DE2515966A1 - Verbesserte vorgefaerbte objekttraeger fuer die blutuntersuchung - Google Patents
Verbesserte vorgefaerbte objekttraeger fuer die blutuntersuchungInfo
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Description
BOEHRINGER MÄNNHEIM GMBH 2OO6
Das sogenannte Differential-Blutbild gehört zu den am häufigsten
durchgeführten mikroskopischen Methoden. Hierbei werden die einzelnen Blutpartikel (Erythrozyten, Leukozyten und Thrombozyten
etc.) mit Farbstoffen selektiv angefärbt, wodurch die mikroskopische Differenzierung und die Erkennung von pathologischen
Veränderungen ermöglicht wird. Die bisher üblichen Färbeverfahren (z.B. na^h Wright, May-Grünwald oder Pappenheim)
beinhalten mehrere Arbeitsschritte wie z.B. Blutausstrich,
Fixieren, z.T. mehrfaches Färben, Waschte und Trocknen und
sind daher recht umständlich. Außerdem ist die Qualität der Anfärbung stark von der Qualität der Farbstoffe, sowie von
übung und Erfahrung der damit befaßten Personen abhängig.
Es hat daher nicht an Versuchen gefehlt, diese Verfahren zu vereinfachen. In jüngerer Zeit ist in der DOS 2.153.673 ein
Verfahren beschrieben, welches sich sogenannter vorgefärbter
Objektträger bedient, die mit Methylenblau N und Kresylviolettacetat
beschichtet sind. Wird auf diese Objektträger ein Tropfen Blut aufgebracht und mit einem Deckgläschen bedeckt, so kann
nach ca. 5 Min. mikroskopiert werden. Hierbei ist neben der Differenzierung der verschiedenen Leüko&ytenformen und der
Thrombozyten, zusätzlich die Erkennung von jugendlichen Erythrozyten,
der sogenannten Retikulozyten möglich. Dies ist, neben der einfachen ur.d sicheren Handhabung, ein weiterer
Fortschritt gegenüber dem herkömmlichen Differentialblutbild.
Trotz des unbestreitbaren Fortschritts, den dieses Verfahren
erbrachte, weist es aber auch einige gravierende Nachteile auf.
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So sind die Färbungen allgemein relativ stumpf, diffus und kontrastarm,
ferner lassen sich die drei verschiedenen Formen der granulierten Leukozyten (Eosinophile, Neutrophile und Basophile) nur
schwierig differenzieren.
Es wurde überraschenderweise nun gefunden, daß man vorgefärbte Objektträger erhält, die kontrastreiche und leuchtende Färbungen
ergeben und die eine sichere Differenzierung der Granulozyten ermöglichen, wenn man die Farbstoffe Methylenblau N und Kresylviolettacetat
in hochgereinigter Form in einem Gewichtsverhältnis von Ii. 1,5 bis 1:5 einsetzt. Vorzugsweise wird Methylenblau N
als Monohydrochlorid anstelle des handelsüblichen Zinkdoppelsalzes
eingesetzt.
Aus der DOS 2,153,673 geht nicht hervor, von welcher Qualität die
verwendeten Farbstoffe waren. Die Tatsache, daß bei aer Herstellung der Farbstoff-Lösungen von ungelösten Rückständen abfiltriert
werden soll, läßt auf handelsübliche Qualitäten schließen. In der Tat wurden bei der Nacharbeitung der DOS mit handelsüblichen
Farbstoffen vorgefärbte Objektträger erhalten, deren Färbeeigenschaften denen in der DOS (S.5-6) entsprachen.
Die Reinigung von Mikroskopierfarbstoffen ist im allgemeinen nicht üblich. So werden oftmals schon seit Jahrzehnten Farbstoffe
von zweifelhafter Reinheit benutzt, die sonst zur Textilfärbung verwendet werden. Bei vielen Farbstoffen ist zudem nicht
bekannt, ob und welche Verunreinigungen das Färbeergebnis beeinflussen. So ist es z.B. nicht verwunderlich, daß die amerikanische
Biological Stain Commission als wichtigstes Kriterium bei der Spezifikation eines Farbstoffs die Brauchbarkeit in bestimmten
Färberezepturen ansieht und für die Gehaltsbestimmung lediglich
photometrische und reduktometrische, aber keine chromatographischen
Methoden vorschreibt {vgl. z.B. R.D, Lillie "Conn's Biological
Stains", 8. Aufl., Williams and Wilkins Comp. Baltimore 1969,
S. 10-14, 416-417).
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Diese photometrischen und reduktometrischen Methoden geben aber
höchstens Aufschlüsse über den Gesamtfarbstoffgehalt und nicht über etwaige färbende Verunreinigungen.
Methylenblau N (Neumethylenblau, CI. Basic Blue 24, 3,7-Bis-(N-äthylamino)-2,8-dimethylphenothiazoniumchlorid)
ist als ca. 50-70 %ige Ware im Handel erhältlich und weist nach unseren Befunden bei der dünnsehiehtchromatographischen Analyse 3-4
Nebenilecken in wechselnder Menge auf« Der Rest ist Zinkchlorid
und Natriumchlorid. Es wurde von uns gefunden, daß eine ausgezeichnete Reinigung durch Lösen in Wasser und Ausfällen des
Hydrochlorides mit Salzsäure erfolgen kann. Man erhält so ein chromatographisch reines Produkt, das nur noch ca. 0,5 % Zinkchlorid
enthält und in Form des Monohydrochlorids vorliegt.
Kresylviolettacetat (Cresylechtviolett, Cresyl Fast Violett
Acetate, 5,9-Diaminobenzo(a)phenoxazoniuiri-acetat) ist im Handel
mit mehr oder weniger großen Mengen Natriumacetat verunreinigt erhältlich. Auch hier weist die dünnschichtchromatographische
Analyse 3 Nebenflecken in wechselnder Menge auf. Die Reinigung kann wie folgt vorgenommen werden:
Zuerst wird durch vorsichtiges Digerieren in Wasser das Natriumacetat
entfernt. Danach wird in Methanol gelöst und mit Äther ausgefällt. Die Wiederholung dieser Prozedur liefert ein chromatographisch
reines Produkt.
Die so gereinigten Farbstoffe lösen sich im Gegensatz zu den Handelsprodukten
rückständefrei in Methanol und können in der in
der DOS 2.153.673 (Seite 4) beschriebenen Weise auf Objektträger ausgestrichen werden. Sie können auch gemäß DOS 2.424.955 in
Wasser gelöst und zusammen mit Polyoscyäthylen-sorbitan-monopalmitat
(Tween 80) aufgebracht werden.
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- 251596b
Es ist weiterhin sehr erstaunlich, daß man nur dann brauchbare
Objektträger mit den überraschend verbesserten Eigenschaften erhält, wenn man das Verhältnis der zwei Farbstoffe zwischen
1:1,5 und 1:5 wählt. In der DOS 2.153.673 wird nämlich umgekehrt
behauptet und beansprucht, daß das Verhältnis 3:1 bzw. gemäß DOS 2.424.955 2,5:1 sein soll und merkliche ."Abweichungen
tunlichst zu vermeiden sind.
Eine bevorzugte Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung
erhält man, wenn man die Farbstofflösung gemäß unserer
am gleichen Tage eingereichten Anmeldung (int.
Nr. 2005) auf die Objektträger aufsprüht.
Die gereinigten Farbstoffe werden dabei in Gesamtmengen von ca. 0,5 bis 10 f/cm auf die Objektträger aufgebracht. Das Verhältnis
von Methylenblau N zu.Kresylvxolettacetat darf dabei
zwischen den Werten von 1:1,5 bis 1:5 variieren.
Die erfindungsgemäßen vorbeschichteten Objektträger werden wie in der DOS 2.153.673 (Seite 4-5) beschrieben, mit einem Blutstropfen
und danach mit einem Deckgläsdhen versehen und nach.
ca. 3-5 Min. mit einem öliinmersionsobjektiv mikroskopiert.
Die Färbungen sind außerordentlich klar, kontrastreich und gut reproduzierbar. Gegenüber den in der DOS 2.153.673 (Seiten 5-6)
beschriebenen Färbecharakteristiken treten folgende Besonderheiten auf:
a) Die Granula der Eosinophilen sind leuchtend gelb gefärbt, gegenüber einer dort beschriebenen Orangefärbung.
b) Die,Granula der Basophilen sind orangerot gefärbt im Gegensatz
zur dort beschriebenen Purpurfärbung. Die als wirksames
identifizierendes Merkmal bezeichnete Orangefärbung tritt dort nur am Rand der Zelle bei geeigneter Fokussierung auf.
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c) Die Konturen'der Kerne sind außerordentlich, klar erkennbar,
was die Differenzierung von Lymphozytenf Monozyten und den
verschiedenen Reifestadien der Granulozyten sehr erleichtert«
Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen diagnostischen Mittel
besteht darin, daß die Färbungen nicht mehr von. den Qualitätsschwankungen
der handelsüblichen Farbstoffe abhängen. Bei der technischen Herstellung großer Stückzahlen ist die Reproduzierbarkeit
bezüglich F?„rb«toffauftrag und -zusammensetrrtr-.g vor.
größter Bedeutung.
Als Material für die Objektträger kann Glas verwendet werden. Sofern
die Farbstoffe gemäß unserer Anmeldung int. Nr. 2ΟΟ5 aufgesprüht
werden, können auch Kunststoffe verwendet werden, wobei die
Farbstoffe natürlich auch auf Deckgläsehen aus Glas oder Kunststoff aufgebracht sein können.
In den folgenden Beispielen soll die Erfindung näher erläutert werden, ohne sie jedoch im Hinblick auf die Reinigung der Farbstoffe
und ihre Anwendung zu beschränken.
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Beispiel 1
50 g Kresylviolefctacefcafc (Matheson Coleman & Bell) werden in
100 ml Wasser suspendiert und 15 Min. kräftig gerührt. Danach
wird der Farbstoff abgesaugt und zweimal laifc ]e lOO EtI eiskaltem
Wasser gewaschen« Der Filterrückstand wird ib 1,6 Itx. Methanol
tinter Erwärmen gelost und h&l ca« 30° von den unlöslichen Anteilen
abgesaugt. Das Filtrafc wird langsam unter Röhren mit 3,5 Itr,
Äther versetzt und unter Eiskühlung 30 Min. nachgerührfc« Die
gebildeten Kristalle werden abgesaugt, in 620 ipI Methanol unter
Erwärmen gelöst,- die Lösung auf 30° abgekühlt und der Farbstoff
durch Zugabe von 1,85 Itr. Äther unter Rühren und Eiskühlung
abgeschieden. Nach Absaugen und Waschen mit dreimal 12O ml
Äther-Methanol (3:l) erhält man nach trocknen über Diphosphorpentoxid
22 g Kresylviolefctacetafc in Form dunkelgrüner Kristalle.
Zusammensetzung: ca, 82 % Kresy 1 violettacetafc, 8 % Kresylviolettchlorid
und 10 % Wasser« Beim Erwärmen auf 15O° tritt Zersetzung
ein. Die Substanz ist nach chromatographischer untersuchung
(BC-Fertigplatte Kieselgel 6O F 254 Merck, taufmittelsystent
Butanol-Eisessig-Wasser 4:1:5) praktisch rein. R -Werfe: O«6,
In einem 4 Itr.-Dreihalskolben werden lOO g Methylenblau N
(New Methylene Blue - Matheson Coleman έ BeIl)In 1 Itr.
Wasser unter Rühren gelost und mit 1 3tr.konzentrierter
Salzsäure, d = lrl8r versetzt* Mach 4 Std. Rühren lauter
Eiskühlung, S Std. Stehen im Kühlsehrank bei -f-5° saugt man
die gebildeten Kristalle ab, wäscht mit 4OO.ml eisgekühlter
6 N Salzsäure und 5QO ml Äther« Man erhält 36,5 g schwarze,
metallisch glänzende Krisfcaller Versetzung ab 253°. Der ge-
3/1128
reinigte Farbstoff besteht aus 95-97 % Methylenblau N-chlorid-Hydrochlorid
und enthält 3-5 % Wasser. Zink ist nur noch in Spuren vorhanden. Der Farbstoff ist nach chromatographischer
Untersuchung (DC-Fertigplatte Kieselgel 60 F 254 Merck, Laufmittelsystem
n-Butanol-Eisessig-Wasser 4:1:5) praktisch rein. Rp-Wert: 0,5.
Es wird eine Lösung folgender Zusammensetzung unter Verwendung
der gemäß Beispiel 1 und 2 gereinigten Farbstoffe hergestellt:
Methylenblau N-Hydrochlorid 130 mg Kresylviolettacetat 27O mg
Methanol ad 1OO ml
Diese Lösung wird mit einem Wattebausch auf Objektträger als Film verstrichen und getrocknet oder aus eiiier 0r5 mm Breitstrahldüse
(SS 60 67228-45 der Fa. Spraying Systems) mit einem Sprühwinkel von ca. 25 im Abstand von 20 cm durch eine Maske
in einer Breite von 3 cm auf Objektträger gesprüht, die mit einer Geschwindigkeit von 1,5 m/min unter der Düse vorbeigeführt
werden.
Sprühdruck: lr2 atü; Flüssigkeitsdurchsatz durch die Düse: 10 ml/min.
Bei einer mittleren Tröpfchengröße von ca. 2O.u beträgt die auf-
1 '
gebrachte Färb stoff menge ca. 3 «ug/caa .
Auf so hergestellte vorgefärbte Objektträger wird ein Blutstropfen
von ca. 5-lOyUl aufgebracht und mit einem Deckglas
bedeckt. Mach ca. 3-5 Min. wird die Anfärbung unter dem Mikroskop
bei ca. 80O-fächer Vergrößerung unter Verwendung eines iJlimmersionsobjektivsCbeurteilt.
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Die einzelnen Partikel des Blutes stellen sich in folgender Anfärbung dar:
Retikulozyten: purpurfarbenes Netzwerk innerhalb der kaum angefärbten
Erythrozyten.
Neutrophile: purpurfarbener Kern innerhalb ein^s fein granulierten
fast farblosen Plasmas«
Eosinophile: purpurfarbener Ksrn innerhalb eines grob granulierten
gelben Plasmas,
Basophile:
dunkelpurpurfarbener Kern innerhalb eines mittelgroß kompakt granulierten orangerotfarbenen Plasmas,
Lymphozyten: purpurfarbener Kern mit hellpurpurfarbenem Plasma,
Monozyten: wie Lymphozyten, nur größer und mit mehr Plasma,
Thrombozyten: kleine purpurfarbene Partikel.
60 9843/J12
Claims (5)
- Patentansprüche/lΛ Verbesserte vorgefärbte Objektträger für die Blutuntersuchung, gekennzeichnet durch hochgereinigtes Methylenblau N und Kresylviolettacetat im Gewichtsverhältnis 1:1,5 bis 1:5,
- 2. Verbesserte vorgefärbte Objektträger gemäi> Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Methylenblau N als Monohydrochlorid vorliegt.
- 3. Verbesserte vorgefärbte Objektträger gemäß Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Farbstoffe av.fgesprüht sind.
- 4. Verwendung von chromatographisch reinem Methylenblau N und Kresylviolettacetat im Verhältnis 1:1,5 bis 1:5 zur Herstellung vorgefärbter Objektträger für die Blutuntersuchung.
- 5. Verbessertes Verfahren zur Blutuntersuchung, dadurch gekennzeichnet, daß man Chromatographiseh reines Methylenblau N und Kresylviolettacetat im Verhältnis 1:1,5 bis 1:5 auf vorgefärbten Objektträgern verwendet.609843/1128
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