DE2421501A1

DE2421501A1 - Verfahren und vorrichtung zur analyse von leukozyten und aehnlichen zellen

Info

Publication number: DE2421501A1
Application number: DE2421501A
Authority: DE
Inventors: Marcos Y Kleinerman
Original assignee: Block Engineering Inc
Current assignee: Block Engineering Inc
Priority date: 1973-05-31
Filing date: 1974-05-03
Publication date: 1974-12-19
Also published as: FR2231968A1; NL7406331A; JPS5020820A; US4146604A; FR2231968B1; AU6861274A; GB1475317A; CH582355A5

Description

PATENTANWÄLTE

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DR. TINO HAIBACH "*^IOUI

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BLOCK ENGINEERING, INC., Cambridge, Massachusetts, U.S.A.

Verfahren und Vorrichtung zur Analyse von Leukozyten und ähnlichen Zellen.

Die Erfindung betrifft Verbesserugaa bei bioanalytischen Färbeververfahren, und insbesondere ein Verfahren zur Färben biologischer Meßproben mit fluoreszierenden Farbstoffen sowie eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.

Die gegenwärtigen Verfahren der Mikroskopie von Struktur oder Morphologie von biologischen Proben sind durch das räumliche Auflösungsvermögen der verwendeten, optischen Instrumente stark eingeschränkt. Ein bekanntes Verfahren besteht in der Verwendung einer Vielzahl von Farbstoffen, wobei jeder Farbstoff für einen speziellen Bestandteil oder eine zu differenzierende MikroStruktur spezifisch ist. Nach dem Färben können die verschiedenen Merkmale der Struktur durch den Farbkontrast voneinander unterschieden werden. Da bei diesem Verfahren eine Rationierung erforderlich ist, wird das Verfahren offenbar durch Auflösungsgrenzen und andere Faktoren beschränkt, die die Aufrechterhaltung der räumlichen Kohärenz beeinflußen können.

Die gegenwärtigen Verfahren zur Bestimmung der Korrelation der räumlichen Verteilung von zwei oder mehreren Mikrostrukturen oder Bestandteilen sind auch durch das Auflösungsvermögen der verwendeten, optischen Meßvorrichtung begrenzt.

Für viele Zwecke ist es nicht erforderlich, die genaue Form und Größe der MikroStruktur zu bestimmen. Eine Anzeige über ihr Vorhandensein kann ausreichend sein. In solchen Fällen muß man nur

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die Koexistenz der verschiedenen Bestandteile, die die gerade geprüfte Struktur bilden, bestimmen, wobei mehrere Reagenzreaktionen gerade für diesen Zweck verwendet werden. Die meisten solcher Reaktionen mit Reagenzmitteln zerstören jedoch die Probe oder sind in ihrer Art so verschieden, daß sie die Durchführung weiterer Meßungen an der Probe ausschließen.

Mehrere weitere Probleme sind auch in der Verwendung von analytischen Färbverfahren für die Mikrountersuchung von biologischen Proben vorhanden. Ein gemeinsames Problem ist die Erfassung von kleinen Änderungen in der Signalintensität der charakteristischen Wellenlänge aufgrund der Färbung bei Anwesenheit einer großen Hintergrundsintensität. Dieses Problem wurde insbesondere durch die Verwendung von fluoreszierenden Farbstoffen gelöst. Die.Lokalisierung eines Farbstoffes mit der gewünschten Art für eine spezielle Mikrostruktur oder einen Bestandteil ist eine ernste Schwierigkeit bei der Entwicklung neuer Färbverfahren. Das Problem wird weiter verschärft, wenn man fluoreszierende Farbstoffe verwenden will, da die zur Verfügung stehende Zahl solcher Farbstoffe verhältnismäßig klein und beispielsweise erheblich kleiner als die Zahl der bekannten nicht-fluoreszierenden biologischen Farbstoffe ist. Der Begriff "fluoreszierender Farbstoff" soll sowohl fluorochrome (fluoreszenzanregende) als fluoreszierende Farbstoffe umfassen, wenn der Zusammenhang des Textes dem nicht entgegensteht.

Ein weiteres Problem bei biologischen Färbverfahren beruht auf der geringen Farbaufnahme durch die infragestehende Mikrostruktur. Im Falle von Fluoreszenz- und Fluorochrom-Farbstoffen führt die geringe Farbaufnahme zu geringen Signalstärken selbst bei annehmbaren Niveaus der Energieanregung. Zusammen mit der gewöhnlich kleinen Größe der Meßproben schränken diese niedrigen Signalniveaus die Anwendbarkeit von Verfahren mit Fluorochrom-Farbstoffen stark ein, weil die Meßung des Signales Schwierigkeiten bereitet. Der gegenwärtige Versuch, dieses Problem zu lösen, besteht in der Erhöhung der Bestrahlung mit der Anregungsenergie oder in dem Versuch, die Farbaufnahme zu erhöhen. Dieser Versuch ist nur teilweise erfolgreich» weil es gewöhnlich eine Grenze für die Menge an

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Farbstoffen gibt, die an einer vorgegebenen Struktur angebracht werden kann^und das Niveau der möglichen Bestrahlung ist entweder durch den Mangel an einer geeigneten Quelle oder die Möglichkeit einer Beschädigung oder Zerstörung der Meßprobe durch übergroße Strahlungsdosis begrenzt<

Wenn die Farbäufgabe erhöht wird, kann dennoch das von dem fluorochromen Farbstoff emittierte Signal sich nicht linear mit der Farbmenge bei der hohen Konzentration erhöhen, weil gewöhnlich eine Selbs't-Löschung auftritt.

Ein anderes Problem, das oft bei biologischen Färbverfahren auftritt, ist das photochemische Ausbleichen des Farbmittels. Obwohl dieses Problem am häufigsten bei hohen Bestrahlungsniveaus auftritt, ist es dennoch zu beachten. Die gegenwärtige Tendez zur Verwendung von Hochleistungs-Strahlungsquellen, beispielsweise Lasern, führt dazu, daß die Eigenschaften der Farbstoff-beim Ausbleichen wichtig sind.

Ferner ist zu beachten, daß die Einschränkung des relativ breiten Spektrums von Farbstoffen auf den verhältnismäßig engen Spektralbereich, in dem die Farbstoffe emittieren oder absorbieren, die Zahl der Kanäle der Information stark begrenzt, die gleichzeitig von einer vorgegebenen Meßprobe abgeleitet werden kann. Dieses spezielle Problem ist nicht mit der möglichen Zahl von Kombinationen von Farbstoffen zu verwechseln, die durch die chemische Verträglichkeit ihrer Eigenschaften begrenzt ist. Das Problem des spektralen Responses der Farbstoffe ist noch größer bei fluorochromen Farbstoffen, von denen jedes effektiv einen Emissionskanal und einen Absorptionskanal in dem verwendeten, optischen Gerät benötigt.

Im Zusammenhang mit der Anwendung biologischer Farbverfahren gibt es mehrere Verfahren und Vorrichtungen zum Zählen und Klassifizieren von Leukozyten. Gewöhnlich beobachtet ein Laborant einen Blutausstrich auf einem gewöhnlichen Mikroskopträger, wobei das Präparat mit einem der Romanowsky-Farbstoffe, beispielsweise dem Wright- oder Giemsa-Farbstoff, gefärbt ist. Der Laborant prüft nacheinander

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100 Leukozyten und klassifiziert jede Zelle nach ihrem Typ. Dieses Verfahren ist nicht nur zeitraubend sondern leidet auch unter dem Nachteil, daß es nur begrenzt zuverlässig bezüglich dem Zählen und Klassifizieren der weniger häufigen Zellen, beispielsweise der Monozyten, Eosinophilen und Basophilen, ist. Bei neuerlich entwickelten, automatisierten System werden die Leukozyten in einer ~ Strömung durch drei oder vier verschiedene Kanäle geführt, wobei jeder Kanal mit Einrichtungen versehen ist, um die darin fließenden Leukozyten mit einem speziellen Farbstoff zu färben. Da mehrere Kanäle und verschiedene chemische Behandlungen für jeden Zellentyp erforderlich sind, leidet ein solches System unter dem Nachteil, daß es komplex aufgebaut und in der Herstellung kostspielig ist.

Bei einem anderen, automatischen System wird ein ausgewählter Bereich eines Blutfleckens, der in üblicher Weise mit einem Romanowsky-Farbstoff eingefärbt ist, mechanisch unter einem Mikroskop angetastet, das mit einer elektronischen Bildröhre versehen ist. Wenn ein Leukozyt in dem Blickfeld der Bildröhre ist, wird der Schlitten angehalten. Ein Bildanalyse-Rechner, der an die Bildröhre angeschlosse ist, klassifiziert das Leukozyt nach seinem Zellenprofil und nach seiner Zytoplasmafarbe. Da dieses System die Bedienung durch einen Laboranten erfordert, um einen für die automatische Abtastung geeigneten Bereich des Blutfleckens auszusuchen, haben diese Systeme den Nachteil, daß sie zeitraubend und kostspielig sind.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Analyse von biologischen Strukturen anzugeben, bei dem insbesondere die oben genannten Probleme beim Färben und der nachfolgenden Erkennung der Strukturen überwunden werden sollen.

Die Erfindung zielt auch darauf ab, einen neuartigen Farbstoff sowie ein Verfahren und eine Vorrichtung anzugeben, durch die Leukozyten, Erythrozyten, Reticulozyten und andere Zellen automatisch absolut gezählt und die Leukozytentypen differentiell gezählt und klassifiziert werden, wobei die genannten Schwierigkeiten umgangen werden sollen. Dazu wird durch die Erfindung ein Farbstoff angegeben, um Eosinophile, Monozyten, Lymphozyten, reife und unreife

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Neutrophile, Erytrhozyten und Reticulozyten zu unterscheiden, die unregelmäßig in einem Blutmedium verteilt sind. Der Farbstoff weist eine Vielzahl miteinander kompatibler Farbstoffe auf, wobei wenigstens einer der Farbstoffe allen Leukozyten, die damit gefärbt werden, eine charakteristische Fluoreszenz gibt. Der Farbstoff hat die Eigenschaft, daß^wenn die gefärbten Leukozyten mit einer optischen Strahlung mit der charakteristischen Absorptionswellenlänge jedes Farbstoffes bestrahlt werden, die relativen Intensitäten des Lichtes, welches" von jedem Leukozytentyp emittiert und/ oder durchgelassen wird, einen speziellen Leukozytentyp definiert.

Bei der Erfindung wird der Effekt der zwischenmolekularen Energieübertragung zwischen einem Sensibilisator und einem floureszierenden Farbstoffes ausgenutzt, welcher genügend nahe bei dem Sensibilisator lieKt, so daß ein Teil von dem letzteren absorbierten Energie zur Verfügung steht, um in dem fluoreszierenden Farbstoff die Fluoreszenz zu erregen.

Es ist wichtig, daß der hier interessierende Übertragungsmechanismus intermolekular, das heißt zwischen Molekülen, stattfindet. Es wird angenommen, daß die Energie durch ein Resonanzphänpmen übertragen wird. Folglich müssen der Sensibilisator und der emittierende Farbstoff keine Verbindung bilden, um die Energieübertragung zu ermöglichen. Es ist lediglich erforderlich, daß der Sensibilisator und der fluoreszierende Farbstoff ähnliche Anregungsniveaus haben, die innerhalb von einigen Hundert Angstrom beieinander liegen. Dadurch wird ermöglicht, daß die Sensibilisator-Farbstoffτ Kombinationen als Mischung anstatt als Verbindung arbeitet.

Der Begriff "Floureszenz" soll hier eine Luminiszenz bezeichnen, die durch Bestrahlung angeregt wird und während der Anregung emittiert. Bei den Mischungen, die in einem Fall der Erfindung verwendet werden, wird die Fluoreszenz sensibilisierf, das heißt die Floureszenz wird in einer Komponenten angeregt, wenn die Mischung einer Strahlung ausgesetzt wird, die hauptsächlich von der anderen Komponenten absorbiert wird. Es ist zu beachten, daß die Luminiszenz der sensibilisierten Mischung aus einer Strahlung von einem oder

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mehreren Elementen der Mischung bestehen kann. Im wesentlichen besteht der Mechanismus der sensibilisierten Ploureszenz in der Absorption von Strahlung durch eine Komponente der Mischung (die hier als Sensibilisator bezeichnet wird), um angeregte Moleküle zu erzeugen. Die angeregten Moleküle des Sensibilisator, die nahe bei den Molekülen des sensibilisierten Farbstoffs oder Emitters liegen, übertragen Energie auf die Moleküle des letzteren, wobei diese zur Emission angeregt werden. Die Energieübertragung, wie sie beschrieben wurde, beruht sehr wahrscheinlich auf einem Resonanzprozess, das heißt einer Singulett-Energieübertragung, die von dem Abstand zwischen Donor und Akzeptor abhängt.

Drei interessierende Fälle können bezüglich der Anordnung des Sensibilisators und des Emitters in einer MikroStruktur .unterschieden werden, die geprüft werden soll:

(1) Der Sensibilisator kann mehr oder weniger gleichförmig in der MikroStruktur verteilt sein, während der Emit.ter dazu verwendet wird, vorzugsweise eine spezielle MikroStruktur oder einen Bestandteil derselben zu färben;

(2) Der Sensibilisator wird selektiv in der Meßprobe verteilt, das heißt vorzugsweise im Zusammenhang mit einer speziellen Mikrostruktur oder einem Bestandteil derselben, während der Emitter gleichförmig verteilt wird; und

O) sowohl der Farbstoff als auch der Sensibilisator werden vorzugsweise auf verschiedene Mikrostrukturen oder Bestandteile derselben verteilt.

Dieser letzte Fall führt zu einem erheblichen Vorteil gegenüber herkömmlichen Färbverfahren, bei denen die Farbstoff-Sensibilisierung durch eine geeignete Absorption nur auf einem molekularen Niveau erreicht werden kann, weil Stabilisator und Farbstoff für das selbe Material spezifisch seih müssen.

Der Sensibilisator soll im Effekt als Strahlungsaammler für den emittierenden Farbstoff und die Farbstofflösung dienen. In dem einfachsten Fall ist die maximal für die Fluoreszenz zur Verfügung. stehende Energie die Summe der Energie, die von dem Sensibilisator

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übertragen wird^und der Energie, die direkt von dem Farbstoff selbst absorbiert wird. Die von dem Sensibilisator übertragene Energie hängt von der Menge und der Lage des letzteren ab, während die von dem Farbstoff selbst absorbierte Energie von der Menge und der Lage des Farbstoffes abhängt. Um eine hohe Emission von einem kleinen Volumen eines mit geringer Konzentration vorliegenden Farbstoffes zu halten, muß man lediglich eine genügende Menge an Sensibilisator vorsehen, in dem man ihn mit .einer geeigneten Konzentration anbringt.

Der Sensibilisator selbst kann eine FarbstoiTlösung oder er kann auch nicht -färbend sein. Wenn die Floureszenz von einem Sensibilisator nicht leicht beobachtet werden kann, kann man dennoch ein Fluoreszenzsignal dadurch erhalten, daß man den Sensibilisator mit einem geeigneten Emitter mischt. Dadurch ist man in der Lage, schwache Absorptionssignale zuverlässiger als kleine Emissionssignale auf einem schwarzen Hintergrund "statt kleine Signale auf einem hellen Hintergrund zu beobachten. Dadurch ist auch die Synthese von Fluoreszenzsigrialen von Farbstoffen möglich, die keine beobachtbare Fluoreszenz in einem speziellen Absorptionsmedium liefern, wodurch die Auswahl an fluoreszenten Farbstoffen erwünschter Eigenschaften vergrößert wird. Bisher ist es jedoch erforderlich , die Bestandteile des Farbstoffes chemisch miteinander zu verbinden, um eine fluoreszierende Verbindung zu bilden.

Es ist nun ersichtlich, wie die Verwendung von zwischenmolekularer Energieübertragung die.Darstellung von Korrelationen der räumlichen Verteilung von zwei Substanzen gestattet. Beispielsweise wird eine Sensibilisator-Emitter-Kombination derart gewählt, daß der Sensibilisator sich an einer der zwei Substanzen und der Emitter an der anderen ablagert bzw. daran haftet. Wenn die Substanz nun in dem Absorptionsband des Sensibilisators bestrahlt und in dem Emissionsband des Emitters beobachtet wird, ist'das beobachtete Signal ein Maß der Korrelation der räumlichen Verteilung der zwei Substanzen.

Da der Energieübertragungsmechanismus offenbar auf der Resonanz beruht, ist die räumliche Auflösung, die bei dem erfindungagemäßen Verfahren beobachtet werden kann, in der Größenordnung von einigen

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Zehntel Angström. Diese Auflösung entspricht der Annäherung, die zwischen dem Sensibilisator und dem Emitter auftreten muß, und sie ist unabhängig von der optischen Auflösung des Meßsystems.

Das Ausbleichen des Farbstoffes aufgrund einer mehrfachen Photonen Sättigung kann dadurch reduziert werden, daß ein Sensibilisator in Verbindung mit dem Emitter verwendet wird. Der Energieübertragungsmechnismus hängt in kritischer Weise von der Besetzungszahl des Anregungsniveaus des emittierenden Farbstoffes mehr ab als im Fall der Selbstabsorption. Dadurch wird der übertragung bei Annäherung an den Sättigungspunkt eine Grenze gesetzt.

Man kann auch zwei fluoreszente Farbstoffe in Verbindung mit einer Sensibilisator-Emitter-Mischung verwenden. Solche eine Kombination ermöglicht die Meßung der Konzentration jedes Farbstoffes und die Korrelation in ihrer räumlichen Konzentration, ohne daß die Zahl der Meßkanäle erhöht werden muß. Man kann mit anderen Worten η im wesentlichen unabhängige Meßungen von n-1 Farbstoffen erhalten, das heißt man kann einen weiteren Freiheitsgrad bei der Meßung erreichen.

Der Begriff "differentielles Anfärben" wird hier in der Weise verwendet, daß der verwendete Farbstoff einen bestimmten Bestandteil des interessierenden Zellentyps ( beispielsweise das Protein des Zellentyps) in weit größerem Maße anfärbt als die anderen Bestandteile (beispielsweise die Nukleinsäuren) des selben Zellentyps.

Bei Verwendung einer Färbstoffmischung gemäß der Erfindung beim Klassifizieren von Leukozyten in einem Präparatträger-Abtastverfahren wird ein Bluttropfen auf einem Mikroskop-Objektglas ausgebreitet und nach der Fixierung durch Eintauchen in die Farbstoffzusammensetzung angefärbt. Bei dem Verfahren mit Strömungsrohren wird eine kleine Menge einer Blutprobe nach geeigneter Verdünnung in einer flüssigen Lösung der Farbstoffzusammensetzung angefärbt, und die Zellen werden dazu gezwungen, in einem einzelnen Faden durch ein Kapillarrohr zu fließen. In beiden Verfahren werden die gefärbten Leukozyten mit ultraviolettem und violettem Licht bestrahlt, und ihre Fluoreszenz wird durch einen Blau-Grün-Filter beobachtet. Die

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Leukozyten machen sich mit einer Fluoreszenz bemerkbar, die in abfallender Reihenfolge der Intensität von Eosinophilen zu unreifen Neutrophilen zu reifen Neutrophilen zu Monozyten zu den Lymphozyten abfällt. Die gefärbten Leukozyten werden dann mit grünem Licht bestrahlt, und die Kerne der verschiedenen Leukozytentypen werden durch einen Rot-Filter beobachtet. Die Leukozyten zeigen eine rote Fluoreszenz vergleichbarer Intensität, Reticulozyten fluoreszieren mit einer erheblich kleineren Intensität, und normale Erythrozyten haben eine vernachlässigbare Fluoreszenz. Die Leukozyten werden gezählt und klassifiziert, beispielsweise durch Meßung des Verhältnisses der blaugrünen Komponenten der Zellenfluoreszenz zu der roten Kernfluoreszenz. Bei dem Durchflußverfahren erzeugt die Erregung mit ultraviolettem Licht eine starke orangerote Komponente, die am deutlichsten bei Neutrophilen und Eosinophilen auftritt und deren Intensität bezüglich der blaugrünen Komponenten einen weiteren Parameter für die Unterscheidung spezieller Leukozytentypen bildet. Zusätzlich wird das durchgelassene violette Licht gemessen, um Erythrozyten von Leukozyten zu unterscheiden. Im Gegensatz zu der vernachlässigbaren- Absorption von violettem Licht durch Leukozyten zeigen die Erythrozyten und Reticulozyten eine beachtliche Absorption von violettem Licht.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist daher vorteilhaft, daß ein verhältnismäßig großes Signal von einem fluorochromen Farbstoff mit geringer Farbstoffaufgabemenge und einem praktikablen Niveau der Arregungsbestrahlung erzeugt werden kann. Durch die bei der Erfindung angewendete biologische Anfärbung ist es möglich, das Vorhandensein einer Vielzahl von Strukturen unter Verwendung eines einzigen Signals statt einem Paar von räumlich miteinander in Beziehung stehenden Signalen zu bestimmen, ohne daß eine chemische Reaktion erforderlich wäre. Schließlich ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren vorteilhaft, daß eine Korrelation in der räumlichen Verteilung einer Vielzahl von Substanzen in einer MikroStruktur erhalten werden kann, wobei die räumliche Auflösung besser als,die Grenzen ist, die durch das spezielle, optische Verfahren gesetzt werden.

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Die Erfindung wird im folgenden anhand der Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:

.Fig. 1 eine schematische Darstellung zum Teil in Blockdarstellung einer Meßvorrichtung mit Objektträger-Abtastung für die differenzierte Zählung von Leukozyten;

Fig. 2 eine schematische Darstellung zum Teil in Blockform einer Meßvorrich-tung mit Durchflußrohr zur differenzierten Zählung von Leukozyten;

Fig. 3 eine graphische Darstellung, die die Fluoreszenzgrößen ausgewählter Leukozytentypen auf einem mit Methanol fixierten Blutausstrich, der mit einem der im folgenden beschriebenen Mischungen angefärbt ist, zeigt.

Zur Durchführung der Erfindung wird im allgemeinen ein biologisches Präparat, beispielsweise ein Blutpräparat, auf einem Standard-Mikroskop-Objektträger hergestellt, welches durch Trocknen oder durch Eintauchen in Alkohol fixiert wird, worauf der Farbstoff und der Sensibilisator der Probe zugegeben werden. Die auf diese Weise hergestellte Probe wird dann bestrahlt, um die Fluoreszenz zu erregen, und die Fluoreszenzeigenschaften der Probe werden unter dem Mikroskop oder durch eine andere optische oder elektrooptische Einrichtung bekannter Art geprüft oder gemessen.

Bei einem erfindungsgemäßen Verfahren wird beispielsweise ein Blutmedium mit einer Farbstoffzusammensetzung angefärbt, die mehrere Farbstoffe enthält, wobei wenigstens einer der Farbstoffe allen Leukozyten eine charakteristische Fluoreszenz vermittelt. Die Farbstoff zusammensetzung ist so gewählt, daß, wenn das gefärbte Blutmedium mit Licht bestrahlt wird, das die charakteristische Absorptionswellenlänge jedes Farbstoffes hat, die relativen Intensitäten des Lichtes, das von jedem Zellentyp in dem optischen Wellenlängenbereich der Emissions- und Absorptions-Charakteristik von jedem Farbstoff emittiert und/oder durchgelassen wird, in eindeutiger Weise in wenigstens einem charakteristischen Wellenlängenbereich von dem Leukozytentyp abhängt. Das Licht, das von den be-, strahtei Leukozyten in jedem ihrer charakteristischen Wellenlängenbereichen emittiert wird, wird gemessen, und die Leukozytentypen

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werden nach den relativen Intensitäten des emittierten Lichts in dem charakteristischen Wellenlängenbereich jedes Farbstoffes klassifiziert.

Insbesondere werden bei einem Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens die unregelmäßig in einem Medium verteilten Leukozyten mit einer Farbstoffzusammensetzung gefärbt, die eine Mischung aus (1) einem sulfonierten Triazinylstilbenderivat, (2) einer Naphthalinsulfonsäure und (3) einem kationischen Farbstoff aufweist. Die gefärbten Leukozyten werden mit ultraviolettem oder violettem Licht bestrahlt und durch einen grünen oder blau-grünen Filter betrachtet bzw. gemssen. Die grüne Komponente der Leukozytenfluoreszenz wird mit einer charakteristischen Fluoreszenzintensität gegen einen schwarzen Hintergrund dargestellt. Die gefärbten Leukozyten werden auch mit grünem Licht bestrahlt, und die rote Fluoreszenz von nur den Kernen der Zellen wird durch einen roten oder einen orange-roten Filter betrachtet bzw. gemessen. Wie in Fig· 3 gezeigt ist, sind die gemessenen Leukozyten durch eine Fluoreszenz gekennzeichnet, deren Intensität in abfallender Reihenfolge von den Eosinophilen zu den Neutrophilen zu den Monozyten und den Lymphozyten abfällt, wobei jeder Leukozytentyp in eindeutiger Weise durch das Verhältnis der "blaugrünen Komponenteder Zellenfluoreszenz zur roten . der Kerne bezüglich der roten fluoreszenz von dem Kern definiert.

Wie sich aus den folgenden Beispielen ergibt, ist die Art des Sensibilisators außerordentlich variabel. Der Sensibilisator ist so zu wählen, daß er einen großen Absorptionskoeffizienten bezüglich der einfallenden Strahlung hat, so daß genügend Energie für die übertragung auf den Farbstoff zur Verfügung steht. Ferner sollte der Sensibilisator eine verhältnismäßig lange Lebensdauer in seinem angeregten Zustand haben, so daß sich eine hinreichende Gelegenheit für die Energieübertragung zwischen dem Sensibilisator und dem Farbstoff ergibt. Der Sensibilisator soll ferner kein Material sein, das sterisch daran gehindert wird, in der Nähe eines Farbstoffmoleküls zu liegen. Schließlich .ist wichtig, daß der Sensibilisator einen großen elektrischen Dipoleffekt bezüglich

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seines Übergangs in einen angeregten Zustand zeigt, das heißt er muß eine gute Antenne oder Abstrahler sein, der sich gut an die Elektronen des Farbstoffmoleküls ankoppelt. Es ist anzunehmen, daß diese Kopplung zwischen nebeneinanderliegenden Molekülen sich nicht erheblich über 30 Angstrom hinaus erstreckt, und sie ist gewöhnlich recht gut innerhalb von 10 Angström.

Unter den fluoreszierenden Farbstoffen, die in Zusammenhang mit der Erfindung brauchbar sind, befinden sieh solche Farbs.toffe, die vorzugsweise Protein, beispielsweise 'das Zytoplasma von weißen Blutkörperchen und den Kernen in Granolozyten, färben. Insbesondere sind solche Farbstoffe wie sulfonierte Triazinylderivate oder Diaminost üben, die jeweils eine Aminogruppe in jedem der Phenylringedes Stilbenmoleküls haben, und ihre alkyl-,alkoxy- oder halogensubstituierten Derivate geeignet, beispielsweise 4,4·— Bis-.(4-(3-sulf aniline)-6-(bis-(2-hydroxyäthyl)-amino)-1,3,5,-triazin-2-y1)-amino-stilben-2,2'-disulfansäure (als Tetranatriumsalz) (im folgenden als LN bezeichnet). Für diese Farbstoffe liegt das optimale Band der Airegungswellenlängen im Bereich von 320 bis 390 mjuund das optimale Fluoreszenzwellenlängenband von 440 bis 550 m/u. Diese Farbstoffe bewirken eine starke blaue Fluoreszenz des Proteins der Leukozyten und der Heutrophilen Granula und eine schwächere, blaue Fluoreszenz der Eosinophilen, Monozyten und Lymphozyten.

Die Struktur von LN wird wie folgt angenommen:

IjI (CH₂CH₂OH) C

NaSO

NaSO.

Fluoreszente Farbstoffe, die insbesondere zum Anfärben eosinophiler Granula: geeignet sind, sind die Anilino-oder Toluidino-

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Naphthalinsulfonsäuren und deren alkyl-, alkoxy- oder halogensubstituierten-Derivate;4,4^l-Diaminostilben-2,2^t-disulfonsäure,N,N, N',N¹ Tetraessigsäure und ihre alkyl-,alkoxy- oder halogensubstituierten Derivate; sulfönierte fluoreszente Derivate von 1,8-Naphthalimid, wie z.B. Brilliantsulfaflavin (im folgenden als BSF bezeichnet) und ihre alkyl-, alkoxy- oder halogensubstituierter. Derivate; 8-p-Toluidino-l-naphthalinsulfonsäure und ihre alkyl-, alkoxy- oder halogensubstituierte" Derivate und 8-Hydroxy-l,3,6-pyrentrisulfonsäure und ihre Alkyl-, Alkoxy- und Halogenderivate. Die Anilino- und Toluidinonaphthalinsulfonsäuren haben eine optimale Anregungswellenlänge im Bereich von 320 bis 410 mu und eine optimale Fluoreszenzwellenlänge im Bereich von 440 bis 550 m^u . Brilliantsulfaflavin hat eine optimale Erregungswellenlänge im Bereich von 360 bis 450 in u und eine optimale Floureszenzwellenlänge im Bereich von 480 bis 550 mix . Diese Farbstoffe färben die e_Osinophilen Granula mit einer grün->blauen oder grünen Floureszer.z stark an.

Die Farbstoffe, die eine starke rote Fluoreszenz der Nukleinsäure der Leukozyten, hauptsächlich in den Kernen, erzeugen, sind vorzugsweise kationische Farbstoffe, beispielsweise die Phenanthridtnium-Farbstoffe, beispielsweise Athidiumhalogenid (2,7-Diamino-10-äthyl-9-phenyl-phenanthridiniumbromid, im folgenden als EB bezeichnet) und ihre Alkyl-, Alkoxy- oder Halogenderivate, und in trockenen Präparaten Acridinorange und Rhodulinorange. Ethidiumbromid hat eine optimale Anregungswellenlänge im Bereich von 480 bis 550 miiund eine optimale Fluoreszenzwellenlänge im Bereich von 58O bis 650 m Ai. Die Struktur von EB wird wie folgt angenommen:

^CH₃CH₃

-NH

Br

Eine große Zahl anderer Fluoreszenzfarbstoffe kann verwendet

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-Ik-

werden, worunter mehrere der !Farbstoffe sind, die in Biological Stains, R.D. Lillie, The Williams & Wilkins Co., Baltimore 1969,

beschrieben sind.

Das Sensibilisatormaterial sollte chemisch mit der die Fluoreszenz abstrahlenden Farbstofflösung kompatibel sein, das heißt es sollte keine chemischen Verbindungen mit dem Farbstoff durch kovalente oder semipolare Bindung bilden, wodurch die ursprünglichen, optischen Eigenschaften oder chemischen Affinitäten des Farbstoffes und des Sensibilisators zerstört oder reduziert werden. Der Sensibilisator sollte (beispielsweise durch Van der Waalskräfte, chemische Bindungen usw.) an einen Zellenbestandteil in einer solchen Weise gebunden sein, daß er nahe bei dem Farbstoff liege und für diesen zugänglich ist. Anderenfalls soll der Sensibilisator in einem Zellenbestandteil gelöst sein. .

Wenn der Sensibilisator ebenfalls ein fluoreszierender Farbstoff ist, ist er natürlich so zu wählen, daß seine Emissionsbänder leicht von denen des emittierenden Farbstoffes zu unterscheiden sind.

In Fig. 1 ist eine Meßeinrichtung 10 mit Objektträgern gezeigt, um Leukozyten differentiell zu zählen. Beispielsweise wird ein durch Alkohol fixierter Blutausstrich.il auf einem Objektträger in eine bevorzugte Farbstofflösung eingetaucht, die enthält:

1 χ 10 molares Athidiumbromid; 1 χ 10 bis 1 χ 10 molares

Brilliantsulfaflavin und 1 χ lo"*¹ molare M '-Bis{V(3-sulfanilino-6-§)is-(2-hydroxyäthyl)-amin(3-l,3,5-triazin-2-yl] -aminostilben-2,2'-disulfonsäure (als Tetranatriumsalz) in einer Lösung mit einem Puffer von 0,01 bis 0,1 molarer 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol-HCl, gewöhnlich als tris-HCL bekannt , bei einem pH-Konzentrationsbereich von 8,0 bis 10,0, zur Erzielung bester Resultate bei einem pH-Konzentrationsbereich von 8,5 bis 9,5. In alternativen Ausführungsbeispielen ist der Puffer ein anderes Mittel als tris-HCl, beispielsweise Natriumborat oder Natriunbi- carbonat. Nach einer Anfärbezeit von etwa 10 Minuten wird der Ob4ektträger 12 in einer wäßrigen Lösung, beispielsweise de stilliertem Wasser, während einer Minute gespült und dann ge-

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trocknet.

Danach wird der Objektträger 12 mit einer Quelle 14, beispielsweise einer Quecksilber-Lichtbogenlampe, bestrahlt, die über eine Kollimatorlinse 16, eine Filterscheibe 18, einen Strahlteiler 20 und eine Kondensatorlinse 22 darauf fokussiert ist. Die Filterscheibe 18 weist einen Filter 32., der ultraviolettes und violettes Licht, beispielsweise mit einer Wellenlänge von 320 bis khO Nanometer durchläßt, und einen Filter 34 auf, der grünes Licht, beispielsweise die Quecksilberlinie bei 546 Nanometer, durchläßt. In dem gezeigten Ausführungsbeispiel ist der Strahlteiler 20 ein dichroitischer Spiegel. In anderen Ausführungsbeispielen ist der Strahlteiler 20 kein dichroitischer Spiegel sondern kann ein Reflektor, beispielsweise ein Spiegel mit einer geraden Oberfläche, sein. Das Blickfeld, welches die fluorochrome gemachten Leukozyten enthält, wird auf einer p.hotoelektrischen Einrichtung 2¹I, beispielsweise auf der photoempfindlichen Oberfläche einer Bildröhre, über eine Kollimatorlinse 26 und eine Emissionsfilterscheibe 28 abgebildet. Die Filterscheibe 28 weist einen Blau-Grün-Filter 36 und einen Rot-Filter 38 auf. Wie noch beschrieben wird, werden die Filterscheiben 18, 28 durch eine Steuereinrichtung 30 schrittweise weitergeschaltet.

Anfänglich stellt die Steuereinrichtung 30 die Filterscheiben l8 und 28 in einer solchen Weise ein, daß die Filter 32 und 36 in dem Strahlengang liegen, so daß der Objektträger 12 mit ultraviolettem und violettem Licht bestrahltwird und blau-grüne Fluoreszenzbilder über den Blau-Grün-Filter 36 auf der photoempfindlichen Oberfläche der Bildröhre 2¹I vorhanden sind. Die Grün-Komponenten der Leukozytenfluoreszenz erscheinen auf einem dunklen Hintergrund, wobei die Fluoreszenz in ansteigender Reihenfolge der Intensität von den Eosinophilen zu den Neutrophilen zu Monozyten und Lymphozyten geht. Durch Anhebung der Erregungsstrahlung von 36O auf MO Nanometer gegenüber 320 bis 36O Nanometer wird die Differenz zwischen den Fluoreszenzintensitäten der Eosinophilen und Neutrophilen zu einem Maximum. Die photoempfindliche Oberfläche der Bildröhre 24 wird nach einem vorgegebenen

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Muster abgetastet, das durch eine Steuereinrichtung 40 bestimmt wird, die durch einen Rechner 42 programmiert ist. Die Intensität der bestrahlten Leukozyten wird durch den Rechner 42 gemessen, und Datensignale für jede Messung werden in einem Speicher 44 an X, Y-Adressenstellen gespeichert, die den Χ,Υ-Positionen der photoempfindlichen Oberfläche der Bildröhre 24 entsprechen.

Die Steuereinrichtung 30 schaltet dann die Filterscheiben 18 und 28 in einer solchen Weise weiter, daß die Filter 34 und 38 in dem Strahlengang liegen, so daß der Objektträger 12 mit einem grünen Licht bestrahlt wird, und die roten Fluoreszenzbilder über den Rot-Filter 38 an der photoempfindlichen Oberfläche der Bildröhre 24 vorhanden sind. In diesem Fall tritt nur die rote Fluoreszenz der Kerne der Leukozyten gegen einen dunklen Hintergrund auf der photoempfindlichen Oberfläche der Bildröhre 24 auf. In der oben beschriebenen V/eise werden die Fluoreszenzintensitäten der Kerne an jeder X,Y-Position der photoempfindlichen Oberfläche, der Bildröhre 24 durch den Rechner 42 gemessen. Die Meßdaten, die in dem Speicher 44 gespeichert sind, das heißt die Daten entsprechend der grüben Komponenten der Zellenfluoreszenz, werden in dem Rechner 42 adressiert, um die Leukozytentypen dadurch zu bestimmen, daß aus den Zählerdaten differentielle Signale gebildet werden, die das Verhältnis der Grünkomponenten der Zellfluoreszenz zu der roten Kernfluoreszenz bezüglich der roten Fluoreszenz von dem Zellkern darstellen, wie in Fig. 3 gezeigt ist. Signale, die Daten über das Zellenprofil enthalten, das heißt solche Daten, die durch Meßung der Zeitdauer, während der ein Signal von einer Zelle empfangen wird, abgeleitet werden, unterscheiden die Lymphozyten von den Monozyten. Die differentiellen Signale, die von dem Rechner 42 aus den Zählerdaten erzeugt worden sind, werden an einer Anzeige 46, beispielsweise eine Digitalanzeige mit der relativen Häufigkeit der verschiedenen Zellentypen, zur sichtbaren Darstellung angelegt. Es ist zu beachten, daß in alternativen Ausführungsbeispielen die Anzeige J>6 eine andere als eine Digitalanzeige sein kann, beispielsweise eine Kathodenstrahlröhre, ein Blattschreiber oder ein Magnetband-Aufzeichnungsgerät.

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Es ist zu beachten, daß andere Meßeinrichtungen als die in Fig. 1 gezeigte Einrichtung verwendet werden können, um Leukozytentypen auf einem gefärbten Blutausstrich differentiell zu zählen und zu klassifizieren. Beispielsweise kann eine von Hand bedienbare Einrichtung verwendet werden, bei der der Objektträger mit dem angefärbten Präparat in der oben beschriebenen Weise bestrahlt und durch ein Mikroskop betrachtet wird. In einem alternativen Ausführungsbeispiel werden die bestrahlten Leukozyten durch andere Einrichtungen als eine Bildröhre, beispielsweise durch einen oder mehrere Photodetektoren und eine Abtasteinrichtung mit wanderndem Lichtpunkt, erfaßt.

In Fig. 2 ist eine Meßeinrichtung 50 mit Durchflußrohr gezeigt, um Leukozytentypen differentiell zu zählen. Eine Blutprobe wird beispielsweise in einer Salzlösung verdünnt und die Zellen werden mit Formaldehyd fixiert.Es ist zu beachten, daß die Zellen mit Formaldehyd vor und nach der Verdünnung fixiert werden können. Die weißen Zellen werden in einer Lösung gefärbt, die besteht aus: 1 χ 10 molare^ 4,4 ^f-Bis-{4-(3-sulfanilino-6-{pis-(2-hydroxyäthyl)-amin^-l,3,5-triazin-2-y5-aminostilben;l χ 10~^ bis 1 χ 10 molarem Brilliantsulfaflavin mit 1 χ 10 molarem Äthidiumbromid. Die resultierende Suspension wird verdünnt und' entweder mit 0,1 molarer tris-HCL oder 0,05 molarem Borax bei einem pH. im Bereich von 9,C bis 9,2 gepuffert. Die Blutprobe hat beispielsweise eine im Bereich von dem 50 bis 100-fachen liegende Verdünnung in der Suspension,

-4 deren endgültige Konzentration etwa 1 χ 10 molar oder kleiner bei jedem der fluoreszierenden Farbstoffe ist. Die Zellen fließen dann in einem einzigen Faden durch ein enges Rohr 52, beispielsweise eine Kapillare, in der jedes der Leukozyten mit einer Strahlung von einer Quelle 54, beispielsweise einer Quecksilberlampe, bestrahlt wird. Die von der Quecksilberlampe 54 erzeugte Strahlung wird durch eine Kollimatorlinse 56 auf einen reflektierenden Filter 58, beispielsweise einen dichroitischen Filter, gerichtet. Das durch den dichroitischen Filter 58 hindurchtretende Licht wird über eine Kondensatorlinse 64 auf eine Kapillarrohre fokusiert. In dem gezeigten Ausführungsbeispiel läßt der dichroitische Filter 58 beispielsweise das grüne Licht der Quecksilberlinie

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bei 546 Nanometer durch. Das von dem dichroitischen Filter 53 reflektierte Licht wird auf einen reflektierenden Filter 66, bei-

und

spielsweise exnen dichroitischen Filter, gerichtet/über eine Kondensorlinse 72 bei 70 auf die Kapillarrohre fokusiert. In dem gezeigten Ausführungsbeispiel reflektiert beispielsweise der dichroitische Filter 66 das ultraviolette und violette Licht des Quecksilberspektrums im Bereich von 320 bis 410 Nanometer. Vorzugsweise ist der Abstand zwischen den Stellen, die durch die Bezugszahlen 62 und 70 bezeichnet sind, in typischen Fällen im Bereich von 50 bis 200 Aim. Eine photoelektrische Einrichtung 74, beispielsweise ein Photomultiplier, mißt das ola-agrüne Emissionslicht von der Kapillarröhre 52 über eine Kollektorlinse 76, einen dichroitischen Spiegel 77 und einen Blau-Grün-Emissionsfilter 78. Eine photoelektrische Einrichtung 80, beispielsweise ein Photomultiplier, mißt das orangerote Emissionslicht von der Kapillarrohre 52 über eine Kollektorlinse 76, einen dichroitischen Spiegel 77> einen dichroitischen Spiegel 82 und einen Orange-Rot-Emissionsfüter Eine photoelektrische Einrichtung 81, beispielsweise eine Photodiode, mißt das ultraviolette und violette Licht an dem Punkt 70 über einen Emissionsfilter 82, der einen Durchlaßbereich bei etwa 410 bis 430 Nanometer hat.

Der Photomultiplier 74 mißt dieblaugrüne Komponente der Zellfluoreszenz, der Photomultiplier 80 die rote Komponente der Kernfluoreszenz und der Photomultiplier 8l das violette Licht. Erythrozyten und Reticulozyten sind durch eine beachtliche Absorption von violettem Licht, und Leukozyten durch eine vernachlässigbare Absorption von violettem Licht gekennzeichnet. Folglich miß der Photomultiplier 81 die Absorption an violettem Licht, um noch rote Zellen von weißen Zellen zu unterscheiden.

Die Datensignale, die von den Photomultipliern 74 und 80 erzeugt werden, werden an eine Datenverarbeitungseinrichtung 86, beispielsweise einen kleinen Spezialrechner, angelegt, in dem die gemessenen Leukozytenfluoreszenzen als Verhältnis der Grün-Komponenten der Zellfluoreszenz zu der Rot-Komponenten der Kernfluoreszenz im Verhältnis zu der Rot-Fluoreszenz von dem Kern für jeden

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. -19-

Leukozytentyp differentiell gezählt und klassifiziert. Die differentiellen Zählerdatensignale, die von dem Rechner 86 für jedes durch die Kapillarröhre 52 hindurchtretendes Leukozyt erzeugt werden, werden an einer Anzeigeeinrichtung 88, beispielsweise eine digitale Anzeige mit der relativen Häufigkeit der verschiedenen Zellentypen zur Darstellung angelegt. Zusätzlich werden die von der Photodiode 8l erzeugten Signale, die eine Meßung des absorbierten, violetten Lichtes darstellen, an den Rechner 86 angelegt, um Erythrozyten und Leukozyten zu unterscheiden. Die Leukozyten können von einander dadurch unterschieden werden, daß das von den Leukozyten gestreute Licht durch Photodetektoren, beispielsweise Photodioden, gemessen wird. Es ist zu beachten, daß in alternativen Ausführungsbeispielen eine andere Anzeigeeinrichtung als eine digitale Anzeige für die Anzeigeeinrichtung 88 verwendet werden kann. Beispielsweise kann eine Kathodenstrahlröhre, ein Kartenschreiber oder eine magnetische Aufzeichntingseinrichtung verwendet werden. Ferner ist zu beachten, daß in alternativen Ausführungsbeispielen das von der Quelle 54 emittierte Licht durch andere Mittel als zwei Strahlteiler auf die Röhre 52 gerichtet werden kann. Beispielsweise können zwei Bestrahlungsquellen, von denen jede Licht abgibt, das auf die Röhre 52 gerichtet wird, verwendet werden. Auch kann eine Quelle verwendet werden, die durch einen abtastenden Lichtstrahlcharakterisiert ist.

Die folgenden Beispiele zeigen, das Prinzip der vorliegenden Erfindung und sind zur Vereinfachung auf Blut als biologische Meßproben beschränkt.
Beispiel I

Ein Tropfen aus reinem Blut wird auf einem Mikroskop-Objektträger gebracht und mit Hilfe eines anderen Mikroskop-Objektträgers zu einer dünnen Schicht ausgebreitet. Nachdem die Schicht ausgetrocknet ist, wird der Blutausstrichdurch Eintauchen des Objektträgers in Methanol für eine Dauer von 5 Minuten fixiert. Danach wird der Objektträger in eine flüssige Mischung eingetaucht, die enthält: 1. 100 ppm von 4,4'-BiS-L¹M3-sulfanilino)-6-[bis-(2-hydroxy.= äthyl)-aminoJ-1,3,5~triazin-2-y IJ -aminostilben-2,2'-disulfonsäure (Tetranatriumsalz;LN);

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2. 1 000 ppm aus Brilliantsulfaflavin;

3. 30 ppm aus Äthidiumbromid (EB), das durch LN sensibilisiert ist;

4. ein Lösungsmittel, das 12 000 ppm von 2-Amino-2-Chlorwasserstoff-propandiol bzw. 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-l,3-propandiol und genügend konzentrierte Salzsäurelösung aufweist, um den pH der Lösung auf 8,0 zu bringen.

Nach 10 Minuten in der flüssigen Mischung wird der Objektträger in destilliertem Wasser während einer Minute gespült und dann getrocknet.

Beispiel II

Ein Teil des reinen Blutes wird mit vier Teilen einer Lösung mit einem pH von 9₅O gemischt, die aufweist:

1. 1 200 ppm eines 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-l,3-propandiol-HCl-Puffers (pH 9,0);

2. 85 000 ppm von Natriumchlorid;

3. 1 000 ppm von Brilliantsulfaflavin;

4. 100 ppm von 4,4 ^l-Bis-iTⁱi-(3-sulfanilino)-6-£bis-(2-hydroxy = äthyl)-aminoJ-l,3,5-triazin-2-ylJ-aminostilben-2,2 '-disulfonsäure (als Tetranatriumsalz); und

5. 30 ppm Ä'thdidiumbromid.

Nach drei Minuten wird die Suspension mit einem Teil einer 20-prozentigen Lösung von Formaldehyd gemischt. Fünf Minuten später wird die Mischung 15 bis 20-fach mit einer Lösung verdünnt, die besteht aus:

6. 12 000 ppm eines 2-Amino-2-(hydroxymethyI)-1,3-propandiol-HCl-Puffers (pH 9,0);

•7. 85 000 ppm Natriumchlorid;

8. 100 ppm von 4,4 '-Bis-C4-(3-sulfanilino)-6-£bis-(2-hydroxy= äthyl)-aminöj-l,3,5-triazin-2-ylJ -aminostilben-2,2'-disulfonsäure fels Tetranatriumsalz);

9. 15 ppm Ä'thidiumbromid.

In diesem Beispiel zeigen die gefärbten, suspendierten Zellen die folgenden optischen Eigenschaften Jigger Ultraviolettbestrahlung

mit einer Wellenlänge von etwa 365 Nanometer:

(a) Das Zytoplasma und die Granula der Neutrophilen zeigen eine s-ichbare Fluoreszenz mit spektralen Spitzen in dem blauen und dem orange-roten Bereich. Die blaue Komponente ergibt sich von der direkten Anregung des Triazinylfarbstoffes, und die rote Komponente, die am deutlichsten in den Granula hervortritt, beruht auf der Energieübertragung von dem Triazinylfarbstoff auf das Äthidiumbromid, wobei das letztere in den Granula und in dem Rest des Zytoplasmas mit Konzentrationen vorhanden ist, die zu klein sind, um durch direkte Absorption von ultraviolettem Licht effektiv angeregt zu werden.

(b) Das Zytoplasma und die Zellkerne der Eosinophilen zeigen eine stärkere sichtbare Puoreszenz als die Neutrophilen mit spektralen Spitzen im blau-grünen- und orange-roten Bereich. Die blaugrüne Komponente ergibt sich hauptsächlich'aus der.Anregung des Brilliantsulfaflavinfarbstoffes und des Triazinylfarbstoffes. Die Rot-Örange-Komponente beruht auf der Energieübertragung von dem Triazinylfarbstoff und dem Brilliantsulfaflavinfarbstoff auf das Äthidiumbromid, wobei das letztere in den Granula und im Rest des Zytoplasmasmit Konzentrationen vorhanden ist, die zu klein sind, um durch die direkte Absorption von ultraviolettem Licht wirksam angeregt zu werden.

(c) Das Zytoplasma und die Kerne der Lymphozyten und Monozyten zeigen eine schwächere Fluoreszenz als die der Neutrophilen oder Eosinophilen. Diese Fluoreszenz ist durch eine Spektralverteilung charakterisiert mit einer Spitze in dem blauen Bereich und eine; kleinere"; Spitze oder Schulter in dem^roten Bereich, wobei die Fluoreszenz der Monozyten kleiner als die Fluoreszenz der Lymphozytefa ist.

Unter violetter Bestrahlung mit Wellenlängen zwischen etwa 400 bis 440 Nanometer zeigen die Eosinophilen eine starke grüne !Fluoreszenz, die um ein mehrfaches stärker als die der anderen Leukozyten ist.

Unter grüner Bestrahlung zeigen die Zellkerne und in geringerem

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Maße das Zytoplasma der Leukozyten eine rote Fluoreszenz, wobei die Eosinophilen die größte Fluoreszenzintensität, die Neutrophilen und Monozyten vergleichbare Pluoreszenzintensitäten geringerer Helligkeit und die Lymphozyten im allgemeinen die geringste Fluoreszenzintensität zeigen.

Es ist zu beachten, daß rote Zelle eine vernachlässigbare Fluoreszenz unter jeder der oben genannten Bedingungen zeigen.

Beispiel.III

Ein Teil reines Blut wird mit einem Teil einer 10-prozentigen Lösung aus Formaldehyd 5 Minuten lang gemischt. Die Suspension wird dann mit vier Teilen einer Lösung gemischt, die besteht aus:

1. 1.200 ppm eines 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-l,3-propandiol-HCl-Puffers (pH 9,0);

2. 85 000 ppm Natriumchlorid;

3. 300 ppm von 8-p-Toluid±io-l-riaphthalinsulfonsäure;

li. 100 ppm von 4,4 '-Bis-D-(3-sulfanilino)-6-[bis-(2-hydroxyäthyl)-amino7 -1,3,5~triazin-2-ylj -aminostilben-2,2'-sulfonsäure (als Tetranatriumsalz);und

5. 20 ppm Äthidiumbromid.

Nach fünf Minuten wird die Mischung 15 bis 20-fach mit einer Lösung verdünnt, die besteht aus:

6. 12 000 ppm eines 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-l,3-propandiol-HCl-Puffers (pH 9,0);

7. 85 000 ppm Natriumchlorid;

8. 60 ppm von 8-Toluidino-l-naphthalinsulfonsäure;

9. 100 ppm von 4,4'-Bis-0-(3-sulfanilino)-6- Ü>is-(2-hydroxyäthyl)-aminoJ-l,3,5-triazin-2-yi[ -aminostilben-2,2 '-disulfonsäure (als Tetranatriumsalz);und

10. 15 ppm Äthidiumbromid.

In diesem Beispiel zeigen die gefärbten, suspendierten Zellen die folgenden optischen Eigenschaften unter ultravioletter Bestrahlung mit einer Wellenlänge von etwa 365 Nanometer:

' (a) Das Zytoplasma und die Granula der ITeutrophilen zeigen eine sichtbare Fluoreszenz mit spektralen Spitzen in dem blauen

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und dem orange-roten Bereich.- Die blaue Komponente ergibt sich aus der direkten Anregung des Triazinylfarbstoffes, und die' rote Komponente, die in den Granula am stärksten betont ist, beruht auf der-Energieübertragung von dem Triazinylfarbstoff auf das Äthidiumbromid, wobei das letztere in den Granula und in dem Rest des Zy toplasmasmit Konzentrationen vorhanden ist, die zu klein sind, um durch direkte Absorption des ultravioletten Lichtes effektiv angeregt zu werden.

(b)Das Zytoplasma und die Granula der Eosinophilen zeigen eine stärkere sichtbare Fluoreszenz als die Neutrophilen mit spektralen Spitzen in dem blau-grünen und orange-roten Bereich. Die blau-Srüne-Komponente ergibt sich hauptsächlich aus der Anregung der 8-p-Toluidino-l-naphthalinsulfonsäure und dem Triazinylfarbstoff. ■ Die Rot-Orange-Komponente beruht auf der Energieübertragung von ■ dem Triazinylfarbstoff und der 8-p-Toluidino-l-naphthalinsulfonsäure auf das Äthidiumbromid, wobei das letztere in dem Granula und in dem Rest des Zytoplasmas mit Konzentrationen vorhanden ist, die zu klein sind, um durch direkte Absorption des ultravioletten Lichtes wirksam angeregt zu werden.

(c) Das Zytoplasma und die Kerne der Lymphozyten und Monozyten zeigen eine schwächere Fluoreszenz als die Neutrophilen oder Eosinophilen. Diese Fluoreszenz ist durch eine Spektralverteilung gekennzeichnet, die eine Spitze in dem blauen .Bereich und eine kleinere Spitze oder Schulter in dem roten Bereich hat, wobei die Fluoreszenz der Monozyten kleiner als die Fluoreszenz der Lymphozyten ist.

Unter violetter Bestrahlung mit einer Wellenlänge von etwa 400 bis 4*10 Nanometer zeigen die Eosinophilen eine starke grüne Fluoreszenz, die um ein mehrfaches stärker als die der anderen Leukozyten ist.

Unter grüner Bestrahlung zeigen die Zellkerne und in geringerem Maße das Zytoplasma aller Leukozyten eine rote Fluoreszenz, wobei die Eosinophilen die größte Fluoreszenzintensität, die Neutrophilen und Monozyten, vergleichbare Fluoreszenzintensitäten geringerer Helligkeit und die Lymphozyten i_m allgemeinen die geringste

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Fluoreszenzintensität haben.

Es ist zu beachten, daß rote Zellen unter jeder der oben genannten Bedingungen eine vernachlässigbare Fluoreszenz zeigen.

Beispiel IV

Ein getrockneter Blutausstrich wird mit LN in wäßriger Lösung genügend lange behandelt, um die Proteinbestandteile in der Probe anzufärben. Der Objektträger wird dann in Wasser gewaschen und getrocknet. Eine Lösung aus Acridinorangebase in Äthanol wird dann genügend lange in Einwirkung auf die gefärbte Meßprobe gebracht, um die Lipoiden in dem letzteren zu färben. Es wird angenommen, daß die Acridinorangebase die folgende Struktur hat:

"N(CH.

Wenn die so behandelte Meßprobe mit einer Strahlung von etwa 350 mu bestrahlt wird, zeigt das LN eine Fluoreszenz bei etwa 470 mu . Wo das LN Protein nahe bei den Lipoiden-Bestandteilen eingefärbt hat, verursacht eine" Energieübertragung von dem LN (das als Sensibilisator dient) auf die Acridinorangebase, die in den Lipioden-Bestandteilen gelöst ist, eine Fluoreszenz in der Acridinorangebase mit einer Wellenlänge von etwa 5^0 m ,u . Die letztere Emission zeigt die Anwesenheit von Lipoprotein, obwohl die tatsächliche Struktur Abmessungen haben können, die weit unter dem Auflösungsvermögen der Meßeinrichtung liegt.

Nach einem Gesichtspunkt der Erfindung wird eine Farbstoffzusammensetzung angegeben, die aus drei fluoreszenten Farbstoffen besteht, um Leukozyten, Erythrozyten und Reticulozyten eindeutig zu unterscheiden, die in einem Medium unregelmäßig verteilt sind. Ein Verfahren und eine Vorrichtung zum absoluten Zählen der Leukozyten und Reticulozyte.n und zum differentiellen Zählen der Leukozyten, die mit der Farbstoffzusammensetzung angefärbt worden sind, wird

ebenfalls angegeben. Wenn die angefärbten Leukozyten durch Licht bestrahlt werden, das die charakteristische Absorptionswellenlänge, jedes der Farbstoffe aufweist, hängen die relativen Intensitäten der Leukozytenfluoreszenz bei dem optischen Wellenlängebereich der Emission von,jedem Farbstoff in eindeutiger Weise bei wenigstens einem charakteristischen Wellenlängenbereich von dem Leukozytentyp ab. Das von den bestrahlten Leukozyten emittierte Licht in jedem ihrer charakteristischen Wellenlängenber-eiche wird gemessen und die Leukozytentypen werden nach den relativen Insitäten des emittierten Lichts in charakteristischen Wellenlängenbereichen jedes Farbstoffes klassifiziert. Das durchgelassene, violette Licht wird gemessen, um Erythrozyten, Reticulozyten und Leukozyten zu unterscheiden, wobei Erythrozyten und Reticulozyten eine beachtliche Absorption von violettem Licht zeigen, während Leukozyten nur eine vernachlässigbare Absorption von violetten Licht zeigen.

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Claims

-26-Patentansprüche

1. Verfahren zum Anfärben eines biologischen Materials, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifischen Bestandteile des Materials mit einer Mischung aus einem fluoreszierenden Farbstoff und einer Sensibilisatorverbindung differenziert angefärbt wird, wobei der Sensibilisator in der Lage ist, einfallende Strahlung in einem spektralen Absorptionsband'zu absorbieren und auf den Farbstoff wenigstens einen Teil der Energie der absorbierten, einfallenden Strahlung zu übertragen, wodurch der Farbstoff zur Fluoreszenzemission angeregt wird.

2. Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen fluoreszenten Farbstoff, der sich zum Anfärben eines speziellen Bestandteiles des Materials eignet, und durch eine Sensibilisatorverbindung, die in der Lage ist, einfallende Strahlungen in einem spektralen Absorptionsband zu absorbieren und wenigstens einen Teil der Energie der absorbierten, einfallenden Strahlung auf den in der Nähe der Verbindung befindlichen Farbstoff zu übertragen, um den Farbstoff in Fluoreszenzemission anzuregen.

3. Mittel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung ein fluoreszente.r Farbstoff ist, der in der Lage ist, einen spezifischen Bestandteil des Materials anzufärben.

¹J. Mittel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung eine nicht-fluoreszente Verbindung ist, die an einen speziellen Bestandteil des Materials ankoppelbar ist.

5. Mittel nach einem der Ansprüche 2 bis ¹I, dadurch gekennzeichnet, daß der Farbstoff ein sulfoniertes Triazinylderivat von Diaminostilben ist.

6. Mittel zur Unterscheidung biologischer Zellentypen, gekennzeichnet durch mehrere kompatible Farbstoffe, die charakteristische Strukturen der interessierenden Zellentypen differenziert anfärben,- wobei einer der Farbstoffe ein sulfoniertes Triazinylderivat von Diaminostilben ist, der Proteinstrukturen der interessierenden

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-27-Zellentypen differenziert flurochrom anfärbt»

7. Mittel nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das sulfonierte Triazinylderivat von Diaminost üben 4,4 '-Bis-j^-O-sulfanilino)-6-[bis-(2-hydroxyäthyl)-amino] -l,3,5-triazin-2-yl| aminostilben-2,2'-disulfonsäure als Tetranatriumsalz ist.

8. Mittel nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß der andere Farbstoff ein kationischer Farbstoff ist, der die Nukleinsäuren der interessierenden Zellentypen differenziert anfärbt .

9. Mittel nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der kationische Farbstoff ein Phenantridiniumfarbstoff ist.

10. Mittel nach Anspruch 9/ dadurch gekennzeichnet, daß der Phenantridiniumfarbstoff Äthidiumbromid ist.

11. Mittel nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die interessierenden Zellentypen Blutzellen sind, und daß die Proteinstrukturen das Zytoplasma von Leukozyten und die Granula von Granulozyten sind.

12. Mittel nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der andere Farbstoff ein kationischer Farbstoff ist, der die Zellkerne von Blutzellen und die fadenartige Netzstruktur von Reticulozyten differenziert anfärbt.

13. Mittel nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der andere Farbstoff ein sulfoniertes, fluoreszentes Derivat von 1,8-Naphthalimid ist, das die Granula von Eosinophilen differenziert anfärbt.

14. Mittel nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das sulfonierte, fluoreszente Derivat von 1,8-Naphthalimid.Brilliantsulfaflavin'ist.

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15· Mittel nach einem der Ansprüche 11 bis 13» dadurch gekennzeichnet, daß der andere Farbstoff ein Toluidinoderivat von Naphthalinsulfonsäure ist, welches die Granula von Eosinophilen differenziert anfärbt. "

16. Mittel nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Toluidinoderivat von Naphthalinsulfonsäure 8-p-Toluidino-lnaphthalinsulfonsäure ist.

17. Mittel zur Unterscheidung biologischer Zellentypen, die unregelmäßig in einem Medium verteilt sind, dadurch gekennzeichnet, daß/sulfonierte Triazinylderivate von Diaminostilben enthält.

18. Mittel nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das sulfonierte Trianizylderivat von Diaminostilben ¹J ,¹J '-Eis-j ¹J-O-' sulfanilino)-£-£bis-(2-hydroxyäthyl)-aminoJ -1,3, 5-triazin-2-ylj aminostilben-2,2'-disulfonsäure als Tetranatriumsalz ist.

19· Verfahren zum differenzierten Zählen von Erythrozyten, Reticulozyten und Leukozyten, die in einem Blutmedium verteilt sind, dadurch gekennzeichnet, daß

(a) das Blut mit mehreren Farbstoffen angefärbt wird;

(b) die Leukozyten, Erythrozyten und Reticulozyten mit einer Strahlung in dem charakteristischen Absorptionswellenlängenbereich von jedem der Farbstoffe bestrahlt werden, wobei spezielle Leukozytentypen eine optische Strahlung in einem für jeden der Farbstoffe charakteristischen,optischen Wellenlängenbereich emittiert, so daß die Intensität des von jedem Leukozytentyp emittierten Lichtes einen speziellen Leukozytentyp eindeutig definiert, wobei Reticulozyten mit einer kleineren Intensität als Leukozyten fluoreszieren und die Erythrozyten eine vernachlässigbare Fluoreszenz haben;

(c) die relative Intensität der Strahlung gemessen wird, die jeweils von den Leukozyten, Erythrozyten und Reticulozyten in dem charakteristischen Wellenlängenband jedes der Farbstoffe emittiert und durchgelassen wird; und daß

(d) jeder der Leukozyten-, Reticulozyten- und Erythrozytentypen nach den relativen Intensitäten des von jedem Typ emittierten Lichtes unterschieden wird.

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20. Verfahren zum differenzierten Zählen von Leukozytentypen, die unregelmäßig in einem Blutmedium verteilt sind, nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß:

(a) die Leukozyten mit einer Farbstofflösung angefärbt werden, die mehrere Farbstoffe enthält, von denen wenigstens einer allen Leukozyten eine Fluoreszenz erteilt;

(b) die gefärbten Leukozyten mit einer Strahlung bestrahlt werden, die ein· charakteristisches Absorptions-Wellenlärigenband für jeden Farbstoff hat, wobei die Intensität der Strahlung, die von jedem Leukozyt in wenigstens einem charakteristischen Wellenlängenbereich der Farbstofflösung emittiert und durchgelassen wird, jeden Leukozytentyp in eindeutiger Weise definiert;

(c) die relativen Intensitäten der von den Leukozyten emittierten Strahlung gemessen wird; und daß

(d) jeder Leukozytentyp gemäß den relativen Intensitäten der Strahlung klassifiziert und gezählt wird, die in dem charakteristischen Wellenlängenbereich emittiert und durchgelassen wird.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die emittierte Strahlung durch direkte optische Absorption von wenigstens zwei der Farbstoffe angeregt wird.

22. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, daß die emittierte Strahlung durch Sensibilisierung von wenigstens einem der Farbstoffe angeregt wird.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß. die Farbstoff lösung ein sulfoniertes Triazinylderivat von 4,4'-Diaminostilben enthält, um dem Protein der Leukozyten und den n'eophilen und e.osinophilen Granula eine blaue Fluoreszenz zu erteilen. .

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Farbstoff lösung 8-p-Toluidino-l-naphthalinsulfonsäure enthält, um den eosinophilen Granula eine blau-grüne Fluoreszenz zu erteilen.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 24, dadurch ge-

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kennzeichnet, daß die Farbstofflösung Brillianzsulfaflavin enthält, um den eosinophilen Granula eine blau-grüne Fluoreszenz zu erteilen.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Farbstofflösung Äthidiumbromid enthält, um den Kernen aller Leukozyten eine rote Fluoreszenz zu erteilen.

27. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 20, gegebenenfalls zum differenzierten Klassifizieren von Leukozytentypen, insbesondere von Eosinophilen, Neutrophilen, Monozyten und Lyir.phozyten, wobei die Leukozytentypen auf einem Objektträger fixiert sind, gekennzeichnet durch:

(a) ein Anfärbemittel für die Leukozytentypen -mit einer

Färbstofflösung, die wenigstens ein erstes und ein zweites Farbstoffmittel aufweist, wobei das erste Farbstoffmittel den Neutrophilen und Lymphozyten eine erste Fluoreszenz erteilt, und das zweite Farbstoffmittel den Kernen aller Leukozyten eine zweite Fluoreszenz erteilt;

(b) eine Strahlungsquelle (14) zur Erzeugung einer optischen, auf den Objektträger (12) gerichteten Strahlung, wobei die Strahlungsquelle (14) die gefärbten Leukozytentypen bestrahlt und die Leukozyten in einem spezifizierten Spektralbereich Strahlung emittieren und durchlassen, wodurch ausgewählte Leukozytentypen durch eine spezifizierte Fluoreszenzintensität identifizierbar sind; und durch

(c) eine Detektoreinrichtung (24), die optisch an den Objektträger (12) gekoppelt ist, um die von den Leukozyten emittierte und durchgelassene Strahlung zu messen, wobei die Detektoreinrichtung die Leukozytentypen nach der Fluoreszenzintensität, die von dem jeweiligen Leukozytentyp emittiert wird, klassifiziert und zählt (Fig. 1).

28. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 20 und gegebenenfalls zum differenzierten Klassifizieren und Zählen von Leukozytentypen, wobei die Leukozytentypen unregelmäßig in äner Blutprobe verteilt sind, gekennzeichnet durch:

(a) ein Anfärbemittel für die Leukozytentypen mit einem

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Farbstoffmittel, das mehrere fluoreszente Farbstoffe aufweist, von denen wenigstens einer den Kernen aller Leukozyten eine erste charakteristische Fluoreszenz erteilt, und von denen der andere fluoreszente Farbstoff dem Zytoplasma der Eosinophilen; Neutrophilen, Monozyten und Lymphozyten eine zweite charakteristische Fluoreszenz erteilt, während die gefärbte Blutprobe eine Suspension bildet;

(b) eine Strömungseinrichtung (52), durch die die Blutprobe hindurchfließt, wobei die gefärbten Leukozyten in einem einzigen Faden durch die Strömungseinrichtung (52) hindurchtreten;

(c) eine Strahlungsquelle (54), um die gefärbten Leukozyten, die in einem Faden durch die Strömungseinrichtung (52) hindurchtreten, zu bestrahlen, wobei die Leukozyten eine optische Strahlung in einem spezifizierten Spektralbereich emittieren, so daß die ausgewählten Leukozytentypen durch eine spezifizierte Fluoreszenzintensität identifizierbar sind; und durch

(d) eine Detektoreinrichtung (7^_t8O,8l), die optisch mit der Strömungseinrichtung (52) gekoppelt ist, um die durch die Strömungseinrichtung (52) in einem einzigen Faden hindurchtretenden Leukozyten zu erfassen bzw. auszumessen, wobei die Detektoreinrichtung die Leukozytentypen nach der Fluoreszenzintensität, die von jedem Leukozytentyp emittiert wird, klassifiziert und zählt.

29. Vorrichtung nach Anspruch 27 oder 28, dadurch gekennzeichnet, daß:

(a) das Anfärbemitter enthält:

(1) ein erstes, fluoreszentes Farbstoffmittel, um dem Zyto - plasma der Leukozyten und den Granula der Neutrophilen eine erste Fluoreszenz zu erteilen bzw, diese anzufärben, wobei die Fluoreszenz eine Anregungsspitze bei einer ersten Wellenlänge im ultravioletten Bereich' des Spektrums und eine Emissionsspitze in dem blauen Bereich des Spektrums bei einer zweiten Wellenlänge hat;

(2) ein zweites, fluoreszentes Farbstoffmittel, um die Eosinophilen anzufärben, um ihnen eine zweite Fluoreszenz mit einer Anregungsspitze bei einer dritten Wellenlänge und einer Emissionsspitze be.i.einer vierten Wellenlänge zu erteilen, wobei die dritte Wellenlänge länger als die erste

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Wellenlänge und die vierte Wellenlänge länger als die zweite Wellenlänge ist; und

(3) ein drittes, fluoreszentes Färbstoffmittel, um die Kerne der Leukozyten zu färben und diesen eine dritte Fluoreszenz mit einer Erregungsspitze bei einer fünften Wellenlänge und einer Emissionsspite bei einer sechsten Wellenlänge zu erteilen, wobei die fünfte Wellenlänge langer als. die dritte Wellenlänge und die sechste Wellenlänge länger als die vierte Wellenlänge ist;.

(b) die Einrichtung zur Erzeugung einer Strahlung eine Strahlungsquelle (14;54) zum Bestrahlen der gefärbten Leukozyten aufweist, wobei spezifizierte Leukozytentypen diese Strahlung in einem definierten Spektralbereich emittieren und durch eine spezifizierte Fluoreszenzintensität in wenigstens einer der Spektralbereiche der Emission identifiziert werden; und daß

(c) die Detektoreinrichtung (24,40,42,44,47^4,80,81,86, 88) optisch an die bestrahlten Leukozyten angekoppelt ist und die Leukozytentypen nach dem Fluoreszenzintensitätsverhältnis der ersten Fluoreszenz zu der zweiten Fluoreszenz klassifiziert und zählt.

30. Vorrichtung zum absoluten Zählen von Leukozyten, Erythrozyten und Reticulozyten nach dem Verfahren gemäß Anspruch 19 und gegebenenfalls zum differenzierten Zählen von Leukozyten, gekennzeichnet durch:

(a) ein Anfärbemittel für Leukozyten, Erythrozyten und Reticulozyten mit einem Farbstoffmittel, das sulfonierte Triazinylderivate von 4,4'-Diaminostuben, sulfonierte, fluoreszente Derivate von 1,8-Naphthalimid und einen Phenanthridiniumfarcstcff aufweist;

(b) eine Strahlungsquelle (14,54) zur Bestrahlung der gefärbten Leukozyten, Erythrozyten und Retic-ulozyten mit einer optischen Strahlung in dem charakteristischen Absorptionswellenlängenbereich von jedem der Farbstoffe, wobei spezifische Zellentypen eine optische Strahlung in einem definierten Spektralbereich emittieren und die Leukozyten, Erythrozyten und Reticulozyten durch eine spezifizierte Fluoreszenzintensität identifiziert werden; und durch

(c) eine Detektoreinrichtung (24,40,42,44 ,46 ;74 ,80, 81, hf.,

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88), die optisch mit den bestrahlten Leukozyten, Erythrozyten und Reticulozyten gekoppelt ist, um jeden Zellentyp nach seiner Fluoreszenzintensität zu klassifizieren und zu zählen, wobei die Reticulozyten mit einer geringeren Intensität als die Leukozyten fluoreszieren, und die Erythrozyten eine vernachlässigbare Fluoreszenz haben.

31. Vorrichtung nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß das sulfonierte fluoreszierende Derivat von 1,8-Naphthalimid Brilliantsulfaflavin ist.

32. Vorrichtung nach Anspruch 30 oder 31, dadurch gekennzeichnet, daß der Phenanthridiniumfarbstoff Äthidiumbromid ist.

33· Vorrichtung nach einem der Ansprüche 30 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektoreinrichtung Photodetektoreinrichtungen zum Messen des von den Leukozyten gestreuten Lichtes aufweist, um die Leukozyten nach ihrer Größe zu differenzieren.

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