DE19702914A1 - Verfahren und Anordnung zum Bestimmen vorgegebener Eigenschaften von Zielpartikeln eines Probenmediums - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1 bzw. ein Verfahren nach dem Oberbegriff des Anspruchs 15 sowie auf eine Anordnung nach dem Oberbegriff des Anspruchs 18.

Zeitkorreliertes Einzelphotonen-Zählen ist eine vielsei­ tige spektroskopische Technik, die es erlaubt, eine Vielzahl von Parametern zu untersuchender Partikel zu bestimmen. Dazu zählen die Fluoreszenzlebensdauer, ggf. auch die verschiede­ nen Fluoreszenzlebensdauern von multiexponentiellen Zerfäl­ len, Rotationsdiffusionskonstanten, kinetische Übergangs­ raten, u.ä. Außerdem erlaubt die mit zeitkorreliertem Ein­ zelphotonen-Zählen verbundene hohe Zeitauflösung in Verbin­ dung mit gepulster Anregung eine effektive Trennung von un­ verzögert gestreutem Anregungslicht und verzögerter Fluo­ reszenz. Dadurch lassen sich das gesuchte Signal (Fluoreszenz) und unerwünschtes Rauschen (unverzögertes Streulicht) voneinander trennen und das Signal-Rausch-Ver­ hältnis für viele Anwendungen erhöhen.

Weitere Eigenschaften, insbesondere die Diffusions­ konstante von Zielpartikeln, lassen sich mit der Technik der Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) gewinnen. Die Kenntnis der Diffusionskonstante ermöglicht in vielfältiger Weise Aussagen über die Größe der Zielpartikel oder ihren Bindungszustand an andere große Moleküle.

Bei herkömmlichen FCS-Meßverfahren (vgl. WO 94/16313) besteht jedoch keine Möglichkeit der Diskriminierung zwi­ schen unverzögert gestreutem Anregungslicht und verzögertem Fluoreszenzlicht, so daß das Signal-Rausch-Verhältnis be­ grenzt bleibt.

Beide Techniken, zeitkorreliertes Einzelphotonen-Zählen und Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie, sind für hoch­ empfindliche Messungen an stark verdünnten Lösungen fluores­ zierender Partikel, vorzugsweise im subnanomolaren Bereich, geeignet. Es können mit diesen Techniken sogar einzelne Mo­ leküle in Probenmedien detektiert werden (vgl. C. Zander et al. Applied Physics B, Band 63, S. 517-523, 1996). Aller­ dings kann bisher die Autokorrelationsfunktion von Signalen einzelner Partikel nicht bestimmt werden.

Ein Verfahren und eine Anordnung der eingangs genannten Art wurde von Richard A. Keller et al. in Applied Spectro­ scopy, Band 50, Nr. 7, 1996, auf den Seiten 12A bis 32A be­ schrieben. Die Datenanalysemöglichkeiten sind bei der be­ schriebenen Anordnung auf ein isoliertes Anwenden entweder der Auswertemöglichkeiten des zeitkorrelierten Einzelphoto­ nen-Zählens oder der FCS begrenzt. Die Vorteile beider Tech­ niken werden nicht kombiniert genutzt. Ferner arbeitet die Auswerteeinrichtung der aus dieser Druckschrift bekannten Anordnung mit einem aufwendigen und kostspieligen CAMAC-Rah­ men und benötigt einen Multi-Channel-Scaler (MCS).

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Anwen­ dungsmöglichkeiten der Fluoreszenz-Korrelations-Spektrosko­ pie zu erweitern.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 bzw. durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 15 sowie durch eine Anord­ nung mit den Merkmalen des Anspruchs 18 gelöst.

Bei der ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Bestimmen vorgegebener Eigenschaften von Zielpartikeln eines Probenmediums wird das Probenmedium zu­ nächst mit periodisch moduliertem Licht einer vorgegebenen Periodendauer bestrahlt. Vorzugsweise wird das Probenmedium mit einer regelmäßigen Folge gleichmäßig beabstandeter Lichtpulse bestrahlt. Der Abstand zwischen zwei Lichtpulsen beträgt beispielsweise 12 ns (1 ns = 10^-9 s = 1 Nanosekunde). Anschließend wird im Probenmedium gestreutes Licht in Form von einzelnen Photonen von einer Detektionseinrichtung de­ tektiert. Dabei wird einerseits der zeitliche Abstand zwi­ schen dem Detektionszeitpunkt jedes Photons und einem in der zugehörigen Periode des bestrahlenden Lichts liegenden Refe­ renzzeitpunkt als Verzögerungszeitpunkt bestimmt; anderer­ seits wird der Detektionszeitpunkt jedes Photons bestimmt. Dies geschieht in der Regel mit zwei unterschiedlichen, auf die jeweilige Meßaufgabe abgestimmten Meßanordnungen. Die Verzögerungszeit, welche im Nanosekundenbereich liegt, er­ fordert eine analoge Meßanordnung zur Messung extrem kurz­ zeitiger Vorgänge. Die Bestimmung des Detektionszeitpunkts andererseits wird in der Regel mit einer digitalen Meßanord­ nung bestimmt, die geeignet ist, die entsprechenden Zeiten im Mikrosekundenbereich zu messen.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeich­ net, daß zunächst mit Hilfe der Verzögerungszeiten für je­ weils eine Anzahl von aufeinanderfolgende detektierten Pho­ tonen wenigstens ein Parameter des gestreuten Lichts be­ stimmt wird. Die Anzahl von aufeinanderfolgend detektierten Photonen kann beispielsweise fest vorgegeben sein oder an das Vorhandensein von Zielpartikeln im Probenraum angepaßt werden. Ein erster Parameterwert wird für eine Anzahl von aufeinanderfolgend detektierten Photonen bestimmt. Daraufhin wird ein weiterer Parameterwert aus den Verzögerungszeiten einer weiteren Anzahl von aufeinanderfolgend detektierten Photonen bestimmt. Dabei kann die weitere Anzahl der aufein­ anderfolgend detektierten Photonen einerseits sich an die vorhergehende Anzahl von detektierten Photonen anschließend, andererseits kann die zweite Anzahl von Photonen jeweils einen Teil der ersten Anzahl von Photonen mit umfassen. Im ersten Fall ergebe sich eine Aufteilung der aufein­ anderfolgend detektierten Photonen in aufeinanderfolgende Gruppen, zu denen jeweils ein Parameterwert bestimmt wird. Im zweiten Fall wird praktisch ein über die aufeinanderfol­ genden detektierten Photonen hinweggleitendes Auswahlfenster gelegt, wobei die Verzögerungszeiten der an das Fenster fal­ lenden Photonen zur Bildung des Parameterwerts verwendet werden.

Um einen Parameterwert aus den Verzögerungszeiten zu be­ stimmen, werden in der Regel weitere Informationen herange­ zogen, die aus einer Vorauswertung bestimmter Partikelei­ genschaften gewonnen wurden. Diese liegen beispielsweise als spektroskopische Daten vor, zum Beispiel in Form vorbekann­ ter Fluoreszenzlebensdauern. Die Verzögerungszeiten für eine vorgegebene Anzahl von aufeinanderfolgenden detektierten Photonen werden dann mit Hilfe der hinterlegten spektrosko­ pischen Daten ausgewertet. Beispielsweise können dabei Am­ plitudenanteil unverzögerter Streulichtanteile und verzöger­ ter Fluoreszenzlichtanteile quantitativ analysiert werden.

Anschließend werden mittels der Parameter und der zuge­ hörigen Detektionszeitpunkte der aufeinanderfolgend detek­ tierten Photonen jeweils Parameter-Zeit-Wertepaare gewonnen und aus mehreren Parameter-Zeit-Wertepaaren wenigstens eine Parameter-Zeit-Funktion bestimmt. Dann wird eine Korrela­ tionsfunktion der wenigstens einen Parameter-Zeit-Funktion berechnet. Die Korrelation der so gewonnenen Parameter-Zeit-Funk­ tion gestattet erweiterte und neuartige Aussagen über Eigenschaften der Partikel.

Die erfindungsgemäße Anwendung der Korrelationstechnik auf die mit Hilfe von zeitkorreliertem Einzelphotonen-Zählen gewonnenen Parameterwerte erlaubt die Bestimmung neuartiger Eigenschaften der Zielpartikel und erweitert die Möglich­ keiten der bekannten Techniken. So kann beispielsweise die Autokorrelationsfunktion des isolierten Amplitudenanteils des auf Fluoreszenz zurückzuführenden Anteils des gestreuten Lichts berechnet werden. Dadurch ergibt sich eine effektive Unterdrückung von Hintergrundsignalen. Aus derart berechne­ ten Korrelationsfunktionen kann beispielsweise die Diffu­ sionskonstante des Zielpartikels bestimmt werden. Gegenüber der herkömmlichen FCS führt das erfindungsgemäße Verfahren zu einer deutlichen Verbesserung des Signal-Rausch-Verhält­ nisses. In ultraverdünnten Lösungen werden erst durch das erfindungsgemäße Verfahren derartige Messungen überhaupt er­ möglicht.

Bei einer vorteilhaften Weiterbildung des erfindungsge­ mäßen Verfahrens wird das im Probenmedium gestreute Licht von mehr als einem Detektor erfaßt. Anschließend wird je­ weils wenigstens eine Parameter-Zeit-Funktion für die von jedem Detektor detektierten Photonen getrennt berechnet. Vorzugsweise wird anschließend als Korrelationsfunktion eine Kreuzkorrelationsfunktion mit Hilfe der Parameter-Zeit-Funk­ tionen verschiedener Detektoren berechnet. Dies gestattet eine genaue Beobachtung der Bindungsreaktionen zwischen Par­ tikeln, indem z. B. unterschiedliche Spektralfilter in den einzelnen Detektionszweigen eingesetzt werden.

Bei einer alternativen Ausführungsform des Verfahrens zum Bestimmen vorgegebener Eigenschaften von Zielpartikeln eines Probenmediums wird das Probenmedium zunächst mit Licht bestrahlt, im Probenmedium gestreutes Licht in Form von ein­ zelnen Photonen von einer Detektionseinrichtung detektiert und der Detektionszeitpunkt jedes gestreuten Photons erfaßt. Die Dichte der Zielpartikel wird dabei so gewählt, daß sich im Mittel weniger als ein Zielpartikel in einem beobachteten Volumenelement des Probenmediums (Probenraum) befindet. Durch bewerten der erfaßten Detektionszeitpunkte wird fest­ gestellt, in welchem Zeitintervall ein Zielpartikel einzeln im Probenraum vorlag. Dies geschieht beispielsweise durch Erfassen der zeitlichen Abstände zwischen aufeinanderfolgen­ den Detektionszeitpunkten, wobei der Eintritt eines Ziel­ partikels in den Probenraum dann erkannt wird, wenn z. B. eine vorgegebene Anzahl von zeitlichen Abständen einen Maxi­ malabstand unterschreitet. Andererseits kann beispielsweise auch die Anzahl der erfaßten Detektionszeitpunkte in einem vorgegebenen Zeitintervall bewertet werden, wobei das vorhanden sein eines Zielpartikels im Probenraum dann erkannt wird, wenn die Anzahl der pro Zeiteinheit erfaßten Detek­ tionszeitpunkte einen Minimalwert überschreitet.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeich­ net, daß eine Korrelationsfunktion ausschließlich mit Hilfe derjenigen Detektionszeitpunkte berechnet wird, die in das solcherart bestimmte Zeitintervall fallen, und daß die vor­ gegebenen Eigenschaften der Zielpartikel mit Hilfe dieser Korrelationsfunktion bestimmt werden.

Im Unterschied zum Stand der Technik werden bei diesem erfindungsgemäßen Verfahren die erfaßten Detektionszeit­ punkte selektiert, bevor eine mit Hilfe der Detektionszeit­ punkte berechnete Detektionsfunktion einer Korrelation un­ terzogen wird. Die Detektionsfunktion kann beispielsweise eine Abtastfunktion sein, die den Wert Null annimmt, wenn in einem Abtastzeitintervall keine Detektion eines Photons stattfand, und die den Wert Eins annimmt, wenn in einem Ab­ tastzeitintervall eine Detektion stattfand. Bei einem größer gewählten Zeitintervall kann die Detektionsfunktion auch die Anzahl der in den jeweils konstanten Zeitintervallen erfaßten Detektionszeitpunkte wiedergeben.

Bei der erfindungsgemäßen Anordnung wird für jedes de­ tektierte Photon sowohl der zeitliche Abstand zwischen dem Detektionszeitpunkt eines Photons und einem Referenzzeit­ punkt für die Periode des bestrahlenden Lichts, also die Verzögerungszeit, bestimmt, als auch mit Hilfe der Zähler­ anordnung der zeitliche Abstand zwischen aufeinanderfolgen­ den Detektionszeitpunkten von Photonen. Beide Zeiten werden gespeichert.

Das Bestimmen des zeitlichen Abstands zwischen aufeinan­ derfolgenden Detektionszeitpunkten von Photonen geschieht erfindungsgemäß mit einer Wechselzähleranordnung, die minde­ stens einen ersten und einen zweiten Zähler enthält. Sie wird durch elektrische Impulse der Detektionseinrichtung ge­ steuert und ist so geschaltet, daß die Zähler abwechselnd zählen. Wenn also ein Photon detektiert wurde, startet der entsprechende Impuls z. B. den ersten Zähler. Wird ein zwei­ tes Photon detektiert, so stoppt der zugehörige elektrische Impuls der Detektionseinrichtung den ersten Zähler und star­ tet den zweiten Zähler. Während der zweite Zähler zählt, kann der Zählerstand des ersten Zählers an die nachgeschal­ tete Recheneinheit übertragen werden. Bei Eintreffen eines dritten Photons wird der zweite Zähler gestoppt und der erste Zähler wieder gestartet. In der darauffolgenden Zeit kann der Zählerstand des zweiten Zählers ausgelesen und an die nachgeschaltete Recheneinheit übertragen werden, während der erste Zähler erneut zählt. Eine vertauschte Beschaltung der beiden Zähler ist ebenso geeignet.

Ein Vorteil der erfindungsgemäßen Anordnung besteht darin, daß sie mit einfachsten konstruktiven Mitteln, näm­ lich Zählern und bekannten Schaltungselementen, realisiert werden kann.

Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß die Anordnung totzeit- oder verlustlos arbeitet. Befindet sich ein Zähler in einem Reset-Vorgang, ist der andere Zähler zum Zählen be­ reit.

Schließlich ist noch ein Vorteil der erfindungsgemäßen Anordnung, daß die mit ihr realisierbare Zeitauflösung für die Bestimmung der Detektionszeitpunkte der Photonen sehr hoch ist und flexibel vorgegeben werden kann.

Die Erfindung ermöglicht es, einzelne oder wenige Mole­ küle mit vertretbarem apparativen Aufwand und hoher Genauig­ keit und Vielfalt der Analysemöglichkeiten spektroskopisch zu untersuchen. Durch die Erfindung gelingt es, das von den Zielpartikeln gestreute Licht wirksam von störendem Hinter­ grund zu trennen und als Folge davon die gesuchten Eigen­ schaften der Zielpartikel mit bisher nicht erreichter Genau­ igkeit zu erfassen.

Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungs­ beispielen näher erläutert, die in den Figuren schematisch dargestellt sind. Gleiche Bezugsziffern in den einzelnen Fi­ guren bezeichnen dabei gleiche Elemente. Im einzelnen zeigt:

Fig. 1 eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels der Erfindung;

Fig. 2 eine schematische Darstellung eines zweiten Ausführungsbeispiels der Erfindung;

Fig. 3 eine Kurve, die die zeitlichen Abstände Δt aufeinanderfolgender Detektionszeitpunkte von Photonen für eine Photonenfolge beschreibt;

Fig. 4 ein Histogramm, bei dem die Anzahl der pro Zeiteinheit detektierten Photonen für die Photonenfolge der Fig. 3 aufgetragen ist;

Fig. 5 ein Histogramm, gewonnen aus den zeitlichen Abständen zwischen Anregungspulsen und Detek­ tionszeitpunkten der Photonen, für ein erstes in Fig. 3 und 4 markiertes Intervall;

Fig. 6 ein Histogramm, gewonnen aus den zeitlichen Abständen zwischen Anregungspulsen und Detek­ tionszeitpunkten der Photonen, für ein zwei­ tes, in Fig. 3 und 4 markiertes Intervall;

Fig. 7 eine Kurvenschar, die ein Beispiel der Aus­ wertung von aufgenommenen Daten zeigt.

Das erfindungsgemäße Verfahren sowie die erfindungsge­ mäße Anordnung können vielfältig Verwendung finden.

Als eine Eigenschaften eines Zielpartikels kann z. B. seine Bindungsfähigkeit an ein anderes Molekül oder der Wert seiner Diffusionskonstante in einem bestimmten Probenmedium bestimmt werden. Unter Eigenschaften werden auch Zustände oder Zustandsänderungen der Zielpartikel verstanden. Mögli­ che Zustände des Zielpartikels wären demnach z. B. der gebun­ dene bzw. der freie Zustand. Zustandsänderungen können so­ wohl Übergänge zwischen gebunden und frei sein, als auch Übergänge zwischen verschiedenen elektronischen Zuständen des Zielpartikels. Im einfachsten Fall kann dies der Über­ gang zwischen dem ersten angeregten Singulett und dem elek­ tronischen Grundzustand sein, also Fluoreszenz. Der Kehrwert der zugehörigen Geschwindigkeitskonstanten ist die Fluores­ zenzlebensdauer.

Zielpartikel sind Partikel, die spektroskopisch vermes­ sen oder detektiert werden sollen. Sie befinden sich in oder auf den Probenmedien. Zielpartikel können dabei sowohl Mole­ küle als auch Molekülaggregate oder -komplexe sein. Ferner kann diese Technik auf Atome, mikrobiologische Objekte, wie Viren, Zellorganellen oder Zellen und Membranen, oder son­ stige kleine Objekte, wie Latexkügelchen, u. ä., angewendet werden.

Das Probenmedium ist in der Regel ein flüssiges Medium, insbesondere ein Lösungsmittel für die Zielpartikel. Typi­ sche Probenmedien sind etwa organische Lösungsmittel, Wasser oder geeignete Pufferlösungen für biologische Untersuchun­ gen, Blut oder Kulturmedien von Pilz- oder Bakterienkultu­ ren. Im allgemeinen kann das Probenmedium flüssig, fest oder gasförmig sein, homogen oder heterogen, d. h. aus verschiede­ nen Phasen zusammengesetzt sein. Es kann etwa aus zwei Pha­ sen bestehen, nämlich einer Flüssigkeit oder einem Gas die bzw. das über einer Festkörper-Oberfläche steht.

Der Probenraum ist ein durch die gattungsgemäße Anord­ nung beobachtetes Volumenelement des Probenmediums.

Das die Zielpartikel des Probenmediums im Probenraum be­ strahlende Licht kann sowohl sichtbares Licht sein, als auch ultraviolettes oder infrarotes Licht. Im allgemeinsten Fall ist es elektromagnetische Strahlung, die durch die Zielpar­ tikel gestreut werden kann.

Das Licht kann beliebig moduliert sein, solange es eine feste Periode aufweist. Insbesondere kann es pulsförmig oder sinusförmig mit einem geeigneten Offset moduliert sein.

Das Licht kann in vielfältiger Weise gestreut werden. Insbesondere kann das Licht elastisch oder inelastisch ge­ streut werden, d. h. unter Beibehaltung oder Änderung seiner Wellenlänge. Ferner kann es unverzögert oder verzögert ge­ streut werden. Zu den verzögerten, elastischen Streuungen gehört die Lumineszenz und darunter insbesondere die Fluo­ reszenz mit typischen Verzögerungszeiten von einigen Nanose­ kunden.

Die Detektionseinrichtung besteht bei den gattungsgemä­ ßen Anordnungen in der Regel sowohl aus einem geeigneten op­ tischen Aufbau, aus einem oder mehreren Detektoren und einer nachgeschalteten Elektronik zur Aufbereitung der Detektions­ signale, in der Regel einschließlich einer analog-digital Wandlung.

Die Auswerteeinrichtung besteht bei den gattungsgemäßen Anordnungen in der Regel aus einem Interface zur Aufnahme der Daten von der Detektionseinrichtung sowie aus einer Re­ cheneinheit, die häufig ein Computer ist.

Die Detektionszeitpunkte der Photonen können sowohl durch eine absolute Bestimmung seit Beginn der Messung er­ halten werden, als auch durch eine Bestimmung des zeitlichen Abstands zwischen den Detektionszeitpunkten aufeinan­ derfolgend detektierter Photonen. Die beiden Fälle können durch Differenzbildung oder durch Aufsummieren der zeitli­ chen Abstände ineinander überführt werden.

Zu bestimmende Parameter können alle Parameter sein, die man mit zeitkorreliertem Einzelphotonen-Zählen bestimmen kann. Dies sind u. a. Fluoreszenzlebensdauern, ggf. auch die verschiedenen Fluoreszenzlebensdauern von multiexponentiel­ len Zerfällen, Rotationsdiffusionskonstanten, kinetische Übergangsraten, Photonenanzahlen bzw. Gesamtamplituden oder Amplitudenanteile von einzelnen Anteilen des gestreuten Lichts, ferner auch jede Form von statistischen Abstandmaßen zwischen gemessenem und gesuchtem Signal, z. B. ein Kleinste-Qua­ drate-Abstand oder ein Informationsmaß, wie es in M. Köllner, Applied Optics, Band 32(6) (1993), S. 806-820, beschrieben ist.

Korrelationsfunktionen können sowohl Auto- als auch Kreuzkorrelationsfunktionen der bestimmten Parameter sein, z. B. die Autokorrelationsfunktion von bestimmten Amplituden­ anteilen oder die Kreuzkorrelationsfunktion von bestimmten Fluoreszenzlebensdauern.

Im folgenden werden zunächst einige Ausführungsbeispiele der erfindungsgemäßen Anordnungen näher erläutert. Danach wird im Detail erklärt, wie die Eigenschaften der Zielparti­ kel aus mit Hilfe der erfindungsgemäßen Anordnungen gewonne­ nen Daten erhalten werden.

Betrachten wir zunächst den optischen Aufbau. Üblicher­ weise wird dieser in Form eines konfokalen oder nahfeldopti­ schen Aufbaus realisiert. Bei einem nahfeldoptischen Aufbau, der eine maximale Ortsauflösung aufweist, wird das Licht der Lichtquelle, die zum Bestrahlen oder Anregen der Zielparti­ kel dient, durch eine Öffnung auf das Probenmedium geworfen. Die Öffnung hat dabei einen Abstand von nur ca. 100 nm zum Probenraum. Ferner ist der Durchmesser der Öffnung kleiner als die Wellenlänge des Anregungslichts. Dadurch erreicht man eine extreme lokale Begrenzung der Intensitätsverteilung des Anregungslichts um die Öffnung herum. Ein solcher nah­ feldoptischer Aufbau ist besonders dazu geeignet, einzelne Zielpartikel gezielt anzufahren, die auf einer Oberfläche sitzen.

Ein konfokaler Aufbau, der eine maximale Empfindlichkeit aufweist, ist dazu geeignet, ein kleines Volumerxelement in einem Probenmedium, d. h. den Probenraum, zu bestrahlen und zu beobachten. Typischerweise läßt man zu diesem Zweck die Zielpartikel in das Beobachtungsvolumen hinein diffundieren und aus dem Beobachtungsvolumen hinaus diffundieren. Ebenso können die Zielpartikel in einem Flußsystem oder auf andere Weise in den Probenraum geführt oder bewegt werden.

Im folgenden wird auf Fig. 1 Bezug genommen. Als Licht­ quelle ist in Fig. 1 ein gepulster Laser 20 gezeigt. Typi­ scherweise wird ein modengekoppelter Laser oder ein gepul­ ster Diodenlaser verwendet, der Pulse mit einer Länge zwi­ schen ca. 100 fs (Femtosekunden) und ca. 500 ps (Pikosekunden), je nach Art des Lasers, mit einem Abstand von ca. 10 bis 30 ns (Nanosekunden) aussendet. Lichtquellen mit längeren Pulsen oder größeren Pulsabständen haben sich als ungünstig erwiesen.

Erfindungsgemäß kann statt einer gepulsten Lichtquelle auch eine periodisch modulierte Lichtquelle verwendet wer­ den. Zur Analyse der Meßsignale wird dann sowohl die Ampli­ tudenänderung als auch die Phasenänderung des Streulichts gegenüber dem Anregungslicht ausgewertet. Eine genauere Be­ schreibung dieses Meßprinzips findet sich in J. R. Lakowicz: "Principles of fluorescence spectroscopy", Plenum Press, New York, 1983.

Für den in Fig. 1 dargestellten konfokalen Aufbau wird das Laserlicht durch eine Linse 1 auf einen Punkt fokus­ siert. Im weiteren Verlauf des Strahlengangs wird das Laser­ licht durch einen dichroitischen Umlenkspiegel 2 in ein Mi­ kroskopobjektiv gelenkt. Der dichroitische Umlenkspiegel ist derart ausgebildet, daß er das Laserlicht reflektiert, je­ doch das längerwellige Streu- bzw. Fluoreszenzlicht der Zielpartikel durchläßt. Mit Hilfe des Umlenkspiegels 2 und des Mikroskopobjektivs wird der Fokuspunkt des Lasers auf einen Punkt innerhalb des Probenmediums abgebildet. Das Pro­ benmedium kann sich z. B. auf einen Probenhalter 5 in Form eines Objektträgers für die Mikroskopie befinden. Der vom Laser 20 beleuchtete Punkt innerhalb des Probenmediums wird mit Hilfe des Mikroskopobjektivs auf ein Pinhole 6 bzw. eine Lochblende abgebildet. Vor dem Pinhole befindet sich ein Spektralfilter 7, um gewünschte Streulichtanteile von unge­ wünschten farblich zu trennen. Direkt hinter dem Pinhole be­ findet sich ein Detektor 8, der so empfindlich ist, daß er einzelne Photonen nachweisen kann. Dazu eignen sich Pho­ tomultiplier, Mikrokanalplatten-Photomultiplier, Avalanche-Pho­ todioden, CCDs oder CCDs mit vorgeschalteten Bildverstär­ kern. Eine genauere Beschreibung eines konfokalen Aufbaus findet sich in: G. Kalusche et al., Experimental Technique of Physics, Vol. 41(2) (1995) S. 265-276, bzw. in M. Eigen, R. Rigler, Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A., Vol. 91 (1994), S. 5740-5747.

Außer dem Signal des Photodetektors 8 wird noch ein Syn­ chronisationssignal vom Laser 20 benötigt. Dies kann entwe­ der als direktes elektrisches Signal von der Steuerelektro­ nik des Lasers ausgegeben werden, oder es wird aus dem La­ serlicht selbst abgeleitet. Dazu wird mit Hilfe eines Strahlteilers 9, der in den Strahlengang des Lasers 20 ge­ stellt ist, ein Teil des Laserlichts auf einen Detektor 10 gelenkt. Dieser Detektor 10 kann z. B. eine Photodiode sein.

Um den Detektionszeitpunkt eines im Probenmedium ge­ streuten Photons zu bestimmen, muß der zeitliche Abstand zwischen dem Zeitpunkt der Anregung bzw. des Laserpulses und dem Zeitpunkt der Emission des Photons bestimmt werden. Han­ delt es sich bei dem gestreuten Licht um Fluoreszenz, so wird dieser zeitliche Abstand Fluoreszenz-Verzögerungszeit genannt. Er kann dadurch bestimmt werden, daß der zeitliche Abstand zwischen dem vom Detektor 10 ausgegebenen Trigger­ puls und dem Detektionszeitpunkt eines Photons im Detektor 8 bestimmt wird.

Aufgrund des elektrischen und optischen Aufbaus wird es in der Regel eine konstante Verzögerung zwischen einem Trig­ gerpuls des Detektors 10 und dem Zeitpunkt geben, an dem ein unverzögert gestreutes Photon vom Detektor 8 detektiert wird. Diese auch für alle sonstigen detektierten Photonen stets konstante Verzögerung kann durch eine geeignete Eich­ messung und durch geeignete Verzögerungselemente ausgegli­ chen werden.

Um stets möglichen Jitter zu entfernen, werden die elek­ trischen Pulse der Detektoren 8 und 10 üblicherweise über sogenannte "constant fraction"-Diskriminatoren (CFD) 21 ge­ leitet. Bei Wahl geeigneter Detektoren kann auf die CFDs 21 auch verzichtet werden.

Anschließend werden die Pulse einem sogenannten Zeit-zu- Amplituden-Konverter (Time-to-Amplitude Converter, TAC) 22 zugeführt. Ein TAC wandelt die Zeitdifferenz zwischen einem an ihm anliegenden Startpuls und einem an ihm anliegenden zeitlich verzögerten Stoppuls in eine Spannungsamplitude um. Der Startpuls startet eine im wesentlichen lineare Span­ nungsrampe, deren weitere Steigung bei Eintreffen des Stopp­ pulses abgebrochen wird. Der bis dahin erreichte Spannungs­ wert wird am Ausgang ausgegeben. Möchte man den zeitlichen Abstand zwischen dem Anregungspuls des Lasers und dem Detek­ tionszeitpunkt des Photons bestimmen, so würde man zunächst das Triggersignal des Laserpulses dem Starteingang des TAC 22 zuführen und den elektrischen Puls des Detektors 8, der das Photon detektiert hat, dem Stoppuls zuführen (sog. nor­ maler Modus). Bis auf konstante Verzögerungen könnte man so­ mit den zeitlichen Abstand zwischen der Anregung des Ziel­ partikel und der Emission des Photons bestimmen.

Nicht jedes emittierte Photon aus dem Probenraum kann von dem Mikroskopobjektiv 3 und dem Detektor 8 detektiert werden. Dies ist nur für ca. 1% möglich. Daher gibt es we­ sentlich mehr Anregungspulse des Lasers 20 als detektierte Photonen. Um aber verläßliche Bestimmungen der Eigenschaften vornehmen zu können, braucht man möglichst viele detektierte Photonen. Die Anzahl der detektierten Photonen kann dabei zwischen z. B. 50 und z. B. 50 Millionen liegen. Entsprechend muß die Zahl der Anregungspulse noch höher sein.

Erstellt man aus den bestimmten Verzögerungszeiten ein entsprechendes Histogramm, so wird man den zeitlichen Abfall der Fluoreszenz als Kurvenverlauf des Histogramms rekonstru­ iert wiederfinden.

Um den TAC 22 nicht unnötig zu belasten und damit Tot­ zeitverluste hervorzurufen, wird in der Regel der Puls des Detektors 8, der ein detektiertes Photon anzeigt, auf den Starteingang des TAC 22 und der Triggerpuls des Lasers 20 auf den Stoppeingang des TAC 22 gegeben (sog. invertierter Modus). Dies entspricht effektiv einer Umkehr der Zeitrich­ tung. Durch ein erneutes Umkehren der Zeitrichtung und eine eventuelle konstante Verschiebung der Zeitachse in der nach­ geschalteten Recheneinheit kann das ursprüngliche Signal oh­ ne weiteres rekonstruiert werden.

Die Ausgangsspannung des TACs 22 wird einem Analog-Digi­ tal-Wandler (ADC) 23 zugeführt. Der digitalisierte Amplitu­ denwert wird anschließend über eine Leitung 12 einer digita­ len Ein-/Ausgabekarte 28 und damit einem Rechner 27 zuge­ führt. Dort wird in der Regel eine Vielkanalanalyse vorge­ nommen, um das Histogramm aufzubauen. Das Histogramm wird somit aus den einzelnen digitalisierten Amplitudenwerten aufgebaut, die jeweils die Verzögerungszeit eines detektier­ ten Photons widerspiegeln.

Die bis hierhin geschilderte, bekannte Anordnung erlaubt es nur, die Verzögerungszeit eines detektierten Photons zu bestimmen. Sie erlaubt es nicht, den Detektionszeitpunkt des Photons absolut zu bestimmen, d. h. seit Beginn der Messung, bezogen etwa auf einen fixen Referenzzeitpunkt oder bezogen auf den Detektionszeitpunkt des letzten detektierten Pho­ tons. Um dies zu ermöglichen, sind der bisher beschriebenen Anordnung verschiedene Komponenten hinzugefügt worden, die im folgenden näher erläutert werden.

In einem ersten Ausführungsbeispiel wird ein vom ADC 23 nach jeder Wandlung ausgegebener Anfragepuls über eine Lei­ tung 11 zunächst an eine Umschalteinrichtung 24 geleitet und von dort weiter an die digitale Ein-/Ausgabekarte 28 zum Triggern einer Datenaufnahme. Der Anfragepuls bewirkt ein Umschalten der Ausgänge der Umschalteinrichtung 24, die so ausgebildet ist, daß sie auf der ansteigenden Flanke des An­ fragepulses umschaltet und damit effektiv die Frequenz des Anfragepulses halbiert. Sie bildet somit eine Frequenztei­ lerschaltung. Die Frequenzteilerschaltung 24 basiert auf ei­ nem Flip-Flop und weist zwei Ausgänge auf, die in üblicher Weise gegeneinander negiert sind. Sie kann in bekannter Weise aus D- oder JK-Flip-Flops aufgebaut werden.

Der erste Ausgang 15 des Frequenzteilers 24 ist z. B. mit dem Stopeingang des ersten Zählers 17 und dem Starteingang des zweiten Zählers 18 gekoppelt. Entsprechend ist der zwei­ te Ausgang 16 des Frequenzteilers 24 mit dem Starteingang des ersten Zählers 17 und dem Stopeingang des zweiten Zäh­ lers 18 gekoppelt. Eine umgekehrte Beschaltung wäre ebenso geeignet.

Die Frequenzteilerschaltung 24 möge nach Empfangen eines Anfragepulses vom ADC 23 z. B. den ersten Zähler 17 starten und den zweiten Zähler 18 stoppen. Der erste Zähler zählt daraufhin Takte eines Taktgebers 25, der in Fig. 1 gezeigt ist.

Der Taktgeber 25 kann z. B. eine gewöhnliche Quarzuhr sein, die durch Stecken gewisser Jumper in ihrer Frequenz variierbar ist. Typische Frequenzen für den Taktgeber 25 liegen zwischen 100 MHz und 20 kHz. Auch das vom Laser 20 selbst abgeleitete Triggersignal aus dem Detektor 10 kann als Takt verwendet werden.

Nach dem Detektieren eines weiteren Photons durch den Detektor 8 wird ein erneuter Anfragepuls durch den ADC 23 ausgelöst. Der Frequenzteiler 24 schaltet daraufhin seine Ausgänge um und der erste Zähler wird gestoppt und der zwei­ te Zähler gestartet. Der gestoppte erste Zähler überschreibt daraufhin mit seinem Zählerstand einen Zwischenspeicher 26.

Der Anfragepuls wird vom Frequenzteiler 24 über eine zweite Leitung 11 an die digitale Ein-/Ausgabekarte 28 weitergeleitet. Ebenso wird der Inhalt des Zwischenspeichers 26 über eine Leitung 13 an die Ein-/Ausgabekarte 28 weiter­ geleitet.

Durch Empfangen des Anfragepulses ist ferner die digi­ tale Ein-/Ausgabekarte 28 bereit, Daten aufzunehmen. Sie nimmt daraufhin sowohl den vom ADC 23 ausgegebenen gewandel­ ten TAC-Wert über die Leitung 12 als auch den Inhalt des Zwischenspeichers 26 über die Leitung 13 auf und speichert sie zusammen im Rechner 27.

Typischerweise hat der gewandelte TAC-Wert eine Breite von 8 Bit und der Zwischenspeicher 26 eine Breite von 24 Bit, so daß die digitale Ein-/Ausgabekarte 28 eine Eingangs­ breite von 32 Bit aufweisen sollte. Andere Bitbreiten sind selbstverständlich auch geeignet, sofern die Frequenz des Taktgebers 25 und die Breite des Zwischenspeichers 26 an die experimentellen Gegebenheiten angepaßt sind. Auch der Ein­ satz von 64 Bit aufnehmenden Ein-/Ausgabekarten ist möglich. Dabei könnten verschiedene Bitbereiche für die Signale von unterschiedlichen Detektoren reserviert werden. Ebenso könn­ ten einzelne Bits dazu dienen zu kodieren, welcher Detektor das jeweilige Photon detektiert hat.

Nach Beendigung der Datenaufnahme sendet die Ein-/Aus­ gabekarte 28 ein Bestätigungssignal über eine Leitung 14 an den Analog-Digital-Wandler, der daraufhin für eine erneu­ te Wandlung bereit steht.

Wird ein drittes Photon vom Detektor 8 detektiert, so sendet der ADC 23 einen erneuten Anfragepuls über die Lei­ tung 11 aus und der Frequenzteiler 24 schaltet seine Aus­ gänge erneut um. Daraufhin wird der erste Zähler erneut ge­ startet und der zweite Zähler gestoppt. Der zweite Zähler überschreibt daraufhin den Inhalt des Zwischenspeichers 26 und dieser Inhalt wird von der Ein-/Ausgabekarte 28 über die Leitung 13 aufgenommen. Gleiches geschieht für alle folgen­ den Photonen-Detektionsereignisse.

Auf diese Weise wird zu jedem Photon sowohl der zeit­ liche Abstand zum nachfolgenden Anregungspuls als auch der zeitliche Abstand zum vorhergehenden Detektionszeitpunkt ei­ nes Photons gespeichert.

Beide Informationen sind sowohl zusammen (siehe das er­ findungsgemäße Verfahren weiter unten) als auch getrennt zur Auswertung geeignet. Interessiert man sich z. B. nur für den Detektionszeitpunkt der Photonen, so kann man die digitali­ sierten TAC-Werte vernachlässigen und die Detektionszeit­ punkte einer geeigneten Auswertung zuführen. Interessiert man sich andererseits nur für den zeitlichen Verlauf des Fluoreszenzabklingens, so können die gewandelten TAC-Werte zu einem Histogramm zusammengefaßt und ausgewertet werden, ohne die zeitlichen Abstände der einzelnen Detektionszeit­ punkte der Photonen weiter zu betrachten.

In einem zweiten Ausführungsbeispiel wird statt einer Wechselzähleranordnung nur ein einziger Zähler bzw. eine Uhr verwendet, wie es in Fig. 2 gezeigt ist, auf die im folgen­ den Bezug genommen wird.

Ein Anfragepuls des ADCs 23, der über die Leitung 11 ausgegeben wird, bewirkt, daß der in Fig. 2 gezeigte Zwi­ schenspeicher 26 den Zeitwert des Zählers 29 bzw. der Uhr detektiert und zwischenspeichert. Der sich daraus ergebende Inhalt des Zwischenspeichers 26 wird von der digitalen Ein-/Aus­ gabekarte 28 nach Empfangen des Anfragepulses über eine Leitung 13 in gleicher Weise aufgenommen, wie es im ersten Ausführungsbeispiel beschrieben wurde.

In einem dritten Ausführungsbeispiel ist der Zähler 29 gemäß dem zweiten Ausführungsbeispiel derart geschaltet, daß ein Anfragepuls des ADCs 23 sein Anhalten bewirkt. Der aktu­ elle Zählerstand wird in den Zwischenspeicher 26 geschrie­ ben, der Zähler 29 wird zurückgesetzt und beginnt erneut zu zählen. Der Inhalt des Zwischenspeichers 26 wird von der di­ gitalen Ein-/Ausgabekarte 28 zusammen mit dem digitalisier­ ten TAC-Wert über die Leitung 12 aufgenommen, nachdem die digitale Ein-/Ausgabekarte 28 den Anfragepuls des ADCs 23 über die Leitung 11 empfangen hat, wie es bereits im ersten Ausführungsbeispiel beschrieben wurde. Die Bitbreite des Zwischenspeichers 26 und des ADC-Werts kann in ähnlicher Weise, wie im ersten Ausführungsbeispiel beschrieben, ausge­ bildet sein.

Auch in diesem Ausführungsbeispiel zählt der Zähler 29 Takte eines z. B. in Fig. 2 gezeigten Taktgebers 25, der, wie im ersten Ausführungsbeispiel, in seiner Taktrate variabel ausgebildet sein kann.

Die in den Ausführungsbeispielen geschilderten Anordnun­ gen können sowohl derart angeordnet werden, daß die Zähler, Zwischenspeicher, Taktgeber und Uhren sich außerhalb des Rechners 27 befinden und die Daten mit Hilfe der digitalen Ein-/Ausgabekarte 28 in den Rechner 27 aufgenommen werden. Ebenso gut können aber sämtliche Komponenten der Anordnungen auf einer gedruckten Leiterplatine angeordnet und in den Rechner 27 integriert werden.

In einem vierten Ausführungsbeispiel werden die Pulse der Detektoren 8 und 10 bzw. der CFDs 21 nicht durch einen TAC 22, einen ADC 23 und die beschriebenen weiteren Kompo­ nenten effektiv für den Rechner 27 aufbereitet. Vielmehr werden die Signale in ihrem analogen zeitlichen Verlauf mit möglichst hoher zeitlicher Genauigkeit detektiert. Dazu kann z. B. ein Zweistrahl-Oszilloskop mit möglichst großer Spei­ chertiefe verwendet werden. Die so gewonnen Daten können an­ schließend wieder zu Verzögerungszeiten und Abständen zwi­ schen Detektionszeitpunkten umgerechnet werden.

Nach der obigen Beschreibung der erfindungsgemäßen An­ ordnungen soll im folgenden beschrieben werden, wie aus den gewonnenen Daten die Eigenschaften der Zielpartikel bestimmt werden.

Im folgenden wird auf Fig. 3 bezug genommen. Fig. 3 zeigt eine Kurve, die die zeitlichen Abstände Δt aufeinan­ derfolgender Detektionszeitpunkte von Photonen für eine Pho­ tonenfolge beschreibt. Die Photonen sind dabei in der Rei­ henfolge ihrer Detektion durchnumerieret und auf der X-Achse mit ihrer Ereignisnummer bezeichnet. Der zeitliche Abstand zwischen aufeinanderfolgenden Detektionszeitpunkten von Pho­ tonen ist hier mit einer Genauigkeit von 50 Nanosekunden de­ tektiert, was einer Taktrate des Taktgebers 25 von 20 MHz entspricht. Diese Messung wurde mit einem konfokalen Aufbau durchgeführt. Als Zielpartikel wurden Rhodamin-110 Farb­ stoff-Moleküle verwendet, die in Ethylenglykol gelöst wur­ den.

Befindet sich kein Zielpartikel bzw. Rhodamin-110 Mole­ kül im Probenraum, ist die Zählrate der detektierten Photo­ nen wesentlich geringer, als wenn ein stark absorptions- und fluoreszenzfähiges Farbstoff-Molekül wie Rhodamin-110 sich im beobachteten Volumenelement befindet. Beispiele dafür sind in Fig. 3 zu sehen. Um die Ereignisnummer von ca. 1.500 herum beträgt der zeitliche Abstand zwischen einzelnen Pho­ tonendetektionsereignissen ca. 60.000 × 50 ns, also ca. 3 ms, was einer Hintergrundzählrate von ca. 300 Hz entspricht. Bei der Ereignisnummer von ca. 1.900 ist der zeitliche Abstand zwischen einzelnen Detektionszeitpunkten von Photonen we­ sentlich geringer. Der mittlere Abstand zwischen den ein­ zelnen Photonenereignissen beträgt dort teilweise ca. 1.000 × 50 ns, also ca. 50 µs. Dies entspricht einer Detektionsrate von ca. 20 kHz. Sie ist damit ca. 60mal größer als die Hin­ tergrundzählrate.

Dies wird unmittelbar einsichtig mit Hilfe der in Fig. 4 gezeigten Darstellung, auf die im folgenden Bezug genommen wird. Fig. 4 zeigt die Daten der Fig. 3, wobei auf der Y-Ach­ se nicht mehr der zeitliche Abstand zwischen aufeinander­ folgenden Detektionszeitpunkten von Photonen aufgetragen ist, sondern die Anzahl der pro Millisekunde detektierten Photonen. Ferner ist die Ereignisnummer auf der X-Achse durch die Zeit ersetzt. Fig. 4 läßt sich aus den der Fig. 3 zugrundeliegenden Daten z. B. dadurch erhalten, daß die zeit­ lichen Abstände zwischen den einzelnen Detektionszeitpunkten auf summiert werden und somit jedem Photon der absolute Zeit­ punkt seiner Detektion zugeordnet werden kann. Sodann kann die Anzahl der in jedes Millisekunden-Intervall fallenden Detektionszeitpunkte bestimmt und aufgetragen werden. In Fig. 3 waren zwei Bereiche, die jeweils 220 detektierten Photonen entsprachen, markiert. Die gleichen Bereiche sind in Fig. 4 aufgetragen. Der Bereich um die Ereignisnummer von ca. 1.500 der Fig. 3 nimmt eine Zeitspanne von 737 ms in Fig. 4 ein. Die gleiche Anzahl von 220 Photonen um die Ereignis­ nummer von 1.900 in Fig. 3, der eine wesentlich höhere mitt­ lere Detektionsrate entsprach, nimmt in Fig. 4 nur eine Zeitspanne von 46 ms ein. Man sieht, wie sich die Rate der Photonendetektion dadurch erhöht, daß sich ein Rhodamin-110 Molekül im Fokus bzw. Probenraum befindet. Es kommt in der Auftragung der Fig. 4 zu einem Peak der sich deutlich gegen den Untergrund abhebt.

Die Darstellungsweise der Fig. 4 wird gewöhnlich als Multi-Channel Scaling (MCS) oder Vielkanalzählung bezeich­ net.

Während ein Meßverfahren, welches Daten in der Form der Fig. 4 erzeugt (MCS-Meßverfahren), das Nachweisen eines ein­ zelnen Moleküls anschaulich macht, bietet ein Meßverfahren, das Daten in der Form der Fig. 3 aufnimmt, eine genauere Möglichkeit, die Daten auszuwerten. Dies liegt darin begrün­ det, daß in Fig. 3 jedem einzelnen Photon sein genauer De­ tektionszeitpunkt zugeordnet werden kann. Bei MCS-Meßver­ fahren wird der Detektionszeitpunkt eines Photons hingegen häufig nur mit einer Genauigkeit von 1 ms ermittelt.

Typische Durchmesser des Probenraums bzw. Fokus in einem konfokalen Aufbau betragen 0,5-1 µm. Die Zeit, die ein Rhoda­ min-110 Molekül benötigt, um eine Distanz von 0,5 µm zu dif­ fundieren, d. h. durch den Fokus hindurch zu treten, beträgt im quadratischen Mittel ca. 500 µs Eine Kanalbreite der In­ tegrationszeit von einer Millisekunde liegt daher nahe an der Durchtrittszeit der Moleküle durch den Fokus. Genauere Betrachtungen der Ein- und Austrittszeiten sind daher mit MCS-Daten nicht möglich. Solche Daten benötigt man aber, um Korrelationsfunktionen für die aufgenommenen Daten zu be­ rechnen. Dies wird weiter unten im Detail geschildert.

Für die Entscheidung, ob sich ein Zielpartikel während eines Meßintervalls im Fokus befand oder nicht, kann außer den in Fig. 3 bzw. Fig. 4 dargestellten Detektionsraten der Photonen auch das jeweilige Abklingverhalten des detektier­ ten Signals auf einer ns-Skala für die einzelnen Meßinter­ valle betrachtet werden. Dabei wird, wie es für zeitkorre­ liertes Einzelphotonenzählen üblich ist, der zeitliche Ab­ stand zwischen dem Laserpuls bzw. Anregungszeitpunkt und dem Detektionszeitpunkt der Photonen, also die Fluoreszenz-Ver­ zögerungszeit, für die einzelnen Photonen des Meßintervalls in Histogrammform dargestellt. Dies ist in den Fig. 5 und 6 für Beispieldaten aus den Fig. 3 und 4 gezeigt.

Die Histogramme der Fig. 5 und 6 sind mit einer zeit­ lichen Auflösung von ca. 50 Pikosekunden/pro Kanal erstellt worden.

Zu jedem Photon wurde außer dem zeitlichen Abstand zum vorausgegangenen Detektionszeitpunkts eines Photons auch die zugehörige Verzögerungszeit gespeichert. Diese Werte liegen stets unterhalb der Periodendauer des Anregungslichts bzw. des zeitlichen Abstandes zwischen aufeinanderfolgenden La­ serpulsen. In den Fig. 5 und 6 liegt die Verzögerungszeit zwischen 0 und ca. 12 ns.

Fig. 5 zeigt ein Histogramm dieses zeitlichen Abkling­ verhaltens für den in Fig. 3 markierten Bereich von 220 Pho­ tonen um die Ereignisnummer von ca. 1.500 bzw. den in Fig. 4 markierten Bereich von 220 Photonen entsprechend 737 ms. Wie aus den Fig. 3 und 4 deutlich wird, befindet sich während dieses Meßintervalls kein Zielpartikel im Probenraum. Ent­ sprechend zeigt Fig. 5 einen zeitlichen Verlauf des Histo­ gramms, der einen Peak zu einem frühen Zeitpunkt hat und da­ nach einen fast gleichverteilten zeitlichen Verlauf annimmt. Der Peak entspricht unverzögertem Streulicht und der fast gleichverteilte weitere Verlauf entspricht sonstigem Hin­ tergrundrauschen.

Im Gegensatz dazu zeigt Fig. 6 den zeitlichen Verlauf der Fluoreszenz eines Rhodamin-110 Moleküls bzw. eines Ziel­ partikels. Fig. 6 zeigt ein Histogramm von der Art der Fig. 5 für den in Fig. 3 markierten Bereich von 220 Photonen um die Ereignisnummer von ca. 1.900 herum bzw. für den in Fig. 4 markierten Bereich von 220 Photonen entsprechend 46 ms. Aus den Fig. 3 und 4 wurde bereits deutlich, daß sich in die­ sem Meßintervall ein Zielpartikel bzw. Rhodamin-110 Molekül im Fokus befindet. Entsprechend beobachtet man den in Fig. 6 gezeigten zeitlichen Verlauf der Fluoreszenz, der nach an­ fänglich steilem Ansteigen, was der Anregung durch den zeit­ lich kurzen Laserpuls entspricht, im wesentlichen gleich­ mäßig abfällt. Der zeitliche Abfall ist wesentlich langsamer als in Fig. 5. Die aus Fig. 6 zu erschließende Fluoreszenz­ lebensdauer liegt im Bereich von 3,6 ns.

Zusätzlich sieht man in Fig. 6 zu Beginn einen deutlich ausgeprägten Peak, der von zusätzlichen unverzögert gestreu­ ten Anteilen des gestreuten Lichts herrühren kann. Um zu entscheiden, ob der anfänglich Peak - und vergleichbare Peaks auf vergleichbaren Histogrammen - von zusätzlichen un­ verzögert gestreuten Anteilen des gestreuten Lichts her­ rührt, wird in gesonderten Messungen nur unverzögertes Streulicht aufgenommen, in dem z. B. reines Ethylenglykol vermessen wird. Man erhält daraus einen Fig. 5 vergleich­ baren zeitlichen Verlauf, jedoch mit wesentlich höheren An­ zahlen von detektierten Photonen pro Kanal des Histogramms.

Desgleichen würde man in gesonderten Messungen das Fluo­ reszenzabklingverhalten von Zielpartikeln, in diesem Fall Rhodamin-110, erfassen.

Mit Hilfe dieser dann vorbekannten Daten kann entschie­ den werden, wie groß der Anteil des unverzögert gestreuten Lichts zur Amplitude der Daten z. B. der Fig. 6 ist. Dies kann mit Hilfe von effizienten statistischen Algorithmen ge­ schehen, etwa einer kleinsten Quadrate-Anpassung oder einer Maximum-Likelihood-Anpassung, die in der Literatur beschrie­ ben wurden (siehe z. B.: J. N. Demas: "Excited state lifetime measurements", Academic Press, New York, 1983, bzw. M. Köllner, J. Wolfrum, Chemical Physics Letters, Band 200 (1992) S. 199-204).

Mit Hilfe eines Anpassungstests, der z. B. einen exponen­ tiell abfallenden Verlauf für das Abklingen der Fluoreszenz des Zielpartikels und einen noch zu bestimmenden Anteil von unverzögertem Streulicht am Signal annimmt, kann durch die Berücksichtigung des Anteils des unverzögerten Streulichts die Bestimmung der Fluoreszenzlebensdauer mit größerer Ex­ aktheit vorgenommen werden. In einer solchen Weise kann somit die Fluoreszenzlebensdauer eines Zielpartikels als vorgegebene Eigenschaft des Zielpartikels mit Hilfe der er­ mittelten Amplitudenanteile, in diesem Fall der Fluoreszenz und des unverzögertem Streulichts, bestimmt werden. Weitere Anteile etwa von anderen Partikeln oder anderen Streuquel­ len, können mit Hilfe von ähnlichen gesonderten Messungen und den daraus gewonnenen Daten berücksichtigt werden.

Um die Detektionseffizienz zu erhöhen, kann der in den Fig. 1 und 2 gezeigte optische Aufbau durch ein zweites Mikroskopobjektiv in Verlängerung des Strahlengangs des er­ sten Mikroskopobjektivs 3 unterhalb des Probenhalters 5 er­ gänzt werden. Die Lichtsammeleffizienz erhöht sich dadurch um einen Faktor 2. Dem Mikroskopobjektiv muß, wie dem Mikro­ skopobjektiv 3, ein Filter, ein Pinhole und ein Detektor nachgeschaltet werden. Die weitere nachgeschaltete Datener­ fassungselektronik und -auswerteeinrichtung kann für den zweiten Detektionspfad gesondert aufgebaut werden, oder die Signale des zweiten Detektors werden dem bereits vorhandenen TAC 22 über eine Routingeinheit zugeführt. Im erstgenannten Falle einer gesonderten Datenerfassungsanordnung können die Photonen, die an den einzelnen Detektoren detektiert wurden, in der soeben geschilderten Weise einzeln ausgewertet wer­ den. Insbesondere können die Amplituden der einzelnen Streu­ lichtanteile, d. h. des verzögerten Streulichts bzw. der Fluoreszenz und des unverzögerten Streulichts, für die durch die einzelnen Detektoren detektierten Photonen bestimmt und daraus wiederum die Eigenschaften der Zielpartikel ermittelt werden. Ebenso können die Daten auch in den entsprechenden Histogrammen zusammengefaßt und gemeinsam ausgewertet wer­ den.

Ferner kann die Detektionseffizienz durch den Einsatz eines geeigneten Spiegels direkt unterhalb der Probe erhöht werden.

Die Histogramme der Fig. 5 und 6 wurden für ein Meß­ intervall erstellt, in das 220 Photonen fielen. Ebenso gut hätte man eine beliebige andere sinnvolle Anzahl von Photo­ nen zu einem Histogramm zusammenfassen können. Außerdem legt Fig. 4 es nahe, daß nicht für eine bestimmte Anzahl von Pho­ tonen sondern für ein bestimmtes vorgegebenes Zeitintervall die Histogramme wie in den Fig. 5 und 6 erstellt werden.

Für den Fall, daß die Intervalle durch eine vorgegebene Anzahl von detektierten Photonen definiert sind, kann eine gleitende Auswertung für verschiedene Photonen-Abschnitte der Fig. 3 dadurch vorgenommen werden, daß entsprechende Histogramme gebildet und analysiert werden. Z. B. kann je­ weils ein später detektiertes Photon in das Histogramm auf­ genommen und ein früher detektiertes Photon entfernt werden. Ebenso gut können statt einem Photon zehn oder eine be­ liebige andere Zahl von Photonen aufgenommen bzw. aus dem Histogramm entfernt werden. Ferner kann die vorgegebene An­ zahl von detektierten Photonen auch variable gestaltet wer­ den. Sie kann z. B. für den Fall einzeln vorliegender Ziel­ partikel größer oder kleiner gewählt werden, als für den Fall von sonstigem gestreuten Licht.

Die bestimmten Amplitudenanteile der einzelnen Streu­ lichtanteile oder ggf. die bestimmte Lebensdauer können dann mit Hilfe Detektionszeitpunkte oder der zeitlichen Abstände zwischen aufeinanderfolgenden Detektionszeitpunkten als Funktion der Zeit oder der Ereignisnummer aufgetragen wer­ den. Dies ist beispielhaft in Fig. 7 gezeigt.

Fig. 7 zeigt eine geleitende Auswertung der Daten, die der Fig. 3 zugrunde liegen, wobei die Histogramme jeweils auf der Basis von 40 Photonen erstellt wurden und das je­ weils nächste Histogramm durch Hinzuziehen eines später de­ tektierten Photons und Herauslassen eines früher detektier­ ten Photons erstellt wurde. Auch der mit Δt bezeichnete Ab­ stand zwischen den einzelnen Detektionszeitpunkten der Pho­ tonen, der in Fig. 7 durch "⬩" gekennzeichnet ist, ist über jeweils 40 Photonen gemittelt.

Der Bereich um die Ereignisnummer von ca. 18.850 zeigt sehr deutlich, daß ein kleiner zeitlicher Abstand der detek­ tierten Photonen, der auf das Vorhandensein eines Zielparti­ kels im Fokus hinweist, mit einem ebenso kleinen Amplituden­ anteil des unverzögerten Streulichts und einer großen Fluo­ reszenzlebensdauer korreliert. Die Fluoreszenzlebensdauer beträgt in diesem Fall ca. 4 bis 5 ns. Im Gegensatz dazu zeigt der Bereich um die Ereignisnummer von ca. 19.000 einen großen zeitlichen Abstand zwischen aufeinanderfolgenden Pho­ tonenereignissen, d. h. kein Zielpartikel befindet sich im Fokus, weshalb der Amplitudenanteil des unverzögerten Streu­ lichts auf nahezu 100% ansteigt und die Fluoreszenzlebens­ dauer deutlich absinkt.

Daten von der Form, wie sie in Fig. 7 exemplarisch dar­ gestellt ist, eignen sich erfindungsgemäß auch zur weiteren Verarbeitung. In der Literatur (z. B. M. Eigen, R. Rigler, Proeedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A., Vol. 91 (1994), S. 5740-5747) ist allgemein be­ schrieben, daß mit Hilfe der Autokorrelationsfunktion der detektierten Photonen verläßlich bestimmt werden kann, ob nur ein Zielpartikel oder mehr als ein Zielpartikel sich während der Messung im Mittel im Fokus befand. Ferner kann die Diffusionskonstante eines Zielpartikels aus der Auto­ korrelationsfunktion des gestreuten Lichts ermittelt werden. Mit Hilfe von Korrelationsfunktionen kann auch das signifi­ kante gemeinsame Vorliegen von einzelnen Anteilen des ge­ streuten Lichts bestimmt werden. Dazu berechnet man in be­ kannter Weise die Kreuzkorrelationsfunktion der einzelnen bestimmten Amplitudenanteile. Weist sie einen deutlichen Peak um den zeitlichen Nullpunkt auf, so liegen die betrach­ teten Streulichtanteil signifikant gleichzeitig im Signal vor bzw. treten in der Regel gleichzeitig auf. Dies erlaubt es, das gemeinsame Auftreten von zwei Zielpartikeln signifi­ kant nachzuweisen.

Von Interesse ist eine solche Messung dort, wo für phar­ makologische Zwecke die Bindung zweier Moleküle oder Mole­ külkomplexe aneinander festgestellt werden soll. Dies kann von Relevanz sein im sogenannten Drug Screening. Dort ist häufig relevant, eine besonders starke Bindung zwischen ei­ nem Zielpartikel, z. B. einem Antigen und einem anderen Ziel­ partikel, z. B. einem Antikörper, nachzuweisen. Sind die Zielpartikel, deren Bindung beobachtet werden soll, beide fluoreszenzmarkiert, so sollten die jeweiligen Amplituden­ anteile gleichzeitig erhöhte Werte annehmen. Die Amplituden­ anteile können dabei z. B. mit Hilfe der gesondert aufgenom­ menen Daten für diese Zielpartikel bestimmt werden. Ist die Bindung schwach, so wird dieses gleichzeitige Auftreten nur schwach ausgeprägt sein. Ist die Bindung stark, werden die Partikel in der Regel aneinander gebunden und daher gleich­ zeitig im Fokus beobachtet werden.

Bindung kann aber auch mit Hilfe eines Sandwich-Tests nachgewiesen werden. Bei einem Sandwich-Test wird die Bin­ dung eines gesuchten Moleküls zwischen zwei anderen Molekü­ len beobachtet. Mindestens eines von diesen muß fluoreszie­ rend oder fluoreszenzmarkiert sein. Sind beide fluoreszenz­ markiert, kann ihr gemeinsames Auftreten mit Hilfe einer Korrelationsfunktion bestimmt und zur quantitativen Analyse der Bindung herangezogen werden. Ist nur eines von ihnen fluoreszierend, kann die Bindung über eine geänderte Diffu­ sionskonstante aus der Autokorrelationsfunktion erschlossen werden.

Da das erfindungsgemäße Verfahren die Untersuchung ein­ zelner Partikel erlaubt, ermöglicht es, nicht nur den Mit­ telwert von physischen Meßwerten zu erfassen. Vielmehr kann auch die Verteilung des Meßwerts durch die Bestimmung vieler einzelner Meßwerte an einzelnen Zielpartikeln direkt ermit­ telt werden. Damit kann auch die Heterogenität einer hetero­ genen Menge von Zielpartikeln analysiert werden.

Erfindungsgemäß kann z. B. die Autokorrelationsfunktion der Fluoreszenzlebensdauern als bestimmter Parameter er­ stellt werden. Auch kann die Autokorrelationsfunktion des auf Fluoreszenz der Zielpartikel zurückgeführten Anteils am gestreuten Licht berechnet werden. Dieser Amplitudenanteil, kann dabei, wie bereits erklärt, unter Berücksichtigung der vorbekannten Fluoreszenzlebensdauer des Zielpartikels be­ stimmt werden. Daraus ergibt sich eine Fluoreszenzlebens­ dauer-selektive Autokorrelationsfunktion. Aus ihr kann z. B. eine zugehörige Diffusionskonstante ermittelt werden.

Im Gegensatz zu herkömmlichen FCS-Techniken kann die Korrelationsfunktion erfindungsgemäß selektiv und unter Eli­ minierung von Streulichtanteilen berechnet werden. Im Ergeb­ nis ergibt sich ein verbessertes Signal-Rausch-Verhältnis bei extrem schwachem Signal, das sich aus selten und einzeln im Probenraum befindlichen Zielpartikeln ergibt.

Eine Fluoreszenzlebensdauer-selektive Autokorrelations­ funktion kann z. B. dazu verwendet werden, quantitativ die Bindung eines fluoreszierenden Zielpartikels zu analysieren, dessen Fluoreszenzlebensdauer sich im gebundenen und freien Zustand unterscheiden. Hierfür geeignete Farbstoffe sind z. B. die in der DE-OS 38 07 975 beschrieben sog. "intelligenten" Farbstoffe. Es kann hier erfindungsgemäß die Autokorrelationsfunktion selektiv für den gebundenen und den freien Zustand berechnet werden.

Es kann auch die Kreuzkorrelationsfunktion von unter­ schiedlichen Parametern berechnet werden, so daß sich signi­ fikantes gemeinsames Auftreten oder signifikantes getrenntes Auftreten an einem Peak bzw. Tal um den zeitlichen Nullpunkt der Kreuzkorrelationsfunktion ablesen läßt.

Auch kann im Falle von zwei Detektoren die Kreuzkorrela­ tionsfunktion von gleichen oder verschiedenen für die Daten der einzelnen Detektoren bestimmten Parameter berechnet wer­ den. Auch hier lassen sich in gleicher Weise Aussagen über gemeinsames oder getrenntes Auftreten von Zielpartikeln ab­ lesen.

Es kann auch vorkommen, daß sich mehr als ein Zielparti­ kel im Fokus befindet. Weisen verschiedene Zielpartikel un­ terschiedliche Fluoreszenzlebensdauern auf, so wird das zu einem Histogramm umgeformte Meßsignal einen multiexponenti­ ellen zeitlichen Verlauf des Fluoreszenzabklingens aufwei­ sen. Einen ähnlichen Verlauf kann die Fluoreszenz aufweisen, wenn das einzelne Zielpartikel bereits ein multiexponentiel­ les Fluoreszenzabklingen zeigt. In einem solchen Fall können die weiter oben zitierten statistischen Verfahren dergestalt eingesetzt werden, daß für jeden einzelnen exponentiellen Zerfall ein gesonderter Amplitudenanteil bestimmt wird. Um dies sinnvoll durchführen zu können, werden wieder in geson­ derten Messungen Daten über das Fluoreszenzabklingverhalten der verschiedenen Zielpartikel bzw. jedes einzelnen Zielpar­ tikels aufgenommen.

Im Falle vom multiexponentiellen Fluoreszenzzerfällen bzw. im Falle des Vorliegens von mehr als einem Zielpartikel im Fokus können neben den Amplitudenanteilen der einzelnen Zielpartikel zum Gesamtstreulicht auch deren jeweilige Fluo­ reszenzlebensdauern bestimmt werden, sofern die verschiede­ nen Zielpartikel verschiedene Fluoreszenzlebensdauern auf­ weisen. Auch diese Amplitudenanteile oder Fluoreszenzlebens­ dauern können miteinander korreliert werden bzw. deren Kreuzkorrelationsfunktion kann berechnet werden. Das gemein­ same Auftreten von z. B. aneinander gebundenen Zielpartikeln kann durch ein gemeinsames Auftreten der erhöhten Amplitu­ denanteile bzw. Fluoreszenzlebensdauern nachgewiesen werden. Besonders geeignet sind dafür die in der DE 42 10 970 C2 beschriebenen sog. "Multiplex"-Farbstoffe.

Die spektroskopischen Daten können auch das Rotations­ verhalten der Zielpartikel widerspiegeln, wie es in der Spektroskopie allgemein bekannt ist. Die Rotation eines Zielpartikels führt zu einer Depolarisation der Fluoreszenz während der Abklingzeit. Durch den Einsatz von polarisiertem Anregungslicht und einem Analysator vor dem Detektor 8 kann dieses Depolarisationsverhalten in einem Histogramm gemäß Fig. 6 bestimmt werden. Wird es in gesonderten Messungen ge­ nau bestimmt, kann ein Wissen darüber auch zur Bestimmung des Amplitudenanteils der Fluoreszenz eines Zielpartikels zum gesamten Streulicht verwendet werden.

Nebst spektroskopisch unabhängigen Fluorophoren für z. B. die zwei oben erwähnten Zielpartikel, können auch zwei Fluo­ rophore verwendet werden, zwischen denen resonanter Energie­ transfer auftritt. So kann durch das Laserlicht das erste Zielpartikel angeregt werden, d. h. Laserlicht absorbieren, kann diese Energie resonant an das zweite Zielpartikel über­ tragen, und letzteres kann emittieren. Ein solcher resonan­ ter Energietransfer ist stark abstandsabhängig. D. h. er wird dann effizient stattfinden, wenn die Zielpartikel aneinander gebunden sind und fast nicht auftreten, wenn die Zielparti­ kel nicht aneinander gebunden sind. Bestimmt man dann die Amplitudenanteile der einzelnen Zielpartikel am Streulicht und berechnet deren Kreuzkorrelationsfunktion, so wird sich eine starke Bindung zwischen den Zielpartikeln dahingehend äußern, daß nur die Fluoreszenz des zweiten, des die über­ tragene Energie aufnehmenden Zielpartikels zu beobachten sein wird, wenn beide gleichzeitig im Fokus vorliegen. Man wird also eine negative Korrelation in der Kreuzkorrela­ tionsfunktion beobachten.

Der Verlauf einer Autokorrelationsfunktion für Streu­ licht, daß mit Hilfe eines oben beschriebenen konfokalen op­ tischen Aufbaus aufgenommen wird, ist durch die Diffusion des fluoreszierenden Partikels bestimmt. Die charakteristi­ schen Größen dafür sind einerseits die Diffusionskonstante des Partikels und andererseits die räumlichen Dimensionen des Fokus. Diese Diffusionskonstanten beeinflussen auch in entscheidender Weise die soeben beschriebenen Kreuzkorrela­ tionsfunktionen. In separaten Messungen können die Diffu­ sionskonstanten der einzelnen Zielpartikel bzw. der charak­ teristische Verlauf ihrer Autokorrelationsfunktion bestimmt werden. Mit Hilfe dieses Wissens können die Kreuzkorrelatio­ nen daraufhin ausgewertet werden, wie groß die Anteile der einzelnen Zielpartikel am Zustandekommen der Korrelations­ funktionen sind.

Die erfindungsgemäßen Anordnungen sind, wie bereits er­ wähnt, besonders dazu geeignet, einzelne Zielpartikel spek­ troskopisch zu untersuchen. Um zu entscheiden, ob bzw. daß ein einzelnes Zielpartikel im Probenraum oder -medium bzw. Beobachtungsvolumen vorliegt, müssen zunächst die Zielpar­ tikel in einer solchen Verdünnung vorliegen, daß sich im Mittel weniger als ein Zielpartikel im beobachteten Teil des Probenmediums bzw. dem Probenraum befindet. Typische Konzen­ trationen hierfür sind 10^-9-10^-12 M Lösungen (M = mol/Li­ ter). Verwendet man z. B. eine 10^-12 M Lösung von Rhodamin-110 in Ethylenglykol und hat einen Fokus mit einer ellipsoi­ den Form, deren kurze Halbachsen 0,25 µm und deren lange Halbachse 2,5 µm betragen, so ist das Volumen des beobachte­ ten Probenraums ca. 0,65 µm³. Multiplikation mit einer Kon­ zentration von 10^-12 mol/Liter an Rhodamin-110 Molekülen ergibt eine Wahrscheinlichkeit von ca. 4 × 10^-4 dafür, daß sich ein Rhodamin-110 Molekül zu einem gegebenen Zeitpunkt im beobachteten Probenraum befindet.

Ferner können auch höher konzentrierte Lösungen unter­ sucht werden, wenn das Fluoreszenzverhalten des in einer solchen Lösung stark verdünnt vorliegenden Zielpartikels durch die in höherer Konzentration vorliegenden Partikel be­ einflußt wird. Der Einfluß geschieht dabei durch lokale, mo­ lekulare Wechselwirkungen und kann sich sowohl auf die Fluo­ reszenzlebensdauer als auch auf andere Charakteristiken des Fluoreszenzverhaltens, wie die Intensität der Fluoreszenz, das Depolarisationsverhalten oder ähnliches, auswirken. Das Depolarisationsverhalten kann sich z. B. aufgrund einer Bin­ dung zwischen den Zielpartikeln und den höher konzentriert vorliegenden Partikeln ändern.

Eine Bestimmung des Fluoreszenzverhaltens der Zielparti­ kel erlaubt unter diesen Umständen Rückschlüsse auf die hö­ her konzentriert vorliegenden Partikel. Die Zielpartikel können dabei so stark verdünnt sein, daß sie in der Regel einzeln im Probenraum vorhanden sind.

Im folgenden wird erneut Fig. 3 betrachtet. Die relativ kleinen zeitlichen Abstände zwischen der detektierten Photo­ nen bei der Ereignisnummer von ca. 1.900 bzw. die entspre­ chende relativ hohe Dichte der Detektionszeitpunkte, d. h. die hohe Detektionsrate von Photonen, weisen, wie bereits erklärt, auf das Vorliegen eines einzelnen Zielpartikels im Probenmedium hin. Für eine mehr quantitative Betrachtung können die in R. A. Keller, Applied Spectroscopy, Band 50 Nr. 7 (1996), Seiten 12A bis 32A beschriebenen Mittelungs- und Schwellensetzungsverfahren verwendet werden.

Es kann aber auch jeder aus den Histogrammen bestimmbare Parameter, etwa der Amplitudenanteil einer bestimmten Fluo­ reszenzlebensdauer, z. B. über einfache Schwellensetzungsver­ fahren zur Entscheidung herangezogen werden, ob ein einzel­ nes Zielpartikel im Probenraum vorliegt.

Ferner kann ein statistisches Verfahren verwendet wer­ den, das die Hypothese testet, ob das beobachtete Signal von reinem Hintergrundrauschen herrühren kann. Dazu wird die Wahrscheinlichkeit berechnet, in so kurzen zeitlichen Ab­ ständen eine Reihe von Photonen zu beobachten, und zwar un­ ter der Annahme, daß sie von Hintergrundrauschen bzw. unver­ zögertem Streulicht herrühren. Sinkt diese Wahrscheinlich­ keit unter ein vorgegebenes Maß, so liegt mit entsprechender Signifikanz mindestens ein fluoreszierendes Molekül bzw. ein Zielpartikel im Fokus vor.

Wählt man, wie es in den Fig. 3 bis 6 geschehen ist, die einem einzeln vorliegenden Zielpartikel zugeordneten Photonen aus und erstellt ein Histogramm, wie in Fig. 6, so kann die Fluoreszenzlebensdauer für ein einzelnes Zielparti­ kel bestimmt werden. Alternativ kann das beobachtete Fluo­ reszenzabklingverhalten mit vorbekannten Daten für bestimmte Arten von Zielpartikeln verglichen werden, und es kann ent­ schieden werden, welche der bekannten Arten von Zielparti­ keln in diesem Falle vorliegt. Dazu eignen sich insbesondere Algorithmen, die von M. Köllner in Applied Optics Band 32 (6) (1993), auf den Seiten 806 bis 820 beschrieben wurden. Auf diese Weise können einzelne Moleküle bzw. Zielpartikel identifiziert werden.

Die Anordnungen zur Datenerfassung und die zugehörigen Auswerteverfahren eignen sich damit für die in der DE 42 10 970 C2 beschriebenen Verfahren zur optischen qualitativen und quantitativen Erfassung von Biomolekülen etc. mittels Laserspektroskopie. Dies ist besonders dann der Fall, wenn die hier beschriebenen Anordnungen und Verfahren auf einzeln vorliegende Zielpartikel angewandt werden.

Ferner kann eines der soeben beschriebenen Auswertever­ fahren dazu verwendet werden, festzustellen, ob ein einzel­ nes Zielpartikel im beobachteten Probenraum vorliegt. Die Daten werden danach nur dann einer Auswertung zugeführt, wenn die entsprechenden Algorithmen zu der Entscheidung ge­ führt haben, daß mit hoher Wahrscheinlichkeit ein einzelnes Zielpartikel im Probenraum vorlag. Ein solches Vorgehen stellt eine gleitende Vorauswertung dar.

Ebensogut kann der Amplitudenanteil des unverzögerten Streulichts zum gesamten Streulicht dazu verwendet werden, die Daten für eine weitere Auswertung vorzufiltern.

Insbesondere kann mit Hilfe der vorgefilterten Signale in effizienter Weise die Autokorrelationsfunktion der detek­ tierten Photonen für jeweils einzeln vorliegende Zielparti­ kel berechnet werden. Dies kann dadurch erreicht werden, daß die Autokorrelationsfunktion nur mit Hilfe der Photonen auf­ gebaut wird, die zu Zeiten detektiert wurden, als sich mit vorgegebener Wahrscheinlichkeit ein einzelnes Zielpartikel im Probenraum befand. Solche Photonen, die dem allgemeinen unverzögerten Streulicht und sonstigem Hintergrund zugeord­ net wurden, werden nicht zur Berechnung herangezogen. Dies führt zu einer effektiven Streulichtunterdrückung und zu ei­ ner entsprechenden Verbesserung in der Genauigkeit und Am­ plitude der berechneten Autokorrelationsfunktion, da die Am­ plitude der Autokorrelationsfunktion vom Signal-Rausch-Ver­ hältnis der der Autokorrelation zugrunde liegenden Funktion abhängt. Je schlechter dieses ist, desto geringer ist auch die Amplitude der Autokorrelationsfunktion (vgl. D. E. Kop­ pel, Physical Review A, 1974, Heft 10, S. 1938).

Bei ausschließlicher Verwendung der Information, die in den Detektionszeitpunkten der Photonen vorliegt, unter Ver­ zicht auf die Information aus den Verzögerungszeiten, kann auch eine Korrelationsfunktion allein für die Detektions­ zeitpunkte von einzelnen Zielpartikeln zugeordneten Photonen berechnet werden, und nicht für daraus bestimmte Parameter.

Dies führt gegenüber herkömmlicher FCS, wie oben bereits erläutert, zu einer deutlichen Verbesserung des Signal- Rausch-Verhältnisses. Die Korrelationsfunktion kann dabei selektiv für die einzelnen Zielpartikel berechnet werden.

Für diese Anwendung kann beliebiges Licht verwendet wer­ den, insbesondere kontinuierliches Licht, das nicht modu­ liert ist.

Zur Beurteilung der Frage, ob ein Zielpartikel einzeln im Probenraum vorliegt, kann erfindungsgemäß eine relativ hohe zeitliche Dichte oder können relativ kurze zeitliche Abstände-zwischen den Detektionszeitpunkten der aufeinander­ folgend detektierten Photonen herangezogen werden. Wie be­ reits beschrieben, kann dies in Fig. 3 um die Ereignisnummer 1.900 in Verbindung mit Fig. 4 deutlich erkannt werden. Die "Täler" in Fig. 3 erscheinen in Fig. 4 als Peaks, die allgemein auch als "Burst" bezeichnet werden.

Ein Vergleich des relativ kurzen zeitlichen Abstands zwischen den Detektionszeitpunkten der aufeinanderfolgend detektierten Photonen um die Ereignisnummer 1.100 in Fig. 3 mit dem Tal in der Kurve um die Ereignisnummer 1.900 zeigt, daß die Täler sehr unterschiedliche Dauern haben bzw. aus sehr unterschiedlich vielen detektierten Photonen sich erge­ ben. Um zu beurteilen, ob ein solches Tal durch eine zufäl­ lige Schwankung des Hintergrundsignals hervorgerufen wurde, oder auf ein einzeln vorliegendes Zielpartikel zurückzufüh­ ren ist, eignen sich die oben erwähnten statistischen Krite­ rien, die das Tal um die Ereignisnummer 1.100 als von son­ stigem gestreutem Licht herrührend identifizieren würden.

Für eine sinnvolle Beurteilung, ob eine relativ hohe zeitliche Dichte der Detektionszeitpunkte der Photonen auf das Vorliegen eines Zielpartikels hinweist eignet sich daher auch eine Beurteilung der zeitlichen Dauer eines Bursts.

Im Rahmen des Erfindungsgedankens sind zahlreiche Ab­ wandlungen möglich. Grundsätzlich kann zum Feststellen des Vorhandseins eines einzelnen Zielpartikels das Über- bzw. Unterschreiten sowohl eines Parameters (vgl. Fig. 7) als auch der Anzahl der pro Zeiteinheit erfaßten Detektionszeitpunkte (Intensität) herangezogen werden (vgl. Fig. 4). Es ergeben sich somit grundsätzlich zwei Möglichkeiten für Schwellensetzungen. Außerdem können jeweils entweder eine Korrelationsfunktion eines Parameters oder eine Korrelationsfunktion der Intensität berechnet werden. Aus den zwei Möglichkeiten der Schwellensetzung und den zwei Möglichkeiten, Korrelationsfunktionen zu berechnen, ergeben sich zusammen vier Kombinationsmöglichkeiten. So kann:

• 1. eine Schwelle für die Intensität vorgegeben und an­ schließend eine Korrelationsfunktion der Intensität berech­ net werden.
• 2. eine Schwelle für die Intensität vorgegeben und an­ schließend eine Korrelationsfunktion eines Parameters be­ rechnet werden.
• 3. eine Schwelle für einen Parameterwert vorgegeben und anschließend eine Korrelationsfunktion der Intensität be­ rechnet werden.
• 4. eine Schwelle für einen Parameterwert vorgegeben und anschließend eine Korrelationsfunktion desselben oder eines anderen Parameters berechnet werden.

Lichtquelle, Detektionseinrichtung und Auswerteeinrich­ tung müssen zu den einzelnen Möglichkeiten, wie beschrieben, jeweils geeignet gewählt werden.

Somit ist es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und der erfindungsgemäßen Anordnung erstmals möglich, FCS auch bei geringsten Konzentrationen mit gutem Signal-Rausch-Verhält­ nis bzw. selektiv für ausgewählte Zielpartikel durchzufüh­ ren.

Claims (24)

1. Verfahren zum Bestimmen vorgegebener Eigenschaften von Zielpartikeln eines Probenmediums, wobei:
das Probenmedium mit periodisch moduliertem Licht einer vorgegebenen Periodendauer bestrahlt wird;
im Probenmedium gestreutes Licht in Form von einzelnen Photonen von einer Detektionseinrichtung detektiert wird;
wobei einerseits der zeitliche Abstand zwischen dem De­ tektionszeitpunkt jedes Photons und einem in der zugehörigen Periode des bestrahlenden Lichts liegenden Referenzzeitpunkt als Verzögerungszeit bestimmt wird; und
wobei andererseits der Detektionszeitpunkt jedes Photons bestimmt wird;
dadurch gekennzeichnet,
daß mit Hilfe der Verzögerungszeiten für jeweils eine Anzahl von aufeinanderfolgend detektierten Photonen wenig­ stens ein Parameter des gestreuten Lichts bestimmt wird;
daß mittels des wenigstens einen Parameters und der De­ tektionszeitpunkte der aufeinanderfolgend detektierten Pho­ tonen wenigstens ein Parameter-Zeit-Wertepaar bestimmt wird;
daß aus mehreren Parameter-Zeit-Wertepaaren wenigstens eine Parameter-Zeit-Funktion bestimmt wird;
daß eine Korrelationsfunktion der wenigstens einen Para­ meter-Zeit-Funktion berechnet wird; und
daß die vorgegebenen Eigenschaften der Zielpartikel mit Hilfe der Korrelationsfunktion bestimmt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das periodisch modulierte Licht pulsförmig moduliert ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich­ net,
daß das im Probenmedium gestreute Licht von mehr als ei­ nem Detektor detektiert wird; und
daß jeweils wenigstens eine Parameter-Zeit-Funktion für die von jedem Detektor detektierten Photonen getrennt be­ rechnet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Korrelationsfunktion eine Kreuzkorrelationsfunktion mit Hilfe der Parameter-Zeit-Funktionen verschiedener Detek­ toren berechnet wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet,
daß für jeweils eine vorgegebene Anzahl von aufeinander­ folgend detektierten Photonen des gestreuten Lichts oder für ein vorgegebenes Zeitintervall ein Histogramm der Verzöge­ rungszeiten erstellt wird; und
daß aus dem Histogramm mit Hilfe von effizienten stati­ stischen Verfahren Parameter des gestreuten Lichts bestimmt werden.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Zielpartikel fluoreszenzfähige Mole­ küle oder Gruppen (Fluorophore) aufweisende Partikel gewählt werden.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,
daß bei der Bestimmung des wenigstens einen Parameters des gestreuten Lichts berücksichtigt wird, daß sich das de­ tektierte gestreute Licht wenigstens aus Fluoreszenzlicht der Zielpartikel und sonstigem gestreuten Licht anteilig zu­ sammensetzt; und
daß als Parameter ein Anteil des gestreuten Lichts an der Gesamtamplitude bestimmt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Parameter eine 'Fluoreszenzlebensdauer bestimmt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekenn­ zeichnet,
daß zur Bestimmung der Amplitudenanteile der einzelnen Anteile des gestreuten Lichts vorgegebene Informationen über die Zusammensetzung des Fluoreszenzlichts der Zielpartikel aus einer Überlagerung mehrerer einzelner exponentieller Ab­ fälle, die sich durch spezifische Fluoreszenzlebensdauern beschreiben lassen verarbeitet wird; und
daß als Parameter die Amplitudenanteile und/oder die Fluoreszenzlebensdauern der einzelnen exponentiellen Abfälle bestimmt werden.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Bestimmung der Amplitudenanteile der einzelnen exponentiellen Abfälle Informationen über die typischen Fluoreszenzlebensdauern der Zielpartikel verwendet werden.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Amplitudenanteile des von den jewei­ ligen Zielpartikeln gestreuten Lichts mit Hilfe von Informa­ tionen über das Rotations- oder Fluoreszenz-Depolarisations­ verhalten der Zielpartikel bestimmt werden.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet,
daß als Zielpartikel wenigstens zwei jeweils Fluorophore aufweisende Partikel verwendet werden, wobei zwischen den jeweiligen Fluorophoren ein resonanter Energietransfer auf­ tritt;
daß als Parameter die Amplitudenanteile des von den je­ weiligen Fluorophoren gestreuten Lichts bestimmt werden; und
daß als Korrelationsfunktion eine Autokorrelationsfunk­ tion der Amplitudenanteile des von den jeweiligen Fluoropho­ ren gestreuten Lichts bestimmt wird.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet,
daß die Dichte der Zielpartikel so gewählt wird, daß sich im Mittel weniger als ein Zielpartikel in einem beob­ achteten Volumenelement des Probenmediums (Probenraum) be­ findet; und
daß die Korrelationsfunktion ausschließlich aus Ab­ schnitten der Parameter-Zeit-Funktion berechnet wird, die einzelnen Zielpartikel zugeordnet sind.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß ein Vorhandensein eines einzelnen Zielpartikels im Pro­ benraum durch ein Überschreiten einer vorgegebenen Schwelle durch einen vorgegebenen Parameter des gestreuten Lichts festgestellt wird.

15. Verfahren zum Bestimmen vorgegebener Eigenschaften von Zielpartikeln eines Probenmediums, wobei:
das Probenmedium mit Licht bestrahlt wird;
im Probenmedium gestreutes Licht in Form von einzelnen Photonen von einer Detektionseinrichtung detektiert wird;
der Detektionszeitpunkt jedes gestreuten Photons erfaßt wird;
die Dichte der Zielpartikel so gewählt wird, daß sich im Mittel weniger als ein Zielpartikel in einem beobachteten Volumenelement des Probenmediums (Probenraum) befindet; und
durch Bewerten der erfaßten Detektionszeitpunkte festge­ stellt wird, in welchem Zeitintervall ein Zielpartikel ein­ zeln im Probenraum vorliegt;
dadurch gekennzeichnet,
daß aus den erfaßten Detektionszeitpunkten und dem Zeit­ intervall wenigstens eine auf das Zeitintervall begrenzte, zeitabhängige Funktion bestimmt wird, die die Anzahl der pro Zeiteinheit erfaßten Detektionszeitpunkte angibt;
daß eine Korrelationsfunktion der wenigstens einen Funk­ tion berechnet wird; und
daß die vorgegebenen Eigenschaften der Zielpartikel mit Hilfe der Korrelationsfunktion bestimmt werden.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Absinken eines Mittelwerts der zeitlichen Abstände zwischen den Detektionszeitpunkten von aufeinanderfolgend detektierten Photonen über eine vorgegebene Anzahl von auf­ einanderfolgend detektierten Photonen unter einen vorgegebe­ nen Wert als Entscheidungskriterium für das Vorliegen eines einzelnen Zielpartikels im Probenraum verwendet wird.

17. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Absinken eines Mittelwerts der zeitlichen Abstände zwischen den Detektionszeitpunkten von aufeinanderfolgend detektierten Photonen über ein vorgegebenes Zeit Intervall unter einen vorgegebenen Wert als Entscheidungskriterium für das Vorliegen eines einzelnen Zielpartikels im Probenraum verwendet wird.

18. Anordnung zum Bestimmen vorgegebener Eigenschaften von Zielpartikeln eines Probenmediums mit:
wenigstens einer Lichtquelle (20), die moduliertes Licht mit einer vorgegebenen Periodendauer aussendet;
einem Probenraum, in welchem Partikel eines Probenme­ diums mit dem Licht aus der Lichtquelle bestahlt werden;
einer Einrichtung (8) zur Detektion von einzelnen Photo­ nen aus dem Probenraum, die derart ausgebildet ist, daß sie bei Erfassung eines Photons aus dem Probenraum einen Impuls an einem ersten Ausgang (11) ausgibt und den zeitlichen Ab­ stand zwischen dem Detektionszeitpunkt jedes Photons und einem in der zugehörigen Periode des bestrahlenden Lichts liegenden Referenzzeitpunkt als Verzögerungszeit bestimmt und in Form von Digitaldaten an einem zweiten Ausgang (12) ausgibt; und
einer mit dem ersten und zweiten Ausgang der Detektions­ einrichtung gekoppelten Auswerteeinrichtung zum Aufnehmen und Auswerten der Digitaldaten;
dadurch gekennzeichnet,
daß zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 die Auswerteeinrichtung eine mit dem zweiten Ausgang gekoppelte Recheneinheit (27), zwei jeweils Start- und Stopeingänge aufweisende Zähler (17, 18) und eine die Start- und Stopein­ gänge der Zähler mit dem ersten Ausgang (11) der Detektions­ einrichtung koppelnde Umschalteinrichtung (24) aufweist,
wobei die Umschalteinrichtung die Zähler bei jedem von der Detektionseinrichtung ausgegebenen Impuls gegensinnig ein- und ausschaltet, so daß der eine Zähler zählt, während der andere Zähler gestoppt ist und/oder den Zählerstand aus­ gibt, wobei der Takt der Zähler von einer Taktgebereinrich­ tung (25) vorgegeben ist; und
daß die Zählerstände zur Bestimmung der Eigenschaften der Zielpartikel an die Recheneinheit (27) übertragbar sind.

19. Anordnung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Zähler (17, 18) derart geschaltet sind, daß sie nach dem Stoppen und vor einem erneuten Starten zurückgesetzt werden.

20. Anordnung nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Auswerteeinrichtung derart ausgebildet ist, daß sie bei Empfang eines elektrischen Impulses von dem ersten Ausgang (11) die von der Detektionseinrichtung (8) ausgegebenen Digitaldaten in Zuordnung zu einem Zählerstand der Zähler (17, 18) speichern kann.

21. Anordnung nach einem dem Ansprüche 18 bis 20, da­ durch gekennzeichnet, daß den Zählern (17, 18) wenigstens ein Zwischenspeicher (26) nachgeschaltet ist, der dazu dient, den Zählerstand bzw. die Zählerstände vor dem Über­ tragen an die Recheneinheit (27) zu speichern.

22. Anordnung nach einem der Ansprüche 18 bis 21, da­ durch gekennzeichnet,
daß die Recheneinheit (27) eigen Rechner aufweist, der eine digitale Ein- und Ausgabekarte (28) zur Aufnahme der Digitaldaten aufweist; und
daß die Karte zur Datenaufnahme durch die Impulse (11) der Detektionseinrichtung (8) triggerbar ist.

23. Anordnung nach einem der Ansprüche 18 bis 22, da­ durch gekennzeichnet, daß die Detektionseinrichtung (8) mehr als einen Detektor aufweist.

24. Anordnung nach einem der Ansprüche 18 bis 23, da­ durch gekennzeichnet, daß die Detektionseinrichtung (8) eine optische Anordnung in Form eines konfokalen Mikroskops oder eines Nahfeld-Mikroskops umfaßt.