DE3304795A1 - Verfahren zur differentiellen bestimmung der entwicklungsstufen neutrophiler, granulozytischer zellen und anderer leukozyten mittels metachromatischer frabstoffadsorption und einer fluoreszenzlicht-emissionseinrichtung - Google Patents

Description

In der DE-OS 31 09 252 sowie der DE-OS 32 08 wird eine große Klasse von Farbstoffen beschrieben, die bei der supravitalen Blutanalyse durch Absorption von Licht im sichtbaren Bereich auf dem Gebiet der Zytologie einen beachtlichen Fortschritt bringen.

Die Erfindung bezieht sich auf den gleichen Gegenstand wie die DE-OS 31 09 252 , durch die ein verbessertes Verfahren zur optischen Differenzierung von fünf einzelnen weißen Blutzellen-Spezies unter Verwendung einer Klasse basischer guarternärer metachromatischer Farbstoffe bereitgestellt wird, bei welchen sich zeigte, daß sie jede der Spezies in einem Temperaturbereich supravital anfärben.

Der Gegenstand der DE-OS 32 08 629 bezieht sich im wesentlichen auf das gleiche Gebiet, beruht jedoch auf der Feststellung, daß bestimmte spezifische Unterklassen der Farbstoffe, die in einem weiten Bereich zur Differenzierung, Identifizierung und Zählung der menschlichen Blutzellen-Leukozyten geeignet sind, gleichfalls einzeln zur differentiellen Bestimmung der Entwicklungsstufen neutrophiler granul ozytischer Zellen und andere Leukozyten geeignet sind. Die vorstehenden Erfindungen wurden verwirklicht,indem Lichtwellen mit der gleichen Wellenlänge verwendet wurden, wie sie in normalem Tageslicht vorkommen, das im vorliegenden Zusammenhang manchmal als weißes Lichtspektrum bezeichnet wird»
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Durch die Verwirklichung des Gegenstands der DE-OS 32 08 629 sind mikroskopische Untersuchungen eines supravital angefärbten Feldes möglich geworden, die es dem Beobachter erlauben> das allgemeine Verfahren der supravitalen menschlichen Blutanalyse unter Verwendung von "weißem" Licht (einer elektromagnetischen Energieform der Strahlung mit einer Wellenlänge von etwa 400 bis 770 Nanometer ), wie ursprünglich

. beschrieben, durchzuführen, jedoch nunmehr erweitert durch den Einschluß von Fluoreszenzlicht-Emissionen. Nach der DE-OS 31 09 252 und der DE-OS 32 08 629 wird das Licht des weißen Spektrums, das durch das Feld der supravital angefärbten Probe hindurchtritt, absorbiert. Das Fluoreszenzlicht hängt mit Lichtemissionen zusammen und wird durch den Fluß einer Energieform in den emittierenden Körper hervorgerufen» Das Emissionsspektrum der Fluoreszenz wird gebildet durch den absorbierten Energiefluß und das mit einer charakteristischen Frequenz emittierte Licht.

Die Fluoreszenzlicht-Emission in dem Fluoreszenz-Mikroskop für die vorliegenden Zwecke kann eine ultraviolette, violette und manchmal blaue Strahlung sein. Im allgemeinen wird Quecksilber-Dampflicht verwendet. Frühere Versuche haben jedoch den Wert eines einzigen kohärenten Lichtstrahls aus der Lasertechnologie unterstrichen, der in manchen Fällen geeignet sein kann. Es ist bekannt, bei einer fließzytometrischen Einrichtung Laserstrahlen zu verwenden, um einzelne Zellen anzuregen, die in den Zellensortier-• einrichtungen einem Ac ridin-Orange-Farbstoff ausgesetzt sind. Mit den Instrumenten kann eine einzige Zelle betrachtet werden, um deren spezifisches Muster zu bestimmen und die Intensität der metachromatischen Fluoreszenzfarben zu messen. £cridin-Orange sind jedoch Grenzen gesetzt, die sowohl pH- wie temperaturabhängig sind. Acridin-Orange weist keine geeignete Metachromasie bei einem Lichtabsorptionsverfahren auf. Weiterhin neigt der Farbstoff dazu, nach außen zu diffundieren und ist zur supravitalen Untersuchung von (lebenden) Zellen nicht geeignet, beispielsweise ist er konzentrationsabhängig. Bei dem hier beschriebenen Verfahren stellt die Anregung der präparierten mikroskopischen Zellen , die beispielsweise mit Basischorange Nr. 21 angefärbt sind, durch Laserlicht eine

einzigartige Möglichkeit dar zur Identifizierung, Differenzierung und Zählung der Blutzellen sowie anderer Gewebe, die in der Lage sind, Blutzellen herzustellen, zu transportieren oder aufzubewahren. Es hat nicht den Anschein, daß Laserlicht eine neue Art der Chromasie anregt oder herbeiführt oder die Metachromasie stört* die einen wichtigen Faktor der Verwendung der erfindungsgemäßen Farbstoffe darstellt. Es kann mit hoher Energiedichte in einer einzigen Zelle fokussiert werden, wodurch sie unterschiedlicher werden und die Messung präziser wird. Die emittierten Farben scheinen durch die Art der Energie nicht verändert zu werden, die die erfindungsgemäßen adsorbierten Farbstoffe dazu bringt, zu fluoreszieren.

Durch die Verwendung der speziellen Gruppe der hier beschriebenen und beanspruchten Farbstoffe, insbesondere von Basischorange Nr. 21, das bei Fluoreszenz-Einrichtungen einzigartig ist, aber auch durch die gleichfalls einzigartigen, mit weißer Lichtabsorption durchgeführten Verfahren nach der DE-OS 31 09 252 und der DE-OS 32 08 629 wird ein unermeßlicher Fortschritt auf dem Gebiet der Zytologie erreicht.

Die in der DE-OS 31 09 252 beschriebenen Farbstoffe sind weitgefaßt als Methine, Polyme thine und Cyan-Farbstoffe klassifiziert worden. Weitgefaßte Farbstoffe in der Klasse umfassen Carbocyanine, Merocyanine, Azacyanine, Oxanole usw. Es hat sich jedoch gezeigt, daß nur sehr wenige von dieser großen Klasse metachromatisch und geeignet sind, insbesondere auf dem vorliegenden Anwendungsgebiet , bei dem sie sowohl unter Fluoreszenz-Bedingungen wie bei der Absorption von weißem Licht metachromatisch sein müssen=

Ehrlich machte biologische Elemente bei der mikroskopischen Prüfung und fotografischen Beobachtung durch An-

-ΙΟΙ färben mit Farbstoffen (Anilin-Farbstoffe) leichter und einfacher erkennbar, um bestimmte weiße Blutzellen zu identifizieren . Ehrlich war der erste/ der feststellte, daß einige Farbstoffe metachromatisch sind, wobei er beobachtete, daß das Anfärben der Zelle oder von Bestandteilen, wie die Granula von Leukozyten, dazu führt, daß die Zelle eine andere Farbe annimmt als die Farbe des Farbstoffs oder die Farbe, die aufgrund des Farbstoffs zu erwarten ist. Beispielsweise wurde bei basophilen Zellen festgestellt, daß sie eine andere Farbe als die des Farbstoffs annehmen, über andere histologische Proben als Blutzellen wird gleichfalls berichtet, daß sie in einer Vielzahl identifizierbarer unterschiedlicher Farben mit Farbstoff anfärbbar sind. 15

Ein überblick des Standes der Technik zeigt, daß es fast weltweit Praxis ist, vor dem Anfärben (bei dem gegenwärtig ein Gemisch aus einer Vielzahl chemisch unterschiedlicher Farbstoffe verwendet wird) ein Fixierverfahren durchzuführen, das eine Behandlung bis zu einer halben Stunde erfordern kann, bevor die biologische Probe dem Farbstoff ausgesetzt wird. Fixiermittel sind im allgemeinen Konservierungsmittel und Denaturierungsmittel, die die Empfindlichkeit der Farbstoffabsorption, häufig beeinträchtigen. Beispielsweise enthalten Fixiermittel Formaldeyd sowohl als Flüssigkeit als auch als Dampf, absolute Alkohole (Methylalkohol, Picroformal usw.). Sehr häufig werden lebende Zellen nicht angefärbt, wenn Vitalfarbstoffe verwendet werden, wobei sich Fixiermittel als wesentlieh erwiesen haben, um Proben anzufärben. In der Zytochemie gibt es eine umfangreiche Literatur über Verfahren, die entwickelt wurden, um ein reproduzierbares Anfärben von Blutzellen zu ermöglichen. Viele wesentliche Zusätze sind normalerweise nicht stabil und zersetzen sich schnell, so daß die Zellenidentifizierung schwierig und manchmal unzuverlässig ist. Dr. Thomas E. Necheles hat in bezug auf die Leukozyten-Analyse festgestellt, daß dieses "System sich in 50 Jahren wenig

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oder gar nicht geändert hat".

Das Anfärben mit Farbstoff stellt jedoch ein Mittel zur Unterscheidung sonst nicht unterscheidbarer Details durch übertragung einer Farbreaktion auf die Zellen und deren anfärbbare Teile dar, und zwar metabolisch, funktionell oder pathologisch=

In den Krankenhäusern der USA begann die Leukozyten-Zählung in den frühen 1900er Jahren, wobei die Zählung als Anhaltspunkt dafür dient/ ob beispielsweise eine Notoperation notwendig ist oder nicht. Allein in den USA werden täglich mehr als eine halbe Million Differential-Zählungen durchgeführt, die meisten nach manuellen Verfahren.

Es ist wichtig, daß die Gesamtzählung der weißen Zellen und die Differential-Zellenzählung ohne Verzögerungen durchgeführt und mitgeteilt wird. Die Zeitdauer ist von wesentlicher Bedeutung, so daß ein Bedürfnis besteht, die erforderliche Analyse schneller vorliegen zu haben.

Durch die Bedeutung der Leukozyten-Zählung, die sich etabliert hatte, entwickelte sich der Wunsch nach einer schnellen Blutanalyse, so daß die etwa zu Beginn der 1950er Jahre durch Arbeiten von Mellors und Papanicolaou

(1952) eingeleitete Entwicklung automatischer Differential-Leukozyten-Zähleinrichtungen 1980 zu einer Vielzahl von Geräten führte» Die "CYDAK"-Anlage wurde frühzeitig dazu benutzt, um die Ausführbarkeit der Blutzellenklassifizierung zu untersuchen, die die Bedeutung von spezialisierten Anfärbeverfahren aufzeigte , wodurch die Merkmale der optischen Intensitatshistogramme jedem Zellenbild entnommen wurden. Durch das Verfahren wurde festgestellt, daß die Zellen in vier oder fünf Klassen von Leukozyten aufgeteilt werden können,, nämlich Neutrophile, Eosinophi-Ie, Lymphozyten und Monozyten. Young veröffentlichte Ergebnisse (1969) über eine automatische Klassifizierung vonfünf Klassen von Zellen und Bacus dehnte die Differenzierung 1971 aus.

Es ist jedoch darauf hinzuweisen, daß die automatischen Differentialsysteme gegenwärtig auf einem Vielfarbstoffeinsatz beruhen, sowie auf Farbstoff-Abbausystemen oder indirekten Fluoreszenz-Maßnahmen unter Verwendung von fluoreszierenden Farbstoffen.

Bei dem Anfärben von Blut nach dem Stand der Technik ist festzustellen, daß es die Praxis ist, einen oder mehrere Farbstoffe in Kombination zu verwenden (Romanowski-Giemsa- und Wright-Anfärbungen). Bei diesen Methoden ist es in der Praxis schwierig, eine Qualitätskontrolle vorzusehen. Diese Methoden erfordern eine Standardisierung bei der Herstellung jedes Farbstoffbestandteils wowie bei dem Verfahren der Probeanfärbung. Bei der Entwicklung von brauchbaren automatischen Leukozyten-Zählern ist die Reproduzierbarkeit der Anfärbung sogar noch wichtiger für die kontrollierbare Analyse.

Es wird berichtet, daß das "LARC"-Anfärbemittel (das in den kommerziellen automatischen Differential-Leukozyten-Zählern verwendet wird) ein Gemisch von etwa 10 Thiazin-

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farbstoffen, Eosin Y und 2,4,5 -Tribromfluoreszein ist (Mogler 1973) (P.N. Marshall). Die gegenwärtigen Anfärbemittel liegen häufig in einer alkoholischen Lösung mit einem Fixiermittel vor, wobei zwei oder mehr Farbstoffe in Kombination eingesetzt werden. Eine genaue Analyse durch Vitalblutanfärbung ist sehr schwierig. Durch die Schwierigkeit, die sich durch eine kontrollierte Oxidation von Methylenblau ergibt, was bei den Romanowski-Farbstoffen beispielsweise wesentlich ist, werden die Schwierigkeiten einer Qualitätskontrolle von zehn einzelnen unterschiedlichen zugegebenen Farbstoffen, die in Kombination eingesetzt werden, sehr groß.

Es ist festgestellt worden, daß die weit verbreitete Standardisierung und die Verwendung einer beschränkten Anzahl von Farbstoffen eine größere Genauigkeit und Reproduzierbarkeit bei zytologischen Studien sicherstellen

würde. Wenn Fixiermittel verwendet werden, ist eine ernsthafte Beeinträchtigung durch Artefakte beobachtet worden, was Schwierigkeiten bei der Interpretation und Mißinterpretationen bei der Leukozyten-Differenzierung und -aufzählung verursacht. pH-Einstellungen und Schwermetallkationen sollen zytochemische Versuche daran hindern, in der erwarteten Weise zu arbeiten. Es wurde festgestellt, daß einige Farbstoffe, insbesondere Azofarbstoffe, eine nichtspezifische Ausfällung um die Zellen zeigen. Andere degenerative Veränderungen der fixierten Blutprobe sind Vakuole, Kleeblattbildung der Nuclei , Verzerrung der Zellenform sowie Verschmierung und Störung eines idealen Anfärbens. Die Bedeutung der Durchführung von Differentialzählungen an fast lebenden Zellen in der kürzest möglichen Zeit, um optimal brauchbare und verwertbare Blutzellen-Analysen zu erhalten, ist erkannt worden. Alkoholische Farbstofflösungen beeinträchtigen das supravitale Anfärben. Soweit bekannt/ zeigen frisch zubereitete wasserlösliche Anfärbemittel den geringsten denaturierenden Effekt auf das supravitale Blut bei der Untersuchung. Andere Farbstoffe sind für die Blutzellen mehr oder weniger toxisch, jedoch sind es einige mehr als andere. Es ist wesentlich, daß die Zellen bei der Untersuchung so lange wie möglich am Leben bleiben. Die Schnelligkeit ° des Anfärbens verkürzt offenbar die Einwirkungszeit, so daß die Möglichkeit größer ist, die Leukozyten zu untersuchen, bevor sie ihre Vitalität verloren haben. Es besteht ein Bedürfnis nach einer automatischen Differential-Leukozyten-Zählung innerhalb weniger Minuten. 30

Studien und ein überblick des Standes der Technik zur Durchführung von mikroskopischen Blutanalysen und Krankheitsdiagnosen haben gezeigt, daß es für den Pathologen

nicht unüblich ist, den Farbstoff und die Blutprobe auf 35

Körpertemperatur (37⁰C) vor dem Kontakt zu erwärmen.

Dr. Sabin hatte eine "Wärmebox", um eine Temperaturkontrolle sicherzustellen.

Es ist auch festgestellt worden, daß einige nach dem Stand der Technik verwendete Farbstoffe sehr temperaturempfindlich sind. In der Literatur wird berichtet/ daß Kresylecht-Violett kein brauchbares Anfärbemittel oberhalb 30⁰C ist. Es ist für den Zweck der hier beschriebenen Methode als wesentlich anzusehen, daß der Farbstoff in der Lage ist, Leukozyten bei einer Temperatur von 37°C anzufärben, wobei keine Schwierigkeiten bei den ausgewählten Farbstoffen bei Temperaturen bis etwa 40⁰C beobachtet werden.

In der DE-OS 31 09 252 wird eine verhältnismäßig kleine Zahl von Farbstoffen beschrieben, die sich zur Identifizierung einer oder mehrerer Leukozyten-Arten eignen. ¹^ Die Identifizierung und Differenzierung bezieht sich speziell auf polymorphkernige Leukozyten (neutrophi-Ie), basophile Leukozyten, Lymphozyten allgemein und Monozyten. Eine zu beobachtende Gemeinsamkeit bestand darin, daß die Farbstoffe, die sich für die Zwecke der äl- ^ teren Anmeldung als geeignet erwiesen, eine andere metachromatische Färbung erzeugten als die anderen der vorstehend angegebenen Gruppe.

Die ungewöhnlichen Eigenschaften des Farbstoffs-Basischorange Nr. 21 (CI #48035 und Spektralkurve 7) wurden bei Eosinophilen und Basophilen sowie bei Monozyten festgestellt, jedoch wurden B-Zellen ursprünglich übersehen, da sie in geringer Zahl vorliegen. Nach der DE-OS 31 09 252 wurde ursprünglich die Beobachtung gemacht,

daß die optische Differenzierung zwischen ausgereiften

und unausgereiften Neutrophilen dadurch möglich erscheint, daß die ausgereiften Körnchen (oder Granula) sich im Farbton von den unausgereiften Körnchen unterschieden, die vergleichsweise stark rot und orange waren. 35

Da diese Gruppe, die Myeloblasten, Promyelozyten, Myelozyten, Metamyelozyten und Bänder einschließt , nicht immer in sämtlichen Blutproben oder in einer merklichen Anzahl vorhanden ist, wie dies häufig bei T-Lymphozyten

(oder T-Zellen) und B-Lymphozyten (oder B-Zellen) der Fall ist, wurden sie nicht aufgrund einer metachromatischen und differenzierten Anfärbung durch Basischorgange Nr. 21 spezifisch identifiziert.

Im Nachgang zu den Arbeiten, die die Grundlage der DE-OS 31 09 252 bilden, zeigte die weitere Forschung in bezug auf den Einsatz dieses einzigartigen Farbstoffs bei Untersuchungen ähnlicher Blutspender, daß es bei Verwendung dieses ausgewählten basischen kationischen Farbstoffs der Methin-, Polymethin- und Chinolin-Klasse in reproduzierbarer Weise möglich war, durch metachromatische Reaktion bestimmte Lymphozyten zu unterscheiden. Es ist weiterhin möglich, wenigstens zehn erkannte Granulozyten und LymphozytenzeIlen zu identifizieren, die nach den Kenntnissen der medizinischen Wissenschaft von lebenswichtiger Bedeutung sind.

Da diese Differenzierung außerdem sofort erfolgt, braucht keine verwickelte Biochemie oder eine langwierige Vorbehandlung der Blutproben zu erfolgen. Darüber hinaus wurde festgestellt, daß der Farbstoff eine minimale Toxizität aufweist.

Es wurden mikrosspektrofotometrische Messungen mit einer Blende durchgeführt, die klein genug war, um die Farbe der Körnchen der supravital angefärbten granulozytischen Zellen der Leukozyten zu messen. Da keine anderen Teile der Zelle die Messung irgendwie beeinträchtigen, wurde

^ou festgestellt, daß Extinktionskoeffizienten der Farben der verschiedenen Leukozyten-Arten auftraten, die sich beträchtlich unterschieden und oftmals Unterschiede in der Färbung, dem Wert oder dem Farbton von etwa 50 nm aufwiesen. Diese stellen erkennbare Maxima, die mit vielen Zellen übereinstimmen, dar. Es ist darauf hinzuweiweisen, daß Unterschiede von etwa 5 nm mit mikrospektrofotometrischen Messungen erkennbar sind, wenn diese Unterschiede übereinstimmen und reproduzierbar sind.

Zu den unausgereiften Granulozyten-Zellen , die sofort identifiziert und voneinander unterschieden werden können, gehören Myeloblasten und Zellen der Myeloidreihe, nämlich Promyelozyten, Myelozyten und Metamyelozyten. Es wird allgemein angenommen, daß dieselben die Vorläufer der polymorphkernigen Leukozyten oder neutrophilen Zellen sind, die gleichfalls metachromatisch angefärbt werden, so daß sie bei den supravitalen Blutanalysen, die durch die hier beschriebenen Fortschritte möglich gemacht worden sind, schnell und leicht unterschieden, identifiziert und aufgezählt werden.

Wie in der DE-OS 31 09 252 beschrieben ist, ist es ferner zweckmäßig, gleichzeitig Neutrophile, Eosinophile und Basophile, Lymphozyten und Monozyten voneinander und von den vorstehenden Vorläufern zu unterscheiden, falls sie alle in einer bestimmten Blutprobe bei mikrospektrofotometrisehen Analysen vorliegen sollten.

Darüber hinaus wurde festgestellt, daß dieser einzigartige Farbstoff zu einem optisch unterschiedlichen Farbmuster führt, ferner zu einer unterschiedlichen Dichte der Farbe jeder Granula in der Lymphozyten-Gruppe. Durch diese Eigenschaft der Leukozyten-Zelle kann also eine einzigartige Trennung durch optische Differenzierung von anderen unausgereiften vorstehend genannten Zellen erfolgen. Die Differenzierung der Farbe, der Farbanordnung und der Farbdichte treten darüber hinaus in einer solchen Größenordnung auf, daß beide menschlichen Zählungen aller oben einzeln genannten Zellen manuell durchgeführt werden können, und zwar sowohl mit einem Spektrum weißen Lichts (Adsorption) wie durch Fluoreszenz (Emission). Energiequellen für die Fluoreszenzemission sind beispielsweise Quecksilber-Dampflampen, Wolfram-Halogen-Quellen, Laser, Deuterium-Quellen, Xenon usw.

Auch hat es den Anschein, daß auf dieser Grundlage « ι .«· automatische Differentialzähleinrichtung sich ent-

wickeln läßt/ was durch die Unterschiede aufgrund der Gegenwart oder Abwesenheit der Farbe und der physikalischen Muster, die in dem Nucleus vorliegen und durch die relative Anzahl, Größe, Anordnung oder Muster sowie den Farbton, den Wert und die Färbung und die Farbdichte aufgrund der Anzahl der Körnchen in dem Zytoplasma erleichtert wird. Die Qualität der Farben bei Einwirkung bimodalen Lichts führt zu einer doppelten Nachprüfung der Beobachtung und zu einer Möglichkeit der Fest-. Stellung von Unterschieden der Zellstruktur.

FaIt unglaublich , wie jedoch durch die bisherige Grundlagenforschung demonstriert wurde, ist ferner die Möglichkeit, B-Lymphozyten oder B-Zellen von T-Lymphozyten oder T-Zellen zu unterscheiden. Es ist wiederum möglich, jede dieser wichtigen Lymphozyten spiegelbildlich qualitativ und quantitativ durch Verwendung des gleichen Farbstoffs mit der gleichen supravitalen, fixiermittelfreien Analyse zu identifizieren, sowie unausgereifte und ausgereifte Zellen , einschließlich Bänder zu unterscheiden und zu zählen. T-Lymphozyten sind im Lymphknotengewebe und in anderen Geweben, die mit dem Metabolismus weißer Blutzellen zusammenhängen, durch die Fluoreszenz-Beobachtungsvariante

beobachtet und identifiziert worden. 25

Die früher erfolgte Feststellung der Möglichkeit von Basischorange Nr. 21 zusätzlich zu den Zellen, die in der DE-OS 31 09 252 beschrieben sind, Myeloblasten und Blutzellen der myeloiden Serie sowie Bänder und T-Lymphozyten und B-Lymphozyten zu differenzieren, erweitert das ursprüngliche Anwendungsgebiet des Farbstoffs in unerwarteter Weise über die Möglichkeit hinaus, die aus der DE-OS 31 09 252 hervorgeht. Supravitale Blutprobenfraktionen von Flüssigkeiten,'die mit gesundem Gewebe oder vermutlich anormalem Gewebe in Verbindung stehen, wie Plasma, Lymphe, Serum usw., die eine oder mehrere der vorstehenden Zellen enthalten, können nach der metachromatischen Anfärbung mikroskopisch untersucht werden,

um jede vorstehend angegebene Zellenart zu differenzieren und dadurch Zählungen und Vergleichsuntersuchungen durchführen zu können.

Der heutige Stand der Technik in Verbindung mit dem Gegenstand der DE-OS 31 09 252 führt zu einem bisher nicht dagewesenen Fortschritt in der Hämatologie, Zytologie und Immunologie sowie zu der Möglichkeit, auf einem unbegrenzten medizinischen Gebiet Untersuchungen zu planen und durchzuführen. Hinsichtlich des Bedarfs nach teuren Reagenzien, wertvoller Forschungszeit und genaueren Dateneinrichtungen ist dadurch eine spürbare Verbesserung eingetreten.

Die Diagnose der Krankheiten hat einen neuen Horizont jenseits der gegenwärtigen Grenzen erreicht durch das Auffinden der Fluoreszenz-Reaktionen unter Verwendung einer begrenzten Zahl von Vertretern der basischen quartsrnärer kationischen chemischen Klassen, die die einzigartigen Farbstoffe dieser Offenbarung bilden.

Die ursprünglichen Untersuchungen, die in der DE-OS 31 09 252 beschrieben sind, wobei ein Zeiss-Fluoreszenz-Mikroskop verwendet wurde, zeigten, daß Carbocyanin ^ K5, ein Farbstoff der Methin-Polymethin-Klasse, sowohl bei der Absorption von weißem Licht wie bei emittierter Fluoreszenz metachromatisch ist. Eine spätere Untersuchung einer großen Gruppe von Farbstoffen innerhalb der vorstehend genannten chromophoren Klassifikation

einschließlich roter und violetter (nachstehend angegeben) und Basischorange Nr. 21, ergab , daß alle Monozyten supravital anfärben und dabei diese dual-metachromatische oder bimodale Lichtreaktion unter dem Zeiss-Fluoreszenz-Mikroskop zeigten.

In dem die Beobachtung weiterverfolgt wurde, daß Basischorange Nr. 21 nicht nur im weißen Lichtspektrum eine Metachromasie zeigt, sondern auch unter Fluoreszen-

Bedingungen, wurden die Forschungen weitergeführt, wobei sich herausgestellte, daß Basischorange Nr. 21 beim Einsatz von Fluoreszenz-Lichtquellen verwendbar ist, indem es im wesentlichen die gleichen Muster der Zellengeometrie und -anordnung in den gleichen Zellen hervorbringt, wie sie in der DE-OS 32 08 629 beschrieben sind. Die Fluoreszenzfarben zeigten jedoch nicht die gleiche Farbreaktion wie mit weißen Lichtquellen, obgleich die geometrischen Muster vollständig korrelierten. Parallel-Untersuchungen des gleichen präparierten Objektträgers zeigten bei einer großen Zahl von Fällen sowohl von normalen Leukozyten wie von jenen von Patienten mit verschiedenen Stadien krankhafter Zustände sowohl bei normalen weißen Lichtwellenlängen, wie nach der DE-OS 31 09 252 , wie mit Fluoreszenzlicht, wie hier beschrieben, eine bemerkenswerte Demonstration wiederholter Leukozyten-Identifikationen und -Bestätigungen sowohl bei weißen Lichtwellenlangen wie mit Fluoreszenz-Lichtwellenlängen, jedoch mit identifizierenden Farben der beiden unterschiedlichen bimodalen Beobachtungsarten im Farbton , in der Wertigkeit und der Farbreinheit sowie der variierenden sichtbaren Lichtintensität.

Untersuchungen, die unter Verwendung von Methin- und Polymethin-Farbstoffarten zur Leukozyten-Zellidentifikation fortgesetzt wurden, bestätigten ungewöhnliche Eigenschaften gewisser Farbstoffe dieser Klasse, insbesondere Basischorange Nr. 21, Basischrot Nr. 13, Basischrot Nr. 36, Basischrot Nr. 49, Basischviolett

Nr. 7, 15, 16, 36, 39 und 40. Alle diese genannten Farbstoffe erwiesen sich als metachromatisch bei weißen Lichtwellenlängen und bei der Fluoreszenz-Emission, wobei sie alle Monozyten charakteristisch und mit den hier beschriebenen bimodalen Maßnahmen metachromatisch sofort anfärbten. Weitere Versuche ergaben, daß sämtliche der vorstehend genannten Farbstoffe recht ungewöhnlich darin sind, daß sie auch metachromatisch sind in Verbindung mit bestimmten biologischen Einheiten bei

Fluoreszenzlicht und auch eine metachromatische Fluoreszenz zeigen, wenn sie supravital zum Anfärben von Monozyten verwendet werden.

Bei einer weltweiten Suche wurden insgesamt etwa 2000 Farbstoffproben ausfindig gemacht/ mit denen Versuche durchgeführt wurden. Viele dieser Farbstoffe sind von den bekannten Farbstoffbezugsquellen nicht mehr erhältlich.

Genauere Untersuchungen zeigten, daß von den vorstehend angegebenen Farbstoffen Basischorange Nr. 21 sich einzigartig verhält. Basischorange Nr. 21 ist der einzige Farbstoff , der gegenwärtig bekannt ist/ daß er eine bimodale Funktion zur Identifikationen aller nachstehend genannten biologischen Blutzellen zeigt. Diese einzigartigen Farbstoff unktionen sowohl im weißen Lichtspektrum wie im angeregten Fluoreszenz-Lichtspektrum führen zu einer metachromatisch unterschiedlichen Identifikation des einzelnen erfolgenden Leukozyten, einschließlich der EntwicklungsStadien der neutrophilen, granulozytischen Zellen. Durch eine schnelle supravitale Anfärbung mit wässrigen Lösungen von Basischorange Nr. 21 kann eine optische Differenzierung, Identifizierung und Zählung mittels des Fluoreszenz-Lichtspektrums jedes der folgenden Zellen erfolgen, d.h. mit einem einzigen präparierten mikroskopischen Feld und mit stereooptischen manuellen oder Reihen- oder Simultan-Untersuchungseinrichtungen im weißen Lichtspektrum oder mittels des angeregten Fluoreszenz-Spektrums. Es werden ^Q zwei verschiedene, jedoch charakteristisch unterschiedliche Farbmuster erhalten, wobei jede gegenüber der anderen überprüft werden kann, um die Identifikation der Neutrophilen, Eosinophilen, Basophilen, Monozyten, Lymphozyten, Promyelyozyten, Meylozyten, Metameylozyten, Bänder und B-Zellen sowie T-Zellen zu bestätigen. Die Zeit hat es nicht erlaubt, umfangreiche Untersuchungen über mögliche Grenzen weiterentwickelter computerbetriebener hochtechnologischer Einrichtungen durchzu-

führen, die durch gleichzeitiges Ablesen der biokularen Abtastung sowohl weiße Licht- wie Fluoreszenz-Lichtprojektionen möglichst von einem einzigen Probenfeld wiedergeben.
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Es sind optische Einrichtungen bekannt, die sowohl bimodali Simultan- wie Reihenanalyse mit einem Gerät ermöglichen, das für die gleichzeitige Messung der Absorption und der Fluoreszenz geeignet ist. (Vgl.

Seite 144, J. Membran Biologie 33, 141 bis 183, 1977, Springer Verlag, New York Inc. 1977). Es ist deshalb nicht unbekannt, eine angefärbte biologische Probe unter Einwirkung einer bimodalen Lichtquelle zu untersuchen.

Es ist weiterhin festzuhalten, daß die Fluoreszenz allein häufig eine einfachere, schnellere und vielseitigere Lichtquelle ist, um die mikroskopische Differenzierung auszulösen, es jedoch auch bekannt ist, daß diese Licht-²^ quelle zu Komplikationen bei der Kalibrierung und der Genauigkeit aufgrund der Artifakt-Verwundbarkeit führt. Dadurch, daß die nacheinander erfolgende Anwendung sowohl von weißer Lichtwellenlänge wie von Fluoreszenz-Lichtwellenlänge bei der vergleichenden Betrachtung einer einzigen biologischen Untersuchungsprobe , die mit einem Farbstoff angefärbt ist, der nicht nur im weißen Lichtspektrum metachromatisch , sondern auch im Fluoreszenz-Lichtspektrum metachromatisch ist, ermöglicht wird, wird jedoch die Beobachtung sowohl von bestehenden Ähnlich-

keiten wie Unterschieden der Eigenschaften bekannter Komponenten von Leukozyten, wie deren Nuclei, primäre Körnchen, sekundäre Körnchen usw. möglich. Es sind einzigartige Aspekte der Zählstruktur der Eosinophilen

beobachtet worden, die zu deren Differenzierung, Identi-35

fizierung und Zählung beitragen.

Die Körnchen der Eosinophilen zeigen spezifisch eine starke Fluoreszenz ausschließlich an der Peripherie der

Körnchen in Form eines 'Schalen -" oder "Muschel"- Musters. ■ Soweit festgestellt worden ist, werden durch dieses Grenzoder periphere Fluoreszenz-Muster oder Schaleninuster Eosinophile einzigartig identifiziert. Eine derartige struktuelle Indizierung einer Blutzelle ist bisher, soweit bekannt, nicht beschrieben worden. Diese Möglichkeit liegt nahe, daß weiße Blutzellen und verwandte Gewebe bei weiteren Vergleichsuntersuchungen sowohl im Fluoreszenzwie im weißen Lichtspektrum auffindbar sein werden, die weitere Bestimmungswege aufzeigen und neue Untersuchungen durch eine neue beobachtete sichtbare strukturelle Differenzierung in Gang setzen, deren Existenz bisher noch garnicht angenommen worden ist.

Ein weiteres Beispiel für die vielversprechenden Aussichten ist eine bemerkenswerte Unterscheidung des Ausmaßes der Intensität der nuklearen Fluoreszenz der verschiedenen T-Zellen (T-Lymphozyten). Es ist vorhersehbar, daß diese beobachteten Unterschiede der Fluoreszenz-Lichtemission Aufschluß geben über die Identifikation von T-Zellen und der Einheiten, beispielsweise von Unterdrücker- und Mörderzellen. Obgleich erkannt worden ist, daß ein signifikanter beobachtbarer Unterschied zwischen T-Zellen bei bimodaler Lichtbeleuchtung besteht, wird die Bedeutung dieser festgestellten Unterschiede gegenwärtig nicht verstanden.

Das gegenwärtige vitale Interesse von Immununtersuchungen legt es nahe, auf das praktische Interesse und die An^ow wendung der bimodalen Untersuchungen, die mit den hier beschriebenen supravitalen analytischen Methoden möglich sind, abzustellen. Beobachtungen der Leukozyten und deren Entwicklungsstadien und die Erfassung biochemischer und biophysikalischer struktureller Unterschiede durch bimodale Lichtbeobachtung wird zu einem tieferen Verständnis von deren ordnungsgemäßen Zustand sowie von Krankheitsstörungen führen.

Eine Untersuchung der chemischen Struktur von Basischorange Nr. 21 und Basischorange Nr. 22 wurde durchgeführt, wobei festgestellt wurde, daß das erstere das ungewöhnlichste und das zweite für die hier beschriebenen Zwecke unbrauchbar war.

Die einzigen Unterschiede, die zu beobachten sind, bestehen darin, daß das Indolyl-Radikal jedes Basischorange sich nur durch einen Wechsel der Methylgruppe von der Zweiposition im Basischorange Nr. 21 in die Einsposition im Basischorange Nr. 22 unterscheidet. Die Methylgruppe ist in Basischorange Nr. 21 mit einem Kohlenstoffatom verbunden, und in Basischorange Nr. 22 mit einer Stickstoffgruppe. In Basischorange Nr. 22 weist die Zweiposition eine Phenylgruppe anstelle der Methylgruppe in der Zweiposition des Basischorange Nr. 21 auf.

Nach dem Stand der Technik ist es bei supravitalen Analysen nicht unüblich, daß der Einsatz von drei Farbstoffkonzentrationen bei drei Präparationen von Objektträgern in derartigen Analysen erforderlich ist/ um die Ergebnisse zu überprüfen. Mit Basischorange Nr. 21 sind die Farbunterschiede derart deutlich und die Farben derart außergewöhnlich kräftig, muß man mit einem Farbstoff und einem Objektträger primäre von sekundären Körnchen sofort leicht unterscheiden kann.

Die vorliegende Erfindung stellt einen Fortschritt - auf zytologischem Gebiet dar, da sie einen einzigen basischen guaternären kationischen organischen Farbstoff der Methin- und Polymethinreihe angibt, der selektiv metachromatisch durch einen oder mehrere periphere Blutzellen-Leukozyten absorbiert wird, wodurch eine ungewöhnliche Verbesserung der Identifikation und Differenzierung zwischen unausgereiften und ausgereiften Teilen verschiedener Arten der Myeloidreihen und der ausgereiften weißen Blutzellen erreicht wird. Bisher mußten zytochemische Maßnahmen und

komplexe Färbemittel zur Differenzierung der Blutzellen verwendet werden, die häufig eine Stunde und mehr an mühsamen Präparationen erforderten, um eine einzige Art bekannter Leukozyten durch mikroskopische Analyse zu differenzieren und zu zählen.

Es ist nunmehr möglich, differenziert anzufärben und mit einem einzigen reinen Farbstoff (mit dem andere bei bestimmten Untersuchungen kombiniert sein können) durch einen einfachen wässrigen Kontakt mit einer peripheren venösen Blutprobe oder Fraktion derselben, einschließlich leukozytenreicher Proben, jede der folgenden Arten oder Typen von Zellvorstufen, weißen Blutzellen, Plättchen usw. genau und leicht zu identifizieren. Diese Arten umfassen Myeloblasten, Promyelozyten, Myelozyten, Metamyelozyten, Bänder("bands" oder stabkernige Neutrophile^, Eosinophile und Basophile, B-Lymphozyten, T-Lymphozyten und Monozyten. Blutplättchen können gleichfalls identifiziert und gezählt werden, ihre Körnchen zeigen jedoch Metachromasie.

Jede der vorstehenden Leukozyten-Arten wird, wenn sie nach der Behandlung mit Basischorange Nr. 21 einer supravitalen Analyse unterzogen werden, sowohl im weißen wie im Fluoreszenz-Lichtspektrum durch eine ungewöhnliche metachromatische Reaktion der Zellen gegenüber dem Farbstoff und der Lichtquelle, der das präparierte Feld ausgesetzt ist, differenziert.

Mit den bimodalen Lichtquellen kann bei jeder Qualität der verwendeten Lichtquelle jede einzeln genannte Art von ihren Nachbarn unterschieden werden, wobei jede Art gezählt wird , die gesamte Zahl der vorhandenen Arten bestimmt wird, jede Art hinsichtich ihrer Morphologie untersucht werden kann und viele Bestimmungen gemacht werden können, die von großem medizinischem Wert sind.

Grundsätzlich absorbiert jede der genannten weißen Blut-

zellen oder Leukozyten differentiell Licht von dem gleichen reinen metachromatischen Farbstoff, in Abhängigkeit von der Qualität des Farbstoffs, der Art des Leukozyten und der Farbstoffrezeption der Bestandteile der spezifisehen, in der analysierten Probenfraktion vorhandenen Zellen.

Wenn keineFixiermittel vorhanden sind, wird der erfin dungsgemäße basische Farbstoff metachromatisch absorbiert, so daß jede einzelne Klasse, Art oder Spezies von Leukozyten, Lymphozyten oder Granulozyten ein charakteristisches Lichtspektrum oder eine Farbe reflektiert, die von jeder anderen in der Probe vorhandenen Klasse, Art oder Spezies von Blasten, Myeloidzellen, Leukozyten oder Granulozyten sich unterscheidet. Die auffallend starke Metachromasie des einzigen erfindungsgemäßen orangen Farbstoffs ist, soweit bekannt,einzigartig und bemerkenswert. Jede Spezies der Reihen, die Myeloblasten, Promyelozyten, Myelozyten, Metamyelozyten, Bänder, neutrophile, eosinophile und basophile Zellen, B-Lymphozyten, T-Lymphozyten und Monozyten umfaßt, absorbiert auf diese Weise eine einzelne metachromatische Farbe, so daß ein unterschiedliches Lichtspektrum oder eine unterschiedliche Farbe im Bereich des sichtbaren Lichts reflektiert wird, oder eine Farbe, wenn.sie Licht im Fluoreszenz-Bereich ausgesetzt sind. Kombinationen des erfindungsgemäßen Farbstoffes mit anderen Farbstoffen der gleichen chemischen Klasse/ die ein ähnliches metachromatisches Verhalten zeigen bei

bimodalen Lichtquellen₇sind nicht ausgeschlossen. 30

Diese Erfindung stellt eine Weiterbildung der älteren Patentanmeldung P 31 09 252.7 dar, die auf der Erkenntnis beruht, daß mit einer Gruppe einzigartiger metachromatischer Farbstoffe, die einzeln, jedoch häufig in Kombination verwendet werden, fünf Spezies von weißen Blutzellen, nämlich Neutrophile, Eosinophile und Basophile, Lymphozyten und Monozyten voneinander, wenn sie in menschlichen Blutproben vorliegen, identifizierbar und unterscheidbar

sind. Sie stellt ferner eine Weiterbildung der älteren Patentanmeldung P 32 08 629.6 dar.

Die Erfindung stellt eine Weiterentwicklung der Erkenntnis dar, daß der Farbstoff, der als Basischorange Nr» 21 bekannt ist, wenn er allein in einem wässrigen Medium bei Anwendung der supravitalen Blutanalysentechnik einer fixiermittelfreien Probe oder Fraktion eingesetzt wird, die Fähigkeit besitzt, in ungewöhnlicher und unterscheidbarer metachromatischer Weise die bisher identifizierten Reihen von menschlichen Blutzellen und -plättchen anzufärben, und zwar bei Fluoreszenzlicht.

Die Idenfikation dieser einzelnen Spezien gegenüber ¹^ einander mit Fluoreszenzlicht gibt ein : bemerkenswertes Ausmaß der Differenzierung wieder.

Die Identifizierung von Basischorange Nr. 21 erfolgt durch die "Colour Index"-Zahl 48035 , ferner durch die chemische Struktur sowie die Spektralkurven, die in den älteren Anmeldungen und in öffentlichen Druckschriften angegeben sind.

' Ohne daß dies theoretisch bindend sein soll, ist es bekannt, daß fast alle fremden Zusätze die Tendenz besitzen, proteinhaltige Materialien zu denaturieren. Bisher war die Verwendung von Fixiermitteln bei der Präparierung der Blutproben zur Anfärbung die weltweite Praxis. Die Erfahrung hat gezeigt, daß das Fixieren die Wechselwirkung

zwischen der Metachromasie der Zellen und der metachromatischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Farbstoffe stört. Störende Artefakte werden dadurch auf diesem Gebiet über den einfachen Umweg der Verwendung einer supravitalen, fixiermittelfreien Probe beim Einsatz der supra-35

vitalen Technik gleichfalls vermieden.

Bei der Durchführung der Erfindung erfolgt das Anfärben ausreichend schnell, so daß bei normaler Bluttemperatur

(37°C) der Zytologe nicht zu warten braucht oder sich auf die feinere Zytochemie zurückziehen muß, bevor die Farbentwicklung der Zellen erfolgt, wobei die spektrale Differenzierung der aufgezählten Mitglieder der Familie der Leukozyten, Lymphozyten und Granulozytenzellen durchgeführt werden kann, bevor die mikroskopischen Untersuchungen entweder manuell oder mittels automatischer Differential-Leükozyten-Zähleinrichtungen beginnen.

Es können folgende Arten fixiermittelfreier Blutproben verwendet werden:

1. Antikoaguliertes (EDTA, Citrat, Heparin) Gesatmtblut,

2. Suspensionen von Leukozyten, die mittels Dextran und/ ¹^ oder Schwerkraftsedimentierung des antikoagulierten Gesamtblutes erhalten worden sind,

3. Proben des Gesamtblutes, das mit einer hypotonischen Lösung behandelt worden ist, um eine Auflösung der roten Blutzellen zu bewirken, wobei primär weiße Blut-

^u zellen und -plättchen zurückbleiben,

4. Proben anderer Körperflüssigkeiten, wie Rückenmarkflüssigkeit oder Rippenfellflüssigkeit oder Bauchwasserflüssigkeit sowie Proben vereinigter Flüssigkeiten, sofern die weißen Blutzellen von Interesse

' sind.

Obgleich die Erfindung nicht spezifisch auf eine automatische Differential-Leukozyten-Zähleinrichtung abgestellt ist, sind derartige Einrichtungen einer genauen überprüfung unterzogen worden.

Das Kolleg der amerikanischen pathologischen Konferenz in Aspen, Colorado, August 1975 hat eine Reihe von Druckschriften veröffentlicht, die zu dieser Zeit in Form ei-35

ner Sammlung herausgegeben worden ist, die den Titel "Differential-Leukozyten-Zählung" trägt. Diese Berichte geben Auskunft über die Entwicklung und den Stand der Technik auf dem Gebiet der automatischen Differential-Blut-

zellen-Zählcomputer. Auch ist auf die US-PS 3 916 205 sowie die US-PS 4 146 604 (Kleinerman) hinzuweisen, wonach bestimmte fluoreszierende Farbstoffe in bestimmten Kombinationen zur automatischen Differenzierung bestimmter Leukozyten und anderen Blutzellen aufgrund des Anpsrechens des fluoreszierenden Lichts verwendet werden. Diese Li teraturstellen sind hinsichtlich des Gegenstandes und der Aufgabe der vorliegenden Erfindung relevant. Es ist ferner darauf hinzuweisen, daß Kleinerman nicht von der bei der mikroskopischen Untersuchung der Leukozyten üblichen Fixierung der Zellen abgeht. Nach dem Stand der Technik werden verschiedene Grade der Diskriminierung in dem Verhalten bei der Leukozyten-Differentialzählung getroffen. Grundlegend oder primär ist die Differenzierung zwischen polymorphkernigen Zellen und mononuklearen Zellen. Dazwischen liegt die Differenzierung der polymorphen in neutrophile, eosinophile und basophile Zellen sowie die Trennung der mononuklearen Zellen in Monozyten und Lymphozyten, was im Prinzip als möglich bezeichnet wird. 20

Der anscheinend dritte Schwierigkeitsgrad, der die Unterscheidung der neutrophilen Zellen in reife und unreife Formen sowie die Trennung der Lymphozyten in normale und reaktive Arten umfaßt, wurde ursprünglich erkannt und in der älteren Anmeldung P 31 09 252.7 erwähnt. Soweit be -

kannt, stellt die Erfindung die einzige Methode dar, um auf einfache Weise mit einem einzigen reinen Farbstoff die Blasten, die myeloide Reihe, Bänder, polymorphkernige Leukozyten (neutrophile), eosinophile und basophile Zellen, SQ B-Zellen und T-Zellen sowie Monozyten und Plättchen mit einem einzigen Farbstoff in einer einzigen Probenfraktion zu unterscheiden.

Der gegenwärtige Stand der Technik bei automatischen Differential-Leukozyten-Zählern befindet sich deutlich in einem Entwicklungsstadium, das die Verwendung von weißem Licht und einem einfachen wässrigen Farbstoff angeht. Manuelle Differentialzählungen mit vorstehend beschrie-

benen Schwierigkeiten scheinen die zu sein, auf die man sich hauptsächlich verläßt. Die automatischen Differentialzähler werden in zwei Hauptklassen oder -gruppen eingeteilt: 1. Bildererkennungssysteme und 2. zytochemische Differenzierungssysteme. Es ist darauf hinzuweisen, daß nach dem Stand der Technik Anfärbemethoden mit mehr oder weniger großem Erfolg angewendet werden, wobei die Bedienungsperson des Geräts den Betrieb Zelle für Zelle überwachen kann.

Obgleich sie genau sind, müssen für die gegenwärtigen zyt'ochemischen Sy§teme noch zufriedenstellende Kalibra tor en entwickelt werden, desgleichen erfordern sie hochqualifizierte Bedienungspersonen. Es ist deshalb vorteilhaft, in der Lage zu sein, ein einziges mikroskopisches Feld mit einer bimodalen Lichtkontrolle zu beachten .

Bei einer kurzen Übersicht über die Fluoreszenzfarben und Fluoreszenz-Lichtquellen-Methoden nach dem Stand der Technik sind folgende Punkte festzuhalten. 1. Es sind wenigstens zwei Lichtquellen wesentlich, einschließlich violettem und ultraviolettem Licht; 2. eine dritte Lichtquelle wird offenbar auch benötigt. 3. Das System er- . fordert eine Vielzahl von Flooreszenz-Farbstoffe, um die Leukozyten-Arten zu identifizieren und zu differenzieren. 4. Das System erfordert alkoholfixierte Blutabstriche. 5. Die erforderliche Anfärbezeit liegt in der Größenordnung von 10 Minuten, wobei ein Abspülen von 1 Mi-

nute, das von einem Trocknen gefolgt ist, erforderlich ist. 6. Es scheint eine Abnahme der Fluoreszenz zu geben in der Reihenfolge von a) eosinophilen zu b) neutrophilen Zellen und zu c) Monozyten zu d) Lymphozyten. (Die Identifizierung der basophilen Zellen wird nicht beschrieben.) 7. In einem Strömungsrohrsystem werden die Blutzellen mit Formaldehyd fixiert und mit drei verschiedenen Farbstoffen angefärbt. 8. Die festgestellten Leukozyten-Fluoreszenzen werden differentialgezählt. 9. In einem

Patent wird die Identifizierung von lediglich vier der fünf Leukozyten-Arten beschrieben. 10. Es werden drei Fluoreszenz-Farbstoffe genannt, die kombiniert werden müssen, um eine "einzige" Farbstoffzusammensetzung zu ergeben, welche Kombination von Farbstoffen für die Arbeitsweise ' oder das Verfahren wesentlich ist, also nicht lediglich vorteilhaft zu sein scheint.

Nach der älteren Anmeldung P 31 09 252.7 wird normales weißes Licht zur Beleuchtung des mikroskopischen Feldes verwendet, das eine elektromagnetische Strahlungsenergieform darstellt, das die Eigenschaft besitzt, im Wellenlängenbereich von etwa 400 bis etwa 770 nm sichtbar zu sein. Nach der älteren Anmeldung wird der ausgewählte Teil des Spektrums des sichtbaren Lichts , das durch das Farbstoff- Leukozyten-Medium des Feldes hindurchtritt absorbiert. Die Bezeichnung "Fluoreszenz" ist im Zusammenhang mit dem Emissionsvermögen zu verstehen. Es wird angenommen, daß die Fluoreszenz durch die Emission elektromagnetischer Strahlung, die die angefärbten Leukozyten selektiv imittieren, hervorgerufen wird, wobei die Emission aufhören, wenn die Energiezufuhr aufhört. Die bisherige Erfahrung hat gezeigt,- daß die Quelle der elektromagnetischen Energie, die zu metachromatischen Emissionen und zur Differenzierung der mit Basischorange Nr. 21 angefärbten Leukozyten-Zellen führt, wie sie hier beschrieben wird, nicht kritisch ist. Es kann sich um eine Quecksilber-Dampflampe handeln, wie sie in Fluoreszenz-Mikroskopen häufig verwendet wird. Auch hat es sich funktionell als zufriedenstellend erwiesen, wenn die Energieform durch einen sehr selektiven Strahl gebildet wird, beispielsweise von einem Laser. Die Bezeichnung "Absorption" wird für das weiße Lichtspekbrum verwendet und die Bezeichnung "Fluoreszenz" für den Fall der zuletzt beschriebenen Emissionen.

Die beschriebenen Methoden basieren auf einer supravita-

len Technik. Es ist ein kontinuierliches Uberwachungssystem bei der Krankenhausdiagnose und -behandlung möglich, wo eine kontinuierliche kritische weiße Blutzellenüberwachung direkt am Patienten ein erwünschtes Ziel ist₇ was durch die beschriebenen bimodalen Methoden ermöglicht wird.

Der Ausdruck supravitaler Farbstoff oder Färbemittel sowie der Ausdruck supravitales Anfärben schließt die Möglichkeit einer kontinuierlichen Perfusion durch die Blutgefäße eines lebenden Organismus und die kontinuierliche Überwachung sämtlicher möglicher weißer Blutzellen nicht aus, wenn dieselben durch ein spezielles Bypass-Rohr zur Überwachung und zur Zählung hindurchtreten, in dem ein kohärentes Laserlicht als Energiequelle für die Fluoreszenz jeder individuellen Blutzelle verwendet wird, wie sie bei der Zellenzytometrie beobachtet wird, wobei sie individuell beleuchtet (oder Fluoreszenzlicht emittierend gemacht ) , wenn es in den Brennpunkt des mikroskopisch vergrößerten Feldes eintritt.

Aufgrund der Grenzen , die panoptisch angefärbten Proben eigen ist, wurde in den letzten Dekaden eine Anzahl von zytochemischen Tests vorgeschlagen, um eine Blutzellenart von einer anderen genauer zu unterscheiden. Im allgemeinen zielen diese Tests darauf ab, einen höheren Anteil einer Art einer Verbindung in einer bestimmten Zelle im Vergleich zu einer anderen festzustellen, oder eine Substanz (Substanzen) in einem charakteristischen zellulären Be-

®^ standteil in einer Zelle gegenüber einer anderen festzustellen. Beispielsweise ist die Aktivität der nichtspezifischen Esterase in Monozyten ungewöhnlich hoch, wobei diese Aktivität insbesondere hinsichtlich der Inhibition durch Natriumfluorid empfindlich zu sein scheint. In ähnlicher Weise hängt die Identifizierung der Granulozytenzellen meistens von einer Sichtbarmachung der Eigenschaften der Lysosomen ab. Aus diesem Grunde hat sich die Bestimmung der Aktivität der Myeloperoxidase und der spezifischen

Esterase als geeigneter zytochemischer Test erwiesen. Die Lysosomalkörnchen der eosinophilen Zellen enthalten Myeloperoxidase, die gegenüber einer Inhibition durch Natriumcyanid resistent ist, wobei die Körnchen der basophilen Zellen mit einer Vielzahl von Farbstoffen zum Teil aufgrund ihres hohen Gehalts an kationischen Substanzen, wie Heparin, metachromatisch anfärbbar sind.

Es ist darauf hinzuweisen, daß Monozyten keine anfärbende nukleare Reaktion zeigen, jedoch durch zytoplasmatische und Körnchenfarbdifferenzierung identifizert werden können, und zwar mit wenigen anderen ungewöhnlichen, hier beschrieben Farbstoffen, die auch metachromatisch sind

sowohl bei weißem Licht wie bei Fluoreszenzlicht. 15

Die supravitale Anfärbetechnik, bei der lebende Blutzellen verwendet werden und bei der unterschiedliche Affinitäten gegenüber einem supravitalen Anfärben dieser Zellen mit verdünnten wässrigen, fixiermittelfreien Farbstoffen ²^ auftreten, vermeidet Artefakte, die häufig bei herkömmlichen Fixiermitteln auftreten. Durch die Verwendung sowohl von weißem wie von Fluoreszenzlicht wird die Verwirrung , die durch Artifakte hervorgerufen werden, beseitigt. Die erfindungsgemäße Vitalanfärbetechnik mit bimodalen Lichtquellen stellt eine genauere Wiedergabe der zellulären Lokalisation des Farbstoffs (z.B. Lysosome, fibrilläre Strukturen, nukleares Chromatin) gegenüber den bisher verwendeten herkömmlichen Färbemitteln dar. Mit zunehmender Erfahrung mit Basischorange Nr. 21 und Ver-

besserungen der automatischen Technologie der differentiellen Blutzellenzählung stellt die supravitale, fixiermittelfreie Anfärbung von periphren Blut-Leukozyten einen wichtigen Beitrag auf dem Gebiet der Zytochemie dar.

In diesem Zusammenhang erscheint es zweckmäßig, auf die Fig. I Bezug zu nehmen, um das Verständnis der erfindungsgemäßen Identifizierung und Differenzierung der Leukozyten

zu erleichtern.

Die Beschränkung auf eine Schwarz-Weiß-Wiedergabe der Fig. I und der Umstand, daß die wesentlichen DarsteUungen dreidimensionale Gegenstände sowie Farbunterschiede umfassen, die durch die Ungenauigkeit der Sprache nicht genau identifizierbar sind, stellt einen Nachteil dar, der auf die Schwarz-Weiß-Wiedergabe von Patentschriften zurückzuführen ist.
10

Sämtliche Blutzellen scheinen von undifferenzierten Stammzellen , sogenannten mesenchymalen Zellen, herzurühren. Die unmittelbaren Nachkommen der Stammzellen werden Blasten genannt, wobei die spezifischen Myeloblasten als Vorstufen der differenzierten Leukozyten anzusehen und identifizierbar und aufzählbar bei supravitalen Analysen sind, wen sie Basischorange Nr. 21 in einer fixiermittelfreien wässrigen Lösung ausgesetzt werden. Die Myeloblasten sind effindungsgemäß durch die Abwesenheit von Körnchen der

*® Lysosomen identifizierbar,die charakteristisch die drei davon abstammenden Zellen der Myeloidreihe durch ihre metachromatische Farbabsorption erkennen lassen. Die drei abstammenden Zellen, nämlich Promyelozyten, Myelozyten und Metamyelozyten werden jeweils in der beschriebenen Art und Weise durch die metachromatische und unterschiedliche Farbe und Farbverteilung separat identifiziert.

Promyelozyten werden leicht durch folgende manuelle und automatische Überprüfung identifiziert. Sie sind im allge-

meinen der Größe nach die größten der Myeloidreihe. Der ovale Nucleus N-1 wird durch Basischorange Nr. 21 nicht angefärbt, wobei er einen relativ großen Teil der gesamten Granulozytenzelle darstellt. Das Zytoplasma C ist dicht mit einer großen Anzahl relativ kleiner primärer Körn-"

chen mit einer orangeroten Farbe 1 gepackt, wobei wenige verstreute violette Körnchen 2 im allgemeinen beobachtet werden können, die in der Masse der orangeroten Körnchen verteilt sind. Unter Fluoreszenz-Emissionsbedingungen

fluoreszieren die primären Körnchen oder Lyosomen 1 hellgelb und das Zytoplasma mattgrün.

Myelozyten weisen gleichfalls einen nicht angefärbten, eiförmigen Nucleus N-2 mit etwas verminderter Fläche (Volumen) auf. Der herausragende Unterschied ist die eindeutige Entwicklung großer sekundärer gelber Körnchen (Granula) 4 in einer unreifen Myelozytenzelle mit im allgemeinen zunehmendem Halbmond. Die beiden imaginären Linien a - a grenzen die zunehmende Anzahl größerer sekundärer gelber Körnchen 4 der Myelozyten von der abnehmenden Anzahl kleiner orangeroter oder fuchsinfarbener primärer Körnchen 6 ab. Es ist festzustellen, daß die Myelozyten von den Promyelozyten sich durch die bemerkbar isolierte Komponente der Entwicklung sekundärer gelber Körnchen 4 unterscheiden. Diese (weißes Licht) absorbierenden fuchsinfarbenen Körnchen fluoreszieren unter Fluoreszenz-Emissionsbedingungen hellgelb/ und die sekundären (größeren) Körn.-chen fluoreszieren blaßgrün.

Metamyelozyten, wie die vorstehenden beiden Zellen (N₁ und N_) weisen gleichfalls einen ungefärbten Nucleus N-3 auf, der anfängt, eine lobuläre Form zu entwickeln, im Unterschied zu der vorstehend beschriebenen Eiform der ersten Zelle in der Myeloidreihe. Die kleiner werdende Masse kleiner, primärer, orangeroter oder fuchsinfarbener Körnchen 6 wird nun zu einer vergleichsweise kleinen Fläche der gesamten Fläche des beobachteten Zytoplasmas C-2 der Zelle.

Größere sekundäre gelbe Körnchen 8 scheinen einen erheblichen mittleren Bereich des vorherigen eiförmigen nicht angefärbten Nucleus N-3 zu ersetzen, was den Wechsel wiedergibt, der verbal mit "von der Eiform zu der lobulären Form" wiedergegeben wird. Die Fluoreszenz-Ansprechmuster sind ständig ähnlich und erkennbar.

Die Bänder werden zunehmend unterscheidbar und setzen sich

von den drei ersten vorstehend beschriebenen Zellen ab, die ein metachromatisches Anfärben der Körnchen zeigen und die Mitglieder der myeloiden Reihen sind.

Soweit bekannt, waren Bänder -bisher nicht von den anderen Leukozyten durch Metachromasie mit einem Farbstoff unterscheidbar.

Die Bänder unterscheiden sich von allen anderen Leukozyten durch einen ungefärbten lobulären Nucleus N-5, der zusammen mit der gesamten Bandgröße eine merklich verminderte Fläche (Volumen) aufweist im Vergleich zu den bisherigen Leukozytenzellen der Myeloidreihen. Darüber hinaus ist die lobuläre Form des unangefärbten Nucleus N-5 stärker gegabelt worden durch weiteres Wachstum des Zytoplasmas C-6 nach innen. Die Zunahme der Zahl der se-■ kundären gelben Körnchen 12 in dem Zytoplasma hat bis auf ein sehr kleines Band restlicher primärer kleiner orangeroter Körnchen 10 alles ersetzt. Es ist darauf hinzuweisen, daß das Band der roten Körnchen 10 spezifisch in dem nach innen gerichteten Vorsprung oder der Bewegung des Zytoplasmas C-6 angeordnet ist, der bzw. die den Nucleus N-5 zu teilen bestrebt ist. Größere sekundäre gelbe Körnchen 12 beginnen damit, das Zytoplasma C-6 bis auf diese charakteristische kontrastreiche Farbgruppe der Bänder zu übernehmen. Ein wichtiger Punkt der Trennung ist der schmale Verband der roten Körnchen 10 in dem Zytoplasma C-6 bei 10.

Dieser herausragende Punkt der Differenzierung der Bänder von allen anderen Leukozyten wird als außergewöhnlich nützlich bei der Entwicklung automatischer Einrichtungen angesehen, die die kleinen primären, orangeroten Körnchen 1O₇ die von einem großen Übergewicht sekundärer gelber grosser Körnchen 12 umgeben sind, umfassen können.

Wie bei der Absorption zeigen Bänder bei Fluoreszenz eine kleine Ansammlung von gelber fluoreszierenden Körnchen

im Zytoplasma C-6 mit den vorstehenden charakteristischen Zellmustern mit gleichfalls überwiegendem blaßgrünen sekundären Körnchen 12.

Die Möglichkeit, Bänder leicht / schnell und genau von allen anderen Leukozyten mit einem einzigen Farbstoff, wie vorstehend angegeben, zu unterscheiden, zu identifizieren und aufzuzählen ist völlig unerwartet und mit keiner bekannten Theorie der Bandfunktion vereinbar. 10

Neutrophile sind reife weiße Blutzellen und können von den interessanten fünf Hauptklassen weißer Blutzellen nach der älteren Anmeldung unterschieden werden. Es konnten nunmehr weitere interessante Details festgestellt werden.

Neutrophile, Eosinophile und Basophile sind aufgrund der fehlenden farbigen Darstellung in der Zeichnung in ihrer physikalischen Form alle relativ ähnlich. Bei der Verwendung von Basischorange Nr. 21 als einzigen supravitalen Farbstoff in einer fixiermittelfreien Umgebung werden die neutrophilen Zellen durch sekundäre Körnchen 16 in dem Zytoplasma C-8 identifiziert, wobei sie hauptsächlich gelb sind. Die Nucleus N-8 ist nicht angefärbt und im allgemeinen geteilt. Die großen sekundären gelben Körnchen 16 bilden die größte Fläche (Masse) des Zytoplasmas C-8.

Eosinophile besitzen gleichfalls einen geteilten unangefärbten Nucleus N-10, jedoch unterscheiden sich die großen sekundären Körnchen 18 von den neutrophilen und basophilen Zellen durch ihre orange Farbe, die das charakteristische und wichtigste Merkmal des Zytoplasmas C-10 ist.
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Die Fluoreszenz-Anregung stellt bei Eosinophilen eine sehr interessante und charakteristische Entwicklung dar. Die allgemeine Struktur, die der zweigeteilte Nucleus

N-10 wiedergibt, ist bei der bimodalen Lichtunter- suchung üblich. Die sekundären Körnchen zeigen jedoch eine hellgelbe Außenkontur oder "Schalen "-Fluoreszenz an der Peripherie der sekundären Körnchen 18, die bisher nicht festgestellt worden ist. Diese einzigartige "Markierung" , die bei Eosinophilen bei emittierender (Fluoreszenz-) Anregung festgestellt wird, stellt eine Möglichkeit dar, Beobachtungen zu überprüfen, die bei einer früheren Absorptionsuntersuchung gemacht wurden, ferner wird dadurch ein interessantes, bisher unbekanntes Phänomen im Hinblick auf die Struktur der sekundären Körnchen als solcher aufgezeigt. Die Beobachtung der allgemeinen Strukturen bei Zufuhr der Energie beider Quellen dient ansonsten als Bestätigung.

Basophile Zellen weisen gleichfalls einen geteilten von Basischorange Nr. 21 unangefärbten Nucleus N-12 auf, wobei die sekundären Körnchen 20 von denKörnchen der neutrophilen Zellen 16 und den eosinophilen Zellen 18 dadurch unterscheiden, daß die basophilen Körnchen 20 durch metachromatische Anfärbung eine helle karmesinrote Farbe annehmen, die einen schwach blauen Farbton oder Unterton aufweist.

Die Fluoreszenz-Anregung der Basophilen führt im wesentlichen zu einem Muster, das der des absorbierten Lichts strukturell ähnlich ist. Die Fluoreszenz der sekundären Körnchen 20 führt jedoch zu einer ungewöhnlich brillianten zitronengelben Fluoreszenz-Lichtemission derselben.

Bei der angegebenen Zellstruktur ist darauf hinzuweisen, daß jede der in der Figur dargestellten Leukozyten, neutrophilen, eosinophilen und basophilen Zellen in Wirklichkeit von ihren spezifischen Vorstufen abstammen. Die Figur der Zeichnung stellt diese Entwicklung im einzelnen nicht dar. Promyelozyten werden als Vorstufen der Monozyten bezeichnet.

B-Lymphozyten und T-Lyinphozyten haben einen im wesentlichen ovalen Nucleus N-14 bzw. N-16. Jeder Nucleus N-14 und N-16 ist in ähnlicher Weise gelb gefärbt. Das Zytoplasma C-14 und C-16 bleibt in jedem Falle unangefärbt. Ein charakteristisches Merkmal des Zytoplasmas C-16 der T-Lymphozyten differenziert wiederum klar die T-Lymphozyten von den B-Lymphozyten. Dies ist die Gegenwart einer kleinen Ansammlung roter Körnchen 22 in dem Zytoplasma C-16 der T-Lymphozyten.

Bei Beobachtung der gleichen Proben, wie sie .vorstehend angegeben sind, unter Einwirkung beispielsweise einer Quecksilber-Dampflichtquelle ist festgestellt worden, daß bei T-Zellen kleine Ansammlungen von Körnchen 22 in dem Zytoplasma 16 hellgelb fluoreszieren und der Nucleus N-16 sehr häufig im wesentlichen unangefärbt bleibt, jedoch eine mattgrüne Fluoreszenz bei derselben Untersuchung zeigt. Die Muster bei beiden Beobachtungsmethoden sind sehr gut vergleichbar und dienen der Bestätigung.

Bei den B-Zellen weist der Nucleus ständig eine mattgrüne Fluoreszenz auf.

Bei Beobachtungen mit beiden Arten der Energieanregung variieren die B-Zellen durch eine gelbe Farbe des Nucleus bei der Absorption und eine mattgrüne Fluoreszenz bei Lichtemissionsbedingungen. Bei beiden Arten der bimodalen Lichtenergieuntersuchung wurden keine sekundären Ansammlungen in dem Zytoplasma der B-Zellen beobachtet. Dieses Muster ist entscheidend.

Wie in der älteren Anmeldung P 31 09 252.7 ausgeführt, sind Monozyten deswegen ungewöhnlich, weil bei Beobachtung mit weißem Licht alle Farbstoffe der hier beschriebenen basischen quaternären Farbstoffe, die sich usprünglich als metachromatisch aktiv erwiesen, sowie bei den jüngeren Untersuchungen unter Verwendung von Fluoreszenzlicht emittierenden Energieformen die Monozyten sich stets sowohl metachromatisch wie fluores-

zierend verhalten, nicht nur mit Basischorange Nr. 21, sondern mit einigen anderen Basischrot- und Basischviolett-Cyan^arbstoffen, die vorstehend beschrieben sind.

Mit Basischorange Nr. 21 werden die Monozyten, was ihren im allgemeinen eiförmigen Nucleus N-18 betrifft, nicht angefärbt. Jedoch nimmt das Zytoplasma C-18 einen rosa Ton an, in dem eine verstreute, relativ kleine Anzahl von karmesinroten und rosaroten Körnchen 24 erkennbar ist, ¹^ die sich im Farbton, dem Wert und der Farbe hinreichend von dem "rosa" Ton des Zytoplasmas C-18 unterscheiden, um optisch eindeutig von dem Plasma C-18 differenziert zu werden, das im allgemeinen eine ähnliche rosa Färbung

besitzt.
15

Bei der Fluoreszenz-Anregung mit elektromagnetischer Schwingungsenergie führen sämtliche angegebenen Vertreter der Klasse der Cyanin- oder Methin- und Polymethinfarbstoffe, auf die hier Bezug genommen wird, zu Fluores-

^O zenz-Emissionen der so angefärbten Monozyten. Mit Basischorange Nr. 21 sind die wenigen Körnchen 24 in dem Zytoplasma C-18 hellgelb fluoreszierend. Die genannten Basischviolett und Basischrot, die die Monozyten nuclei-metachromatisch durch Absorption anfärben,

²^ fluoreszieren ebenfalls metachromatisch durch Emissionsenergie.

Die Identifizierung und Aufzählung der Monozyten ist durch die Feststellung des Satzes ungewöhnlicher Farbstoffe vereinfacht worden, der in der älteren Anmeldung beschrieben ist. Die zytochemische fluoridsensitive, nichtspezifische Esterase-Standardreaktion, die für die Monozyten-Identifizierung verwendet wird, erfordert häufig eine Stunde oder mehr, bis sie abgeschlossen ist, wobei um erfolgreich zu sein, eine exakte zytochemische Handhabung notwendig ist. Mit irgendeinem der beschriebenen Farbstoffe kann das Anfärben des Leukozytenfilms im zentrifugierten Blut, des gesamten Bluts oder abgetrennter

Fraktionen auf einfache Weise in der Größenordnung von Minuten ohne chemische Einstellungen durchgeführt werden. Das Anfärben der Monozyten nach dem erfindungsgemäßen Verfahren lediglich mit Basischorange Nr. 21 erfolgt augenblickr lieh, was das Zytoplasma und die Körnchen in dem Zytoplasma betrifft.

Es ist darauf hinzuweisen, daß die metachromatischen Farbstoffe die Zellen schließlich in einem Ausmaß einfärben, wo eine Identifizierung nicht mehr möglich ist. Die beschriebenen Farbunterschiede gehen also verloren oder vermindern sich in einem starken Ausmaß, wenn die Analysen nicht unverzüglich durchgeführt werden. Da in der Praxis das Anfärben jedoch sofort erfolgt, ist jedoch bis zur Bildung maximaler Unterschiede keine Wartezeit erforderlich.

Die Identifizierung und Differenzierung der Monozyten wird nach dem Stand der Technik durch zeitaufwendige und komplizierte zytochemische Behandlung der Zellen durchgeführt, die eine Nichtesterasereaktion, eine Präparierung fixierter Zellen, eine Hexazotierung, eine pH-Einstellung und eine Anfärbung mit Mehrfachfarbstoffen umfaßt, wobei etwa 60 Minuten benötigt werden, um das zu erreichen,, was mit irgendeinem Farbstoff der älteren Anmeldung erforderlichenfalls in weniger als einer Minute durch Inberührungbringen eines einfachen Farbstoffs und einer Blutprobe in einem wässrigen System durchgeführt werden kann. Mit dem erfindungsgemäßen spezifischen Farbstoff wird ebenfalls eine sofortige bevorzugte Anfärbung des Zytoplasmas der Monozyten erreicht.

Der einzigartige Farbstoff wird für die erfindungsgemäße Anwendung durch Filtrieren einer wässrigen Lösung von reinem Basischorange Nr. 21 in destilliertem Wasser in einer Konzentration von etwa 1 % erhalten. Die Farbstoffkonzentration ist nicht besonders kritisch, vielmehr sind Abweichungen möglich. Vorzugsweise werden frische wässrige

Lösungen verwendet, die keine toxischen Zusätze enthalten. Eine Beeinflussung der metachromatischen Reaktion zwischen dem Farbstoff und der spezifischen Art oder Klasse von Leukozyten kann vollständig durch die Anwesenheit eines der bekannten herkömmlichen Fixiermittel verhindert werden.

Die Bezeichnung "supravital" stellt eine wichtige Einschränkung dar. Sie bezieht sich auf die ursprüngliche Blutprobe und wird für lebende Zellen, die frisch aus einem lebenden Organismus entfernt worden sind oder von einem frisch getöteten Organismus oder dergleichen stammen, verwendet. Durch diese Bezeichnung sollen sämtliche "Fixiermittel" ausgeschlossen werden, jedoch nicht die Verwendung eines Antikoagulans (Heparin, EDTA etc.). Die Blutzellen können auch aus dem Knochenmark, Urin oder anderen dieselben enthaltenden biologischen Teilen entfernt werden, einschließlich beispielsweise lymphatischem Gewebe und der Milz.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird im allgemeinen wie folgt durchgeführt:

Es wird eine 1 %-ige Lösung in.destilliertem Wasser aus einem ausgewählten basischen quaternären kationischen Farbstoff, hier Basischorange Nr. 21, hergestellt. Alle nicht gelösten Farbstoffe werden abfiltriert. Am geeignetsten ist Basischorange Nr. 21. Falls es sich in der Praxis als notwendig erweisen sollte, kann für einen bestimmten Zweck einer oder mehrere der betreffenden Farbstoffe in Form von Lösungen zugemischt werden.

Die wässrige Lösung des ausgewählten, vorstehend identifizierten, einzigen reinen Farbstoffs (oder es werden Kombinationen von einem oder mehreren reinen Farbstoffen eingesetzt wie in den Tabellen I und II angegeben und in der Tabelle III der älteren Anmeldung P 31 09 252.7 veranschaulicht) wird gelöst, um eine einfache wässrige Farbstoff-

lösung zu bilden." (Durch Berücksichtigung verschiedener Volumenanteile der wässrigen Farbstofflösung und verschiedener Stärken der wässrigen Farbstofflösung können optimale Bedingungen für verschiedene spezifische zytologische Analysen erhalten werden.) Versuche dürften zu bestimmten Kombinationen führen, die besondere Vorteile aufweisen, was jedoch über den Rahmen dieser Beschreibung hinausgehen würde.

Die Blutproben können von verschiedenen Quellen erhalten werden und können frische Proben venösen Bluts, von denen die Erythrozyten entfernt worden sind (Zentrifugierung, hypotonische Lysis, Schwerkraftsedimentation, Dichtegradientensedimentation usw.) oder eine Probe eines nach bekannten physiko-chemischen Verfahren mit weißen Blutzellen angereichten Plasmas. Gewebe mit Zellen (wie sie oben beschrieben . sind) können ebenfalls angefärbt und zur Untersuchung einer bimodalen Lichtanregung ausgesetzt werden.

Vorzugsweise werden der wässrige Farbstoff und die Blutprobe, die beide frisch hergestellt worden sind, bei normaler Blut- oder Körpertemperatur (etwa 36 bis 40⁰C) miteinander vereinigt, wenn die geplanten Analysen dies angezeigt erscheinen lassen. Es wird im allgemeinen ein schnelleres und kontrastreicheres Anfärben bei einer höheren Tempera tür erreicht. Basischorange Nr. 21 scheint nicht temperaturempfindlich zu sein.

Die Farbstoff- und Blutlösungen funktionieren ordnungsgemaß, wenn sie in einem Volumenverhältnis von 1:4 miteinander vereinigt werden. Das Gemisch wird einige Sekunden leicht bewegt und ein Tropfen des Gemisches wird sofort als nasse Auftragung unter Verwendung eines Deckglases mit einem Lichtmikroskop oder falls vorhanden mit einer automatischen Differential-Leukozyten-Zähleinrichtung untersucht. Weitere Möglichkeiten des Kontakts zwischen dem Farbstoff und den Blutzellen umfassen bekannte Medien, beispielsweise Gelatine, Emulsionen usw.,

die mit dem Farbstoff in einer Konzentration von etwa 1 % imprägniert sind. Die Fixierung der Probe beeinträchtigt ernsthaft die ungewöhnliche metachromatische Wechselwirkung des erfindungsgemäßen Farbstoffs mit den Leukozyten.

Basischorange Nr. 21 ermöglicht eine Untersuchung allein mit weißem Licht oder allein mit Fluoreszenzlicht oder mit beiden entweder simultan, singular oder in Sequenz in Abhängigkeit von dem erhältlichen Gerät und eine Unterscheidung der folgenden Spezies voneinander, falls sie zusammen vorliegen: Myeloblasten, Promyelozyten, Metamyelozyten, Myelozyten, Bänder, netrophile, eosinophile und basophile Zellen, B-Lymphozyten, T-Lymphozyten und Monozyten. Die Differenzierungsmaßnahmen zur Zählung und andere Untersuchungen sind vorstehend anhand der Figur umrissen worden.

Die beschriebenen Beispiele dienen der Erläuterung und ermöglichen es dem Fachmann, das Ausmaß des erfindungsgemäßen Verfahrens zu erkennen. Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens bestehen nicht zuletzt in der Leukozyten-Zählung (insgesamt), der Zählung von Leukozyten-Spezies, der Diagnose von Krankheiten, insbesondere der Leukämie, sowie der überwachung von Patienten, die eine Vielzahl kritischer Behandlungen erfahren, beispielsweise eine Chemotherapie, Bestrahlungstherapie, ACTH usw.

Die Identifizierung und Zählung sämtlicher Leukozyten-Arten ist häufig von kritischer Bedeutung bei der Diagnose und der Behandlung von Krankheiten.

Die nachstehenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung und deren Durchführung. Sie sind selbstverständlich weder erschöpfend noch einschränkend zu verstehen.

Beispiel I

ßasischorange Nr. 21)

Es wurden umfangreiche Reihen von Methin-, PοIymethin-, Chinoid- und/oder Carbocyanin-Farbstoffen hergestellt, aufgrund der ursprünglichen Feststellung, daß Basischorange Nr. 21 sich als ungewöhnlich metachromatich in bezug auf die differentielle Anfärbung weißer Blutzellen herausgestellt hat. Von den über 2000 getesteten Farbstoffen zeigte lediglich Basischorange Nr. 21 die hier beschriebene ungewöhnliche Metachromasie bei weißem Licht und Fluoreszenz.

50 ml peripheres Blut wurden von normalen Personen in Serien heparinisierter Reagenzgläser erhalten.

Zwei Reagenzgläser wurden mit 10 ml einer 1 %-igen Lösung von Basischorange Nr. 21-Farbstoff in destilliertem Wasser bei etwa 37°C vermischt. Es wurde festgestellt, daß die Temperatur bei Verwendung dieses Farbstoffs nicht kritisch ist.

Eine mikroskopische Untersuchung ergab, daß Eosinophile, von denen berichtet wird, daß sie braune Körnchen aufweisen, hier genauer dadurch wiedergegeben werden, da sie große orangefarbene Körnchen in dem Zytoplasma bei Absorption und eine leuchtend gelbe Fluoreszenz mit einem Schalen-Muster mit einem nicht angefärbten lobulären Nucleus bei beiden Lichtarten besitzen. Die Basophilen zeigten eine ähnliche geometrische Konfiguration bei bimodaler Beobachtung, jedoch waren die Körnchen bei der Absorption im Hauptton leuchtend karmesinrot mit einem schwachen, blauen Unterton und fluoreszierten leuchtend gelb. Der Nucleus war gleichfalls lobulär und nicht angefärbt bei der bimodalen Untersuchung. Die Monozyten unterschieden sich deutlich durch einen nichtangefärbten, ovalen Nucleus und ein rosafarbenes Zytoplasma, das wenige karmesinrote und rosafarbene Körnchen enthielt. Im Fluoreszenzlicht

waren die Körnchen leuchtend gelb -. Der Ausdruck "nicht angefärbt" kann auch sehr blasse Töne umfassen, was etwas von der Zeit abhängig ist, bis der Objektträger untersucht wird.
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Bemerkenswert ist, daß die differentielle Anfärbung sowohl der ausgereiften, erwachsenen wie auch der nichtausgereiften neutrophilen Zellen spezifischer war als es bisher nach dem Stand der Technik mit irgendeinem Farbstoff festgestellt wurde. Die ausgereiften Neutrophilen waren durch Absorption spektral identifizierbar durch die wenigen hauptsächlich gelben großen Körnchen in dem Zytoplasma und den nicht angefärbten lobulären Nucleus. Bei Fluoreszenz-Bedingungen fluoreszierte das Zytoplasma mattgrün und die Körnchen waren nicht sichtbar.

Beispiel 2

T-zellenreiche und B-zellenreiche Suspensionen menschliehen Bluts werden aus 50 ml Proben periphren Bluts hergestellt, das von normalen Personen in heparinisierten "Vacutainer"-Reagenzgläsern durch Durchleiten von Ficoll-Hypaque angereicherten Fraktionen durch Nylongewebe-Mikrosäulen erhalten wurden. Die T-zellenreichen und B-zellenreichen Suspensionen wurden von den Säulen unter kontrollierten Temperaturbedingungen und mit ausgewählten unterschiedlichen Puffern gemäß dem Stand der Technik eluiert.

Fraktionen dieser gewonnenen Suspensionen wurden einer immunologischen Analyse unterworfen, indem für die T-ZeI-len eine T-Zellenrosettenbildung und bezüglich der B-Zellen eine Oberflachen-Immunoglobulin-Bestimmung zur Anwendung kommt. Ein Tropfen einer 1 %-igen Lösung des Basischorange Nr. 21-Farbstoffes wurde 5 Tropfen der gewonnenen Suspension in getrennten Reagenzgläsern einverleibt. Jedes Reagenzglas enthielt etwa 2 χ 10 Lymphozyten. Die Lymphozyten, die mit Hilfe der T-Zellen-

rosettenbildung als T-Zellen" identifiziert wurden, wurden mikroskopisch untersucht im weißen Lichtspektrum/ um festzustellen, daß sie kleine Gruppen oder Ansammlungen von fünf bis zehn oder mehr roten Körnchen enthielten. Beim Fluoreszenz-Verfahren war der Nucleus manchmal nicht angefärbt oder er wies eine mattgrüne Fluoreszenz auf, wobei die gleichen Ansammlungen von Körnchen leuchtend gelb fluoreszierten. Die Lymphozyten, die durch immunologische Methoden als B-Zellen identifiziert wurden, zeigten lediglieh eine schwach rot angefärbte Granula in dem Zy toplasma , während die B-Lymphozyten keine roten Körnchen in dem Zytoplasma aufwiesen. Der Nucleus war bei der Absorption sowohl bei den T-Zellen wei bei den B-Zellen oval und gelb gefärbt. Beim Fluoreszenz-Verfahren wiesen die Nuclei der B-Lymphozyten eine mattgrüne Fluoreszenz auf und das Zytoplasma blieb unverändert.

Die Verwendung von Basischorange Nr. 21 stellt eine neue, schnelle Methode zur Identifizierung, Differenzierung und Aufzählung von T- und B-Lymphozyten oder -Zellen bimodal oder allein bei Fluoreszenz-Anregung dar. Die gegenwärtigen Methoden umfassen den Einsatz instabiler biologischer Reagenzien (Schafzellen), erfordern Radioisotopen-Techniken, die teuer und zeitaufwendig sind und machen die Kontrolle vieler Variabler, einschließlich der Temperatur, des pH-Wertes des Inkubationsmediums usw. erforderlich, was nicht länger notwendig erscheint.

Beispiel 3

Bei einer 48 Jahre alten Frau, die Brustkrebs im Endstadium aufwies , trat kurz vor dem Tod Septikämie und hohes Fieber auf. Zu dieser kritischen Zeit stieg ihre Zahl der weißen Blutzellen auf 45000 pro mm . Durch Verwendung des Standard—Wright-Färbemittels wurde festgestellt, daß 60 % der peripheren Blutleukozyten Bänder waren, die einen charakteristischen ungeteilten Nucleus aufwiesen.

Proben des Bluts der Patientin wurden mit einer 1 %igen wässrigen Lösung von Basischorange Nr. 21 als supravitalem Anfärbemittel ohne Fixiermittel angefärbt.

Die Bänder ("bands" oder Kernstabige) wurden anhand der ständigen Anwesenheit einer kleinen schmalen Ansammlung rot angefärbter (primärer) Körnchen unter einer großen Anzahl größerer (sekundärer) Körnchen identifiziert, die netachromatisch gelb angefärbt waren wie der typische ungeteilte Nucleus. Fluoreszenzlicht bewirkte, daß die primären Körnchen in der Ansammlung eine gelbe Fluoreszenz zeigten.

Es war also möglich/ eine positive Identifizierung, Differenzierung und Zählung der Bandformen anhand ihrer zy-

toplasmischen Reifung durchzuführen, wobei die Farbe bei Absorption die primäre gegenüber der.sekundären Granulation differenzierte, und die gelbe Fluoreszenz die Ansammlung primärer Körnchen.
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Beispiel 4

Ein 24 Jahre alter Mann litt an Mattigkeit und es zeigte sich bei der medizinischen Untersuchung, daß er eine vergroßerte Milz hatte. Die Laborwerte ergaben eine weiße Blutzellenzahl von 15000 / mm , wobei etwa 75 % der Zellen atypische Lymphozyten waren. Bei der weiteren immunologischen Untersuchung wurden sie als T-Zellen identifiziert. Der Einflecktest ("Monospot-Test") war bei dem Patienten positiv und es wurde infektiöse Monocleose diagnostiziert. Bei Verwendung von Basischorange Nr. 21 als supravitaler Farbstoff enthielten die meisten Lymphozyten eine Ansammlung metachromatisch angefärbter roter Körnchen in dem Zytoplasma sehr nahe an dem nicht angefärbten Nucleus.

Bei Anwendung der Fluoreszenz fluoreszierten die gleichen Körnchen leuchtend gelb mit einem matt fluoreszierenden grünen Nucleus.

-48-Beispiel 5

Ein 75 Jahre alter Mann entwickelte vergrößerte Lymphknoten am Hals und in der Leistengegend, desgleichen eine vergrößerte Milz. Die Laboruntersuchungen ergaben Anämie und eine weiße Blutzellenzahl von 80000 / mm . Etwa 90 % dieser Zellen waren Lymphozyten und eine Untersuchung des Knochenmarks ergab, daß das Mark weitgehend durch ähnlich aussehende Lymphozyten ersetzt war. Es wurde chronische lymphozytische Leukämie diagnostiziert.

Die immunologische Untersuchung ergab , daß die Lymphozyten B-Zellen waren. Bei Verwendung von Basischorange Nr. 21 als supravitaler Farbstoff wurden im weißen Licht keine Körnchen beobachtet. Bei Fluoreszenz konnten keine Körnchen in dem Zytoplasma der Lymphozyten sichtbar gemacht werden.

Beispiel 6

Ein 33 Jahre alter Mann litt an Schwäche und Müdigkeit und es stellte sich heraus, daß er eine beträchtlich vergrößerte Milz hatte. Die Laboruntersuchung ergab eine weiße Blutzellenzahl von 800000 / ram sowie eine geringe -Anämie, jedoch eine normale Plättchenzahl. Bei der Standard-Wright-Anfärbung des peripheralen Blutes konnten sämtliche Stadien der Leukozyten-Entwicklung beobachtet werden, wobei Promyelozyten, Myelozyten und Metameylozyten vorherrschten. Es wurden zahlreiche Eosinophile, Basophile und nuklierte Erytrozyten beobachtet. Aufgrund des Knochenmarks und zytogenischer Bestimmungen wurde chronische granulozytische Leukämie diagnostiziert.

Bei supravitaler Verwendung von Basischorange Nr. 21 wurde im weißen Licht die erwartete metachromatische Differenzierung der Leukozyten beobachtet. Mit Fluoreszenzlicht erschienen die primären Körnchen, die metachromatisch rot angefärbt waren, mit leuchtend gelber bis gelbgrüner Fluoreszenz. Zellen, die hauptsächlich

sekundäre Körnchen (z.B. Neutrophile) enthielten, zeigten bei Verwendung von weißem Licht eine leuchtend gelbe Farbe, jedoch eine mattgrüne Fluoreszenz bei Verwendung von Fluoreszenzlicht. Basophile zeigten eine leuchtend gelbe Fluoreszenz ihrer Körnchen und die gleichen Körnchen erschienen leuchtend rot bei Verwendung von weißem Licht. In den Eosinophilen waren die Körnchen leuchtend orange angefärbt/ wenn weißes Licht verwendet wurde, bei Verwendung von Fluoreszenzlicht zeigten die Körnchen jedoch nur Fluoreszenz an ihrer Peripherie mit einem "Schalen"-Fluoreszenz-Muster.

Beispiel 7

Bei einer 25 Jahre alten Frau mit Bronchialasthma wurde eine Routineblutzählung als Teil ihrer medizinischen Untersuchung durchgeführt. Bei der Leukozyten-Differenzierung wurden etwa 40 % Eosinophile festgestellt. Bei supravitaler Verwendung von Basischorange Nr. 21 mit weißem Licht wurden die Körnchen der E0s3.n0ph.ilen orange angefärbt. Bei Verwendung von Fluoreszenzlicht zeigten die gleichen Körnchen eine "Schalen"-Fluoreszenz.

Beispiel 8

Eine 62 Jahre alte Frau mit Diabetes melitus und einem Karzinom des Grimm-Darms litt an Anämie und Leukozytose kurz vor ihrem Tod. Die weiße Blutzellenzahl betrug 35000 / mm und bei der Wright-Anfärbung zeigten sich zahlreiche Myelozyten und Promyelozyten. Bei Verwendung von Basischorgange Nr. 21 als supravitales Färbemittel zeigten die metachromatisch rot angefärbten oder magentafarbigen Körnchen der Promyelozyten und Myelozyten eine leuchtend gelbe Fluoreszenz. Wie erwartet waren die Körnchen in den Promyelozyten zahlreicher als in den Myelozyten.

Beispiel 9

Bei einem 47 Jahre alten Mann mit akuter lymphoblastischer Leukämie betrug die weiße Blutzellenzahl 10000 / mm , wobei 80 % leukämische Lymphoblasten (PAS positiv und die Terminale des Oxynucleatidyltransferase passiv) enthalten waren. Bei supravitaler Verwendung von Basischorange Nr. zeigten die leukämischen Lymphoblasteη eine schwach gelbe nukleare Anfärbung mit weißem Licht und geringfügige oder IQ keine nukleare Fluoreszenz bei Verwendung von Fluoreszenzlicht.

Leukämische Blasten mehrerer Patienten mit akuter Leukämie zeigten eine wesentlich herabgesetzte Fluoreszenz, verglichen mit normalen Leukozyten. Durch diese Unterschiede werden normale und leukämische Zellen differenziert.

In der vorstehenden Beschreibung und in den Beispielen ist die Bedeutung der Vorteile der Erfindung im Hinblick 2Q auf automatische Differential-Leukozyten-Computer hervorgehoben worden. Es ist kein serienmäßiges Gerät bekannt/ das direkt ohne Modifizierung für die vorteilhafte Anwendung der hier beschriebenen bimodalen Lichtmethode oder nur für die Anwendung mit Fluoreszenzlicht geeignet ^ist·

Es ist jedoch bekannt, daß mindestens drei Teile einer analytischen Einrichtung, die auf der Emission von Fluoreszenzlicht beruht, erhältlich sind, wobei in einigen

QQ Fällen bekannte Farbstoffe verwendet werden, die ihrer Natur nach nicht metachromatisch fluoreszieren. Es versteht sich, daß diese Vorrichtungen in der Lage sind, Muster von mit Licht beleuchteten Zellen und die Größe der speziellen Muster, die durch Fluoreszenz-Farbunterschiede bestimmt werden, zu bestimmen, wobei zahlreiche kohärente Lichtlaser als Ganzes oder teilweise verwendet werden zur Identifizierung und Zählung der so differenzierten Zellen. Die Bekannten umfassen Epic V (Coulter),

-51-FACS (Becton-Dickinson) und Cytofluorograph (Ortho).

Fachleute auf dem Gebiet der medizinischen Technologie wissen um die Bedeutung einer raschen und genauen Be-Stimmung der verschiedenen Differential-Leukozyten-Zählungen zu den verschiedensten Zwecken. Es ist geschätzt worden, daß in den USA jeden Tag eine halbe Million Differential-Leukozyten-Zählungen durchgeführt wird, die meisten manuell mit jährlichen Kosten von mehr als 750 Millionen Dollar.

Blutzählungen, ob manuell oder automatisch, wie sie hier beschrieben sind, sind lebenswichtige Hilfsmittel bei der Untersuchung und der Bestimmung der Natur einer Krankheit. Fieber unbekannter Ursache, ob virulent oder als nichtpyrogene Infektion, Pyrogene, die den Blinddarm, die Gallenblase, die Eileiter betreffen, die Prognose bei Patienten mit verschiedenen Krankheiten unterschiedlicher Stadien, maligne Stadien, einschließlich der Hodgkin-Krankheit, die Lungenkrankheit, die Überwachung der Behandlung von Patienten mit adrenDcorticalen Steroiden, verschiedene Arten akuter und chronischer Leukämie, die diagnostische Differenzierung zwischen aspetischer Knocheninfarktion und Osteomyelitis; bakterielle Infektionen und viele andere medizinische Fragen werden bei der Diagnose, Prognose und der Behandlung durch eine genaue Zählung, Analyse und zytologisches Studium der Leukozyten erleichtert.

Die Bezeichnung "metachromatisch" , wie sie hier verwendet wird, bezieht sich nicht nur auf die außergewöhnliche und sonderbare Eigenschaft der beschriebenen Farbstoffe, sondern auch auf die Eigenschaft der verschiedenen Bestandteile, beispielsweise des Nucleus und des Zytoplasmas, jede der einzelnen Spezies der Leukozyten, die metachromatisch in einer -einem Synergismus ähnlichen Weise reagieren, um eine Differenzierung hinsichtlich des spektralen Ansprechens zu erzeugen, die zu den beschriebenen zytochemisch möglichen Fortschritten führt. Im wesentli-

chen absorbiert (oder absorbiert nicht) jede weiße Blutzellenart einen einzigen metachromatischen Farbstoff in einer etwas ungewöhnlichen und einzigartigen Art und Weise/ so daß jede Zelle mit absorbiertem Farbstoff bei Anregung mit gewöhnlichem weißem Licht und bei Fluoreszenz-Emission ein individuelles und unterschiedliches Lichtspektrum wiedergibt. Seltsamerweise sind die hier beschriebenen Farbstoffe sowohl bei weißem Licht wie bei Fluoreszenz-Emission metachromatisch.

Es ist geläufig_f daß bestimmte granuläre Leukozyten gegenüber verschiedenen Farbstoffen unterschiedliche Affinitäten aufweisen, d.h. basophile zeigen eine Affinität gegenüber basischen Farbstoffen, eosinophile weisen eine Affinität gegenüber sauren Farbstoffen auf/ während neutrophi-Ie weder mit sauren noch mit basischen Farbstoffen intensiv angefärbt werden, wobei davon ausgegangen wird, daß die morphologischen Merkmale und das chemische Verhalten die Spezifität von Basischorange Nr. 21 in bezug auf klaren Unterschiede ausmachen, die bei der vorstehend beschriebenen bimodalen Lichtanregung zwischen T-Lymphozyten und B-Lymphozyten festgestellt worden sind, ferner auf die ungewöhnliche Unterscheidung der Bänder.

Dies ist um so überraschender/ als festgestellt worden ist, daß Basischorgange Nr. 22/ dessen chemische Struktur sich lediglich in der vorstehend erwähnten Abänderung zweier sekundärer Gruppenpositionen unterscheidet , für den erfindungsgemäßen Zweck völlig unwirksam ist.

Die Identifizierung, Differenzierung und Aufzählung von Monozyten ist von großer diagnostischer Bedeutung. Eine zunehmende Anzahl von Monozyten im Blut weist auf die Anwesenheit von aktiver Tuberkulose, Septikämie oder Blutvergiftung sowie Lymphomas, wie die Hodgkin-Krankheit bei der Diagnose hin. Eine Zunahme der Anzahl der Monozyten im Blut von Personen, die sich von hypoplastischer oder aplastischer Anämie erholen, kann eine günsti-

ge Prognose für den Patienten ankündigen. Eine schnelle und genaue mikroskopische Analyse von Monozyten bei den beiden Lichtarten begünstigt die ausgedehnte Anwendung einer wertvollen Technik.

Die Feststellung, Identifizierung und Aufzählung von polymorphkernigen Leukozyten (neutrophilen) stellt einei kritischen Parameter bei allen Blutbestimmungen dar. Sie sind vor allem bei der Diagnose von akuten Infektionen, wie

IQ Lungenentzündung oder Bauchfellentzündung von entscheidender Bedeutung, bei denen die Zahl der neutrophilen Zellen anwächst. Sie sind bei der Überwachung von Patienten von Bedeutung, die chemotherapeutisch oder strahlungstherapeutisch behandelt werden. Eine abnehmende Anzahl kann

lg bei einer starken Infektion auftreten, wie sie sich bei ArzneimittelVergiftungen, einer Hyperaktivität der Milz und bei akuter Leukämie zeigt.

Wenn die absolute Neutrophilenzählung unter 1000 mm sinkt, steigt das Infektionsrisiko an. Der erfindungsgemäße spezifische Farbstoff färbt sofort die Granula oder Lysosomen an, die bei einer oder beiden beschriebenen Lichtquellen charakteristisch sind, um die Struktur der polymorphnuclearen Leukozyten oder Neutrophilen zu identifizieren.

Eosinophile Zellen spielen bei einer allergischen Reaktion eine Rolle, desgleichen die basophilen. Lymphozyten spielen bei Entzündungen eine Rolle und in einem

3Q größeren Ausmaß bei Immunreaktionen und Reaktionen auf Antigene (Fremdkörper). Eosinophile Zellen werden hier sofort anhand der großen orangen Körnchen in dem Zytoplasma identifiziert/ ferner anhand der lobulären Struktur des ungefärbten Nucleus bei Lichtabsorption und der ungewohnlichen Fluoreszenz der Schale, wenn die angefärbte Blut- oder Gewebeprobe zum Fluoreszieren aigeregt wird.

Eosinophilenzählungen werden bei der medizinischen Verab-

reichung des adrenocorticotropen Hormons ACTH bei der Behandlung unter klinischen Bedingungen durchgeführt. Nach den bisherigen Methoden wurden Artefakte und undefinierbare Formen, die verwechselbar ähnlich sind, mit eosoniphilen Zellen verwechselt. Die Genauigkeit der Blutzellenzählung nach dem Stand der Technik nimmt mit der Zeit zwischen der Blutprobenpräparierung und der Beendigung der Zählung ab. Mehrfachfarbstoffe wurden im wesentlichen verwendet. Häufig ist eine saure und eine basische Anfärbung erforderlich. Die nach dem Stand der Technik verwendeten Farbstoffe neigen dazu, beim Stehen aus der Lösung auszukristallisieren.

Lymphozyten, die als Klasse spezifisch mit Borrelblau identifizierbar sind, sind bekannt, daß sie mit Entzündungen und der Immunität zusammenhängen . Ihre Zahl erhöht sich im Blut von Personen mit chronischer lymphatischer Leukämie und bei Personen mit Pertussis (Keuchhusten). Die Zählrate kann bei Patienten herabgesetzt sein, die einer Chemotherapie oder Radiotherapie unterzogen werden, bei Patienten mit Lymphoma und bei verschiedenen Arten von vererbbaren immunologischen Störungen.

Basophile haben ein Zytoplasma, das große Körnchen enthält, die reich an kationischen Substanzen, wie Heparin, Serotonin und Histamin sind. Sie spielen beispielsweise bei allergischen Reaktionen eine Rolle.

Der Hauptvorteil der Erfindung ist darin zu sehen, festgestellt zu haben, daß gegenwärtig ein einziger Farbstoff existiert, der Lymphozyten differenziert anfärbt/ die bisher lediglich als eine Klasse mit Borrelblau bei niedrigen Temperaturen angefärbt wurden und der in einer einzigen reinen Form sowohl zur manuellen wie automatischen Identifizierung und sowohl im weißen Lichtspektrum wie im Fluoreszenzspektrum verwendet werden kann, um zwei Arten der überprüfung eines zu untersuchenden mikroskopischen Zellenfeldes jeder angegebenen Spzies zu ergeben.

Die bekannten Untersuchungen von T-Zellen und B-Zellen zu deren Differenzierung umfassen kompliziertere biochemische Präparationen und Verfahren, einschließlich: 1. Säurephosphatase (Enzyme); 2. nichtspezifische Esterase; 3. Fragmente von menschlichen Immunoglobulinen (IgG); 4. nicht metachromatische fluoreszierende Farbstoffe; und 5. Präparationen roter Blutzellen von Schafen (SRBC), die eine Lebensdauer von etwa 14 Tagen aufweisen und die Grundlage für die Rosettenbildung zur Identifizierung der T-Zellen darstellen und temperaturabhängig sind.

T-Lymphozyten werden zu 60 bis 80 % im peripheren Blut und zu 85 bis 90 % im Brustlymphgang aufgefunden. Es ist bekannt, daß diese Zellen mit der Allograftabstoßung zusammenhängen, wobei sowohl die T-Zellen wie die B-Zellen in der Immunologie und Pathologie eine große Rolle spielen. Die B-Zellen kommen zu 10 bis 30 % im germinalen Zentrum sowie im Rückenmark vor.

Drogenabhängige zeigen eine auffallende Verminderung der T-Zellen.

Die größte Zahl der kongenitalen immunologischen Störungen weist einen Zusammenhang mit dem T-Zellen- und B-ZeI-lensystem auf. Auch ist bekannt, daß das immunogenetische System bei neoplastischen Krankheiten eine Rolle spielt, wobei Abnormalitaten des T-Lymphozyten- und B-Lymphozytensystems festgestellt wurden. Ein Erwachsenen-Lymphomas gehen sehr häufig auf B-Zellen zurück. Ein Kinder-Lymphomas weist andererseits T-Zellenanzeichen auf, wobei angenommen wird, daß dies mit einem aktiveren Thymus während der frühen Kindheit zusammenhängt.

Chronische lymphozytische Leukämie ist B-zellenabhängig, wobei leukämische Zellen B-Zellen sind und keine T-Zellenansammlungen aufweisen. Aus dieser kurzen Darstellung ist die weitreichende Bedeutung einer leichten Identifizierung, eines Vergleichs und einer Zählung dieser Zellen deutlich.

Die Bezeichnung "metachromatisch" dürfte zuerst von Erh- lieh (1897) benutzt worden sein, um einen Farbstoff zu beschreiben, der seine Farbe deutlich ändert, wenn er von bestimmten Zellen absorbiert wird. Der Farbstoff zeigt Metachromasie, welche eine Eigenschaft relativ weniger reiner Farbstoffe ist, hauptsächlich basischer kationischer Farbstoffe, einschließlich Methinen, Polymethinen und Carbocyanines die Gewebeteile mit verschiedenen Farben anfärben. Metachromatisch wird auch dadurch definiert, daß verschiedene Substanzen zu verschiedenen Farbspektren führen, wenn sie mit dem gleichen Farbstoff angefärbt werden. Die Fluoreszenz-Metachromasie ist sehr selten. In der Zytologie sind metachromatische Körnchen jene, die eine Farbe annehmen, die anders ist als die des Farbstoffs, der zu ihrer Anfärbung benutzt wurde.

Im Zusammenhang mit der vorstehenden Erörterung der Bezeichnungen "metachromatisch" und "Metachromasie" sind zwei Faktoren zu nennen. Einer ist die biologische Zelle (und ihre spezialisierten Teile), die "metachromatisch" und "chromotrop" bezeichnet wird und ein Wesensmerkmal und eine Eigenschaft der biologischen Zellprobe darstellt, und der andere ist die Qualität des Farbstoffs. Sehr wenige Farbstoffe besitzen die wesentliche Eigenschaft, Strukturen in der Zelle bei Absorptions- und Fluoreszenz-Verfahren zur Metachromasie anzuregen. Conn (9. Auflage) berichtet, daß "es nur eine geringe Anzahl reiner Farbstoffe gibt, die diese Reaktion zeigen". Es konnten nur wenige Berichte ermittelt werden, die andeuten, daß das Phänomen mehr als zwei unterschiedliche Farbspektren umfaßt. In einem Fall wurde von "einem hellgrün-blauen Nucleus-Färbemittel mit einer violetten Metachromasie für Knorpel" berichtet. Bei Farbstoffen, die normalerweise bei fixierten Geweben angewendet werden, deren chemische und physikalische Natur sich durch das übliche Präparationsverfahren vor dem Anfärben ändert, also die wesentliche Wechselwirkung zwischen dem Charakter der natürlichen

biologischen Strukturen innerhalb einer Zellprobe (kann sich hierdurch ändern und unempfindlich werden gegenüber etwas, was sonst reagiert), so daß eine Farbstoffabsorption nicht erfolgt.

Fluoreszenz-Farbstoffe sind geläufig. Bei der Fluoreszenz wird in einem ausgewählten schmalen Frequenzbereich mehr Lichtenergie emittiert als bei diesen ausgewählten Frequenzen absorbiert wird, obgleich das gesamte reflektierte Licht nicht mehr als das gesamte absorbierte Licht darstellt. Die fluoreszierende Metachromasie ist bekannt. Bestimmte Farbstoffe der Acridinchromophoren-Klasse können metachromatisch fluoreszierend sein. In der älteren Patentanmeldung P 31 09 252 ist diese Bezeichnung in überein-Stimmung mit der Bezeichnung verwendet worden, die in Conn (9. Auflage) und Gurr "Synthetische Farbstoffe in der Biologie, Medizin und Chemie" sowie Gurr, "Vernünftige Verwendung von Farbstoffen in der Biologie" zu finden ist, wo eine Bezugnahme auf die "fluoreszierende Metachromasie" nicht festzustellen ist. Nach der Erfindung ist festgestellt worden, daß wenige ungewöhnliche in der älteren Anmeldung P 31 09 252 beschriebene Farbstoffe zweifach metachromatisch sind und Gegenstand der Erfindung sind.

Von besonderem Interesse und am vielversprechendsten ist die Klasse der Methin-, Polymethine Chinolin- und Carbocyanin-Farbstoffe, bei denen die angegebenen chromophoren Gruppen Brücken zwischen anderen chromophocen Gruppen der kationischen Klasse bilden. Häufig wird beispielsweise eine Methin- oder Polymethingruppe festgestellt, die eine Brücke zwischen einem oder mehreren Chinolin aufweisenden Chromophoren bildet.

Nach Hinterlegung der älteren Anmeldung P 31 09 252 stellte sich zuerst Basischorange Nr. 21, ein Polymethinfarbstoff, als vielversprechend für die weiße Blutzellenklassifizierung heraus, wobei Proben anderer Basischorange-Farbstoffe, die nach dem "Colour Index" identifiziert werden,

nämlich Nr. 22, 27, 42, 44 und 46, gefunden und bezüglich der Metachromasie überprüft wurden. Diese Farbstoffe werden der Polymethinklasse zugeschrieben. Basischorange Nr. 24, 25, 26 und 28 wurden gleichfalls überprüft. Letztere gehören nicht zu den Polymethinen. Von sämtlichen überprüften Basischorange-Farbstoffen, einschließlich Polymethin- und Methinbssischorange-Farbstoffen, erwies sich lediglich Basischorange Nr. 21-Farbstoff für den erfindungsgemäßen Zweck geeignet.

Basischrot Nr. 13 und Basischviolett Nr. 16 der Polymethin-Klasse, die in der älteren Anmeldung P 31 09 252 beschrieben sind, haben sich als bimodal metachromatisch erwiesen und geeignet zur Monozyten-Blutzellen-Identifizierung.

Die Untersuchungen wurden ausgedehnt, um sich auf ähnliche und erhältliche Methin- und Polymethinrot- und -violett-Farbstoffe des "Colour Index" zu erstrecken.

Basischrot Nr. 14, 15, 27, 37, 68 und 102 ergaben bei An-Wendungstests, daß ihnen die Metachromasie-Eigenschaft fehlt, die für das Anfärben von Monozyten und/oder anderen Leukozyten bei Absorption wesentlich ist.

Basischrot Nr. 36 und 49 (alles Polymethine), die sich für die differentielle metachromatische Anfärbbng weißer Blutzellen nach der älteren Anmeldung P 32 08 629 als geeignet erwiesen, werden auch nach der Erfindung eingesetzt.

Basischviolett Nr. 7, 15, 16, 39 und 40 (wiederum alles Polymethine) haben sich als geeignet und wirksam herausgestellt. Hingegen entwickelte Basischviolett Nr. 14, das nach dem "Colour-Index" nicht als ein Polymethin klassifiziert wird, im Gegensatz zu Basischviolett Nr. 16 beim Anfärben von weißen Blutzellen keine Metachromasie bei der Absorption oder der Emissionsenergien.

Claims (11)

CorneJiusstnitc 15 ■ 8000 Min..::, V'.-i LAWRENCE KASS 1939 Ridge Road, Hinckley, Cleveland, Ohio 44233, USA Verfahren zur differentiellen Bestimmung der Entwicklungsstufen neutrophiler, granulozytischer Zellen und anderer Leukozyten mittels metachromatischer Farbstoffadsorption und einer Fluoreszenzlicht-Emissionseinrichtung Patentansprüche

1.) Mikroskopisches Verfahren zur Analyse menschlicher Blut-Leukozyten und -Lymphozyten sovjie der Entwicklungsstufen der neutrophilen_? granulozytischen Zellen, die in einer Donorprobe vorliegen^ in einer fixiermittelfreien, wässrigen Umgebung unter Einwirkung einer Fluoreszenzlicht-Emissionsenergiequelle zur Verbesserung der Identifikation, der Zählung sowie der Untersuchung der in der Probe vorhandenen Monozyten, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe mit einer wässrigen Lösung eines basischen, kationischen, guarternären,organischen Farbstoff angefärbt wird, der aus einer Gruppe ausgewählt wird, die aus Basischorgange Nr. 21, Basischrot Nr. 13, Basischrot Nr₀ 36, Basischrot Nr. 49, Basischviolett Mr. Ί, Basischviolett Nr. 15, Basischviolett Nrο 16, Basischviolett ^r₀ 36, Basischviolett Nr. 39

':330A795

sowie Basischviolett Nr. 40 besteht, und die angefärbte Probe einer Emissions-^ Wellenenergie ausgesetzt wird, um die dem Farbstoff ausgesetzten Zellen zur
Fluoreszenz anzuregen, wobei eine emittiertes
Fluoreszenzlicht liefernde Einrichtung zur Differenzierung der in der Probe vorhandenen Monozyten von allen anderen Blutzellen vorgesehen ist.

2. Verfahren zur Analyse menschlicher Blut-Leukozyten und -Lymphozyten sowie der Entwicklungsstufen der neutrophilen, granulozytischen Zellen, die in einer Donorprobe vorliegen, in einer fixiermittelfreien wässrigen Umgebung unter Einwirkung einer Fluoreszenzlicht-Emissionsenergiequelle, zur Verbesserung der Differenzierung jeder der einzelnen Zellspezies in erkennbare, zählbare Zellspezies, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe mit einer wässrigen Lösung von Basischorange Nr. 21 angefärbt wird, und die angefärbte Probe einer Emissions-Wellenenergie ausgesetzt wird, um die dem Farbstoff ausgesetzten Zellen zur Fluoreszenz anzuregen, wobei eine optische Einrichtung zur Differenzierung jeder der in der Probe vorhandenen Zellen in Zellspezies, die optisch gegenüber einander identifizierbar sind, wirksam wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Blutzellen, die in der Donorprobe vorhanden sind, die dieselben enthält, eine oder mehrere der folgenden Spezies umfassen: Myeloblasten, Promyelozyten, Myelozyten,
Metamyelozyten, Bänder, Neutrophile, Eosinophile,
Lymphozyten, Basophile, Monozyten, B-Lymphozyten und T-Lymphozyten, dadurch gekennzeichnet, daß jede vorhandene Zelle mit Hilfe des emittierten Fluoreszenzlichts gegenüber den anderen differentiell optisch
identifizierbar ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2„ dadurch gekennzeichnet, daß die Anregung der Fluoreszenzlicht-Emissionsenergie zumindest teilweise von dem kohärenten Licht eines Laserstrahls herrührt.

5. Mikroskopisches Verfahren zur supravitalen Analyse menschlicher normaler oder pathologischer Blut-Leukozyten und -Lymphozytenj, die in einer Donorprobe vorhanden sind«, in einer wässrigen, fixiermittelfreien Umgebung,, dadurch gekennzeichnet, daß (a) die Probe dem Farbstoff Basischorange Nr. 21 ausgesetzt wird,

(b) jede der in der Probe vorhandene angefärbte Spezies durch Einwirkung von Wellenenergie zur Fluoreszenz angeregt wird und jede der Blutzellen voneinander durch die Gegenwart oder die Abwesenheit einer charakteristischen Fluoreszenzfarbe und -Musters des Nucleus und des Zytoplasmas sowie durch die Zahl, die Größe, die Anordnung, die Muster und die Fluoreszenzfarbe oder - farben, die von den vorhandenen Körnchen emittiert werden, der Größe,, Zahl und Lage der Körnchen in dem Zytoplasma_f falls vorhanden, differenziert wird.

6. Mikroskopisches Verfahren zur vergleichenden supravitalen Analyse menschlicher oder pathologischer Blut-Leukozyten und -Lympnozytenj, die in einer Donorprobe vorhanden sind„ die eine oder mehrere der folgenden Spezies umfaßts Myeloblasten, Promyelozyten, Myelozyten, Metamyelozyten, Bänder, Neutrophile, Eosinophile, Lymphozytenj, Basophile, Monozyten, B-Lymphozyten und T-Lymphozyten, dadurch gekennzeichnet, daß jede dieser Spezies gegenüber einander durch getrennte selektive Einwirkung sowohl einer Adsorption weißen Lichts wie einer Fluoreszenzlicht-Emission optisch identifizierbar gemacht wird, wobei die Identifizierung der Spezies der vorhandenen vorstehend genannten Zellen durch optische, für diese Spezies charakteristische Muster er-

-A-

folgt, sowie durch die unterschiedlichen Eigenschaften des von dem Nucleus, dem Zytoplasma und den Körnchen dieser Blutzellen reflektierten und/oder emittierten Lichts , welches unter der vorstehenden bimodalen Lichteinwirkung beobachtet wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine gesunde normale Donorprobe zum Vergleich mit einer zweiten Donorprobe vermutlich pathologischen Ursprungs untersucht wird, um eine Diagnoseinformation zu erhalten.

8. Mikroskopisches Verfahren zur fixiermittelfreien, supravitalen menschlichen Blutzellen-Analyse, dadurch gekennzeichnet, daß eine optische Differenzierung, Vergleich und Zählung von T-Lymphozyten und B-Lymphozyten, die in der Donorprobe vorhanden sind, durch wässriges metachromatisches Anfärben mit Basischorange Nr. 21-Farbstoff durchgeführt wird, und die angefärbte Probe einer Fluoreszenzlicht-Anregungsenergiequelle ausgesetzt wird, um die vorhandenen T-Zellen von den B-Zellen zu differenzieren durch eine Ansammlung hellgelber fluoreszierender Körnchen in dem Zytoplasma der T-Zellen, die eine geringe fluoreszierende mattgrüne Färbung des Nucleus aufweisen können, sowie der vorhandenen B-Zellen, deren Zytoplasma im wesentlichen frei von fluoreszierenden Körnchen und/oder fluoreszierender Farbe ist, wobei der Nucleus derselben jedoch eine mattgrüne Fluoreszenz zur erforderlichen Identifikation zeigt.

9. Mikroskopisches Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß eine ähnliche Bandzellen enthaltende Probe einer Fluoreszenzlicht anregenden Energiequelle ausgesetzt wird, wobei die Bandzellen von den anderen Blutzellen differenziert werden durch

ο α β» m

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eine relativ kleine Ansammlung hellgelber fluoreszierender Körnchen in Teilen des Zytoplasmas, die ein Muster aufweist, die den mittleren Abschnitt des im wesentlichen farblosen Nucleus im wesentlichen gabelförmig teilt=

10. Mikrokopisches Verfahren zur supravitalen menschlichen Blutanalyse, dadurch gekennzeichnet, daß eine optische Differenzierung _e Vergleich und Zählung jeder der einzelnen granulozytischen myeloiden Serien, einschließlich, falls vorhandenj, der Promyelozyten, Myelozyten, Metamyelozyten, Bänder und Neutrophilen durch metachromatische Anfärbung von wenigstens einer supravitalen, fixiermittelfreien menschlichen Blutprobenfraktion durch Kontakt mit Basischorange Nr. 21—Farbstoff lösung in wässriger Umgebung durchgeführt wird, wobei die Promyelozyten durch fluoreszierende hellgelbe primäre Körnchen auf einer Seitenfläche des Zytoplasmas^ die Myelozyten durch eine relativ gleichförmige Verteilung der hellgelben primären Körnchen über das Zvtoplasma, die Metamyelozyten durch eine kleinere Masse fluoreszierender hellgelber primärer Körnchen in dem kleineren sichelförmigen Abschnitt gegenüber einem unangefärbten klaren Vorsprung des Zytoplasmas in den Nucleus , die Bänder durch eine relativ kleine Ansammlung primärer hellgelber fluoreszierender Körnchen in einem dominierenden Feld des Zytoplasmas , wobei im allgemeinen die Masse des Nucleus gabelförmig geteilt wird, und die Neutrophilen durch ein weniger unterschiedliches Zytoplasma , das eine tiefgrüne Fluoreszenz zeigt, wobei die Körnchen hellgelb fluoreszieren, differenziert werden, wobei jeder Vertreter der vorstehenden Serie eine anscheinend abnehmende proportionale Fläche (Volumen) des Nucleus, der im wesentlichen ungefärbt ist- aufweist, wobei die ersten drei Vertreter der

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im allgemeinen eine insgesamt größere Zellfläche (Volumen) als die anderen beiden Vertreter der Serie aufweisen.

11. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die wesentliche Blutzellen-Differenzierung mit einer automatischen Leukozyten-Zähleinrichtung erfolgt, die zur bimodalen Welleneinergieeinwirkung auf das gefärbte mikroskopische Feld , das die Zellen umfaßt, die der Analyse unterworfen werden, in der Lage ist, wobei getrennte Okulareinrichtungen zur Beobachtung des gleichen Feldes unter jeder modaler Einwirkung vorgesehen sind.