterlaserstrahls (10 mW) von 830 nm auf das Markierungsmittel Nr. 3. Das Meßgerät ist IMUC-7000, hergestellt von Otsuka Electron Co., Ltd.
- In Fig. 1 zeigt Kurve A die Wellenform des auftreffenden Halbleiterlaserstrahls. Kurve B zeigt die Fluoreszenzemissions-Wellenform des Markierungsmittels Nr. 3.
- Das Markierungsmittel, das im Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verwenden ist, ist alternativ eine Verbindung der allgemeinen Formel (IV), worin A, B, D und E einzeln Wasserstoffatom oder Alkylgruppe (beispielsweise Ethylgruppe, n-Propylgruppe, Isopropylgruppe, n-Butylgruppe, sek.-Butylgruppe, Isobutylgrup pe, t-Butylgruppe, n-Amylgruppe, t-Amylgruppe, n-Hexylgruppe, n-Octylgruppe, t-Octylgruppe u. dgl.) und zusätzlich andere Alkylgruppen wie z. B. eine substituierte Alkylgruppe [beispielsweise 2-Hydroxyethylgruppe, 3-Hydroxypropylgruppe, 4-Hydroxybutylgruppe, 2-Acetoxyethylgruppe, Carboxymethylgruppe, 2-Carboxyethylgruppe, 3-Carboxypropylgruppe, 2-Sulfoethylgruppe, 3-Sulfopropylgruppe, 4-Sulfobutylgruppe, 3-Sulfatpropylgruppe, 4-Sulfatbutylgruppe, N-(Methylsulfonyl)-carbamylmethylgruppe, 3- (Acetylsulfamyl)-propylgruppe, 4-(Acetylsulfamyl)-butylgruppe u. dgl.], cyclische Alkylgruppen (beispielweise Cyclohexylgruppe), Allylgruppe (CH&sub2;=CH-CH&sub2;-), Alkenylgruppe (Vinylgruppe, Propenylgruppe, Butenylgruppe, Pentenylgruppe, Hexenylgruppe, Heptenylgruppe, Octenylgruppe, Dodecenylgruppe, Prenylgruppe u. dgl.), Aralkylgruppe (beispielsweise Benzylgruppe, Phenethylgruppe, α-Naphthylmethylgruppe, β-Naphthylmethylgruppe u. dgl.), eine substituierte Aralkylgruppe (beispielsweise Carboxybenzylgruppe, Sulfobenzylgruppe, Hydroxybenzylgruppe u. dgl.), eine substituierte oder eine unsubstituierte Arylgruppe (beispielsweise Phenylgruppe, Aminophenylgruppe, Naphthylgruppe, Tolylgruppe, Xylylgruppe, Methoxyphenylgruppe, Dimethoxyphenylgruppe, Trimethoxyphenylgruppe, Ethoxyphenylgruppe, Dimethylaminophenylgruppe, Diethylaminophenylgruppe, Dipropylaminophenylgruppe, Dibenzylaminophenylgruppe, Diphenylaminophenylgruppe, Sulfonatophenylgruppe, Carboxylatophenylgruppe u. dgl.) oder eine substituierte oder eine unsubstituierte Styrylgruppe [beispielsweise Styrylgruppe, Methoxystyrylgruppe, Dimethoxystyrylgruppe, Trimethoxystyrylgruppe, Ethoxystyrylgruppe, Aminostyrylgruppe, Dimethylaminostyrylgruppe, Diethylaminostyrylgruppe, Dipropylaminostyrylgruppe, Dibenzylaminostyrylgruppe, Diphenylaminostyrylgruppe, 2,2-Diphenylvinylgruppe, 2-Phenyl-2-methylvinylgruppe, 2-(Dimethylaminophenyl)-2-phenylvinylgruppe, 2- (Diethylaminophenyl)-2-phenylvinylgruppe, 2-(Dibenzylaminophenyl)-2-phenylvinylgruppe, 2,2-Bis(diethylaminophenyl)vinylgruppe, 2,2-Bis(methoxyphenyl)vinylgruppe, 2,2-Bis(ethoxyphenyl)vinylgruppe, 2-(Dimethylaminophenyl)-2-methylvinylgruppe, 2-(Diethylaminophenyl)-2-ethylvinylgruppe u. dgl.] bedeuten.
- r&sub1;' und r&sub2;' bedeuten einzeln Wasserstoffatom oder Alkylgruppe (beispielsweise Methylgruppe, Ethylgruppe, n-Propylgruppe, Isopropylgruppe, n-Butylgruppe, sek.-Butylgruppe, Isobutylgruppe, t-Butylgruppe, n-Amylgruppe, t-Amylgruppe, n-Hexylgruppe, n-Octylgruppe, t-Octylgruppe u. dgl.) und zusätzlich andere Alkylgruppen wie z. B. eine substituierte Alkylgruppe [beispielsweise 2-Hydroxyethylgruppe, 3-Hydroxypropylgruppe, 4-Hydroxybutylgruppe, 2-Acetoxyethylgruppe, Carboxymethylgruppe, 2-Carboxyethylgruppe, 3-Carboxypropylgruppe, 2-Sulfoethylgruppe, 3-Sulfopropylgruppe, 4-Sulfobutylgruppe, 3-Sulfatpropylgruppe, 4-Sulfatbutylgruppe, N-(Methylsulfonyl)-carbamylmethylgruppe, 3- (Acetylsulfamyl)-propylgruppe, 4-(Acetylsulfamyl)-butylgruppe u. dgl.]; cyclische Alkylgruppen (beispielweise Cyclohexylgruppe), Allylgruppe (CH&sub2;=CH-CH&sub2;-), Alkenylgruppe (Vinylgruppe, Propenylgruppe, Butenylgruppe, Pentenylgruppe, Hexenylgruppe, Heptenylgruppe, Octenylgruppe, Dodecenylgruppe, Prenylgruppe u. dgl.), Aralkylgruppe (beispielsweise Benzylgruppe, Phenethylgruppe, α-Naphthylmethylgruppe, β-Naphthylmethylgruppe u. dgl.) und eine substituierte Aralkylgruppe (beispielsweise Carboxybenzylgruppe, Sulfobenzylgruppe, Hydroxybenzylgruppe u. dgl.).
- A, B, D, r&sub1;' und r'&sub2; enthalten vorzugsweise eine oder mehr als eine bekannte polare Gruppe, damit dem Markierungsmittel (Farbstoff) der allgemeinen Formel (IV) Wasserlöslichkeit verliehen wird. Die polaren Gruppen schließen beispielsweise Hydroxylgruppe, Alkylhydroxylgruppe, Sulfongruppe, Alkylsulfongruppe, Carboxylgruppe, Alkylcarboxylgruppe, Tetraammoniumbase u. dgl. ein. A, B, D, r&sub1;' und r&sub2;' enthalten vorzugsweise eine oder mehr als eine bekannte reaktive Gruppe, damit das Markierungsmittel der allgemeinen Formel (IV) mit einer Substanz aus einem lebenden Organismus eine kovalente Bindung bilden kann.
- Die reaktiven Gruppen schließen die reaktiven Stellen von Isocyanat, Isothiocyanat, Succinimidester, Sulfosuccinimidester, Imidester, Hydrazin, Nitroarylhalogenid, Piperidindisulfid, Maleinimid, Thiophthalimid, Säurehalogenid, Sulfonylhalogenid, Aziridin, Azidnitrophenyl, Azidamino, 3-(2-Pyridyldithio)-pro pionamid u. dgl. ein. In diesen reaktiven Stellen können die folgenden Abstandsgruppen eingefügt sein:
- (n 0, 1 bis 16), um eine sterische Behinderung der Bindung eines Markierungsmittels und einer Substanz aus einem lebenden Organismus zu verhindern.
- Solche reaktiven Gruppen schließen vorzugsweise Isothiocyanat, Sulfosuccinimidester, Succinimidester, Maleinimid u. dgl. ein.
- In der allgemeinen Formel (IV) ist k 0 oder 1 und ist l 1 oder 2.
- X&sub2; bedeutet ein Anion und schließt Chlorion, Bromion, Iodion, Perchloration, Benzolsulfonation, p-Toluolsulfonation, Methylsulfation, Ethylsulfation, Propylsulfation, Tetrafluoroboration, Tetraphenylboration, Hexafluorophosphation, Benzolsulfinsäureion, Acetation, Trifluoracetation, Propionation, Benzoation, Oxalation, Succination, Malonation, Oleation, Stearation, Citration, Monohydrogendiphosphation, Dihydrogenmonophosphation, Pentachlorostannation, Chlorsulfonation, Fluorsulfonation, Trifluormethansulfonation, Hexafluoroantimonation, Molybdation, Wolframation, Titanation, Zirkonation u. dgl. ein.
- Besondere Beispiele für diese Markierungsmittel werden in Tabelle 5 veranschaulicht, jedoch sind sie nicht darauf eingeschränkt. Tabelle 5 Tabelle 5 (Fortsetzung) Tabelle 5 (Fortsetzung) Tabelle 5 (Fortsetzung) Tabelle 5 (Fortsetzung)
- Diese als Beispiele erwähnten Markierungsmittel absorbieren Licht in einem nahen Infrarot-Wellenlängenbereich von 670 bis 900 nm, und der molare Absorptionskoeffizient liegt im Bereich von 50.000 bis 300.000 l/mol · cm. Einige der als Beispiele erwähnten Markierungsmittel erzeugen intensive Fluoreszenz.
- Der in Tabelle 5 erwähnte Farbstoff Nr. 30 zeigt die maximale Absorption bei einer Wellenlänge von 819 nm im nahen Infrarotbereich und emittiert Fluoreszenz. Die Wellenlänge maximaler Fluoreszenz (λem) beträgt 864 nm (Medium: Dichlormethan).
- Die vorstehend beschriebenen Markierungsmittel werden gemäß der vorliegenden Erfindung an einer Substanz aus einem lebenden Organismus immobilisiert, jedoch wird die Substanz aus einem lebenden Organismus, an denen sie zu immobilisieren sind, selektiv auf Basis einer zu analysierenden Substanz oder einer Zielprobe festgelegt, d. h., wenn eine Substanz aus einem lebenden Organismus gewählt wird, die eine biologische Spezifität gegenüber einer Zielprobe hat, kann die zu analysierende Substanz mit Spezifität nachgewiesen werden. Mit dem Ausdruck "Substanz aus einem lebenden Organismus" sind natürlich vorkommende oder synthetische Peptide, Proteine, Enzyme, Zucker, Lectine, Viren, Bakterien, Nucleinsäuren, DNA, RNA, Antigene (einschließlich z. B. rekombinanter Antigene), Antikörper u. dgl. gemeint. Die Substanzen, die bezüglich der klinischen Pathologie besonders brauchbar sind, schließen die folgenden ein: Immunoglobulin wie z. B. IgG, IgM, IgE u. dgl.; Plasmaproteine und Antikörper davon wie z. B. Komplemente, CRP, Ferritin, α1-Mikroglobulin, β2-Mikroglobulin u. dgl.; Tumormarker und Antikörper davon wie z. B. α-Fötoprotein, carcinoembryonales Antigen (CEA), saure Phosphatase der Prostata (PAP), CA19-9, CA-125 u. dgl.; Hormone und Antikörper davon wie z. B. luteinisierendes Hormon (LH), follikelstimulierendes Hormon (FSH), Choriongonadotropin (hCG), Östrogen, Insulin u. dgl.; Substanzen, die mit Virusinfektion in Verbindung stehen, und Antikörper davon wie z. B. mit HBV in Verbindung stehende Antigene (HBs, HBe, HBc), HIV, ATL u. dgl.; Bakterien und Antikörper davon wie z. B. Corynebacterium diphteriae, Clostridium botulinum, Mycoplasma, Treponema pallidum u. dgl.; Protozoen und Antikörper davon wie z. B. Toxoplasma gondii, Trichomonas, Leishmania, Tripanozoma, Malaria-Protozoen u. dgl.; Arzneimittel und Antikörper davon wie z. B. Antiepileptika einschließlich Phenytoin, Phenobarbital u. dgl., Kreislaufmittel einschließlich Chinidin und Digoxin, Antiasthmatika einschließlich Theophyllin, Antibiotika einschließlich Chloramphenicol und Gentamycin; außerdem Enzyme, Enterotoxin (Streptolysin O) und die Antikörper davon. Eine Substanz, die eine Antigen-Antikörper-Reaktion mit einer zu messenden Substanz in einer Probe eingehen kann, wird für die Anwendung in Abhängigkeit von der Art der Probe zweckmäßig gewählt.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das folgende bekannte Verfahren angewendet werden, um ein Markierungsmittel an einer Substanz aus einem lebenden Organismus wie z. B. einer physiologisch aktiven Substanz zu immobilisieren.
- Als Beispiele werden i) das Ionenbindungsverfahren, ii) das physikalische Absorptionsverfahren, iii) das kovalente Bindungsverfahren u. dgl. erwähnt.
- Bei dem Ionenbindungsverfahren wird ein Markierungsmittel, das hauptsächlich eine positive Ladung hat, elektrostatisch an eine Substanz aus einem lebenden Organismus wie z. B. Proteine, DNA, RNA u. dgl. gebunden.
- Bei dem physikalischen Absorptionsverfahren wird die hydrophobe Bindung zwischen dem lipophilen Teil eines Markierungsmittels und dem lipophilen Teil eines Proteins ausgenutzt.
- Gemäß dem Ionenbindungsverfahren und dem physikalischen Absorptionsverfahren ist der Reaktionsprozeß der Bindung einfach, jedoch ist in diesem Fall die Bindungsfestigkeit zwischen einem Markierungsmittel und einer Substanz aus einem lebenden Organismus schwach.
- Im Gegensatz dazu wird bei dem kovalenten Bindungsverfahren eine hochreaktive funktionelle Gruppe an ein Markierungsmittel und/oder an eine Substanz aus einem lebenden Organismus gebunden, und die beiden werden durch die funktionelle Gruppe kovalent aneinander gebunden, wodurch eine sehr starke Bindungsfestigkeit erzeugt werden kann. Bei der Bindung eines Markierungsmittels an eine Substanz aus einem lebenden Organismus wie z. B. physiologisch aktive Substanzen über kovalente Bindungen schließen die funktionellen Gruppen, die in der Substanz aus einem lebenden Organismus vorhanden sind und die an dem Bindungsvorgang beteiligt sein können, freie Aminogruppen, Hydroxylgruppen, Phosphatgruppen, Carboxylgruppen, die Sulfhydrylgruppe von Cystein, die Imidazolgruppe von Histidin, die Phenolgruppe von Tyrosin, die Hydroxylgruppe von Serin und Threonin u. dgl. ein.
- Diese funktionellen Gruppen reagieren mit verschiedenen Diazoniumsalzen, Säureamiden, Isocyanat, aktiven halogenierten Alkylgruppen, aktiven Estergruppen u. dgl. Farbstoffe können infolgedessen durch verschiedene Verfahren an einer Substanz aus einem lebenden Organismus immobilisiert werden, indem diese funktionellen Gruppen in ein Markierungsmittel eingeführt werden. Alternativ wird die Konformation einer Substanz aus einem lebenden Organismus, vor allem die von Proteinen, leicht geschädigt, weil sie durch verhältnismäßig schwache Bindungen wie z. B. Wasserstoffbindung, hydrophobe Bindung, Ionenbindung u. dgl. aufrechterhalten wird. Die Immobilisierung mit einem Markierungsmittel sollte deshalb vorzugsweise unter milden Bedingungen ohne Behandlung mittels hoher Temperaturen, starker Säuren und starker Alkalien durchgeführt werden.
- Ein Verfahren zur Durchführung der Immobilisierung unter milden Bedingungen umfaßt die Verwendung bifunktioneller Vernetzungsmittel, die mit einem Markierungsmittel und mit den funktionellen Gruppen einer Substanz aus einem lebenden Organismus reagieren. Die bifunktionellen Vernetzungsmittel umfassen beispielsweise Carbodiimid, das durch die allgemeine Formel R-N=C=N-R' wiedergegeben wird, Dialdehyd, der durch die allgemeine Formel CHO-R-CHO wiedergegeben wird, Diisocyanat, das durch O=C=N-R-N=C=O wiedergegeben wird, (worin R und R' einzeln dieselben oder ver schiedene substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppen, Arylgruppen, Alkylarylgruppen oder Arylalkylgruppen bedeuten) u. dgl.
- Es folgt nun eine Beschreibung der Analyse einer bestimmten besonderen Zielsubstanz durch Verwendung des resultierenden markierten Komplexes, bei dem ein Markierungsmittel an einer Substanz aus einem lebenden Organismus immobilisiert ist.
- Wenn eine Zielverbindung (Analysengegenstand) eine Zellart ist, wird der markierte Komplex durch eine spezifische Bindung wie z. B. eine Bindung, die auf eine Antigen-Antikörper-Reaktion zurückzuführen ist, oder die Wasserstoffbindung zwischen Nucleinsäuren an eine spezifische Substanz an der Zelle, die zu der in dem markierten Komplex gebundenen Substanz aus einem lebenden Organismus komplementär ist, gebunden. Die Menge so eines Antigens oder Antikörpers oder solcher Nucleinsäuren kann dann auf Basis der Fluoreszenz oder der Absorption des Systems gemessen werden.
- Wenn die Analyse einer Zielverbindung im Zusammenhang mit einem Antigen und einem Antikörper durchgeführt wird, werden ein Komplex, bei dem das Markierungsmittel an ein Antigen (oder an einen Antikörper) gebunden ist, und ein zu messender Antikörper (oder ein zu messendes Antigen, wenn ein Markierungsmittel an dem Antikörper immobilisiert ist) einer Antigen-Antikörper-Reaktion unterzogen. Der Komplex (B; gebundener Typ), der an den Antikörper (das Antigen) gebunden worden ist, wird dann von dem Komplex (F; freier Typ), der nicht an den Antikörper (das Antigen) gebunden worden ist, abgetrennt (B/F-Trennung). Danach wird die Menge des Komplexes (B) auf Basis der Fluoreszenz oder der Absorption ermittelt. Das Verfahren, bei dem die vorstehend beschriebene Antigen-Antikörper-Reaktion angewendet wird, ist in "Examination and Technology", Bd. 16, Nr. 7 (1988), näher beschrieben.
- Außerdem ist es im Hinblick auf die Nachweisempfindlichkeit vorzuziehen, daß zwei oder mehr und vorzugsweise 10 oder mehr Moleküle eines Markierungsmittels an ein Molekül einer Substanz aus einem lebenden Organismus gebunden werden. Im Hinblick auf Synthese und Empfindlichkeit können vorzugsweise 10 bis 100 und insbesondere 20 bis 50 Moleküle so eines Mittels an ein Molekül davon gebunden werden.
- Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf Beispiele erläutert.
- Antihuman-CRP-Schafserum (IgG-Fraktion; hergestellt durch Cooper Biomedical Inc.) wurde mit Phosphatpuffer (pH 8,0) auf eine Konzentration von 0,5 mg/ml verdünnt, um eine Antikörperlösung herzustellen. Zu 8 ml der Antikörperlösung wurden 0,2 mg des Markierungsmittels Nr. 3 von Tabelle 1 (λmax = 833 nm) und 0,09 g 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimidhydrochlorid (nachstehend als WSC bezeichnet) (hergestellt durch Dojin Chemicals, Co.) hinzugegeben, um eine dreistündige Reaktion bei Raumtemperatur durchzuführen, wobei ein Markierungsmittel-Antikörper- Komplex erzeugt wurde. Der Markierungsmittel-Antikörper-Komplex wurde durch Gelchromatographie an einer mit Sepharose 6B gefüllten Säule von nicht umgesetzten Substanzen abgetrennt und gereinigt. Das Bindungs-Molverhältnis des Markierungsmittels und des Antikörpers in dem auf diese Weise erhaltenen Komplex betrug 2,1 : 1. Das Absorptionsmaß des Komplexes wurde durch Anwendung eines Spektralphotometers (Shimadzu UV-3100S) getrennt bei den Wellenlängen λ = 833 nm und λ = 280 nm gemessen, um das Molverhältnis des Markierungsmittels und des Antikörpers zu berechnen.
- Lectin Concanavalin A (hergestellt durch E. Y. Laboratories Co. Ltd.) wurde mit Phosphatpuffer (pH 8,2) auf eine Konzentration von 0,2 mg/ml verdünnt, um eine Lectinlösung herzustellen.
- 0,2 mg des Markierungsmittels Nr. 6 von Tabelle 1 (λmax = 825 nm) wurden drei Stunden lang bei Raumtemperatur mit 10 ml der Lec tinlösung zur Reaktion gebracht. Der Markierungsmittel-Lectin- Komplex wurde an einer mit Sepharose 6B gefüllten Gelchromatographiesäule abgetrennt und gereinigt. Das Molverhältnis des Markierungsmittels und des Lectins in dem erhaltenen Komplex betrug 3,7 : 1. Das Absorptionsmaß wurde mit einem Spektralphotometer (Shimadzu UV-3100S) bei den Wellenlängen λ = 825 nm und λ = 280 nm gemessen, um das Molverhältnis des Markierungsmittels und des Lectins zu berechnen.
- Monoklonaler Antihuman-HCG-Antikörper (hergestellt durch ZyMED Lab. Inc.) wurde mit phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS) (pH 7,2) auf eine Konzentration von 0,2 mg/ml verdünnt, um eine Lösung eines monoklonalen Antikörpers herzustellen.
- Zu 8 ml der Antikörperlösung wurden 0,3 mg des Markierungsmittels Nr. 12 von Tabelle 1 (λmax = 705 nm) hinzugegeben, worauf drei Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt wurde. Der Markierungsmittel-Antikörper-Komplex wurde durch Gelchromatographie an einer mit Sepharose 6B gefüllten Säule abgetrennt und gereinigt.
- Das Molverhältnis des Markierungsmittels und des Antikörpers in dem auf diese Weise erhaltenen Markierungsmittel-Antikörper- Komplex betrug 1,7 : 1. Das Absorptionsmaß des Komplexes wurde durch Anwendung eines Spektralphotometers (Shimadzu W-3100S) getrennt bei den Wellenlängen λ = 705 nm und λ = 280 nm gemessen, um das Molverhältnis des Markierungsmittels und des Antikörpers zu berechnen.
- M13mp18-Einzelstrang-DNA (7249 Basen) (hergestellt durch TAKARA Liquor K. K.) (0,1 mg) wurde mit 0,005 m Phosphatpuffer (pH 6) verdünnt, um eine DNA-Lösung herzustellen. Das in Tabelle 1 gezeigte Markierungsmittel Nr. 5 (0,1 mg) (λmax = 796 nm) wurde in 5 ml destilliertem Wasser gelöst, und anschließend wurden zu der erhaltenen Farbstofflösung nach und nach tropfenweise 5 ml der DNA-Lösung hinzugegeben. Es wurde 2 Stunden lang weiter bei Raumtemperatur gerührt, wobei ein DNA-Markierungsmittel-Komplex hergestellt wurde.
- Der Lösung des vorstehend beschriebenen DNA-Markierungsmittel- Komplexes wurden ferner 40 ml Ethanol zugesetzt, um den DNA- Markierungsmittel-Komplex auszufällen. Der DNA-Markierungsmittel- Komplex wurde auf einem Filter abgetrennt, worauf Waschen mit Ethanol folgte. Der DNA-Markierungsmittel-Komplex wurde nach dem Waschen wieder in 2 ml des Phosphatpuffers (pH 6) gelöst. Die Menge des an DNA gebundenen Markierungsmittels betrug 0,5 ug pro ug DNA. Das Absorptionsmaß des Komplexes wurde getrennt bei den Wellenlängen λ = 705 nm und λ = 280 nm gemessen, um die Konzentrationen des Markierungsmittels und der DNA zu berechnen.
- Ein 20-mer-Oligonucleotid mit einer Basensequenz, die zu der Basensequenz einer Modell-Zielnucleinsäure (M13mp18-ss-DNA) partiell komplementär war, wurde mit einem DNA-Synthesegerät (381 A, hergestellt durch ABI Co. Ltd.) synthetisiert. Dann wurde unter Verwendung eines N-MMT-Hexanolamin-Linkers (hergestellt durch Milligen Co. Ltd.) anstelle von allgemeinen Amididreagenzien ein primäres Amin in den 5'-Terminus des Oligonucleotids eingeführt. Es wurde eine vorgeschriebene Verfahrensweise befolgt, um das Herausschneiden aus dem CPG-Träger, die Abspaltung von Schutzgruppen (einschließlich der Abspaltung der Monomethoxytritylgruppe als Schutzgruppe des primären Amins) und die Reinigung durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie durchzuführen.
- Nach dem Zusammenmischen von 200 ug des Oligonucleotids, 100 ul eines 1 m Natriumcarbonatpuffers (pH 9,0) und 700 ul Wasser wurden nach und nach unter Rühren 2 mg des in Tabelle 1 gezeigten Markierungsmittels Nr. 27 (λmax = 826 nm), die vorher in 200 ul Dimethylformamid gelöst worden waren, zugesetzt. Nach der 24- stündigen Reaktion bei Raumtemperatur hatte der Peak der Nucleinsäure auf einem Hochleistungsflüssigkeitschromatogramm abgenommen, während sich ein neuer Peak mit den Absorptionen der Nucleinsäure und des Markierungsmittels entwickelt hatte. Die Reaktionslösung wurde daher an einer Gelchromatographiesäule (NAP-50, hergestellt durch Pharmacia) annähernd gereinigt und dann durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gereinigt, wobei 175 ug des Nucleinsäure-Markierungsmittel-Komplexes erhalten wurden.
- Nachstehend ist die chemische Struktur eines bekannten Cyaninfarbstoffs (NK-1967, hergestellt durch Nippon Photosensitive Dye Research Institute), der Absorption im nahen Infrarotbereich zeigt, dargestellt:
- 0,3 mg des Cyaninfarbstoffs wurden zu 5 ml der in Beispiel 1 hergestellten Antikörperlösung hinzugegeben und 3 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, wobei ein Markierungsmittel-Antikörper-Komplex erzeugt wurde.
- Der Markierungsmittel-Antikörper-Komplex wurde durch Gelchromatographie an einer mit Sepharose 6B gefüllten Säule abgetrennt und gereinigt.
- Das Molverhältnis des Markierungsmittels und des Antikörpers betrug 1,7 : 1. Das Absorptionsmaß wurde mit einem Spektralphotometer (Shimadzu UV-3100S) bei den Wellenlängen λ = 747 nm und λ = 280 nm gemessen, um das Molverhältnis des Markierungsmittels und des Antikörpers zu berechnen.
- Zur Untersuchung der Lagerungsbeständigkeit der Komplexe wurden die folgenden Versuche durchgeführt.
- Die in Beispielen 1 bis 5 und Vergleichsbeispiel 1 hergestellten markierten Komplexe wurden mit 0,01 m Phosphatpuffer (pH 7,2) in festgelegten Konzentrationen hergestellt. Die Lösungen der markierten Komplexe wurden drei Tage lang im Dunklen bei 7ºC gehalten. Am Anfang und am Ende der Untersuchung der Lagerungsbeständigkeit der Komplexe wurde das Absorptionsmaß bei festgelegten Wellenlängen gemessen, um das Verhältnis des Absorptionsmaßes am Ende zu berechnen, und zwar unter der Voraussetzung, daß das Absorptionsmaß am Anfang als 100 festgesetzt wurde.
- Bei den Komplexen, die Fluoreszenz zeigten, wurde das Verhältnis der Intensität der Fluoreszenz am Ende unter der Voraussetzung berechnet, daß die Intensität der Fluoreszenz am Anfang als 100 festgesetzt wurde.
- Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6 - Lagerungsbeständigkeit markierter Komplexe
- * Das anfängliche Absorptionsmaß wurde als 100 festgesetzt.
- ** Die anfängliche Fluoreszenz wurde als 100 festgesetzt.
- Wie in Tabelle 6 gezeigt ist, zeigten die markierten Komplexe der vorliegenden Erfindung eine geringere Änderung des Absorptionsmaßes oder der Intensität der Fluoreszenz in Wasser als der markierte Komplex des Vergleichsbeispiels.
- Antihuman-CRP-Schafserum (IgG-Fraktion; hergestellt durch Cooper Biomedical Inc.) wurde mit PBS (pH 7,2) auf eine Konzentration von 0,5 mg/ml verdünnt, um eine Antikörperlösung herzustellen. Zu 8 ml der Antikörperlösung wurden 0, 2 mg des Markierungsmittels Nr. 29 von Tabelle 5 (λmax = 819 nm) und 0,09 g WSC hinzugegeben, um eine dreistündige Reaktion bei Raumtemperatur durchzuführen, wobei ein Farbstoff-Antikörper-Komplex erzeugt wurde. Der Farbstoff-Antikörper-Komplex wurde durch Gelchromatographie an einer mit Sepharose 6B gefüllten Säule von nicht umgesetzten Substanzen abgetrennt und gereinigt. Das Molverhältnis des Farbstoffs und des Antikörpers in dem auf diese Weise erhaltenen Komplex betrug 2,5 : 1. Das Absorptionsmaß des Komplexes wurde durch Anwendung eines Spektralphotometers (Shimadzu UV-3100S) getrennt bei den Wellenlängen λ = 819 nm und λ = 280 nm gemessen, um das Molverhältnis des Farbstoffs und des Antikörpers zu berechnen.
- Monoklonaler Antihuman-HCG-Antikörper (hergestellt durch ZyMED Lab. Inc.) wurde mit PBS auf eine Konzentration von 0,4 mg/ml verdünnt, um eine Lösung eines monoklonalen Antikörpers herzustellen. Zu 2 ml der Lösung eines monoklonalen Antikörpers wurden 0,3 mg des Farbstoffs Nr. 32 von Tabelle 5 (λmax = 825 nm) und 0,10 g Woodward-Reagenz (hergestellt durch Tokyo Chemicals Co. Ltd.) hinzugegeben, um eine dreistündige Reaktion bei Raumtemperatur durchzuführen. Der Farbstoff-Antikörper-Komplex wurde durch Gelchromatographie an einer mit Sepharose 6B gefüllten Säule abgetrennt und gereinigt. Das Molverhältnis des Farbstoffs und des Antikörpers in dem auf diese Weise erhaltenen Farbstoff-Antikörper-Komplex betrug 3,1 : 1. Das Absorptionsmaß des Komplexes wurde durch Anwendung eines Spektralphotometers (Shimadzu UV-3100S) getrennt bei den Wellenlängen λ = 825 nm und λ = 280 nm gemessen, um das Molverhältnis des Farbstoffs und des Antikörpers zu berechnen.
- Lectin Concanavalin A (hergestellt durch E. Y. Laboratories Co. Ltd.) wurde mit PBS auf eine Konzentration von 0,2 mg/ml verdünnt, um eine Lectinlösung herzustellen. 0,2 mg des Farbstoffs Nr. 40 von Tabelle 5 (λmax = 805 nm) und 10 ml eines 0,05 m Natriumboratpuffers (pH 8,0), der 1% Glutaraldehyd enthielt, wurden eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit 10 ml der Lectinlösung zur Reaktion gebracht. Der Farbstoff-Lectin-Komplex wurde an einer mit Sepharose 6B gefüllten Gelchromatographiesäule abgetrennt und gereinigt. Das Molverhältnis des Farbstoffs und des Lectins in dem erhaltenen Komplex betrug 1,7 : 1. Das Absorptionsmaß wurde mit einem Spektralphotometer (Shimadzu UV-3100S) bei den Wellenlängen λ = 805 nm und λ = 280 nm gemessen, um das Molverhältnis des Farbstoffs und des Lectins zu berechnen.
- M13mp18-Einzelstrang-DNA (7249 Basen) (hergestellt durch TAKARA Liquor K. K.) (0,1 mg) wurde mit 0,005 m Phosphatpuffer (pH 6) verdünnt, um eine DNA-Lösung herzustellen. Der in Tabelle 5 gezeigte Farbstoff Nr. 35 (0,1 mg) (λmax = 780 nm) wurde in 2 ml Ethanol gelöst, und anschließend wurden zu der erhaltenen Farbstofflösung nach und nach unter Rühren tropfenweise 5 ml der DNA-Lösung hinzugegeben. Es wurde 2 Stunden lang weiter bei Raumtemperatur gerührt, wobei ein DNA-Farbstoff-Komplex hergestellt wurde.
- Der Lösung des vorstehend beschriebenen DNA-Farbstoff-Komplexes wurden ferner 40 ml Ethanol zugesetzt, um den DNA-Farbstoff- Komplex auszufällen. Der DNA-Farbstoff-Komplex wurde auf einem Filter abgetrennt, worauf mehrmaliges Waschen mit Ethanol folg te. Der DNA-Farbstoff-Komplex wurde nach dem Waschen wieder in 2 ml des Phosphatpuffers (pH 6) gelöst. Die Menge des an DNA gebundenen Farbstoffs betrug 0,5 ug pro DNA. Das Absorptionsmaß des Komplexes wurde getrennt bei den Wellenlängen λ = 780 nm und λ = 260 nm gemessen, um die Konzentrationen des Farbstoffs und der DNA zu berechnen.
- Ein 20-mer-Oligonucleotid mit einer Basensequenz, die zu der Basensequenz einer Modell-Zielnucleinsäure (M13mp18-ss-DNA) partiell komplementär war, wurde mit einem DNA-Synthesegerät (381 A, hergestellt durch ABI Co. Ltd.) synthetisiert. Dann wurde unter Verwendung eines N-MMT-Hexanolamin-Linkers (hergestellt durch Milligen Co. Ltd.) anstelle von allgemeinen Amididreagenzien ein primäres Amin in den 5'--Terminus des Oligonucleotids eingeführt. Es wurde eine vorgeschriebene Verfahrensweise befolgt, um das Herausschneiden aus dem CPG-Träger, die Abspaltung von Schutzgruppen (einschließlich der Abspaltung der Monomethoxytritylgruppe als Schutzgruppe des primären Amins) und die Reinigung durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie durchzuführen.
- Nach dem Zusammenmischen von 200 ug des Oligonucleotids, 100 ul eines 1 m Natriumcarbonatpuffers (pH 9,0) und 700 ul Wasser wurden nach und nach unter Rühren 2 mg des in Tabelle 5 gezeigten Farbstoffs Nr. 46 (λmax = 810 nm), die vorher in 200 ul Dimethylformamid gelöst worden waren, zugesetzt. Nach der 24stündigen Reaktion bei Raumtemperatur hatte der Peak der Nucleinsäure auf einem Hochleistungsflüssigkeitschromatogramm abgenommen, während sich ein neuer Peak mit den Absorptionen der Nucleinsäure und des Farbstoffs entwickelt hatte. Die Reaktionslösung wurde daher an einer Gelchromatographiesäule (NAP-50, hergestellt durch Pharmacia) annähernd gereinigt und dann durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gereinigt, wobei 175 ug des Nucleinsäure-Farbstoff-Komplexes erhalten wurden.
- Zur Untersuchung der Lagerungsbeständigkeit von Farbstoffkomplexen wurden die folgenden Versuche durchgeführt.
- Die in Beispielen 6 bis 10 hergestellten markierten Farbstoffkomplexe wurden mit 0,01 m Phosphatpuffer (pH 7,2) in festgelegten Konzentrationen hergestellt. Die Lösungen der markierten Komplexe wurden drei Tage lang im Dunklen bei 7ºC gehalten. Am Anfang und am Ende der Untersuchung der Lagerungsbeständigkeit der Komplexe wurde das Absorptionsmaß bei festgelegten Wellenlängen gemessen. Dann wurde das Verhältnis des Absorptionsmaßes am Ende unter der Voraussetzung berechnet, daß das Absorptionsmaß am Anfang als 100 festgesetzt wurde.
- Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt. Tabelle 7 - Lagerungsbeständigkeit markierter Farbstoffkomplexe
- Wie in Tabelle 7 gezeigt ist, zeigten die markierten Farbstoffkomplexe der vorliegenden Erfindung eine geringere Änderung des Absorptionsmaßes in Wasser als der markierte Komplex des Vergleichsbeispiels.
- Ein 20-mer-Oligonucleotid mit einer Basensequenz, die zu der Basensequenz einer Modell-Zielnucleinsäure (M13mp18-ss-DNA) partiell komplementär war, wurde mit einem DNA-Synthesegerät (381 A, hergestellt durch ABI Co. Ltd.) synthetisiert. Dann wurden an den 5'-Terminus des Oligonucleotids unter Verwendung eines Desoxyuridylsäurederivat-Monomers mit einer eingeführten Aminogruppe:
- anstelle von allgemeinen Amididreagenzien 20 solche Desoxyuridylsäurederivate, die jeweils eine primäre Aminogruppe hatten, angelagert. Es wurde ein Routineverfahren befolgt, um das Herausschneiden aus dem CPG-Träger, die Abspaltung von Schutzgruppen (einschließlich der Abspaltung der Trifluoracetylgruppe als Schutzgruppe des primären Amins) und die Reinigung durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie durchzuführen.
- Nach dem Zusammenmischen von 200 ug des Oligonucleotids mit den daran gebundenen primären Aminen, 100 ul eines 1 m Natriumcarbonatpuffers (pH 9,0) und 700 ul Wasser wurden nach und nach unter Rühren 5 mg des in Tabelle 1 gezeigten Farbstoffs Nr. 27 (λmax = 826 nm), die vorher in 200 ul Dimethylformamid gelöst worden waren, zugesetzt. Nach der 24stündigen Reaktion bei 40ºC hatte der Peak der Nucleinsäure auf einem Hochleistungsflüssigkeitschromatogramm abgenommen, während sich ein neuer Peak mit den Absorptionen der Nucleinsäure und des Markierungsmittels entwickelt hatte. Die Reaktionslösung wurde daher an einer Gelchromatographiesäule (NAP-50, hergestellt durch Pharmacia) annähernd gereinigt und dann durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gereinigt, wobei 350 ug des Nucleinsäure-Markierungsmittel-Komplexes erhalten wurden. Die Absorption des Nucleinsäure-Markierungsmittel-Komplexes bei 826 nm hatte etwa die 20fache Intensität der Absorption des in Beispiel 5 gezeigten Nucleinsäure-Markierungsmittel-Komplexes.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung kann durch die Bindung eines Markierungsmittels mit einer bestimmten Struktur an eine Substanz aus einem lebenden Organismus ein stabiler Komplex mit weniger Zersetzung von Farbstoffen und folglich mit einer geringeren Änderung des Absorptionsmaßes oder mit einer geringeren Änderung der Fluoreszenz gebildet werden.
- Der Komplex der vorliegenden Erfindung kann infolgedessen ein Reagenz mit ausgezeichneter Lagerungsbeständigkeit für die Verwendung zur Mikroanalyse bereitstellen.
Claims (16)
1. Markierter Komplex, der sich mit einer Zielverbindung
verbinden kann und Fluoreszenz oder Absorption zeigt, wenn der an
die Zielverbindung gebundene markierte Komplex mit naher
Infrarotstrahlung bestrahlt wird, wobei der markierte Komplex
eine Substanz aus einem lebenden Organismus und ein
Markierungsmittel, das an der Substanz immobilisiert ist, umfaßt,
dadurch gekennzeichnet, daß
das Markierungsmittel eine Verbindung umfaßt, die durch die
folgende Formel (I), (II) oder (III) wiedergegeben wird:
worin R&sub1; bis R&sub7; unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die
aus Wasserstoffatom, Halogenatom, Alkylgruppe mit einer
Kohlenstoffzahl von 1 bis 12, Arylgruppe mit einer Kohlenstoffzahl
von 6 bis 20, substituierter Aralkylgruppe mit einer
Kohlenstoffzahl von 7 bis 19, unsubstituierter Aralkylgruppe mit
einer Kohlenstoffzahl von 7 bis 19, substituierter oder
unsubstituierter Aminogruppe mit einer Kohlenstoffzahl von 10 oder
weniger, substituierter oder unsubstituierter Styrylgruppe mit
einer Kohlenstoffzahl von 8 bis 14, Arylazogruppe mit einer
Kohlenstoffzahl von 6 bis 14, Nitrogruppe, Hydroxylgruppe,
Carboxylgruppe oder Cyanogruppe besteht;
wobei von den Kombinationen von R&sub1; und R&sub2;, R&sub2; und R&sub3;, R&sub3; und
R&sub4;, R&sub4; und R&sub5;, R&sub5; und R&sub6; und R&sub6; und R&sub7; mindestens eine
Kombination einen substituierten oder unsubstituierten kondensierten
Ring bilden kann;
F&sub1; einen zweiwertigen organischen Rest bedeutet und X&sub1; ein
Anion bedeutet;
worin R&sub8; bis R&sub1;&sub4; unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die
aus Wasserstoffatom, Halogenatom, Alkylgruppe mit einer
Kohlenstoffzahl von 1 bis 12, Arylgruppe mit einer Kohlenstoffzahl
von 6 bis 20, substituierter Aralkylgruppe mit einer
Kohlenstoffzahl von 7 bis 19, unsubstituierter Aralkylgruppe mit
einer Kohlenstoffzahl von 7 bis 19, substituierter oder
unsubstituierter Aminogruppe mit einer Kohlenstoffzahl von 10 oder
weniger, substituierter oder unsubstituierter Styrylgruppe mit
einer Kohlenstoffzahl von 8 bis 14, Arylazogruppe mit einer
Kohlenstoffzahl von 6 bis 14, Nitrogruppe, Hydroxylgruppe,
Carboxylgruppe oder Cyanogruppe besteht;
wobei von den Kombinationen von R&sub8; und R&sub9;, R&sub9; und R&sub1;&sub0;, R&sub1;&sub0; und
R&sub1;&sub1;, R&sub1;&sub1; und R&sub1;&sub2;, R&sub1;&sub2; und R&sub1;&sub3; und R&sub1;&sub3; und R&sub1;&sub4; mindestens eine
Kombination einen substituierten oder unsubstituierten
kondensierten Ring bilden kann; und
F&sub2; einen zweiwertigen organischen Rest bedeutet;
worin R&sub1;&sub5; bis R&sub2;&sub1; unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind,
die aus Wasserstoffatom, Halogenatom, Alkylgruppe mit einer
Kohlenstoffzahl von 1 bis 12, Arylgruppe mit einer
Kohlenstoffzahl von 6 bis 20, substituierter Aralkylgruppe mit einer
Kohlenstoffzahl von 7 bis 19, unsubstituierter Aralkylgruppe mit
einer Kohlenstoff zahl von 7 bis 19, substituierter oder
unsubstituierter Aminogruppe mit einer Kohlenstoffzahl von 10 oder
weniger, substituierter oder unsubstituierter Styrylgruppe mit
einer Kohlenstoffzahl von 8 bis 14, Arylazogruppe mit einer
Kohlenstoffzahl von 6 bis 14, Nitrogruppe, Hydroxylgruppe,
Carboxylgruppe oder Cyanogruppe besteht;
wobei von den Kombinationen von R&sub1;&sub5; und R&sub1;&sub6;, R&sub1;&sub6; und R&sub1;&sub7;, R&sub1;&sub7;
und R&sub1;&sub8;, R&sub1;&sub8; und R&sub1;&sub9;, R&sub1;&sub9; und R&sub2;&sub0; und R&sub2;&sub0; und R&sub2;&sub1; mindestens
eine Kombination einen substituierten oder unsubstituierten
kondensierten Ring bilden kann;
F&sub3; einen zweiwertigen organischen Rest bedeutet und X1 ein
Anion bedeutet.
2. Markierter Komplex nach Anspruch 1, bei dem die Substanz aus
einem lebenden Organismus ein Antikörper oder ein Antigen ist.
3. Markierter Komplex nach Anspruch 1, bei dem die Substanz aus
einem lebenden Organismus eine Nucleinsäure ist.
4. Markierter Komplex, der sich mit einer Zielverbindung
verbinden kann und Fluoreszenz oder Absorption zeigt, wenn der an
die Zielverbindung gebundene markierte Komplex mit naher
Infrarotstrahlung bestrahlt wird, wobei der markierte Komplex
eine Substanz aus einem lebenden Organismus und ein
Markierungsmittel, das an der Substanz immobilisiert ist, umfaßt,
dadurch gekennzeichnet, daß
das Markierungsmittel eine Verbindung umfaßt, die durch die
folgende Formel (IV) wiedergegeben wird:
worin A, B, D und E unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind,
die aus Wasserstoffatom, einer substituierten oder
unsubstituierten Alkylgruppe mit zwei oder mehr Kohlenstoffatomen,
Alke
nylgruppe, Aralkylgruppe, Arylgruppe und Styrylgruppe besteht;
r&sub1;' und r&sub2;' einzeln aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus
Wasserstoffatom, einer substituierten oder einer
unsubstituierten Alkylgruppe, cyclischen Alkylgruppe, Alkenylgruppe,
Aralkylgruppe und Arylgruppe besteht; k 0 oder 1 ist; l 0, 1 oder 2
ist und X&sub2; ein Anion bedeutet.
5. Markierter Komplex nach Anspruch 4, bei dem die Substanz aus
einem lebenden Organismus ein Antikörper oder ein Antigen ist.
6. Markierter Komplex nach Anspruch 4, bei dem die Substanz aus
einem lebenden Organismus eine Nucleinsäure ist.
7. Markierter Komplex nach Anspruch 4, bei dem jedes von A, B
und D eine Phenylgruppe ist, E eine Aminophenylgruppe ist, k 0
ist und l 1 ist.
8. Markierter Komplex nach Anspruch 4, bei dem jedes von A, B
und D eine Dimethylaminophenylgruppe ist, E eine mit einer
Carboxylgruppe substituierte Phenylgruppe ist, k 0 ist und l 1 ist.
9. Markierter Komplex nach Anspruch 4, bei dem jedes von A, B,
D und E eine Diethylaminophenylgruppe ist, k 1 ist und l 0 ist.
10. Markierter Komplex nach Anspruch 4, bei dem jedes von A, B
und D eine Diethylaminophenylgruppe ist, E eine
Aminophenylgruppe ist, k 0 ist und l 1 ist.
11. Markierter Komplex nach Anspruch 4, bei dem A eine
Dimethylaminophenylgruppe ist, B und E Ethoxyphenylgruppen sind, D durch
die folgende Formel wiedergegeben wird,
k 0 ist und l 1 ist:
12. Verfahren zum Nachweis einer Zielverbindung in einer Probe,
das die folgenden Schritte umfaßt:
Bereitstellung eines markierten Komplexe; nach einem der
Ansprüche 1 bis 3, der sich mit der Zielverbindung verbinden kann
und eine Substanz aus einem lebenden Organismus und ein
Markierungsmittel, das an der Substanz immobilisiert ist, umfaßt;
Bindung des markierten Komplexes an die Zielverbindung in einer
Probe;
Abtrennung der Markierungssubstanz, an die die Zielverbindung
gebunden ist; und
Bestrahlung der Markierungssubstanz, die mit der Zielverbindung
verbunden ist, mit naher Infrarotstrahlung, um Fluoreszenz oder
Absorption zu zeigen.
13. Verfahren zum Nachweis einer Zielverbindung in einer Probe,
das die folgenden Schritte umfaßt:
Bereitstellung eines markierten Komplexes nach einem der
Ansprüche 4 bis 11, der sich mit der Zielverbindung verbinden kann
und eine Substanz aus einem lebenden Organismus und ein
Markierungsmittel, das an der Substanz immobilisiert ist, umfaßt;
Bindung des markierten Komplexes an die Zielverbindung in einer
Probe;
Abtrennung der Markierungssubstanz, an die die Zielverbindung
gebunden ist; und
Bestrahlung der Markierungssubstanz, die mit der Zielverbindung
verbunden ist, mit naher Infrarotstrahlung, um Fluoreszenz oder
Absorption zu zeigen.
14. Analysenverfahren nach Anspruch 12 oder 13, bei dem zum
Nachweis der Zielverbindung ein optisches Mittel angewendet wird.
15. Verwendung eines markierten Komplexes nach einem der
Ansprüche 1 bis 11 bei einem Analysenverfahren zum Nachweis einer
zu analysierenden Zielverbindung durch ein optisches Mittel,
wobei bei diesem Verfahren ein markierter Komplex, der aus einer
Substanz aus einem lebenden Organismus und einem
Markierungsmittel, das an der Substanz fixiert ist, besteht, verwendet wird
und der Komplex an die zu analysierende Zielverbindung gebunden
wird.
16. Verwendung nach Anspruch 15, bei der das optische Mittel
ein optisches Mittel ist, bei dem nahe Infrarotstrahlen
angewendet werden.
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