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Technisches
Gebiet
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Die
Erfindung betrifft die Analysetechnik und genauer die Erfassung
eines fluoreszierenden Stoffs oder eines Fluorophors in einer Probe.
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Hintergrund
der Erfindung
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Fluoreszierende
Stoffe oder Fluorophore emittieren Fluoreszenzstrahlung, wenn sie
durch Stimulationsstrahlung geeignet stimuliert werden. Die emittierte
Strahlung kann zu chemischen biologischen Analysezwecken verwendet
werden, z.B. bei der Bestimmung, ob ein interessierender Fluorophor in
einer Probe vorhanden ist, sowie bei der Quantifizierung seiner
Konzentration. Eine Analysetechnik dieses Typs ist in dem US-Patent
Nr. 5.171.534 an Smith u.a. offenbart, bei der in der DNA-Sequenzierung
erzeugte DNA-Fragmente auf der Grundlage der Fluoreszenz von Chromophoren,
mit denen die Fragmente markiert werden, charakterisiert werden. Elektromagnetische
Stimulationsstrahlung kann monochromatisch sein oder sie kann erhebliche
Energie in mehreren Energiebändern
enthalten, wie z.B. in dem US-Patent Nr. 5.784.157 an Gorfinkel
u.a. offenbart wird.
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Die
Stimulationsstrahlung verändert
sich normalerweise mit der Zeit entweder stochastisch oder regelmäßig. Eine
regelmäßige Veränderung
der Strahlungsintensität
kann durch Modulieren der Intensität der Strahlungsquelle oder
des Transmissionsgrads oder Reflexionsgrads eines Filterelements im
optischen Weg künstlich
eingebracht werden. Eine regelmäßig modulierte
Strahlung kann als codierte Strahlung bezeichnet werden, wenn die
zeitliche Veränderung
der Strahlung als ein Informationsträger verwendet wird. In Zusammenhang
mit einer solchen codierten Strahlung steht ein Zeitcode, d.h. eine
Zeitbereichsfunktion, die der zeitlichen Entwicklung der modulierten
Strahlungsintensität
entspricht. Eine Zeitbereichsfunktion kann als eine lineare Kombination
mehrerer geeigneter Funktionen gebildet werden, deren jeweiligen
Beiträge
zur linearen Kombination zuverlässig
quantifizierbar sind. In dieser Hinsicht geeignet sind sinusförmige Zeitfunktionen, die
z.B. mit verschiedenen Frequenzen oszillieren.
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In
herkömmlichen
Techniken wird die codierte Strahlung als kontinuierlich angesehen,
wobei die zeitliche Abhängigkeit
der erfassten Strahlungsintensität
als eine kontinuierliche Zeitbereichsfunktion betrachtet wird.
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Ferner
schließt
der Hintergrund mehrere bekannte Techniken zur Einzelphotonendetektion
ein, für
die W. R. McCluney, Introduction of Radiometry and Photometry, Artech
House, 1996, S. 114–122, eine
allgemeine Einführung
bereitstellt. Solche Techniken sind für die Messung modulierter Strahlung
gedacht, und sie können
in zwei Gruppen klassifiziert werden: (a) asynchrone Photonenzählung und
(b) synchrone Detektion. Wie bei Alan Smith, Selected Papers on
Photon Counting Detectors, SPIE, Bd. MS 413, 1998, beschrieben ist,
betreffen die Verfahren (a) der asynchronen Photonenzählung die
Detektion einer Anzahl von Photonen während eines festen Zeitintervalls,
z.B. eine Sekunde, das als das Registrierintervall bezeichnet wird.
Diese Verfahren ermöglichen
die Bestimmung einer durchschnittlichen Frequenz für die Photonenankunft.
Diese Frequenz verändert
sich im Laufe der Zeit entweder stochastisch oder regelmäßig, wobei
eine synchrone Zählung
verwendet werden kann, um die zeitliche Veränderung zu messen. Eine wesentliche
Einschränkung
dieses Verfahrens steht in Zusammenhang mit der Unmöglichkeit,
Modulationsfrequenzen zu messen, die größer als die Wiederholungsfrequenz
des Registrierintervalls sind. Diese Schwierigkeit ist dem Prinzip
der asynchronen Zählung
eigen, das im Aufzeichnen der Gesamtanzahl von Photonen, die in
dem Registrierintervall empfangen werden, anstatt im Registrieren ihrer
Ankunftszeiten besteht. Eine Schwierigkeit kann auftreten, wenn
die höchste
Frequenz fmod im Modulationsspektrum der
Modulationsstrahlung mit der durchschnittlichen Frequenz fphot einer Einzelphotonendetektion vergleichbar
oder größer als
sie ist. Wenn in diesem Fall die Frequenzgrenze durch Verkleinern
des für
die Zählung
gewählten
Zeitintervalls erhöht
wird, wird die Technik zunehmend ineffektiv, weil der Zähler in
den meisten Registrierintervallen nichts zählt.
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Die
Verfahren (b) der synchronen Detektion betreffen die Messung der
Ankunftszeit einfallender Einzelphotonen. Dieser Zeitpunkt kann
auf einen "absoluten" Takt bezogen werden
oder er kann relativ zu oder "synchron
mit" einem Triggeranregungssignal gemessen
werden. Das Triggersignal kann z.B. mit der Ankunft des ersten der
erfassten Photonen verknüpft
sein. Derartige Verfahren sind besonders nützlich hinsichtlich einer Anwendung
bei schnellen Prozessen, z.B. dem Fluoreszenzzerfall eines einzelnen
angeregten Farbmoleküls,
wie z.B. von D. Y. Chen u.a. in, "Single Molecule Detection in Capillary Electrophoresis:
Molecular Shot Noise as a Fundamental Limit to Chemical Analysis", Analytical Chemistry,
Bd. 68 (1996), S. 690–696,
beschrieben wird, wobei typisch spezielle Elektronik erforderlich
ist, um schnelle zeitliche Veränderungen
zu handhaben. Eine wesentliche Einschränkung dieser Verfahren steht
mit der Schwierigkeit in Zusammenhang, Aufzeichnungen hoher Zeitauflösung für eine relativ
lange Zeit aufrechtzuerhalten. Folglich erfordert ein Erfassen von
Photonenankünften
mit der Zeitauflösung,
die Nanosekunden-Zeitintervallen entspricht, über einen Zeitabschnitt von
einer Sekunde die Erfassung von einer Milliarde Datensätzen. Dies
macht es schwierig, Verfahren der synchronen Detektion auf die Photometrie
sich relativ langsam verändernder
modulierter Einzelphotonenflüsse
anzuwenden.
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WO0026644
offenbart eine Technik und eine Vorrichtung für die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie,
bei der ein Impulslaser eine Probe periodisch anregt und die Zeitdauer
zwischen aufeinander folgenden Zeitpunkten des Erfassens einzelner
Photonen in einer Photonenfolge aufgezeichnet wird.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
Erfinder haben erkannt, dass bei der Erfassung eines fluoreszierenden
Stoffes in einer Probe eine Einzelphotonenzählung besonders bei niedrigen
Fluoreszenzsignal-Energieniveaus vorteilhaft verwendet werden kann.
Bevorzugte Detektionstechniken schließen Verfahren ein, (i) bei
denen die Fluoreszenzstimulationsstrahlung in Übereinstimmung mit einem im
Voraus gewählten
Code intensitätsmoduliert
wird, (ii) wobei es die Fluoreszenzstrahlung ist, die mit dem im
Voraus gewählten
Code intensitätsmoduliert
wird, und (iii) wobei die Modulation mit einem im Voraus gewählten Code
auf eine Probe angewendet wird, um eine Eigenschaft, z.B. Temperatur, Druck
oder eine elektrische oder magnetische Feldstärke oder -frequenz zu beeinflussen,
die sich funktionell auf die emittierte Fluoreszenzstrahlung auswirkt.
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Vorzugsweise
wird zur Registrierung der Signale von einem Sensorelement eines
Einzelphotonendetektors die Ankunftszeit optional zusammen mit der
Registrierung von Zeitintervallen aufgezeichnet. Vorteilhafterweise
können
im Interesse der Minimierung der Anzahl von Impulsen, die wegen
einem engen Zeitabstand von Impulsen verloren gehen, D-Trigger in
der Zählschaltungsanordnung
enthalten sein.
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Die
bevorzugten Techniken sind im Allgemeinen auf die Photometrie zeitcodierter
Einzelphotonen- oder Teilchenflüsse
anwendbar. Sie betreffen die Messung von Zeitintervallen zwischen
Einzelphotonen-/Teilchenankünften,
die mit einer Datenanalyse kombiniert wird, die ein Decodieren der
codierten Strahlung erlaubt, d.h. eine Unterscheidung zwischen alternativen
möglichen
Codes und eine Quantifizierung verschiedener Mischkombinationen
der Codes. Die Techniken sehen vor, dass die Zeitintervalle zwischen
aufeinander folgenden Impulsen asynchron gemessen werden sollen,
ohne dass ein externer Taktbezug oder ein spezielles Triggersignal erforderlich
ist. Sie gewährleisten
eine effiziente Messung und Decodierung zeitcodierter Einzelphotonen- oder
Teilchenflüsse.
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Kurzbeschreibung
der Zeichnung
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1 ist
eine schematische Darstellung einer bevorzugten ersten Technik in Übereinstimmung mit
der Erfindung unter Verwendung einer modulierten Lichtquelle.
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2 ist
eine schematische Darstellung einer bevorzugten zweiten Technik
in Übereinstimmung
mit der Erfindung unter Verwendung eines Dispersionselements.
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3 ist
eine schematische Darstellung einer bevorzugten dritten Technik
in Übereinstimmung mit
der Erfindung, die eine Zeitcodierung unterschiedlicher Spektralkomponenten
eines Fluoreszenzsignals einbezieht.
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4 ist
eine schematische Darstellung einer bevorzugten vierten Technik
in Übereinstimmung mit
der Erfindung für
die Registrierung von Zeitparametern einer stochastischen Folge
aus Impulsen konstanter oder ähnlicher
Form.
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5 ist
eine schematische Darstellung einer bevorzugten fünften Technik
in Übereinstimmung mit
der Erfindung, bei der die vierte Technik mit der Mes sung von Zeitintervallen
integriert ist.
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6 ist
eine schematische Darstellung einer bevorzugten sechsten Technik
in Übereinstimmung
mit der Erfindung, bei der die vierte Technik zur weiteren Minimierung
von Impulsen, die der Registrierung verloren gehen, erweitert ist.
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Ausführliche
Beschreibung
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Für die vorliegende
Beschreibung braucht nicht zwischen "Photon" und "Quant" unterschieden werden, da jedes zu einem
Detektorsignal, typischerweise einem elektrischen Signal oder Impuls,
für eine elektronische
Verarbeitung in Übereinstimmung
mit Techniken der Erfindung führen
kann. Die Verwendung weiterer Arten der Signalverarbeitung, z.B. durch
optoelektronische oder rein optische Mittel, wird nicht ausgeschlossen.
Selbstverständlich
kann bei alternativen Verarbeitungsmitteln ein Detektorsignal oder
ein Impuls, das bzw. der verarbeitet wird, von einem elektrischen
Signal oder Impuls verschieden sein.
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A. Einzelphotonendetektion
in Verfahren zur Fluorophor-Identifizierung
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Es
wird eine spezielle Beleuchtungstechnik mit mehreren modulierten
Schmalbandquellen, von denen jede entsprechend ihrer eigenen unterscheidbaren
Zeitbereichsfunktion moduliert wird, verwendet. Die Schmalbandquellen
regen unterschiedliche Fluorophore unterschiedlich an, so dass die
emittierte Fluoreszenzstrahlung mit Informationen über die Beschaffenheit
und Zusammensetzung beleuchteter fluoreszierender Stoffe codiert
wird. Die Photonen werden einzeln erfasst.
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In
einer bevorzugten ersten Ausführungsform,
wie sie durch 1 verdeutlicht wird, ist eine modulierte
Mehrband-Lichtquelle, die codierte Strahlung für die Fluoreszenzanregung erzeugt,
mit einer Einzelphotonendetektion eines codierten Fluoreszenzsignals
kombiniert.
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1 zeigt
die Lichtquelle 11, die einen Strahlungsfluss 12 erzeugt,
der über
ein optisches Beleuchtungssystem 13 auf den Behälter 14,
der eine fluoreszie rende Probe enthält, auftrifft. Der Strahlungsfluss 12 umfasst
mehrere Spektralbänder, wovon
jedes entsprechend seiner eigenen unterscheidbaren Zeitbereichsfunktion
moduliert ist. Die von der fluoreszierenden Probe emittierte Fluoreszenzstrahlung 15 wird
von einem optischen Empfängersystem,
z.B. einem Objektiv 16, aufgenommen und zu dem optischen
Eingang eines Einzelphotonendetektors 17 geführt. Die
Ausgabe des Detektors 17 ist ein stochastischer Strom 18 aus
elektrischen Impulsen ähnlicher
Form, wobei Informationen über die
Intensität
der in einem festen Zeitintervall empfangenen Fluoreszenzstrahlung
in der durchschnittlichen Frequenz der in dem Intervall ankommenden Impulse
enthalten sind. Die zeitlichen Kenngrößen des Stroms 18 aus
elektrischen Impulsen werden in geeigneter Form von dem Aufzeichnungsgerät 19 registriert,
das unten in Zusammenhang mit den 4 und 5 ausführlicher
beschreiben wird. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der stochastische Impulsstrom
in Hinsicht auf den Zeitabstand zwischen den Ankünften aufeinander folgender
Impulse gekennzeichnet. Das Detektionssystem kann durch Kommunikationsmittel 120 ergänzt sein,
um die aufgezeichneten Informationen mit einer passenden Rate von
dem Aufzeichnungsgerät 19 zu
einer Signalprozessoreinheit 121 zu übertragen.
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Eine
bevorzugte zweite Ausführungsform, wie
sie durch 2 verdeutlicht wird, kann als
eine Verbesserung gegenüber
einem bekannten Verfahren zur Mehrfarben-Fluoreszenzdetektion, wie
es z.B. in dem oben als Literaturhinweis erwähnten Patent an Smith u.a.
offenbart ist, betrachtet werden. Bei dieser Technik wird die von
einem angeregten Molekül
emittierte Fluoreszenzstrahlung optisch in verschiedene Wellenlängenkanäle zerlegt,
z.B. mittels eines Prismas oder eines Beugungsgitters. Danach wird
die Intensität
der Fluoreszenzstrahlung in jedem der Wellelängenkanäle durch photometrische Mittel
bestimmt. In der bevorzugten zweiten Ausführungsform wird die Empfindlichkeit
durch die Verwendung einer Einzelphotonendetektion verbessert.
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2 zeigt
die Strahlung 22 von einer modulierten optischen Quelle 21,
die von einer Linse 23 auf eine fluoreszierende Probe 24 fokussiert
wird. Die modulierte optische Quelle 21 kann ein oder mehrere Spektralbänder, die
entweder zusammen oder unabhängig
voneinander mit unterschiedlichen Zeitbereichsfunktionen moduliert
werden, erzeugen. Die von der Probe 24 in Reaktion auf
die einfallende Strahlung 22 emittierte Fluoreszenz 25 wird
von einem Objektiv 26 zu einem optischen Prozessor geführt, der
ein Dispersionselement 27, z.B. ein Prisma oder ein Beugungsgitter,
und eine Gruppe 29 aus Einzelphotonendetektoren (SPD) umfasst.
Das Dispersionselement 27 bewirkt eine spektrale Zerlegung des
Fluoreszenzsignals.
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Jeder
der SPDs erzeugt an seinem Ausgang einen stochastischen Strom aus
elektrischen Impulsen ähnlicher
Form, wobei Informationen über
die Intensität
der empfangenen Fluoreszenzstrahlung in den zeitlichen Kenngrößen des
stochastischen Stroms enthalten sind. Wie in 2 gezeigt
ist, werden die zeitlichen Kenngrößen 210 von jedem
SPD durch ein Aufzeichnungsgerät 211 registriert,
dessen Struktur unten in Zusammenhang mit den 4 und 5 ausführlicher
beschrieben wird.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform,
die ebenfalls unten in Zusammenhang mit den 4 und 5 ausführlicher
beschrieben wird, wird die Beschreibung des stochastischen Impulsstroms
hinsichtlich der Zeitabstände
zwischen Ankünften
aufeinander folgender Impulse spezifiziert. Das Detektionssystem
umfasst ferner eine Signalprozessoreinheit 212 und Mittel,
um die aufgezeichneten Informationen mit einer passenden Rate von
dem Aufzeichnungsgerät 211 zu
der Signalprozessoreinheit 212 zu übertragen.
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2 veranschaulicht
eine Kombination einer modulierten Lichtquelle für die Fluoreszenzanregung mit
einem Dispersionselement zum Zerlegen der Fluoreszenzantwort in
verschiedene Spektralbänder
und einer Einzelphotonendetektion der modulierten Fluoreszenz in
jedem der Spektralbänder. Wie
in 1 kann die modulierte Lichtquelle außerdem auch
mehrbandig sein, so dass der Strahlungsfluss 22 mehrere
Spektralbänder
umfasst, wovon jedes entsprechend seiner eigenen verschiedenen Zeitbereichsfunktion
moduliert wird. In diesem Fall ist eine bevorzugte Technik ferner
dadurch von Vorteil, dass verschiedene fluoreszierende Stoffe sich
sowohl durch ihr Fluoreszenzemissionsspektrum als auch ihr Fluoreszenzanregungsspektrum
unterscheiden. Dies verbessert die Genauigkeit der Fluorophor-Identifizierung.
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Eine
bevorzugte dritte Ausführungsform
der Erfindung, die durch 3 veranschaulicht wird, kann
als eine Verbesserung gegenüber
einer bekannten Technik zur Mehrfarben-Fluoreszenzdetektion, wie
sie z.B. gemäß dem oben
als Literaturhinweis erwähnten
Patent an Smith u.a. angewendet wird, betrachtet werden. Die bekannte
Technik ist mit einer Einzelphotonendetektion unter Verwendung einer Modulationstechnik,
die in der von Gorfinkel u.a. am 7. Oktober 1997 eingereichten US-Patentanmeldung Nr.
08/946.414 offenbart wird, kombiniert. In Übereinstimmung mit der letzteren
Technik wird Strahlung, die von einem Objekt reflektiert, übertragen
oder fluoreszierend emittiert wird, in der Weise codiert, dass die
codierte Strahlung Informationen über Eigenschaften des Objekts
trägt,
z.B. seine Farbe, die durch die reflektierten Wellenlängen gekennzeichnet ist,
oder die Identität
und der quantitative Gehalt fluoreszierender Stoffe, die in dem
Objekt vorhanden sind. In der vorliegenden Ausführungsform der Erfindung wird
eine Zeitcodierung verschiedener Spektralkomponenten eines Fluoreszenzsignals
mit einer Einzelphotonendetektion der codierten Spektralkomponenten
kombiniert, um die Empfindlichkeit zu verbessern.
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3 zeigt
die Strahlung 32 von der optischen Quelle 31,
die durch ein Objektiv 33 auf die fluoreszierende Probe 34 fokussiert
wird. Im Gegensatz zu den durch die 1 und 2 veranschaulichten Ausführungsformen
muss die optische Quelle 31 nicht moduliert werden und
die Strahlung 32 kann oder braucht nicht codiert werden.
Die von der Probe 34 in Reaktion auf die einfallende Strahlung 32 emittierte
Fluoreszenz 35 wird von einem Objektiv 36 auf einen
optischen Prozessor gelenkt, der ein Dispersionselement 37,
z.B. ein Prisma oder ein Beugungsgitter, und eine Gruppe optischer
Modulatoren 38 umfasst. Das Dispersionselement 37 bewirkt
eine spektrale Zerlegung der Fluoreszenz 35. Die Spektralkomponenten
werden zu einer Gruppe optischer Modulatoren 38 geführt, die
die aufgelösten
Spektralkomponenten hinsichtlich der Zeit auf die Weise modulieren,
dass jede verschiedene aufgelöste
Spektralkomponente durch eine bestimmte Zeitfunktion codiert ist.
Die modulierten Komponenten 39 des Fluoreszenzspektrums
werden von einem optischen Element 310 zu einem optischen
Fluss 311 kombiniert, der auf den optischen Eingang des
Einzelphotonendetektors 312 fokussiert ist. Die Ausgabe
des Detektors 312 stellt einen stochastischen Strom 313 aus
elektrischen Impulsen ähnlicher
Form dar, dessen zeitliche Kenngrößen von dem Aufzeichnungsgerät 314,
das unten ausführlich
in Zusammenhang mit den 4 und 5 beschrieben
wird, registriert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform,
die ebenfalls unten ausführlich
beschrieben wird, wird die Beschreibung des stochastischen Impulsstroms hinsichtlich
des Zeitabstands zwischen Ankünften aufeinander
folgender Impulse spezifiziert. Das Detektionssystem umfasst ferner
Mittel 315, um die aufgezeichneten Informationen mit einer
passenden Rate zu einer Signalprozessoreinheit 316 zu übertragen.
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B. Einzelphotonendetektion
modulierter Photonenflüsse
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Eine
bevorzugte vierte Ausführungsform
der Erfindung hinsichtlich eines Verfahrens zur Registrierung von
Zeitparametern einer stochastischen Folge aus Impulsen konstanter
oder ähnlicher
Form wird durch 4 verdeutlicht.
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Das
Aufzeichnungsgerät
von 4 arbeitet mit einer gesteuerten Zeitauflösung, die
durch einen Takt 45 gesteuert wird, der eine regelmäßige Folge 46 aus
elektrischen Impulsen konstanter Form bereitstellt, die die Aufzeichnungszeitintervalle
definieren. Ein stochastischer Strom 41 aus elektrischen
Eingangsimpulsen kann von einem Abtastelement eines Einzelphotonendetektors
stammen, das typisch eine Elektronenvervielfachungsröhre (PMT)
oder eine Lawinenphotodiode (APD) ist.
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Die
Eingangsimpulse brauchen nicht von derselben Form sein. Mit einer
APD wird eine spezielle Lawinenlöschschaltung
entweder passiv oder aktiv verwendet. Typischerweise wird die APD
im Voraus in ihre Lawinenbetriebsart vorgespannt, so dass das erste
Photon die Lawine auslöst.
Um sich auf die nächste
Photonenankunft vorzubereiten, muss die Lawine gelöscht werden.
Es kann vorteilhaft sein, eine so genannte Zwangslöschschaltung
zu verwenden, die unabhängig
davon, ob eine Lawine tatsächlich
ausgelöst
worden ist oder nicht, regelmäßig den Lawinenzustand
löscht,
so dass die Ankunft von Photonen und der Zeitpunkt der Löschung nicht
korreliert sind. Im Ergebnis ist die Löschimpulsdauer ebenfalls stochastisch,
je nach dem Zeitpunkt der Photonenankunft in Bezug auf ein nachfolgendes
Löschen.
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Der
Impulsstrom 41 wird zu einer Zustandsschiebevorrichtung
oder einem -register 42 mit n zyklischen Zuständen geführt. Eine
solche Vorrichtung weist n aufeinander folgende stabile Zustände auf, die
mit 0, 1, 2, ..., n – 1
nummeriert werden können, wobei
ein Wechsel aus einem Zustand k in seinen Nachfolgezustand k + 1
durch einen Eingangsimpuls getriggert wird, wobei ein Zustand n – 1 einen
Zustand 0 als seinen Nachfolgezustand besitzt. Zwischen den Eingangsimpulsen
behält
die Zustandsschiebevorrichtung 42 mit n zyklischen Zuständen ihren
Zustand bei. Beispielsweise kann für eine Zustandsschiebevorrichtung
mit 2 zyklischen Zuständen
ein Flipflop mit einer Folge stabiler Zustände 0, 1, 0, 1, ... verwendet
werden, wobei jeder Eingangsimpuls einen Übergang von 0 zu 1 oder von
1 zu 0 bewirkt. Es ist nicht notwendig, dass die Schiebvorrichtung
mit zyklischen Zuständen
zu ihrem Anfangszustand zurückkehrt,
wenn ihr Zustand gelesen wird. Dies steht im Gegensatz zu herkömmlichen
Photonenzählern,
bei denen jedes Lesen der Zählerdaten von
einem Rücksetzen
des Zustands des Zählers
zurück
in seinen Anfangszustand begleitet wird.
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Der
Spezifität
wegen wird ohne Einschränkung
der Erfindung in der folgenden weiteren Beschreibung von 4 von
einem Flipflop ausgegangen. Die Ausgabe von dem Flipflop stellt
eine stochastische Folge 43 aus Rechteckimpulsen veränderlicher
Länge dar.
Die Folge 43 wird zu einer Aufzeichnungsvorrichtung 44 geführt, die
als ein analoges oder digitales Signalaufzeichnungsgerät realisiert
sein kann. Das Ausgangssignal 47 wird von der Aufzeichnungsvorrichtung 44 zu
einem Signalprozessor (nicht gezeigt) übertragen.
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Das
Aufzeichnungsgerät
von 4 arbeitet im Wesentlichen in einer asynchronen
Betriebsart. Jedoch im Gegensatz zu asynchronen Photonenzählern, die
die Gesamtzahl von Photonen, die in einem bestimmten Zeitintervall
ankommen, aufzeichnen, zeichnet das bevorzugte Aufzeichnungsgerät deren Ankunftszeiten
auf. Die Aufzeichnungsgenauigkeit der Ankunftszeit wird durch den
Takt 45 gesteuert.
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Die
Zeitintervalle werden ohne Messung der Dauer des Intervalls aufgezeichnet.
Diese Funktion kann durch eine von mehreren dem Fachmann auf dem
Gebiet bekannten Vorrichtungen, die in einer elektrischen Schaltung
in Reihe zu dem Aufzeichnungsgerät
platziert wird und sein Ausgangssignal 47 verwendet, durchgeführt werden.
Zum Beispiel kann ein Universalrechner zur Verarbeitung des von der
Aufzeichnungsvorrichtung 44 erfassten Datenfelds verwendet
werden.
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In
einigen Anwendungen kann es vorteilhaft sein, die Funktionen zur
Registrierung der Zeitintervalle zwischen aufeinander folgenden
Einzelphotonendetektionen und der Messung der Zeitintervalle in einer
einzigen Vorrichtung zu integrieren. Eine solche integrierte, bevorzugte
fünfte
Ausführungsform
der Erfindung für
einen stochastischen Strom aus elektrischen Impulsen 51,
auf die die Betrachtungen zur Form und zur APD-Löschung bezüglich der Impulse 41 von 4 anwendbar
sind, wird durch 5 veranschaulicht.
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Wie
in 5 gezeigt ist, wird ein stochastischer Strom aus
Impulsen 51 zu einem Flipflop 52 geführt. Seine
Ausgabe stellt eine stochastische Folge 53 aus Rechteckeingangsimpulsen
veränderlicher Länge dar.
Die Folge 53 wird zwischen den Zählern 56 und 56' und der gesteuerten
Verzögerungsleitung 531 dreigeteilt.
Der Zähler 56 empfängt das
Signal von dem Flipflop direkt, während der Zähler 56' sein Signal über einen Inverter 521 empfängt. Folglich werden
die Zähler 56 und 56' durch gegenphasige
Signale gesteuert. Anstelle eines Flipflops 52 kann eine Zustandsschiebevorrichtung
mit n zyklischen Zuständen
verwendet werden, wie anhand 4 beschrieben
ist. Vorteilhafterweise können
in diesem Fall anstelle zweier Zähler 56 und 56' bis zu n Zähler verwendet
werden.
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Ein
Takt 54 stellt eine regelmäßige Folge 55 aus
elektrischen Impulsen konstanter Form, die von dem Zähler 56 gezählt werden,
bereit. Beispielhaft ist der Zähler 56 der
Zähler,
dessen Eingangssignal zum Zeitpunkt der Taktimpulsankunft gleich
1 ist. Vorteilhafterweise kann, wenn die Impulse 51 von
einer APD stammen, die äußere Löschschaltung,
die die APD periodisch aus ihrer Lawinenbetriebsart zwingt, durch
den Takt 54 synchronisiert werden. Es liegt kein Vorteil
in einer Erhöhung
der Löschfrequenz über die
Taktfrequenz hinaus, die die Basiszeitdiskretisierung in der Technik
bereitstellt.
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Wenn
ein Photon erfasst wird und ein elektrischer Impuls 51 in
das Flipflop 52 eingeht, hört einer der Zähler 56 und 56' auf zu zählen, während der
andere zu zählen
beginnt. Der eine Zähler,
der gerade das Zählen
unterbrochen hat, enthält
die Aufzeichnung 57, wie lange das Intervall zwischen zwei
aufeinander folgenden Impulsen gedauert hat, das in Bezug auf die
gezählte
Taktzyklenzahl gemessen wird. Die Aufzeichnung 57 wird über einen
Kommutator 58 zu der Aufzeichnungsvorrichtung 510 übertragen,
wobei der Kommutator dazu dient, ein aufeinander folgendes Aufzeichnen
in Zeitintervallen zu sichern, so dass, während ein Zeitintervall aufgezeichnet
wird, das nächste
Zeitintervall gemessen wird. Der Kommutator 58 wird durch
ein Schaltsignal gesteuert, das von den Eingangssignalen 53 abgeleitet wird,
die um eine der Reaktionszeit des Zählers 56 entsprechende
charakteristische Zeit τ1 verzögert werden.
Die Ausgabe des Kommutators 58 stellt eine Folge von Codes 59 dar,
die die gemessenen Zeitintervalle zwischen erfassten Photonen beschreiben. Die
Codes 59 treten am Ausgang des Kommutators 58 in
stochastischer Weise auf, die der Detektion einfallender Photonen
entspricht, und sind um das Zeitintervall, dass die Summe aus τ1 und
der Reaktionszeit τ2 des Kommutators selbst ist, verzögert. Es
ist daher vorteilhaft, die Aufzeichnungsvorrichtung 510 durch
Schaltsignale zu steuern, die aus den Eingangssignalen 53,
die ab dem Moment der Flipflop-Umschaltung um die Zeit τ1 + τ2 verzögert werden,
abgeleitet werden. Die Ausgabe 514 der Aufzeichnungsvorrichtung 510 stellt
dieselbe Folge 59 von Codes dar, die die gemessenen Zeitintervalle zwischen
erfassten Photonen beschreiben. Im Gegensatz zu der Folge 59,
die im Laufe der Zeit stochastisch akkumuliert wird, kann die Folge 514 in
regelmäßiger Weise,
z.B. mit einer konstanten Rate, zu Weiterverarbeitung übertragen
werden.
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Bezug
nehmend auf die Technik, die durch 4 veranschaulicht
wird, veranschaulicht 6 die Einbindung von D-Triggern
zur Minimierung der Anzahl von Impulsen, die aufgrund ihres engen
zeitlichen Abstands nicht gezählt
werden. Elektrische Impulse von einem Ausgang des Einzelphotonendetektors
werden über
einen schnellen Schalter 61 zum Eingang C eines synchronen
8-Bit-Binärzählers 62 geführt. Das
Ergebnis der Zählung
wird als ein 8-Bit-Wort oder -Byte zu dem Speicherregister 63 geleitet.
Um eine Änderung
des Zustands des Zählers 62 während der
Speicherung zu vermeiden, sperrt der Synchronimpulsgenerator 65 den
Schalter 61 gleichzeitig mit dem Senden eines kurzen Speicherimpulses
an den Eingang Wr des Speicherregisters 63. Die Ausgabe
von dem Speicherregister 63 geht durch den Puffer 64 direkt
zum parallelen Anschluss eines Computers. Eine Funktionssteuer-Fehleranzeige
wird durch einen Logikkomparator 66, der mit einer LED
(lichtemittierende Diode) 67 ausgestattet ist, ermöglicht.
Der parallele Computeranschluss wird durch einen synchronen Impuls über eine
Verzögerungsleitung 68 mit
einer geeigneten Verzögerung τ synchronisiert.
Derselbe verzögerte
Impuls syn chronisiert den Logikkomparator 66.
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Für eine beispielhafte
Ausführungsform
der durch 6 veranschaulichten Technik,
kann Folgendes spezifiziert und realisiert werden: eine Diskretisierungsfrequenz
von 125 kHz, eine maximale Anzahl von Impulsen pro Diskretisierungsintervall von
256, ein minimaler Zeitabstand zwischen registrierten Impulsen von
20 ns, eine maximale durchschnittliche Frequenz registrierter Impulse
von 32 MHz und ein maximaler Bruchteil fehlender Photonen von 0,25%.
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Die
Techniken der Erfindung können
vorteilhaft in einer Vielzahl von Anwendungen, die codierte elektromagnetische
Strahlung einschließen,
einschließlich
der Mehrfarben-Lumineszenzdetektion auf der Grundlage der Fluoreszenzspektroskopie und
der Fluoreszenzanregungsspektroskopie verwendet werden. Sie können in
gewöhnlichen
Sensoranwendungen mit anderen modulierten Lumineszenzsignalen verwendet
werden, z.B. jenen, die sowohl auf verschiedenen Spektroskopietechniken
wie etwa Transmissions-, Absorptions-, Reflexions- oder Raman-Spektren
als auch Elektrolumineszenz, Chemolumineszenz und dergleichen basieren.
Die Techniken sind besonders nützlich
für die
Erfassung schwacher Signale, z.B. jener, die in optischen Kommunikationsverbindungen,
bei denen Signale über lange
optische Fasern übertragen
werden, vorherrschen.