DE3590026C2 - Vorrichtung zur Bestimmung der Fluoreszenzabklingcharakteristik einer Materialprobe - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Bestimmung der Fluoreszenabklingcharakteristik einer Materialprobe nach dem Oberbegriff von Anspruch 1.

Eine Vorrichtung dieser Art ist in Physical Review B, Vol. 15, No. 3, 1977, S. 1248-1260, insbesondere Fig. 1, beschrieben.

Bei dieser bekannten Anordnung, wie auch bei den Anordnungen gemäß den übrigen zum Stand der Technik in Betracht gezogenen Entgegenhaltungen, ist jedoch keine Bestimmungseinrichtung zur Messung des in aller Regel im Verlauf eines längeren Meßvorganges in gewissen Grenzen veränderlichen Impulsprofiles der Erregerlichtquelle vorgesehen. Daher ist es nicht möglich, der Bestimmung der Fluoreszenzabklingcharakteristik genau das zum Bestimmungszeitpunkt tatsächlich vorliegende Impulsprofil der Erregerlichtquelle zugrundezulegen. Letzteres muß vor oder nach der Messung getrennt bestimmt werden, wodurch neben einer Ungenauigkeit des Bestimmungsvorganges auch eine beträchtlich längere Zeitdauer des Meßvorganges in Kauf genommen werden muß.

In Rev. Sci. Instrum., 53 (9), 1982, S. 1392-1397, Fig. 1, ist ein Spektrometer zur Bestimmung der Fluoreszenzabklingcharakteristik einer Probe mit einem Detektor beschrieben.

Die DE 27 47 409 A1 hat ein Verfahren zum Analysieren von fluoreszierenden Stoffen zum Gegenstand, bei welchem der anregende Strahlungsimpuls auf seinem Weg zur Probe eine größere Zeitverzögerung erleidet, als der Bezugsimpuls auf seinem Weg zum Bezugsstrahlungsdetektor (vergl. den dritten Absatz von Seite 11).

Aus J. Phys. E: Sci. Instrum., Vol. 13, 1980, S. 446-450, Fig. 1, Bezugszeichen TAC, ist es bei der Fluoreszenzspektroskopie bekannt, Zeitintervalle in Amplitudenwerte umzuwandeln.

Gemäß der DE 32 06 407 A1 enthält bei einer Einrichtung zum quantitativen Nachweis biochemischer Reaktionen die Meßelektronik für Einzelphotonenfluoreszenz einen Vielkanalanalysator (letzter Absatz von Seite 6).

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung der eingangs genannten Art in der Weise weiter zu entwickeln, daß die Messung des Erregerimpulsprofiles der Erregerlichtquelle ohne Unterbrechung während der Dauer der Beleuchtung der Probe durchgeführt werden kann. Dadurch soll zum einen die Messung schneller vonstatten gehen, zum anderen soll es möglich sein, die Umfeldbedingungen für die Probe während des gesamten Meßvorganges ohne wesentliche Störungen beizubehalten, wodurch die Bestimmung der Fluoreszenzabklingcharakteristik mit größerer Genauigkeit durchgeführt werden kann.

Diese Aufgabe wird gemäß der Erfindung durch die im Kennzeichen von Anspruch 1 aufgeführten Merkmale gelöst.

Die Meßeinrichtung ist dabei so angeordnet, daß sie das Zeitintervall, bei dem ein Vorgang auftritt, in Relation zu einem Synchronisationsimpuls mißt, wobei sie diese Meßwerte in proportionale Amplitudenmeßwerte umwandeln kann. Darüber hinaus mißt die Meßeinrichtung die aufaddierte Zahl der in jedem Zeitintervall über die Dauer des Meßvorganges stattfindenden Vorgänge.

Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen und aus der Beschreibung, in welcher anhand der Zeichnungen einige Ausführungsformen der Erfindung erörtert werden. Dabei zeigen:

Fig. 1 ein bekanntes Gerät zur Messung der Fluoreszenzabklingcharakteristik,

Fig. 2 und 3 ein weiteres Gerät zur Messung der Fluoreszenzabklingcharakteristik.

Fig. 4 eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Gerätes, und

Fig. 5 eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Gerätes.

Gemäß Fig. 1 ist eine Erregerlichtquelle 1 so angeordnet, daß sie einen Zug von Erregerlichtimpulsen längs eines Strahlenganges 2 aussendet, um eine Probe in einer Probenstation 3 zu beleuchten. Fluoreszenzphotonenvorgänge werden mittels einer Vorrichtung 9 empfangen, die üblicherweise in Form eines Wellenlängenselektors, wie beispielsweise eines Gittermonochromators, vorliegt, dessen Ausgangssignal einem als Einzelphotonendetektor ausgebildeten Detektor 10 (wie beispielsweise einen Photomultiplier) zugeführt wird. Der Detektor 10 liefert entsprechende Ausgangssignale an einen Eingang einer Meßeinrichtung (8, 12) über einen Schwellwertdiskriminator 11, um Rauschsignale auszuschalten. Die Meßeinrichtung (8, 12) enthält einen zweiten Eingang, der so angeschlossen ist, daß er einen Zug von Synchronisationsimpulsen aufnimmt, die von der Erregerlichtquelle 1 erhalten werden, und sie enthält eine Vorrichtung 8, die als Start/Stop-Zähler und Zeitintervall/Amplitudenwandler entsprechend der Photonen-Korrelationstechnik wirkt, sowie einen Mehrkanalanalysator 12, in dem das Ausgangssignal von der Vorrichtung 8 als Histogramm gespeichert wird, welches die relativen Wahrscheinlichkeiten des Auftretens der verschiedenen Start/Stop-Verzögerungszeiten wiedergibt, welches ein Maß für die Fluoreszenzabklingchakteristiken der Probe ist.

Die Synchronisationsimpulse werden in Fig. 1 von dem optischen Ausgangssignal der Erregerlichtquelle 1 über einen Photomultiplier 4, einen Diskriminator 6 und eine Verzögerungsleitung 7 erhalten, wobei erreicht wird, daß die Synchronisationsimpulse nach entsprechend ermittelten Photonenvorgängen auftreten und dementsprechend Photonenvorgänge an den "Start"-Eingang der Vorrichtung 8 angelegt werden, während Synchronisationsimpulse an den "Stop"-Eingang der Vorrichtung 8 angelegt werden.

Bekannterweise können die Synchronisationsimpulse elektrisch von dem Impulsbildungssteuersystem der Erregerlichtquelle 1 erhalten und auf den "Start"-Eingang der Vorrichtung 8 gelegt werden. Daneben liefert selbstverständlich die Photonen-Korrelationstechik gültige Ergebnisse nur dann, wenn eine niedrige Ermittlungswahrscheinlichkeit beibehalten wird, typischerweise ein Photonenvorgang auf jeweils 100 Erregerimpulse.

Soweit in den Fig. 2 bis 5 Bauelemente der Fig. 1 enthalten sind, sind diese auch mit den gleichen Bezugszeichen belegt. So ist in Fig. 2 eine Erregerimpulsprofilbestimmungseinrichtung zusätzlich zu den Bauelementen von Fig. 1 vorgesehen, und diese enthält einen Strahlenteiler 13, der in dem Strahlengang 2 angeordnet ist, wodurch ein kleiner Bruchteil des Erregerlichts einer optischen Zeitverzögerungseinrichtung 14 zugeführt wird, beispielsweise einem Strahlengang in Luft, der zwischen Spiegeln abgelenkt ist oder möglicherweise einem Lichtleiter, wie beispielsweise eine Einzelmoden-Glasfaser, wobei das Ausgangssignal der Zeitverzögerungseinrichtung 14 durch passende Optiken 16 an den Eingang des Detektors 10 geliefert wird. Auf diese Weise empfängt bei dieser Anordnung ein einzelner Detektor 10 Vorgänge auf der Basis von "time sharing" von der Optik 16 und von der Vorrichtung 9. Eine Unterscheidung zwischen den beiden Messungen, geliefert durch die Meßeinrichtung (8, 12), wird bei dies Ausführungsform durch die Lage innerhalb des Speichers des Mehrkanalanalysators 12 erzielt, wobei Erregungsvorgänge gegenüber Fluoreszenzvorgängen verzögert sind.

Bei der Anordnung gemäß Fig. 3 enthält die Erregerimpulsprofilbestimmungseinrichtung in sich ihren eigenen Detektor 23, dem Eingangsoptiken 22 zugeordnet sind, so daß die Geometrie der Photokathodenbeleuchtung mit der des Detektors 10 in Übereinstimmung gebracht werden kann. Das Ausgangssignal des Detektors 23 wird einer Zeitverzögerungseinrichtung 25 (die in diesem Falle elektronisch arbeitet) über einen Schwellwertdiskriminator 24 zugeführt, der entsprechend wie der Schwellwertdiskriminator 11 arbeitet, und das Ausgangssignal der Zeitverzögerungseinrichtung 25 wird an den Eingang der Meßeinrichtung (8, 12) in einer ODER-Konfiguration angelegt. Die Anordnung gemäß Fig. 3 hat gegenüber der von Fig. 2 den Vorteil, daß die Trennung der Detektorfunktion der beiden getrennten Detektoren 10, 23 es ermöglicht, das Impulsansprechen dieser Detektoren gut aneinander anzupassen, obwohl die Detektoren Vorgängen in unterschiedlichen Wellenlängenbereichen ausgesetzt sind.

Bei der in Fig. 4 dargestellten Ausführungsform fehlt gegenüber der Anordnung von Fig. 3 die Zeitverzögerungseinrichtung 25 und es ist eine Weiterleitungsschaltung 18 eingeführt, welche die Eingangsignale von Schwellwertdiskriminatoren 11, 24 empfängt, und in Folge den Mehrkanalanalysator 12 über die Leitung 19 steuert, um Erregerimpulsprofilvorgänge separat von Fluoreszenzphotonenvorgängen aufzunehmen und zu speichern und dadurch eine Unterscheidung zwischen diesen beiden Messungen vorzunehmen.

Leitung 21 liefert ein Rücksetzsignal Weiterleitungsschaltung 18 im Anschluß an die Speicherung von jedem Vorgang. Leitung 20 liefert ein Bestätigungsstartsignal.

Bei der Ausführungsform gemäß Fig. 5 ist lediglich ein einzelner Detektor 10 vorgesehen. Bezüglich der Weiterleitungsschaltung 18 ist sie ähnlich zu der Ausführungsform von Fig. 4, wobei jedoch in diesem Falle die Eingangssignale, die zu der Weiterleitungsschaltung 18 gelangen, einerseits von der Vorrichtung 8 herkommen und andererseits von dem Diskriminator 17 nach dem Ausgang des Detektors 15, der an den Ausgang der Verzögerungseinrichtung 14 gekoppelt ist.

Die Weiterleitungsschaltung 18 enthält beispielsweise ein Latch, was auf die Logik 1 oder die Logik 0 gesetzt ist in Abhängigkeit davon, ob ein Floureszenzvorgang oder ein Erregervorgang signalisiert wird. Der Zustand des Latch bestimmt die Natur des Signals in der Leitung 19. Das Latch wird durch das Signal auf der Leitung 21 rückgesetzt.

Bei der Ausführungsform von Fig. 4, welche nicht die Zeitverzögerungseinrichtung 25 enthält, erfolgt eine Trennung der beiden Arten von Vorgängen auf statistischer Basis, da aufgrund des relativ seltenen Auftretens von Vorgängen ein gleichzeitiges Vorhandensein von sowohl Fluoreszenz- als auch Erregervorgängen die Ausnahme ist. Auf dieser Basis kann entweder lediglich ein Vorgang als ein Fluoreszenzvorgang aufgezeichnet werden oder beide Vorgänge werden zurückgewiesen (und keiner von beiden aufgezeichnet).

In einfachster Form kann eine quasi gleichzeitige Messung (d. h. auf einer "time sharing" Basis) von sowohl Fluoreszenzabklingarakteristiken als auch des Erregerimpulsprofils erfolgen, wodurch eine automatische Korrektur der von den Fluoreszenzabklingcharakteristiken gesammelten Daten aufgrund von Änderungen in der Erregerlichtquelle vorgenommen werden kann. Dies betrifft sowohl Kurzzeit- als auch Langzeitänderungen. Dies hat den zusätzlichen Vorteil, daß eine derartige Messung des Erregerimpulsprofils unabhängig von der Probenstation vorgenommen werden kann, so daß spezielle Umweltbedingungen an dieser in der erwünschten Weise beibehalten werden können. Es ist auch möglich, die Photodetektoren aneinander anzupassen, um ähnliche Impulsübertragungsfunktionen für die empfangenen Vorgänge zu schaffen, so daß die Detektorausgangssignale unabhängig von den spektralen Wellenlängendifferenzen zwischen den Fluoreszenzvorgängen und den Erregerimpulsprofilvorgängen werden.

Claims (5)

1. Vorrichtung zur Bestimmung der Fluoreszenz­ abklingcharakteristik einer Materialprobe mit:

• - einer Probenstation zur Aufnahme der Materialprobe,
• - einer Erregerlichtquelle zur Erzeugung von Erregerlichtimpulsen zur Anregung der Materialprobe,
• - einem nach der Probenstation angeordneten Wellenlängenselektor,
• - einer nach der Probenstation angeordneten Detektoreinrichtung für die von der Materialprobe abgegebenen, das Fluoreszenzsignal bildenden Einzelphotonen und einer vor der Probenstation angeordneten Detektoreinrichtung für ein Referenzsignal,
• - einer von der Erregerlichtquelle gesteuerten Synchronisationseinrichtung zur Erzeugung von Synchronisationsimpulsen, und
• - einer Auswerteinrichtung, die mit den Detektoreinrichtungen und der Synchronisationseinrichtung verbunden ist,

dadurch gekennzeichnet, daß

• - die Detektoreinrichtung für das Referenzsignal als Bestimmungseinrichtung für das Impulsprofil der Erregerlichtquelle und zur Abgabe - eines Erregerimpulsprofilsignales ausgebildet ist,
• - die Auswerteinrichtung zum Bestimmen der Fluoreszenz­ abklingcharakteristik aufgrund des Impulsprofiles der Erregerlichtquelle und des Fluoreszenzsignales ausgebildet ist und verschiedene Speicherkanäle und einen Mehrkanalanalysator (12) aufweist, und
• - eine von dem Mehrkanalanalysator (12) gesteuerte Weiterleitungsschaltung (18) zur Weiterleitung des Fluoreszenzsignales und des Erregerimpulsprofilsignales in die verschiedenen Speicherkanäle vorgesehen ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektoreinrichtungen aus einem einzigen Detektor (10) zum Empfang des Referenzsignales und des Fluoreszenzsignales bestehen.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektoreinrichtungen aus zwei Detektoren (10, 23) zum getrennten Empfang des Referenzsignales und des Fluoreszenzsignales bestehen.

4. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine Zeitverzögerungseinrichtung (14, 25) vorgesehen ist, welche derart angeordnet ist, daß sie eine Zeitverzögerung von weniger als einer halben Impulswiederholungsperiode der Erregerlichtquelle (1) bewirkt, die jedoch wesentlich größer ist als die Fluoreszenzabklingzeit der Materialprobe.