DE2651060C3

DE2651060C3 - Differential-diagnostische Spermauntersuchung

Info

Publication number: DE2651060C3
Application number: DE2651060A
Authority: DE
Inventors: Carsten Andreas 6711 Heuchelheim Carstensen
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1976-11-09
Filing date: 1976-11-09
Publication date: 1980-06-26
Also published as: DE2651060A1; JPS6259264B2; US4185085A; DE2651060B2; JPS5386295A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur differential-diagnoslischen Spermauntersuchung.

Die wesentlichen Bestandteile des Spermas sind die to Spermatozoen und die Rundzellen, die ihrerseits in die Leukozyten und die Zellen der Spermiogenese zerfallen. Die morphologische Untersuchung von Spermatozoen ist für die Andrologie von großer Bedeutung. Die Unterscheidung zwischen normalen und pathologischen Spermien gibt wichtige Aufschlüsse bei Fertilitätsuntersuchungen. Eine genaue Unterscheidung dieser normalen und pathologischen Formen unter dem Mikroskop ist nur dann möglich, wenn die Spermien vorher angefärbt werden. Für die Anfärbung stehen eine Reihe von Methoden (z. B. die Methode nach Mayer/Stiasny sowie die Methode nach Papanicolaou) zur Verfügung, die aber in ihrer Anwendung meist sehr kompliziert sind.

So werden beispielsweise nach Papanicolaou (siehe C. Schirren, Praktische Andrologie, Berlin 1971, Seite 20) die Ausstriche 24 Stunden lang luftgetrocknet und 5 Minuten in einem Gemisch von 95%igen Alkohol und Äther (1 :1) fixiert. Die Ausstriche werden danach einer umfangreichen Behandlung unterzogen, die nacheinander folgende Teilschritte umfaßt:

jeweils 10 Sekunden eintauchen in eine absteigende

Alkoholreihe (80%, 70%, 50%)

10 Sekunden in destilliertes Wasser 3 Minuten in Haematoxilinlösung 10 Minuten oder länger in fließendes Wasser 2 Sekunden in 0,5%ige Salzsäure

5 Minuten in fließendes Wasser

jeweils 10 Sekunden in aufsteigende Alkoholreihe

(50%, 70%, 80%, 95% Äthanol)

2 Minuten Färbung in Orange G Lösung

5 Sekunden in 95% Äthanol

2 Minuten Färbung in Polychromlösung ea 65

jeweils 5 Sekunden abspulen des überschüssigen Farbstoffes in drei verschiedenen Gefäßen mit je 95% Äthanol

2 Minuten eintauchen in absolutem Alkohol

2 Minuten in einem Gemisch aus absolutem Alkohol und XyIoI(I : 1)

20 Minuten in Xylol

Diese Vorschrift ist ganz offensichtlich sehr umständlich, zeitraubend und nur von geschultem Laborpersonal durchführbar.

Es stellte sich daher die Aufgabe, ein wesentlich einfacheres, weniger zeitaufwendiges und auch von ungeschultem Laborpersonal durchführbares Verfahren zur differential-diagnostischen Spermauntersuchung zu suchen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man die zu bestimmende Probe auf einen vorgefärbten Blutbild-Objektträger gibt und nach Entwicklung der Anfärbung mikroskopisch untersucht. Vorgefärbte Blutbild-Objektträger sind bekannt, beispielsweise aus den Deutschen Offenlegungsschriften 25 15 966 und 2153 673. Hierbei stellen sich die Spermien in einer sehr kontrastreichen Färbung dar, während der Untergrund farblos bleibt.

Bevorzugte Ausgestaltungen des Verfahrens sind in den Patentansprüchen 2 bis 4 beschrieben.

Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung vorgefärbter Blutbild-Objektträger zur differential-diagnostischen Spermauntersuchung.

Um gute, zuverlässige Ergebnisse zu erhalten, empfiehlt es sich, als Entwicklungszeit für die Anfärbung mindestens 30 Minuten anzusetzen. Als besonders vorteilhaft hat sich ein Zeitraum von 1 bis 2 Stunden erwiesen. Sollen lediglich Übersichtsbeslimmungen durchgeführt werden, kann schon nach einer Wartezeit von 5 bis 10 Minuten mikroskopiert werden.

Die Spermatozoen weisen die folgenden Farbdifferenzierungen auf:

Innerhalb der Köpfe wird der Kern dunkelpurpur angefärbt. Das Plasma erscheint je nach Fokussierung orange bis hellviolett. Die Mitte erscheint bei pathologischer Vergrößerung ebenfalls hellviolett, während der Schwanz nur schwach angefärbt wird, aber deutlich zu sehen ist. Diese Art der Färbung gestattet eine hervorragende Differenzierung der verschiedenen normalen und pathologischen Spermatozoenformen.

Von den Rundzellen werden die Leukozyten so angefärbt, wie es in der Deutschen Offenlegungsschrift 25 15 966 beschrieben ist: Purpurfarbener Kern und je nach Art der Leukozyten fast farbloses, gelbes oder orangerotes Plasma.

Bei den Zellen der Spermiogenese (Spermatogonien, Spermatocyten und Spermiden) werden, wie bei den Spermatozoen, die Kerne dunkelpurpur und das Plasma hellviolett angefärbt, so daß sie aufgrund ihrer Morphologie leicht vcn den Leukozyten zu unterscheiden sind.

Dieses erfindungsgemäße Verfahren weist demnach gegenüber den herkömmlichen Anfärbemethoden die folgenden wesentlichen Vorteile auf:

— Die bisher übliche 24stündige Lufttrocknung entfällt, so daß die differential-diagnostische Spermauntersuchung am selben Tage möglich ist

— Für die Entwicklung der Anfärbung sind im allgemeinen lediglich 30 bis 120 Minuten Wartezeit erforderlich und nicht eine ca. einstündige, zahlreiche Manipulationen erfordernde Tätigkeit

— Die Anfärbung selbst ist extrem einfach durchführbar und auch von ungeschultem Personal zu bewerkstelligen. Die Differenzierung durch den Arzt ist ebenfalls einfach und problemlos.

Im Vergleich mit der herkömmlichen Papanicolaou-Färbung wurde überraschenderweise festgestellt, daß die erfindungsgemäße Methode

— eine bessere oder zumindest ebenso gute Differenzierung zwischen normalen und pathologischen Spermien

— eine Verminderung der Gefahr der Deformation und damit der Zahl der fälschlich als pathologisch einzuordnenden Formen

bewirkt

In folgenden Beispielen soll die Erfindung näher erläutert werden:

Beispiel 1

Erfindungsgemäß verwendbare, vorgefärbte Objektträger können beispielsweise nach dem in der Deutschen Offenlegungsschrift 25 15 966 beschriebenen Verfahren hergestellt werden.

Hierzu wird unter Verwendung entsprechend gereinigter Farbstoffe die folgende Lösung hergestellt:

Methylenblau N-Hydrochlorid 130 mg

Kresylviolettacetat 270 mg

Methanol ad 100 ml

Diese Lösung wird aus einer 0,5 mm Breitstrahldüse (SS 60 67228-45 der Fa. Spraying Systems) mit einem Sprühwinkel von ca. 25° im Abstand von 20 cm durch eine Maske in einer Breite von 3 cm auf Objektträger gesprüht, die mit einer Geschwindigkeit von 1,5 m/min unter der Düse vorbeigeführt werden.

Sprühdruck: 1,2 atü; Flüssigkeitsdurchsatz durch die Düse: 10 ml/min.

Bei einer mittleren Tröpfchengröße von ca. 20 μ beträgt die aufgebrachte Farbstoffmenge ca. 3 μg/cm².

Auf einen so hergestellten vorgefärbten Objektträger wird ein Tropfen verflüssigtes Ejakulat mittels einer Platinöse von 3 mm Durchmesser aufgebracht und mit einem Deckglas bedeckt Nach ca. 30 bis 120 Minuten wird die Anfärbung unter dem Mikroskop bei ca. lOOOfacher Vergrößerung unter Verwendung eines Öhmmersionsobjektives beurteilt

ίο Zehnmalige Untersuchung eines Ejakulates mit einem hohen Anteil normaler Formen ergab gute Übereinstimmung mit der Papanicoiaou-Färbung: 74 + 3% (ls-Streuung) normale Spermatozoen nach dem erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahren gegenüber 73 + 2% nach der Papanicolaou-Methode.

Beispiel 2

In gleicher Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde ein Ejakulat mit relativ wenig Normalformen untersucht. Hierbei zeigte sich, daß bei der Papanicolaou-Methode die Normalformen unterschätzt werden. Dies ist offenbar auf eine Deformation der Zellen durch das Färbeverfahren nach Papanicoiaou zuiückzuführen, die bei niedrigem Anteil an Normalformen stärker ins Gewicht fällt als bei hohem:

40 ±3% normale Spermien nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gegenüber
33 + 5% nach der Papanicolaou-Methode.

Beispiel 3

20 Ejakulate mit unterschiedlichen Normalformenanteilen an Spermatozoen wurden sowohl nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, wie in Beispiel 1 beschrieben, als auch nach der Papanicolaou-Methode

untersucht. In Übereinstimmung mit dem in den Beispielen 1 und 2 erhaltenen Ergebnis wurde bei hohem Anteil an Normalformen mit beiden Methoden übereinstimmende Werte, bei niedrigen Anteilen an Normalformen mit der erfindungsgemäßen Methode höhere Werte als mit der Papanicolaou-Methode gefunden. Die Ergebnisse sind in Abb. zusammengestellt.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur differential-diagnostischen Spermauntersuchung, dadurch gekennzeichnet, daß man die zu bestimmende Probe auf einen vorgefärbten Blutbild-Objektträger gibt und nach Entwicklung der Anfärbung mikroskopisch untersucht.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein vorgefärbter Blutbild-Objektträger verwendet wird, der als Farbkomponente Methylenblau N und Kresylviolettacetat enthält

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein vorgefärbter Objektträger verwendet wird, der als Farbkomponente cnromatographisch reines Methylenblau N und Kresylvioiettaceta-c im Verhältnis 1 :1,5 bis 1 :5 enthält

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß nach einer Entwicklungszeit für die Anfärbung von 5 bis 120 Minuten mikroskopiert wird.

5. Verwendung vorgefärbter Blutbild-Objektträger zur differential-diagnostischen Spermauntersuchung.

6. Verwendung vorgefärbter Objektträger, die als Farbkomponente Methylenblau N und Kresylviolettacetat enthalten, zur differential-diagnostischen Spermauntersuchung.

7. Verwendung vorgefärbter Objektträger, die als Farbkomponente chromatographisch reines Methylenblau N und Kresylviolettacetat im Verhältnis 1 :1.5 bis 1 :5 enthalten, zur differential-diagnostischen Spermauntersuchung.

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