DE2537098A1

DE2537098A1 - Verfahren und vorrichtung zur unterscheidung zwischen zwei fluoreszierenden teilchenarten mit unterschiedlichen fluoreszenzabklingdauern

Info

Publication number: DE2537098A1
Application number: DE19752537098
Authority: DE
Inventors: William A Mueller
Original assignee: Block Engineering Inc
Current assignee: Block Engineering Inc
Priority date: 1974-08-21
Filing date: 1975-08-20
Publication date: 1976-03-04
Also published as: JPS5149790A; GB1476006A; FR2282639B3; FR2282639A1; NL7509921A; AU8396175A

Description

Patentanwälte viücchen, den 2 D. /\ug. Dipl. Ing. C. Wallach 15 288 H/fc.

Dipl. Ing. G. Koch Dr. T. Haibach 8 MUnchen 2 Kaufinitrstr. B. Tsl.24 01T6

Block Engineering, Inc., Cambridge, Mass., USA

Verfahren und Vorrichtung zur Unterscheidung zwischen zwei fluoreszierenden Teilchenarten mit unterschiedlichen Fluoreszenzabklingdauern

Die Erfindung betrifft allgemein den Nachweis kleiner Teilchen und im besonderen den Nachweis sehr kleiner biologischer Stoffe durch Fluoreszenzemission.

Ein verbreitetes Verfahren zum Nachweis sehr kleiner biologischer Frobensubetanzen, wie beispielsweise Zellen und dergleichen, besteht darin, daü man die Zellen unterschiedlich mit Beizen bzw. Farbstoffen einfärbt, die,im Zustand der Bindung an die betreffende biologische Probensubstanz, bei geeigneter Anregung eine charakteristische Fluoreszenz emittieren. Bei Sinfärbung einer Probe mit einer verhältnismäßig verdünnten Farbstofflösung ist die Konzentration

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der an die Teilchen gebundenen Färbstoffbeize häufig wesentlich höher als die durchschnittliche oder mittlere Konzentration der Färbstoffbeize in der Färbstofflösung. Der höhere Pegel der von den durch die Bindung verursachten örtlichen Färbstoffkonzentrationen ausgehenden Emission gewährleistet üblicherweise die Diskrimination der angefärbten Proben gegenüber der von dem fluoreszierenden Farbstoff in der Einfärblösung ausgehenden Hinter- oder Untergrundemission.

Um die Diskrimination zwischen der von dem gebundenen Beizfarbstoff ausgehenden Emission und der Hintergrundemission zu verstärken, kann man selbstverständlich die Probe auswaschen, falls die Probensubstanzen physikalisch von der Farbstofflösung getrennt werden können. Eine Reihe von Fluoreszenzfarbetoffen wurde als nicht zur ßinfärbung biologischer Proben geeignet betrachtet in Situationen, wo der Farbstoff nicht ausgewaschen werden konnte, da αie Probensubstanzen gegen die auftretende intensive Hinter- bzw. Untergrundfluoreszenz nicht nachgewiesen werden konnten. Da Auswaschen nicht immer möglich ist, hat man zu sogenannten Fluorochrom-Farbstoffen gegriffen, d. h. Farbstoffen, die bei Anregung nur schwach (oder gar nicht) fluoreszieren, soferne sie nicht an das biologische Substrat gebunden sind.

Falls jedoch die Abmessung der Probe sehr klein ist (z. B. Nucleinsäuren und dergleichen), wird das Problem der Diskrimination kritisch. Beispielsweise ist das der Betrachtung zugängliche Mindestvolumeη der Probe durch Beugung begrenzt. Daher haben Proben, die wesentlich kleiner als dieses Mindestvolumeη sind, ein schlechteres Signal-Rausch-Verhältnis gegenüber dem Hinter- oder Untergrund.

Auch andere, nicht notwendigerweise mit der Abmessung der

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Probe in Verbindung stehende Palctoren können die Signal/-Untergrund-Diskrimination für bestimmte Proben schwierig gestalten. Beispieleweise kann das Verteilungsverhältnis (α. h. das Verhältnis der Farbstoffkonzentration in den Probensubstanzen zu der Farbstoffkonzentration im Hinterbzw. Untergrund) gering sein. Auch kann es sein, daß der Anstieg der Quantenausbeute von Fluorochrom-Farbstoffen im Zustand ihrer Bindung an ein biologisches Substrat nicht sehr grob ist.

Der Erfindung liegt daher als Aufgabe die Schaffung eines Systems zur Diskrimination von durch Anfärbung fluoreszierenden Pxoben gegenüber einer durch in einem flüssigen Medium dispergierte Farbstoffmoleküle bedingten Hinter- bzw. Untergrundfluoreszenz zugrunde.

Zu diesem Zweck weist das System gemäß der Erfindung eine Strahlungsquelle auf, welche eine Fluoreszenzemission von an Probensubstanzen gebundenen Farbstoffmolekülen sowie von im Einfärbmedium dispergieren freien Farbstoffmolekülen zu stimulieren vermag; es sind Vorrichtungen vorgesehen, um die Strahlungsintensität der Lichtquelle zu modulieren; vorzugsweise handelt es sich hierbei um ein Schaltsystem, derart, daß die Anstiegs- und Abklingzeiten der Anregungsstrahlung sehr kurz sind. Schließlich wird gemäß der Erfindung nach der Bestrahlung der angefärbten Proben und des Hintergrund- bzw. Untergrundfarbstoffes mit der stimulierenden Anregungsstrahlung die Amplitude der Fluoreszenzemission bestimmt, und zwar beginnend ab einem vorgegebenen Zeitintervall nach der Modulation der Anregungsstrahlung in den "Aus"-Zustand; die Fluoreszenzemission wird danach über eine vorgegebene Periode überwacht bzw.. gemessen, während welcher die Anregungsstrahlung in ihrem Modulationszustand "Aus" verbleibt.

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Im folgenden werden Ausführungsbeispiele der Erfindung an Hand der Zeichnung beschrieben; in dieser zeigen

Fig. 1 in Blockschaltbilddarstellung ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäöen Systems,

Fig. 2 ein Zeitdiagramm zur Veranschaulichung der Wirkungsweise des erfindungsgemäisen Systems aus Fig. %

In vielen Fällen ist die Quantenausbeute (Q_g) eines Fluoreszenzfarbe toffee (d. h. das Verhältnis der emittierten Quanten zu absorbierten Quanten) unterschiedlich je nachdem, ob der Farbstoff an ein Substrat gebunden ist oder nicht. Dies gilt insbesondere für Fluorochrom-Farbstoffe. Falls die Quantenauebeute Q_g zweier identischer Farbstoffmoleküle In dieser Weise unterschiedlich ist, unterscheiden sich auch die Lebensdauern ihrer Anregungszustände. Gemäü der vorliegenden Erfindung wird von diesem Unterschied der statistischen Lebensdauern der Anregungszustände zur Biskrimination zwischen entsprechenden Beständen gebundener und nicht-gebundener Farbstoffmoleküle Gebrauch gemacht, wobei dieser Unterschied durch die Anwendung einer Zeitschlitz-Aueblendung ("time-gating") noch akzentuiert und verstärkt .wird.

Näherhin ist gemäiä der Erfindung vorgesehen, in Fällen, wo die Anregungszustände zweier Teilchenarten (Farbstoffe) statistisch mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten zerfallen bzw. abklingen, eine Bestimmung der Fluoreszenzemissionintensität während eines vorgegebenen Zeit Intervalls in Verzögerungsabstand nach dem gleichzeitigen Einsetzen der Emissionsabklingung beider Teilchenarten vorzunehmen, wobei diese Zeitverzögerung in der Größenordnung der 1/e-Abklingdauer (odei? langer) der Teilchenart mit der kürzeren

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Emissionslebensdauer ist. Diese Bestimmung der Fluoreszenzemission ergibt einen Nachweis sowohl des Vorliegens der Teilchenart mit der längeren Emissionslebensdauer wie auch ein quantitatives Mau für diese Teilchenart, in scharfer Diskrimination gegenüber den .Auswirkungen der anderen Teilchenart. Unter der Bezeichnung "statistische Abklingung " wird hier der exponentielle Abklingverlauf der Fluoreszenzintensität eines Bestands von anfänglich in einem Anregungszustand vorliegenden Teilchen nach dem Aufhören der Zufuhr der Anregungsenergie verstanden.

Bei den beiden Teilchenarten kann es sich, wie bereits erwähnt, um gleichartige Färbstoffmoleküle in gebundenem und in nicht-gebundenem Zustand, oder auch um verschiedene Molekülarten fluoreszierender Stoffe handeln, vorausgesetzt, daß die beiden Teilchenarten unterschiedliche J,\iantenausbeuten besitzen.

Sobald es bei den Teilchenarten um Fluoreszenzfarbstoffe bzw. -beizen geht, weiche an organischen Verbindungen gebunden werden können, so ist dem Fachmann eine riesige Zahl derartiger Stoffe bekannt. Beispielsweise kann man als Farbstoffe, die vorzugsweise Proteine, wie beispielsweise Leucocytencytoplasma oder die Granülenin Granulocyten anfärben, eine Reihe von sulfonierten Triazinyl-Derivaten verwenden, wie beispielsweise ein Diaminostilben, das jeweils jede Aminogruppe in Jedem der Phenylringe des Stilbenmoleküls besitzt, JBin typisches Beispiel eines derartigen Farbstoffs ist 4,4'-Bis-(4-(3-sulfoanilin)-6-(bis-(2-hydroxyäthyl)amino)-1,^,5-triazinyl)aminostilben-2,2'-disulfonsaures Tetra natriums a Iz (nachfolgend als LDJ bezeichnet).

Die Struktur des LN wird wie folgt angenommen:

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N(CH₀CH₉OH),

NaSO.

Fluoreszenzfarbstoffe, die sich speziell zum Anfärben von Eosinophilgranülen eignen, sind die Anilin- oder Toluidin-Naphtüalinsulfonsäuren und deren alkyl-, alkoxy- oder halogensubstituierten Derivate; 4,4 '-Diaminstilben-2,2' -disulforisäure , Ν,Ν,Ν¹ ,JM'-Tetraessigsäure und deren alkyl-, alkoxy- oder halogensubstituierte Derivate; sulfonierte Fluoreszenzderivate von 1,8-Naphthalimid, wie beispielsweise Brilliantsulfaflavin und dessen alkyl-, alkoxy- oder halogensubstituierte Derivate; δ-p-Toluidin-i-.Naphthalinsulfonsäure und deren alkyl-, alkoxy- oder halogensubstituierte Derivate; sowie 8-Hydroxy-1,3,6-Pyrentrisulfonsäure und deren Alkyl-, Alkoxy- und Halogenderivate. Diese Farbstoffe bewirken eine starke Einfärbung der Eosinophilgranülen mit einer grünblauen .oder grünen Fluoreszenz.

Farbstoffe, welche Nucleinsäuren eine starke Fluoreszenz verleihen, sind vorzugsweise lcationische Farbstoffe, z. B. die Phenanthridiniumfarbstofxe, wie beispielsweise Sthidiurnhalogenid, 2,7-Diamino-10-Äthyl-9-Phenylphenanthridiniu.Tibromid (nachfolgend als EB bezeichnet) sowie dessen Alkyl-, Alkoxy- oder Halogenderivate; sowie als trockene Aufstriche Acridinorange und Ehodulinorange. Die Struktur von EB wird wie folgt angenommen:

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/HCH, C=N ^{Z ό}

-NH,

Br

Die vorstehende Aufzählung ist in keiner Weise eine erschöpfende Aufzählung von Farbstoffen, die sich zur Verwendung für die Zwecke der Erfindung eignen. Eine grobe Zahl anderweitiger Fluoreszenzfarbstoffe, die hierzu verwendet werden können, sind in "Biological Stains" von E. D. Lillie, erschienen bei Williams & Wilkens Co., Baltimore, 1969, beschrieben.

Bei dem in Fig. 1 in sc.hematischer Blockdarstellung gezeigten Ausführungsbeispiel der Erfindung ist bei 20 ein Probenbehälter mit (im einzelnen nicht dargestellten) winzigen Probensubstanzteilchen in einem flüssigen Medium dargestellt , wobei an diese Probesubstanz Moleküle eines geeigneten Fluoreszenzfarbstoffs gebunden sind, derart, daß eine erste fluoreszierende Teilchenart gebildet wird. Eine zweite Teilchenart besteht beispielsweise aus dem gleichen, in dem flüssigen Medium in freier oder ungebundener Form vorliegenden Farbstoff. Als Lichtquelle 22 für die Zwecke der vorliegenden Erfindung eignet sich eine Reihe von Anregungsstxahlungsquellen, deren Strahlung eine Fluoreszenzemission der Farbstoffmoleküle beider Teilchenarten in der Probe 20 zu stimulieren oder zu induzieren vermag.

Bei der Lichtquelle 22 kann es sich entweder um eine von Haus aus schmalbandige Lichtquelle handeln, deren Aellenlänge dem Fluoreszenzanregungswellenlängenband des

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Farbstoffe angepaßt ist, oder es kann sich um eine breitbandige Lichtquelle in Verbindung mit geeigneten Filtermitteln handeln« Der Auedruck "Licht" bzw. "Strahlung" soll dabei nicht nur sichtbare Strahlung sondern insbesondere auch Strahlung im UV-Bereich umfassen. So kann es sich bei der Lichtquelle 22 beispielsweise um einen Laser handeln, der aus einer Reihe τοη Lasern in Abhängigkeit von der Natur des"Aüsgangswellenlängenbandes ausgewählt ist; typischerweise kann es sich auch um eine intensitätsstarke Breitbandstrahlungsquelle, wie beispielsweise eine Kohlenbogenlampe oder dergleichen, in Verbindung mit einer geeigneten DurchlaJ&anafiltereinrichtung, die beispielsweise aus einem- Interferenzfilter bestehen kann, handeln. So würde man beispielsweise bei Verwendung von LN als Farbstoff eine Lichtquelle verwenden, welche im Wellenlängenband im Bereich von 320 bis 390 m λχ starke Intensitäten besitzt. Für Anilino- und Toluidino-Naphthalin-Sulfonsäuren wäre eine Lichtquelle 22 zu wählen, welche im Bereich von 320 bis 410 m/U eine starke Ausgangsintensität besitzt. Entsprechend sollte bei Verwendung von Brillianteulfaflavin als Farbstoff die Lichtquelle 22 eine Ausgangsstrahlung im Bereich von 360 bis 45>Q m/U, und bei Verwendung von Ethidiumbromid als Farbstoff eine starke Ausgangsintensität im Bereich von 480 bis 550 a/U besitzen.

Fluorochrom-Farbstoffe zeigen speziell bei Bindung an ein organisches Substrat höhere Quantenausbeuten als im ungebundenen Zustand. Bei derartigen Farbstoffen mit unterschiedlichen Quantenausbeuten je nachdem, ob sie in. gebundenem oder ungebundenem Zustand vorliegen, zeigen freie oder ungebundene Moleküle in der Hintergrund- oder Untergrundflüssigkeit bei Anregung eine Fluoreszenz, die statistisch wesentlich rascher abklingt als die von an ein organisches Substrat gebundenen Farbstoffmolekülen. Zur bestmöglichen Nutzung dieses Unterschieds der Abklinggeschwin-

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digkeiten zum Zweck der Unterscheidung zwischen den Fluoreszenzquellen sind Zeitschlitz- bzw. Zeitausblendvorrichtungen ("time gating means") etwa in Gestalt eines Modulators 24 zur Intensitätsmodulation der Ausgangsstrahlung der Quelle 22 vorgesehen. Vorzugsweise arbeitet diese Modulation derart, daß von der Strahlungsquelle 22 ausgehendes, auf die Probe 20 fallendes Licht diese periodisch zwischen einem Dunkel- oder Minimalpegel (vorzugsweise Strahlung Null) und einer Maximalintensität wechselnd bestrahlt_t mit sehr kurzen Anstiegs- und Abfallzeiten. Die Abfallzeit der durch den Modulator 24 modulierten Erregerstrahlung von der Quelle 22 sollte möglichst nicht größer als die gleiche Größenordnung und vorzugsweise kürzer als die Abklingzeit der von den ungebundenen Farbstoffmolekülen ausgehenden Fluoreszenzemission sein. Unter "Abklingzeit" bzw, "Abklingdauer" wird dabei selbstverständlich die Zeitdauer verstanden, die erforderlich ist, damit die Fluoreszenzintensität auf den Bruchteil 1/e ihrer ursprünglichen oder anfänglichen Intensität abnimmt.

Die Modulation der Lichtquelle 22 kann beispielsweise durch Mode-Verriegelung/("mode-locking") erfolgen, falls als Lichtquelle 22 ein gepulster Laser bekannter Art, beispielsweise ein kommerziell verfügbarer Model 165-Laser der Firma Spectraphysicx Co», Mountain View, California, verwendet wird. In diesem Falle wäre der Modulator 24 die

/-bzw. Kopplunge
Mode-Verriegelungsrsteuerung, beispielsweise ein von einem 70 MHz-Oszillator getriebener piezoelektrischer Model 361 Mode-Verriegler der Firma Spectraphysics. Alternativ kann es sich bei der Lichtquelle 22 um eine kontinuierliche Lichtquelle handeln und die Modulation der Lichtquelle durch Anordnung eines extrem hochtourigeη Zerhackers, beispielsweise in Form einer PockeIs-Bffekt-Vorrichtung zwischen der kontinuierlichen Lichtquelle und der Probe 20 erfolgen. In diesem Falle bestünde der Modulator 24 aus der + bzw. Modekopplung +

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Pockels-Bffekt-Vorrichtung zusammen mit dem das erforderliche elektrische #eld liefernden Impulsfeldgenerator. In beiden Fällen kann ^der Modulator 24 ein elektrisches Signal erzeugen, das die Modulation des Lichts der Strahlungsquelle 22 steuert bzw. synchron mit ihr ist.

Die modulierte Strahlung von der Lichtquelle 22 wird auf den eine Suspension von gefärbten Proben in Flüssigkeit enthaltenden Probenbehälter 20 gerichtet. Die Intensität der Strshiungsenergie, mit welcher die jioleküle des fluoreszierenden Materials bestrahlt werden, sollte nicht so hoch sein, daü sie eine .Ausbleichwirkung zur Folge hat. Ausbleichen kann definiert werden als die Tendenz vieler aioleküle» bei Anhebung in einen hochangeregten Zustand durch zugeführte Jäingangsenergie durch Photozersetzung zu zerfallen oder rasch chemisch mit anderen Stoffen, wie beispielsweise gelöstem Sauerstoff oder dergleichen, chemisch zu reagieren, derart, daü das Molekül so geändert wird, daß es sein Fluoreszenzvermögen verliert.

Das von der bestrahlten Probe emittierte Licht wird durch ein Wellenlängenfilter 26 gefiltert. Das Durchlaiiband des Filters wird so gewählt, daü es eine Diskrimination zwischen Licht von der Strahlungsquelle 22 und Streustrahlung einerseits und charakteristischen Wellenlängen der Fluoreszenz von den Molekülen des jeweiligen zur Anfärbung der Teilchen in der Probe 20 verwendeten speziellen Farbstoffs andererseits bewirkt. Typischerweise handelt es sich bei dem Filter 26 um ein Interferenzfilter oder eine anderweitige bekannte Filterart, dessen Durchlaßbandeigenschaften genau und aciiarf um spezifische Schwerpunktwellenlängen herum gelegt werden können. Das von dem Filter 26 durchgelassene Licht wird des weiteren vorzugsweise über eine Betrachtungsbzw. Abbildungsoptik 2Ö auf einen Detektor gelenkt. Bei dar Optik 28 handelt es sich typischerweise

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entweder um Reflexions-, Refractions- oder katadioptrische Systeme, welche Licht sammeln und auf einen Brennpunkt konzentrieren. Der Detektor 30 kann ein Detektortyp aus einer großen Zahl bekannter photoelektrischer Systeme, wie beispielsweise den bekannten Fhotomultipliern (SEV), sein, die an einer Ausgangsklemme 32 ein elektrisches Ausgangssignal mit einem der Intensität des auffallenden Lichtes proportionalen Parameter, beispielsweise der Lichtintensität proportionalen Amplitude erzeugen. Typischerweise kann man einen fokussierten Photomultiplier, wie beispielsweise den Model VPM-153a-Photomultiplier der Firma Varian Associates, Palo Alto, CaI., verwenden, der eine Verstärkung von etwa ΛΟτ sowie Anstiegs- und Abfallzeiten von etwa 150 Picosekunden oder weniger besitzt ι Wie erwähnt, sind Vorrichtungen vorgesehen, um nach der Bestrahlung der Teilchen in dem Probenbehälter 20 die Amplitude der Fluoreszenzemission von gebundenen Farbstoffmolekülen zu bestimmen, jeaoch erst nachdem die Intensität der Fluoreszenzemission von nichtgebundenen Färbst off mole kiilen in der Suspensionsflüssigkeit in dem Behälter 20 unter einen vorgegebenen Pegel abgeklungen ist, beispielsweise auf den Bruchteil 1/e der ursprünglichen Intensität. Dies wird dadurch erreicht, daß man entweder direkt oder indirekt die Fluoreszenzemission in Verzögerungssynchronismus mit der Modulation der Erregungsstrahlung mißt. So wird beispielsweise bei der in Fig. 1 gezeigten Ausführungsform die Ausgangsgröße des Detektors erst ab einer vorgegebenen Zeitdauer nach der Modulation des Lichte der Strahlungsquelle 22 auf ihre Minimum- oder Aus-Intensität untersucht. Hierzu ist eine elektronische Torsteuerungs- oder Schaltvorrichtung 34, typischerweise ein Feldeffekttransistor, eine Diode oder ein anderweitiges bekanntes schnelles Tor vorgesehen, um die Ausgangsklemme 32 des Detektors 30 und die Eingangsklemme des Verstärkers 36 nach Maßgabe von elektrischen Signalen, αie von einer Phasenverzögerungsvorrichtung 38 geliefert werden, zu

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verbinden bzw. abzukoppeln. Sie Phasenverzögerungsvorrichtung, bei der es eich um eine von verschiedenen bekannten Verzögerungsleitungen oder dergleichen handeln kann, ist beispielsweise mit dem Frequenz treiber des Modulators 24 verbunden, derart, daß sie ein elektrisches Ausgangssignal erzeugt, das in der Phase gegenüber der Leitungsfrequenz des Moduletore um eine vorgegebene Zeit- oder Phasenverzögerung nacheilt, die beispielsweise in Abhängigkeit von der bekannten Abklingdauer des nicht-gebundeneη Farbstoffs festgelegt ist. Die Ausgangsgröße der Verzögerungsvorrichtung 33 wird der Torsteuervorrichtung 34 zugeführt und steuert deren Umschaltung. Schließlich ist der Ausgang des Verstärkers 36 mit dem Eingang einer Vorrichtung 40 verbunden, bei der es sich typischerweise um ein Kathodenstrahloszilloskop, eine Digital-Anzeigevorrichtung oder eine anderweitige Vorrichtung aus einer großen Anzahl bekannter Systeme zur Anzeige bzw. Wiedergabe und Speicherung elektrischer Signale handeln kann. Bei dem beschriebenen System spricht der Detektor somit kontinuierlich auf die Fluoreszenz an, wobei jedoch nur ein ausgewählter Bereich des elektrischen Ausgangseignais des Detektors für die Meisabtastung verwertet wird. Diese Meßausblendung kann statt dessen auch direkt an der Fluoreszenz vorgenommen werden, indem man den Detektor im Sinne einer Torsteuerung hochtastet, d. h. den Detektor in den geeigneten Zeitpunkten ein- und ausschaltet. Alternativ kann statt einer MeßausbIendung an den Detektorein- oder-ausgangssignalen die Meßausblendung auch an dem von dem Verstärker 36 erzeugten Verstärkungesignal erfolgen, durch entsprechende selektive Modulation der Anzeige- bzw. Wiedergabevorrichtung 40.

Die Beschreibung der Wirkungsweise des Systems nach Fig. 1 erfolgt zweckmäßig an Hand der idealisierten Wellenformdarstellung dee Zeitdiagramms von Fig. 2; in diesem sind drei Wellenformen A, B und C sämtlich auf einer gemeinsamen

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Zeitbasis oder Abszisse dargestellt. Die Ordinate der einzelnen Wellenformen entspriciit jeweils der Amplitude. In Fig. 2A ist die Amplitude des Lichts von der Lichtquelle 22 dargestellt, in der Bin-Aus-Modulation durch den Modulator 24, mit Beginn im Zeitpunkt T₁ mit abrupter (ideal.'momentaner) Anstiegszeit und einer wenigstens in gleicher Weise abrupten Unterbrechung im Zeitpunkt T₂, derart, daß man einen idealisierten Rechteck-Amplitudenimpuls der Breite w erhält. Vorzugsweise erfolgt die Modulation der Lichtquelle 22 durch den Modulator 24 derart, daß eine Vielzahl derartiger Impulse von jeweils der Impulsbreite w mit einer Impulsfolgefrequenz mit der Periode B erzeugt werden. Wird der Probenbehälter 20 mit dem modulierten Impuls gemäß Fig. 2A bestrahlt, so beginnen die Farbstoffmoleküle in dem Probenbehälter (da der Impuls Wellenlängen innerhalb der Absorptionsbänder der Farbstoffmoleküle von zur Fluoreszenzanregung ausreichender Intensität enthält) sodann mit ihren charakteristischen Fluoreszenzwellenlängen zu strahlen, Fig. 2B zeigt eine für nicht-gebundene Farbstoffmoleküle repräsentative Wellenform der Fluoreszenzstrahlung während der Periode R; diese Wellenform steigt auf ein Maximum im Intervall T^ bis T₂ an und klingt sodann exponentiell und sehr rasch von T₂ (d. h. dem Zeitpunkt, in welchem die Impulsamplitude in Fig. 2A ihren Minimumwert einnimmt) an auf einen Wert 1/e im Zeitpunkt T, ab.

Vorzugsweise ist die durch die Verzögerungsvorrichtung 38 in das Signal von dem Modulator 24 eingeführte Verzögerung das Zeitintervall zwischen der Zeit T₂ und dem Zeitpunkt Tz, derart, daß der Verstärker 36 das von dem Detektor 30 gelieferte Signal erst vom Zeitpunkt T, an beginnend wahrnimmt.

Die Wellenform gemäß Fig. 20 ist repräsentativ für die Fluoreszenzemission eines Bestands gebundener Farbstoff-

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moleküle in dem Probenbehälter 20; typischerweise erreicht sie ein Maximum zwischen dem Zeitpunkt T^ und 3^, in gleicher Weise wie die durch Fig. 2B typifizierten nicht-gebundenen Färbst off moleküle. Jedoch erkennt man, daß in Figo 2C, obwohl die Abklingung der von den gebundenen Farbstoffmolekülen ausgehenden Fluoreszenz ebenfalls exponentiell verläuft, die Abklingdauer wesentlich langer ist. Daher ist im Zeitpunkt T,, in dem die Fluoreszenz der nicht-gebundenen Farbstoffmoleküle, wie durch Fig. 2B veranschaulicht, bereits auf eine sehr niedrige oder nur noch nominelle Amplitude abgeklungen ist, die Amplitude der von den gebundenen Molekülen emittierten Fluoreszenz noch sehr hoch, und das Verhältnis von Signal (Fluoreszenz des gebundenen Farbstoffs) zu Hinter- bzw. Untergrund oder Rauschen (Fluoreszenz des nicht-gebundenen Farbstoffs) ist im Zeitpunkt T, wesentlich besser als zu irgendeinem Zeitpunkt zwischen T^ und Tq. Die Ablesung bzw. Auswertung des von dem Detektor 30 gelieferten Signals durch den Verstärker 36 wird vorzugsweise für ein gewisses Zeitintervall bis zum Zeitpunkt T^ vor dem Eintreffen des nächsten Impulses von der Licht= quelle 22 fortgesetzt, wobei die Amplitude der wellenform gemäß Fig. 2C während dieser Zeitdauer annähernd um ebensoviel größer verbleibt als die Wellenform gemäß Fig. 2B wie im Zeitpunkt T*.

Man erkennt, daß die Anwendung einer Zeitschlitz-Ausblendung eine, sehr scharfe Discrimination zwischen Emissionen von zwei Beständen fluoreszierender Färbstoffmoleküle ermöglicht, welche unterschiedliche Anregungslebensdauern zeigen, beispielsweise einfach infolge ihres unterschiedlichen Bindungszuatendes.

Dieses Verfahren eignet sich besonders zur Anwendung auf Moleküle, die nicht infolge direkter Absorption der Anregungsstrahlung fluoreszieren, sondern durch Energieüber-

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tragung (beispielsweise durch Tunneleffekt) von benachbarten Molekülen, welche als Absorber wirken. Die Emission derartiger aufgrund von Energieübertragung fluoreszierender Stoffe (ETP-Stoffe) erreicht eine Spitze erst nach einer gewissen durch den Übertragungsvorgang bedingten Verzögerung. Wenn in einem derartigen Fall die eine der Teilchenarten ein derartiges STF-Material (d. h. aufgrund von Energieübertragung fluoreszenzfähiges Material) ist, so braucht sodann die vor der Bestimmung bzw. Messung der Fluoreszenzemission eingeschaltete Verzögerung nicht notwendigerweise auf der 1/e-Abklingdauer der Teilchenart mit der kürzeren Emissionszeit zu beruhen. Statt dessen kann man einen Anregungsstrahlungsimpuls vorsehen, welcher die eine Teilchenart praktisch momentan durch direkte Absorption zur vollen Emissionsintensität anhebt, wobei jedoch dieser Anregungsimpuls so kurz ist, daß er längst wiederin den "Aus"-Zustand moduliert ist, bevor das durch Energieübertragung fluoreszenzfähige ETF-Material den Scheitelwert seiner Emission erreicht hat. Selbst wenn beide Teilchenarten die gleiche Abklinggeschwindigkeit besitzen und man die Bestimmung der Emission so lange verzögert, bis der Scheitelwert der Emission des ETF-Material erreicht wurde, so ergibt das Verfahren gemäti der Erfindung offensichtlich eine überlegene Technik zur Diskrimination der Energieübertragungs-Fluoreszenz von Hinter- bzw. Untergrund- und anderen Emissionen.

Die Erfindung wurde vorstehend an Hand bevorzugter Ausführungsbeispiele beschrieben, denen jedoch keinerlei einschränkende Bedeutung zukommen soll.

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Claims

Patentansprüche

Verfahren zur Unterscheidung zwischen zwei fluoreszierenden Teilchenarten mit voneinander verschiedenen Fluoreszenzabklingdauern, dadurch gekennzeichnet, daß man die Teilchen mit einer Strahlung bestrahlt, welche die betreffenden Teilchenarten zur Fluoreszenzemission anzuregen vermag, deren Intensität jedoch nicht so hoch ist, daß sie eine Ausbleichung hervorruft; daß man sodann die Intensität'der Anregungsstrahlung verringert, derart, daß die von den beiden Teilchenarten ausgehende Fluoreszenzemission statistisch abklingen kann, und daß man im Abstand einer vorgegebenen Zeitverzögerung nach der Verringerung der Anregungsstrahlungsintensität die Intensität der Fluoreszenzemission mißt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Intensität der Anregungsstrahlung in solcher Weise verringert wird, daß die statistische Abklingung der Fluoreszenzemission beider Teilchenarten im wesentlichen im gleichen Anfangszeitpunkt beginnt, und daß das VerzögerungsIntervall von diesem AnfangsZeitpunkt der Abklingung an festgelegt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Verzögerung nicht wesentlich kleiner als die Abklingzeit der Teilchenart mit der kürzeren Abklingdauer ist, in welcher die Fluoreszenz dieser Teil chenart auf einen Wert von etwa 1/e abklingt.
4. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man organisches Material mit einem Fluoreszenzfarbstoff einfärbt, derart, daß die eine Teilchenart von an das organische Ma terial gebundenen Farbstoffmolekülen und die zweite

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Teilchenart von nickt an das organische Material gebundenen Farbstoffmolekülen gebildet wird.
5. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Erregungsstrahlung eine im wesentlichen monochromatische kohärente Strahlung mit Wellenlängen im wesentlichen im Bereich der Absorptionsbänder der betreffenden Teilchenarten verwendet wird.
6. Vorrichtung zur Unterscheidung zwischen zwei fluoreszierenden Teilchenarten mit voneinander verschiedenen Fluoreszenzabfclingdauern, nach dem Verfahren ge mau einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, gekennzeichnet durch eine zur Bestrahlung der betreffenden Teilchenarten (20) angeordnete Strahlungsquelle (22) zur Erzeugung einer eine Fluoreszenzemission der betreffenden Teilchenarten stimulierenden Anregungsstrahlung; eine Vorrichtung (24) zur Intensitätsmodulation der Anregungsstrahlung; sowie Vorrichtungen (30 bis 40) zur Messung der Intensität der Fluoreszenzemission der betreffenden Teilchenarten in einem Zeitausblendintervall in zeitverzögertem Synchronismus mit der Intensitätsmodulation der Anregungsstrahlung.
7· Vorrichtung nach Anspruch 6,. dadurch gekennzeichnet, daß die. Vorrichtungen zur zeitlich ausgeblendeten Intensitätsmessung der Fluoreszenzemission eine auf die Modulationsvorrichtung (24) ansprechende Vorrichtung 08, J4) zur Meβsung der Fluoreszenzemission während eines nach einer vorgegebenen Zeitverzögerung nach Modulation der Anregungsstrahlungsintensität auf einen vorgegebenen niedrigen Pegel beginnenden Zeitintervalls (T^ bis T₄) aufweistο

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8. Vorrichtung nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Strahlungsquelle (22) ein Laser ist und daii die Vorrichtung (24) zur Verringerung des Intensitätspegels der Anregungsstrahlung einen mit dem Laser gekoppelten Mode-Verriegler sowie eine Signalquelle zur Erzeugung von Treibersignalen für den Mode-Verriegler aufweist.

9* Vorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daii die Vorrichtung zur Messung der Fluoreszenzemissionsintensität eine auf die Fluoreszenzemission ansprechende Detektorvorrichtung (30) zur Erzeugung eines der Fluoreszenzemission entsprechenden elektrischen Ausgangssignals (32) sowie eine Vorrichtung (34) zur zeitschlitzgesteuerten Aueblendung eines Bereichs (Tz bis T^) aus dem Ausgangssignal des Detektors (30) aufweist.

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