DE4429383A1 - Verfahren und Vorrichtung zur zeit- und ortsaufgelösten Fluoreszenz- bzw. Streulicht-Spektroskopie - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur zeit- und ortsaufgelösten Fluoreszenz- und Streulicht-Spektroskopie gemäß dem Oberbegriff der Ansprü­ che 1 und 2.

Fluoreszenz- und Streulichtmessungen haben heute ein brei­ tes Anwendungsgebiet, wie z. B. die Bestimmung der Eigen­ schaften von Polymeren, die Erforschung der Photosynthese und viele Anwendungen in der medizinischen und biologischen Forschung und Entwicklung, wie DNA-Sequenzierung (Fluores­ zenzlicht) oder optische Tomographie (Streulicht). Auf dem Gebiet der Fluoreszenz- und Streulichtmessung ist die zeit- und ortsauflösende Einzelphotonen-Zählung (TSCSPC) Spektro­ skopie eine der neusten Entwicklungen. Hiermit ist es möglich, Zeit- und Ortsinformationen von schwach emittieren­ den Quellen simultan zu erfassen.

Aus der US-PS 5,148,031 ist eine Vorrichtung für die Erzie­ lung räumlich und zeitlich aufgelöster Meßwerte einer schwachen optischen Strahlung bekannt. Diese Vorrichtung weist eine gepulste Strahlungsquelle auf, der ein halbdurch­ lässiger Spiegel nachgeordnet ist. Die durch den Spiegel hindurchtretende Strahlung gelangt auf die zu untersuchende Probe. Die von der Probe hervorgerufenen Fluoreszenzen werden einem Polychromator zugeführt, dem ein photoelektro­ nischer Multiplier mit Delay-Line-Anode (Verzögerungslei­ tungs-Anode) nachgeordnet ist. Dieser weist zwei Ausgänge auf, von denen je einer an einem Zeit-Amplituden-Wandler anliegt.

Die am halbdurchlässigen Spiegel reflektierte Strahlung wird auf eine Photodiode als Synchronisiereinheit gelenkt, deren Ausgang mit den zweiten Eingängen des Zeit-Amplitu­ den-Wandlers verbunden ist. Die Ausgänge des Zeit-Amplitu­ den-Wandlers sind wechselseitig mit einem Addierer bzw. Subtrahierer verbunden, deren Ausgänge an einer Datenspei­ cher- und Prozeßeinheit liegen.

Diese Vorrichtung weist den Nachteil auf, daß Fehler, wie z. B. Langzeitdriften, Verschiebungen der Intensität, Wellen­ länge und des Zeitverhaltens der Strahlungsquelle und/oder der Elektronik, sowie Farb- und Intensitätsfehler des Elektronenvervielfachers nicht korrigiert werden können.

Ein weiterer Nachteil besteht darin, daß die Ortsauflösung nur entlang einer Ortskoordinate erhalten werden kann.

Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, die zeit- und raumaufgelöste spektroskopische Meßmethode dahingehend zu verbessern, daß alle intrinsischen Fehler des Meßsystems korrigiert werden und daß zusätzlich wahlweise eine echte zweidimensionale Ortsauflösung erreicht wird.

Erfindungsgemäß wird das bei einem Verfahren zur optischen Spektroskopie dadurch erreicht, daß der zeitliche und räumliche Verlauf der Intensität des Abklingverhaltens der durch Lichtbestrahlung in einer Probe hervorgerufenen Fluoreszenzen bzw. Streuung durch Einzelphotonenzählung für eine Vielzahl von Wellenlängen bzw. Ortskoordinaten im Zweistrahlverfahren simultan ermittelt wird.

Insbesondere wird der zeitliche und räumliche spektrale Fluoreszenz- bzw. Streulichtverlauf abwechselnd für die Probe und für eine Referenz im Sekunden- oder Subsekunden­ takt ermittelt und diese Signale werden anschließend am Ende der Messung zur Korrektur von Systemfehlern miteinan­ der verkoppelt.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann eine "Globalanaly­ se" durchgeführt werden, d. h. eine simultane Analyse von mehreren Fluoreszenz- bzw. Streulichtabklingkurven unter Kopplung eines Parameters oder mehrerer Parameter. Weiter­ hin erfolgt eine automatische Zuordnung der wellenlängen- bzw. ortsabhängigen Fluoreszenz- bzw. Streulichtverfallskur­ ve mit den zugehörigen Streulicht- bzw. Pseudostreulicht-Re­ ferenzkurven, die beide paarweise in einer "Konvolution" in der Analyse verwendet werden.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können mehrere Proben und Referenzen durch den Lichtstrahl nacheinander abgetastet werden, indem entweder die Proben bzw. Referenzen nacheinander in den Lichtstrahl geschoben werden oder der Lichtstrahl über die Proben und Referenzen ge­ scannt wird.

Eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens mit einer gepulsten Strahlungsquelle, einem Strahlungsteiler, einer Einheit zur Ortsauflösung, die mindestens einen Polychromator oder eine andere Einrichtung zur Ortsauflö­ sung, z. B. ein Faserbündel aufweist, mit einem photoelek­ tronischen Multiplier mit der Fähigkeit zur Ortsauflösung, z. B. einer Delay-Line-Anode bzw. eine Multianoden-Vorrich­ tung sowie mit einer Einheit zur zeitlichen Auflösung, die Zeit-Amplituden-Wandler, Addierer und Subtrahierer sowie einen Daten-Speicher und Prozeßeinheit aufweist und der eine Synchronisiereinheit zugeordnet ist, ist erfindungsge­ mäß dadurch gekennzeichnet, daß der Strahlungsquelle ein zu untersuchendes Objekt und ein Referenz-Objekt zugeordnet sind und daß mindestens eine den Polychromator bzw. eine andere Einrichtung zur Ortsauflösung wahlweise mit der Pro­ be bzw. der Referenz optisch verbindende Einrichtung vorgesehen ist.

Für die Aufnahme des zu untersuchenden und des Referenz-Ob­ jektes kann eine Probenzelle und eine Referenzzelle vorge­ sehen sein, die flüssige Proben und Referenzmaterialien enthalten.

Die Vorrichtung kann aber auch für die Untersuchung licht­ durchlässiger oder -undurchlässiger Proben ohne Proben- bzw. Referenzzelle verwendet werden, indem die optisch verbindende Einrichtung in direktem Kontakt auf der Vorder­ bzw. Rückseite mit der Probe und der Referenz steht.

Die optisch verbindende Einrichtung kann in unterschiedli­ cher Form ausgeführt sein. So ist es möglich, daß zwischen der Meßzelle und der Referenzzelle einerseits und dem Polychromator andererseits als optisch verbindende Einrich­ tung ein Lichtleiter vorgesehen ist, dessen eines Ende mit dem Polychromator fest verbunden ist und dessen anderes Ende sowohl der Referenzzelle als auch der Meßzelle zuorden­ bar ist. Bei dieser Vorrichtung wird also das eine Ende des Lichtleiters zwischen der Referenzzelle und der Meßzelle hin- und hergeschwenkt.

Eine andere Möglichkeit besteht darin, daß im Strahlengang vor dem Polychromator als optisch verbindende Einrichtung ein wahlweise in den Strahlengang zwischen Polychromator und Meßzelle bzw. Polychromator und Referenzzelle einschwenkbarer Spiegel vorgesehen ist.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, daß als optisch verbindende Einrichtung je ein der Probe bzw. der Referenz fest zugeordnetes Lichtleitfaserbündel vorgesehen ist, die abwechselnd in den Strahlengang des Polychromators bzw. einer anderen Einheit zur Ortsauflösung einschwenkbar sind.

Die Einrichtung zur wahlweisen optischen Verbindung des Polychromators mit der Meß- bzw. der Referenzzelle ist mit einer Steuereinheit verbunden, die eine Verschiebeeinrich­ tung und einen Timer aufweisen sollte. Die Verschiebeein­ richtung ist zweckmäßig über eine mechanische Verbindung mit dem in seiner Lage zu verändernden Bauteil wie dem Lichtleiter bzw. Spiegel verbunden.

Eine weitere zweckmäßige Ausführungsform sieht vor, daß die Einheit zur räumlichen Auflösung eine Vorrichtung zur Strahlaufweitung aufweist, der im Strahlengang eine licht­ durchlässige Probenplatte zugeordnet ist und daß der Proben­ platte ein Lichtleiterbündel nachgeordnet ist, das mit einem Zeit-Raumdetektor optisch verbunden ist. Mit dieser Vorrichtung ist es möglich, eine Vielzahl von Proben gleich­ zeitig zu untersuchen. Die Probenplatte enthält dazu eine Vielzahl von Probenzellen, die in m Spalten und n Zeilen geordnet sind, wobei in einer Zeile die Probenzellen als Re­ ferenzzellen dienen und in n-1 Zeilen die Probenzellen als Meßzellen dienen. Die Vorrichtung zur Strahlenaufweitung besteht aus n Lichtleitfasern und der das Licht sammelnde Lichtleiter weist ebenfalls n-Lichtleitfasern auf. Auch in diesem Fall ist eine Steuereinheit vorgesehen, die eine Ver­ schiebevorrichtung mit Schrittschaltcharakter für die Probenplatte sowie einen Timer aufweist. Bei dieser Vorrich­ tung wird also die erste Zeile der n Zeilen der Probenplat­ te für die Referenzmessung genutzt, während die übrigen Zeilen Proben enthalten, die simultan in einer Zeile und Zeile für Zeile durch Verschiebung der Probenplatte analy­ siert werden.

An Stelle der Verschiebung der Probenplatte ist es möglich, die Probenplatte rasterartig abzutasten und für die notwendige Ablenkung des Laserstrahls einen computerge­ steuerten beweglichen Spiegel vorzusehen.

Eine weitere Möglichkeit der Abtastung der Proben besteht in der Anwendung der konfokalen Laser-Scanning-Lichtmikro­ skopie.

Um zu gewährleisten, daß bei sehr großem Datendurchsatz eine Einzelphotonenzählung durchgeführt wird, daß also nicht bei Auftreffen eines Photons auf die Katode das durch das vorhergehende Photon ausgelöste Meßverfahren noch nicht abgeschlossen ist, ist vorgesehen, daß die Ausgänge der Zeit-Amplituden-Wandler mit Eingängen einer Koinzidenzein­ heit verbunden sind, deren Ausgang mit der Datenspeicher- und Prozeßeinheit verbunden ist.

Es ist vorteilhaft, als Referenz, ein Pseudo-Streuelement, vorzusehen, z. B. die zu untersuchende flüssige Probe mit einem Elektronen-Akzeptor oder -Donator zu versetzen. Diese Referenz weist ein identisches Spektrum bei stark reduzier­ ter Fluoreszenzlebensdauer auf.

Zur Erweiterung Ortserfassung um eine weitere Dimension ist es möglich, den an sich bekannten DL-MCP-PMT (microchannel plate photomultiplier tube mit Delay Line Anode) mit Hilfse­ lektroden zu versehen, der auch in Einstrahlkonfiguration ohne Referenzprobe einsetzbar ist.

Durch Anwendung der vorgenannten Maßnahmen wird ein Zweistrahl-Spektrometer für die TSCSPC-Spektroskopie mög­ lich, das die bekannten Fehler der Einstrahl-Methode besei­ tigt. Insbesondere werden die Langzeit-Drift der Strahlungs­ quelle, z. B. einer Laserstrahlungsquelle, sowie Farbfehler und Intensitätsfehler des Photoelektronenvervielfachers beseitigt. Weiterhin wird die Ortserfassung um eine zusätz­ liche Dimension verbessert.

Die Erfindung soll in Ausführungsbeispielen anhand von Zeichnungen erläutert werden. Es zeigen:

Fig. 1 ein vereinfachtes Blockschaltbild des erfindungs­ gemäßen Systems;

Fig. 2 ein Blockschaltbild, bei dem die Raumkoordinate durch die Wellenlänge der beobachteten Fluo­ reszenz dargestellt wird, und bei dem ein bewegli­ cher Lichtleiter zwischen Polychromator und Probe bzw. Referenz vorgesehen ist;

Fig. 3 ein Blockschaltbild, bei dem die Raumkoordinate durch eine Vielproben-Platte erzielt wird;

Fig. 4 ein Blockschaltbild mit einem Spiegel zwischen der Probenzelle und einer Referenzzelle;

Fig. 5 eine Anordnung mit zwei hin- und herschwingenden Lichtleiterbündeln.

Fig. 6 eine Delay-line-Anode mit Zusatzanoden zur zweidi­ mensionalen Ortsauflösung.

Das System der Fig. 1 weist eine gepulste Lichtquelle 1 auf, z. B. einen Laser oder eine Blitzlicht-Lampe, einen halbdurchlässigen Spiegel 2, der den Lichtstrahl aufspal­ tet, eine Einheit 3 zur räumlichen Auflösung, z. B. einen Polychromator oder ein Faserbündel, sowie einen Zeit-Raum-Detektor 4 auf. Dieser Detektor 4 kann z. B. eine MCP-PMT mit Delay Line Anode (DL-MCP-PMT), ein Multianoden- Photomultiplier oder eine Variante des DL-MCP-PMT mit zusätzlichen Hilfsanoden, z. B. mit keilförmigen Elektroden (WE-DL-MCP-PMT) zur Aufnahme der zweiten Ortskoordinate, eine CCD-Zeile oder -Matrix oder ein anderer zeit- und raumauflösender Detektor sowie zusätzliche weitere Komponen­ ten aufweisen. Die Signalausgänge des Zeit-Raum-Detektors 4 sind mit den Eingängen einer Einheit 5 zur zeitlichen Auflö­ sung verbunden, die z. B. ein elektronischer Komplex mit Start-Stoppeingängen sein kann und z. B. einen Multiparame­ ter-MCA (MCA = multi-channel analyser) enthalten kann. Dieser elektronische Komplex liegt in Reihe zu einer Syn­ chronisiereinheit 6, z. B. einer PIN-Photodiode, die Refe­ renzlichtimpulse vom halbdurchlässigen Spiegel 2 erhält. Eine Steuereinheit 7 ist sowohl mit der Einheit 3 zur räum­ lichen Auflösung als auch mit der Einheit 5 zur zeitlichen Auflösung verbunden.

Die Fig. 2 stellt ein detailliertes Blockschaltbild des Systems mit der Zweistrahl-Proben-Referenz-Konfiguration dar. Das System dient der Messung der wellenlängenabhängi­ gen Lebensdauer der fluoreszierenden oder streuenden Probe und weist die folgenden Komponenten auf:
eine gepulste Lichtquelle 1, z. B. ein Laser, einen halb­ durchlässigen Spiegel 2, eine Einheit 3 zur räumlichen Auf­ lösung mit einer Referenzzelle 8, die z. B. aus einem Streuelement oder Pseudostreuelement besteht. Weiterhin sind eine Probenzelle 9, Filter 10-13, ein Lichtleiter 14, z. B. ein optisches Quarz-Faser-Bündel oder eine Einzel­ faser, vorgesehen, der an einer mechanischen Verbindung 15 befestigt ist, die ihrerseits mit einer Steuereinheit 7 verbunden ist. Der Ausgang des Lichtleiters 14 ist an einen Polychromator 16 gekoppelt. Der Ausgang des Polychromators 16, der identisch ist mit dem Ausgang der Einheit 3 zur räumlichen Auflösung, ist mit der Vorderseite des Zeit- Raum-Detektors 4 (MCP-PMT) verbunden. Dieses PMT enthält eine Photokatode 17, zwei Vielkanalplatten 18 und eine Delay-Line-Anode 19 mit zwei Anschlüssen 20 und 21, deren Ausgangssignale nach Verstärkung (nicht dargestellt) an die "Constant-Fraction-Discrminators" (CFD) 22 und 23 gelangen. Die Ausgangssignale der CFD sind die Stopp-Eingangssignale für zwei Zeit-Amplituden-Wandler (TAC) 24, 25. Die Start- Eingangssignale für die TAC werden aus der Synchronisierein­ heit 6, z. B. einer schnellen Photodiode, hergeleitet, deren Ausgang wie im Fall der beiden Stop-Eingänge diskriminiert wird (nicht dargestellt). Start- und Stop-Signale können auch vertauscht werden (invertierte Konfiguration), wodurch ein erhöhter Datendurchsatz erzielt wird.

Die Ausgänge beider TAC sind mit einem schnellen Analog- oder Digital-Addierer 26 bzw. einem Subtrahierer 27 verbun­ den. Subtrahierer und Addierer sind mit einer schnellen Da­ tenspeicher- und Prozeß-Einheit 28 verbunden, z. B. mit einem zweidimensionalen Vielkanalanalysator auf Transputer­ basis bzw. einem Signalprozessor. Eine elektromechanische Verschiebevorrichtung 29, die durch die Steuereinheit 7 ge­ steuert wird, ist mit dem Lichtleiter 14 durch die mechani­ sche Verbindung 15 verbunden und wird durch einen Timer 30 gesteuert, der in Reihe zur Datenspeicher- und Prozeß-Ein­ heit 28 liegt.

Das neue dieses Ausführungsbeispiels besteht also in dem schwenkbaren Lichtleiter 14 mit der mechanischen Verbindung 15 zu einer Steuereinrichtung 7, einer Referenzzelle 8 und die Verbindung der Steuereinheit 7 mit der Datenspeicher- und Prozeß-Einheit 28.

Die Fig. 3 stellt ein detailliertes Blockschaltbild des TSCSPC-Systems mit einer Vielprobenplatte dar, das für die simultane Bestimmung der Fluoreszenzänderungen von N flüssi­ gen oder festen Proben geeignet ist. Das System in Fig. 3 weist wiederum eine gepulste Lichtquelle 1, z. B. einen Laser, einen halbdurchlässigen Spiegel 2 sowie eine Einheit 3 zur räumlichen Auflösung auf. Die Besonderheit bei diesem Ausführungsbeispiel besteht darin, daß die Einheit 3 eine Vorrichtung zur optischen Strahlaufweitung des anregenden Laserstrahls, z. B. ein "zylindrisches" optisches System oder ein optisches Faserbündel aufweist. Weiterhin ist ein kohärenter Lichtleiter 32, der aus n Einzelfasern für die Sammlung des fluoreszierenden oder gestreuten Lichts be­ steht, vorgesehen, der von N Proben einer Reihe der zweidi­ mensionalen Probenplatte 33 ausgestrahlt wird. Die Vorrich­ tung zur optischen Strahlaufweitung 31, die Licht emit­ tiert, und der Lichtleiter 32 als Lichtsammler bestehen aus Quarzglas, um für UV-Licht durchlässig zu sein. Die Proben­ platte 33 trägt N Proben, die in n-Reihen 35 angeordnet sind, von denen jede m Proben 34 aufweist, so daß

N = n × m

darstellt.

Die erste Reihe 36 der n Reihen 35 enthält keine Probe und dient so als Referenzreihe zur Bestimmung der Hintergrund-Fluoreszenz und Streuung. Die Probenplatte 33 ist über einen Steg 38 an eine Verschiebevorrichtung 37 gekoppelt und wird durch die Steuereinheit 40 gesteuert. Die Verschiebevorrichtung wird durch einen Timer 30 gesteu­ ert, der seinerseits mit der Datenspeicher- und Prozeß-Ein­ heit 28 der Einheit 5 zur zeitlichen Auflösung verbunden ist. Alternativ kann der Laserstrahl über eine fixierte Pro­ benplatte gescannt werden, indem er über computergesteuerte bewegliche Spiegel eingekoppelt wird.

Ausgänge der Zeit-Amplituden-Wandler 24 und 25 sind mit einer Koinzidenzeinheit 39 verbunden, deren Ausgang mit der Datenspeicher- und Prozeß-Einheit 28 verbunden ist. Die Koinzidenzeinheit ist nur bei hohem Datendurchsatz erforderlich. Das schmale Ende des kohärenten Lichtleiters 32 ist gegenüber der Photokatode 17 des Zeit-Raum-Detektors 4 mit der Verzögerungsleitungsanode 19 positioniert, deren Anschlüsse 20, 21 mit der Einheit 5 zur zeitlichen Auflö­ sung analog der Fig. 2 verbunden sind. Das Fenster des MCP-PMT kann zur besseren Ortsauflösung des Systems aus einem "Faseroptikfenster" bestehen.

In dem vorliegenden Ausführungsbeispiel mit einer Vielzahl von Proben ist die Koinzidenzeinheit 39 mit den TAC-Ausgän­ gen 24 und 25 verbunden und ebenso die Datenspeicher- und Prozeß-Einheit 28. Die Synchronisiereinheit 6 und deren Verbindung entsprechen der Fig. 2.

Das TSCSPC-System mit einer Probe und Referenz (Fig. 2) arbeitet wie folgt:
Es sei angenommen, daß die Energieversorgung eingeschaltet ist, eine Probe in die Probenzelle 9 sowie eine Referenzpro­ be in die Referenzzelle 8 eingesetzt ist und ein Laser kurze, z. B. Pikosekunden, Lichtimpulse hoher Frequenz aussendet. Der Laserstrahl wird durch den halbdurchlässigen Spiegel 2 in zwei Teilstrahlen aufgespalten. Der durch den Spiegel durchtretende Teil des Strahles (ca. 90%) gelangt durch die Referenzzelle 8 in die Probenzelle 9, in der sich die Probe befindet. Der reflektierte Teil des Strahles (ca. 10%) gelangt an die zeitliche Synchronisiereinheit 6, z. B. eine PIN-diode, deren Ausgang an den Starteingängen der TAC 24 und 25 liegt. Das elektrische Ausgangssignal der PIN-Pho­ todiode triggert die TAC 24, 25.

Der durch den halbdurchlässigen Spiegel 2 hindurchgetretene Teil des Laserstrahls erzeugt in der Probe der Probenzelle 9 Fluoreszenz und erzeugt in der Referenzzelle 8 Streulicht oder einen ultraschnellen Fluoreszenzabfall (Pseudostreu­ licht). Zur Steuerung der Fluoreszenzintensität sind die kontinuierlich verstellbaren Abschwäche-Filter 10, 11 mit neutraler Dichte vorgesehen. Ein Filter 13 ist ein "Longpas- Kanten-Filter", um das gesamte Erregerlicht des Lasers zu entfernen. Als weiteres Filter kann ein Polarisationsfilter vorgesehen sein. Das keilförmige Filter 12 ist für die Kom­ pensation kleiner Differenzen der optischen Weglänge beider Zweige vorgesehen. Das von der Probe und der Referenz emit­ tierte Licht gelangt abwechselnd auf den Lichtleiter 14, der unmittelbar hinter den Filtern vorgesehen ist und der auf einer mechanischen Verschiebevorrichtung 29 angeordnet ist, die ihrerseits durch eine Steuereinheit 7 gesteuert wird. Über die mechanische Verbindung 15 kann der Lichtlei­ ter 14 entweder dem Filter 12 oder dem Filter 13 zugeordnet werden. In der erstgenannten Position tritt das emittierte Licht der Referenzzelle 8 in den Lichtleiter 14 ein, wäh­ rend in der zweiten Position die Fluoreszenz der Probenzel­ le 9 in den Lichtleiter 14 eintritt. Der Ausgang des Licht­ leiters 14 ist an einen Polychromator gekoppelt, in dem das Licht abgelenkt und entsprechend der Wellenlänge räumlich aufgelöst wird. Das räumlich aufgelöste Licht, das den Polychromator verläßt, trifft auf die Photokatode 17 des Zeit-Raum-Detektors 4 (innerhalb des gestrichelten Berei­ ches). Jedes Photon, das auf die Photokatode 17 auftrifft, verursacht das Emittieren eines Elektrons, das beim Durch­ gang durch die Vielkanalplatten verstärkt wird. Am Ausgang der zweiten Vielkanalplatte entsteht ein Kegel aus einer Vielzahl Elektronen, die einen Impuls einer elektrischen Ladung darstellen. Dieser elektrische Impuls trifft auf einen bestimmten Punkt der Verzögerungsleitungsanode 19, der dem entsprechenden Punkt auf der Photokatode 17 ent­ spricht, auf der das Photon ursprünglich auftraf. Daraus ergibt sich, daß dieser Punkt einer bestimmten Wellenlänge entspricht, die durch den Polychromator 16 erzeugt wird. Der elektrische Impuls in der Verzögerungsleitungsanode 19 wird in zwei Teile aufgespalten, die über Anschlüsse 20, 21 weitergeleitet werden und durch die CFD 22, 23 diskrimi­ niert werden. Sie werden dann als Stopp-Eingangssignale der Zeit-Amplituden-Wandler 24, 25 verwendet. Diese Signale stoppen die Zeit-Amplituden-Wandler, die vorher durch ein Signal der Synchronisiereinheit 6 gestartet wurden. Ein Zeit-Amplituden-Wandler ist eine Einrichtung, deren Aus­ gangsspannung proportional dem Zeitintervall zwischen den Signalen ist, die an den Start-Stopp-Eingängen ankommen. Die CFD 22, 23 eliminieren Jitter in den Start-Stopp-Signa­ len, die durch Variationen der Signal-Intensität hervorgeru­ fen werden. Die Filter 10, 11 begrenzen die Lichtintensität in dem Umfang, wie es für die Einzelphotonenzählung erfor­ derlich ist. Das Filter 12 entfernt Erregerlicht des La­ sers, das die Fluoreszenz beeinflußt, und das keilförmige Filter 12, das aus transparentem Glas hergestellt ist, korrigiert Differenzen in der optischen Weglänge beider Zweige. Das Polarisationsfilter korrigiert Einflüsse, die durch Rotation von Molekülen in flüssigen Proben hervorgeru­ fen werden.

Die Ausgangsspannung U1 des Zeit-Amplituden-Wandlers 24 ist proportional dem Zeitintervall t + x/v, während die Aus­ gangsspannung U2 des Zeit-Amplituden-Wandlers 25 proportio­ nal dem Zeitintervall t + (l -x)/v ist, worin t die Zeitdif­ ferenz zwischen den Photonen ist, die die Synchronisierein­ heit 6 und die Photokatode 17 erreichen. l ist die Länge der Verzögerungsleitungsanode 19, v ist die Geschwindigkeit der Ladungsausbreitung und x die Koordinate, bei der der Ladungspuls auf die Verzögerungsleitungsanode 19 trifft, was in diesem Fall dem Abstand zwischen diesem Punkt des Auftreffens und dem Ende des Anschlusses 20 oder 21 ent­ spricht.

Der Addierer 26 addiert die Spannungen U1 und U2, voraus sich eine Ausgangsspannung ergibt, die proportional zu 2t + 1/v ist, d. h. sie trägt die Information der Zeit. Die Ausgangsspannung des Subtrahierers 27 ist gleich der Diffe­ renz U1 -U2 und proportional zu 2x - 1/v, d. h. sie trägt die Information der Raumkoordinate x, die der Wellenlänge der Fluoreszenzquelle entspricht. Der Ausgang des Addierers 26 und des Subtrahierers 27 liegen an den Eingängen der Da­ tenspeicher- und Prozeß-Einheit 28. Die Steuereinheit 7 der Verschiebevorrichtung 29 gibt Informationen über die Lage des Lichtleiters 14 (d. h. ob er sich gegenüber dem keilförmigen Filter 12 oder dem Filter 13 befindet) zu einem der Eingänge der Daten-Speicher und Prozeßeinheit 28.

Im Fall der WE-DL-MCP-PMT oder ähnlicher Multianoden MCP-PMT′s zur zweidimensionalen Ortserfassung (z. B. Spi­ ral-Anoden) werden die Ladungen Q₁ und Q₂, die auf den beiden keilförmigen Elektroden 51, 52 (Fig. 6) deponiert wurden, durch zwei rauscharme Verstärker geführt und mit zwei AD-Wandlern ausgelesen. Die Y-Koordinate berechnet sich dann einfach aus

wobei J die Gesamtlänge der Anode in Y-Richtung ist.

Bezugnehmend auf Fig. 3 soll der TSCSPC mit einer Vielpro­ benplatte erläutert werden. Der Laser und der halbdurchläs­ sige Spiegel als Strahlteiler sind die gleichen wie in vor­ hergehenden Systemen (Fig. 2). Der durch den halbdurchlässi­ gen Spiegel durchtretende Teil des Laserstrahles tritt in die Vorrichtung 31 zur optischen Strahlaufweitung, z. B. eine Zylinderlinse oder ein optisches Faserbündel und trifft auf die Probenplatte als schmale Linie. Diese schma­ le Linie tritt durch die Probenplatte 33 und regt die Proben, die z. B. in einer Gelschicht in n-Reihen und m-Spal­ ten angeordnet sind, von hinten bzw. von vorn an. Eine Reihe kann Referenzproben enthalten, während die übrigen Reihen (n -1) die zu untersuchenden Proben enthalten.

Der vom halbdurchlässigen Spiegel 2 reflektierte Teil des Laserstrahls triggert die Synchronisiereinheit 6, z. B. eine PIN-Photodiode, deren Signale an die Starteingänge der Zeit-Amplituden-Wandler 24, 25 gehen und diese auf diese Weise starten. Das laserinduzierte Fluoreszenz-Licht tritt in den Lichtleiter 32 ein, in der die Fluoreszenz jeder individuellen Probe aufgefangen und durch eine individuelle Faser auf eine bestimmte Stelle der Photokatode geleitet wird. Durch das auftreffende Photon wird ein Elektron in der Photokatode emittiert, welches nach Verstärkung als elektrischer Impuls an einem bestimmten Ort auf die Verzöge­ rungsleitungsanode 19 trifft, so daß jeder Punkt auf dieser Verzögerungsleitung einer individuellen Probe entspricht. Der elektrische Puls wird in der Verzögerungsleitung in zwei Teile gespalten, die durch die Anschlüsse 20, 21 weitergeleitet und in der vorher beschriebenen Art weiter­ verarbeitet werden.

Um einen sogenannten "Zwei-Photonen-Fall" auszuschließen, d. h. daß ein zweites Photon auf die Photokatode trifft, während die Verarbeitung des ersten Photons noch abläuft, ist eine Koinzidenzeinheit 39 vorgesehen, die solche uner­ wünschten Vorgänge dadurch ausschließt, daß geprüft wird, ob l = x/v + (1 -x)/v erfüllt ist, da das die Bedingung für die Gültigkeit des "Ein-Photonen-Falles" ist, wobei l die Gesamtlänge der Delay-Line-Anode darstellt. Fälle, die diese Bedingung nicht erfüllen, werden ausgeschlossen. Das erfaßte Fluoreszenz- und Streulicht der ersten Referenzrei­ he (die keine Probe enthält), d. h. die Hintergrund-Emission der Glasplatte und der Gelschicht kann für die Korrektur der erfaßten Probenfluoreszenz der übrigen (n -1)-Reihen genutzt werden.

Bei dem Ausführungsbeispiel der Fig. 4 sind prinzipiell die gleichen Baugruppen wie beim Ausführungsbeispiel der Fig. 2 vorgesehen. Der Unterschied besteht darin, daß anstelle eines Lichtleiters 14 mit einem gegenüber der Referenz und der Probe beweglichen Ende ein schwingender Spiegel 41 zwischen der Referenzzelle 8 und der Probenzelle 9 vorgese­ hen ist.

Beim Ausführungsbeispiel der Fig. 5 sind zwei hin- und herschwingende Lichtleitfaserbündel 42 und 43 vorgesehen, die zwischen Lichteintrittsleisten 44 bzw. 45 sowie Licht­ austrittsleisten 46 bzw. 47 gebündelt sind. Diese Anordnung ist insbesondere für die optische Tomographie einsetzbar. Bei der dargestellten Probe 48 und der Referenz 49 kann es sich z. B. um menschliche Mamalia handeln, die auf das Vorhandensein eines Karzinoms (51) untersucht werden sol­ len. Dabei stellt die Probe 48 die Brust mit dem Karzinom dar, während die Referenz 49 die karzinomfreie Brust dar­ stellt. Für die Untersuchung werden abwechselnd die Licht­ leitfaserbündel 42 und 43 vor den MCP-PMT 50 geschwenkt. Die Lichteintrittsleisten 44 bzw. 45 nehmen dabei dann die Form von halbkugelförmigen, der Brust angepaßten, Büstenhal­ tern ähnlichen Gebilden an. Die Messung erfolgt in der Weise, wie sie in den vorherigen Ausführungsbeispielen beschrieben wurde.

Claims (22)

1. Verfahren zur zeit- und ortsaufgelösten Fluoreszenz- bzw. Streulicht-Spektroskopie, dadurch gekennzeichnet, daß der zeitliche und räumliche Verlauf der Intensität der Abklingkurven der durch Lichtbestrahlung in einer Probe hervorgerufenen Fluoreszenzen bzw. Streuung durch Einzelphotonenmessung für eine Vielzahl von Wellenlän­ gen bzw. Ortskoordinaten im Zweistrahlverfahren simul­ tan ermittelt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der zeitliche und räumliche Verlauf der Fluoreszenz bzw. des Streulichtes abwechselnd für die Probe und für eine Referenz im Sekunden- oder Subsekundentakt ermit­ telt werden und daß diese Signale anschließend am Ende der Messung miteinander verkoppelt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich­ net, daß eine simultane Analyse von mehreren Fluores­ zenz- bzw. Streulichtabklingkurven unter Kopplung eines Parameters oder mehrerer Parameter durchgeführt wird und daß eine Zuordnung der wellenlängen- bzw. ortsabhän­ gigen Fluoreszenz- bzw. Streulichtverfallskurven mit den zugehörigen Streulicht- bzw. Pseudostreulicht-Refe­ renzkurven erfolgt.

4. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere Proben und Referenzen durch den Lichtstrahl nacheinander abgetastet werden, indem entweder die Proben bzw. Referenzen nacheinander in den Lichtstrahl geschoben werden oder der Lichtstrahl über die Proben und Referen­ zen gescannt wird.

5. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach An­ spruch 1 mit einer gepulsten Strahlungsquelle, einem Strahlungsteiler, einer Einheit zur räumlichen Auflö­ sung, die mindestens einen Polychromator oder eine andere Einrichtung zur Ortsauflösung aufweist, mit einem photoelektronischen Multiplier sowie mit einer Einheit zur zeitlichen Auflösung, die Zeit-Amplitu­ den-Wandler, Addierer und Subtrahierer sowie eine Daten-Speicher- und Prozeß-Einheit aufweist und der eine Synchronisiereinheit zugeordnet ist, dadurch ge­ kennzeichnet, daß der Strahlungsquelle (1) ein zu untersuchendes Objekt und ein Referenz-Objekt zugeord­ net sind und daß mindestens eine den Polychromator (16) bzw. eine andere Einrichtung zur Ortsauflösung wahlwei­ se mit der Probe bzw. der Referenz optisch verbindende Einrichtung vorgesehen ist.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß für die Aufnahme des zu untersuchenden und des Referenz-Objektes eine Probenzelle (9) und eine Refe­ renzzelle (8) vorgesehen sind.

7. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die optisch verbindende Einrichtung in direktem Kontakt mit der Probe und der Referenz steht.

8. Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß als optisch verbindende Einrichtung ein Lichtleiter (14) vorgesehen ist, dessen eines Ende mit dem Polychromator (16) fest verbunden ist und dessen anderes Ende sowohl der Referenz als auch der Probe zuordenbar ist.

9. Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß als optisch verbindende Einrichtung im Strahlengang vor dem Polychromator (16) ein wahlweise in den Strahlengang zwischen Polychroma­ tor (16) und der Probe bzw. zwischen Polychromator (16) und der Referenz einschwenkbarer Spiegel (41) vorgese­ hen ist.

10. Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß als optisch verbindende Einrichtung je ein der Probe bzw. der Referenz fest zugeordnetes Lichtleitfaserbündel (42, 43) vorgesehen ist, die abwechselnd in den Strahlengang des MCP-PMT (50) einschwenkbar sind.

11. Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 5 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung zur wahlweisen optischen Verbindung des Polychromators (16) mit der Probe bzw. der Referenz mit einer Steuereinheit (7) verbunden ist.

12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Steuereinheit (7) eine Verschiebevorrichtung (29) und einen Timer (30) aufweist.

13. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Verschiebevorrichtung (29) über eine mechani­ sche Verbindung (15) mit dem Lichtleiter (14) verbunden ist.

14. Vorrichtung nach mindestens einem der vorhergehenden An­ sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Einheit (3) zur räumlichen Auflösung eine Vorrichtung (31) zur Strahlaufweitung aufweist, der im Strahlengang eine lichtdurchlässige Probenplatte (33) zugeordnet ist und daß der Probenplatte (33) ein Lichtleiter (32) nachge­ ordnet ist, der mit einem Zeit-Raum-Detektor (4) op­ tisch verbunden ist.

15. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Probenplatte (33) Probenzellen (35) aufweist, die in m Spalten und n Zeilen geordnet sind, wobei in einer Zeile die Probenzellen (35) als Referenzzellen dienen und (n - 1)-Zeilen mit Probenzellen (35) als Meßzellen dienen, daß die Vorrichtung zur Strahlaufwei­ tung (31) aus n Lichtleitfasern besteht und der Licht­ leiter (32) ebenfalls n Lichtleitfasern aufweist.

16. Vorrichtung nach Anspruch 14 und 15, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der Probenplatte (33) eine Steuereinheit (40) zugeordnet ist, die eine Verschiebevorrichtung (37) mit Schrittschaltcharakter sowie einen Timer (30) aufweist.

17. Vorrichtung nach Anspruch 14 und 15, dadurch gekenn­ zeichnet, daß zur Ablenkung des Anregungslaserstrahls und rasterartigen Abtastung der Probenplatte (33) ein computergesteuerter beweglicher Spiegel vorgesehen ist.

18. Vorrichtung nach Anspruch 14 und 15, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die konfokale Scanning-Lichtmikroskopie angewendet wird.

19. Vorrichtung nach mindestens einem der vorhergehenden An­ sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausgänge der Zeit-Amplituden-Wandler (24, 25) mit Eingängen einer Koinzidenzeinheit (39) verbunden sind, deren Ausgang mit der Datenspeicher- und Prozeß-Einheit (28) verbun­ den ist.

20. Vorrichtung nach mindestens einem der vorhergehenden An­ sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Referenz eine Pseudo-Streu-Referenzprobe vorgesehen ist.

21. Vorrichtung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Pseudo-Streu-Referenzprobe aus der Probe und zugesetztem Elektronen- bzw. Energie-Akzeptor oder -Donator besteht.

22. Vorrichtung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein DL-MCP-PMT mit Hilfselektroden (51, 52) zur zweidimensionalen Ortserfassung versehen ist.