DE2651060A1

DE2651060A1 - Differential-diagnostische spermauntersuchung

Info

Publication number: DE2651060A1
Application number: DE19762651060
Authority: DE
Inventors: Carsten Andreas Carstensen
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1976-11-09
Filing date: 1976-11-09
Publication date: 1978-05-11
Also published as: JPS6259264B2; JPS5386295A; DE2651060B2; DE2651060C3; US4185085A

Description

BOEHRINGER MAKIiHEIM GMBE 7 2106

Differential-diagnostische Spermauntersuchung

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein verbessertes Verfahren zur differential-diagnostischen Spermauntersuchung sowie die Verwendung vorgefärbter Objektträger zur Durchführung dieses Verfahrens.

Die wesentlichen Bestandteile des Spermas sind die Spermato.oen und die Rundzellen, die ihrerseits in die Leukozyten und die Zellen der Spermiogenese zerfallen. Die morphologische Untersuchung von Spermatozoen ist für die Andrologie von großer Bedeutung. Die Unterscheidung zwischen normalen und pathologischen Spermien gibt wichtige Aufschlüsse bei Fertilitätsuntersuchungen. Eine genaue Unterscheidung dieser normalen und pathologischen Formen unter dem Mikroskop ist nur dann möglich, wenn die Spermien vorher angefärbt werden. Für die Anfärbung stehen eine Reihe von Methoden (z.B. die Methode nach Mayer/Stiasny sowie die Methode nach Papanicolaou) zur Verfügung, die aber in ihrer Anwendung meist sehr kompliziert sind.

So werden beispielsweise nach Papanicolaou (siehe C. Schirren, Praktische Andrologie, Berlin 1971, Seite 20) die Ausstriche 24 Stunden lang luftgetrocknet und 5 Minuten in einem Gemisch von 95 %igen Alkohol und Äther (1:1) fixiert. Die Ausstriche werden danach einer umfangreichen Behandlung unterzogen, die nacheinander folgende Teilschritte umfaßt: ,

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jeweils 10 Sekunden eintauchen in eine absteigende Alkoholreihe (80 %, 7O %, 5O %)

10 Sekunden in destilliertes Wasser" 3 Minuten in Haematoxilinlösung

10 Minuten oder langer in fließendes Wasser 2 Sekunden in 0,5 %ige Salzsäure

5 Minuten in fließendes Wasser

jeweils IO Sekunden in aufsteigende Alkoholreihe (50 %, 7O %, 80 %, 95 % Äthanol)

2 Minuten Färbung in Orange G Lösung 5 Sekunden in 95 % Äthanol

5 Sekunden in 95 % Äthanol

2 Minuten Färbung in Polychromlösung ea 65

jeweils 5 Sekunden abspulen des überschüssigen Farbstoffes in drei verschiedenen Gefäßen mit je 95 % Äthanol

2 Minuten eintauchen in absolutem Alkohol

2 Minuten in einem Gemisch aus absolutem Alkohol und Xylol (1:1)

20 Minuten in Xylol

Diese Vorschrift ist ganz offensichtlich sehr umständlich, zeitraubend und nur von geschultem Laborpersonal durchführbar.

Es stellte sich daher die Aufgabe, ein wesentlich einfacheres, weniger zeitaufwendiges und auch von ungeschultem Laborpersonal durchführbares Verfahren zur differential-diagnostischen Spermauntersuchung zu suchen.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß die morphologischen Eigenschaften der Spermien in hervorragender Weise darstellbar sind, wenn auf vorgefärbte Blutbild-Objektträger, wie sie beispielsweise in den Deutschen Offenlegungsschrxften 15 966 und 21 53 673 beschrieben sind, 1 Tropfen Ejakulat aufgebracht, mit einem Deckgläschen bedeckt und nach Entwicklung der Anfärbung mikroskopisch untersucht wird. Hierbei stellen sich die Spermien in einer sehr kontrastreichen Färbung dar, während der Untergrund farblos bleibt.

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Um gute, zuverlässige Ergebnisse zu erhalten, empfiehlt es sich, als Entwicklungszeit für die Anfärbung mindestens 3O Minuten anzusetzen. Als besonders vorteilhaft hat sich ein Zeitraum von 1 bis 2 Stunden erwiesen- Sollen lediglich Übersichtsbestxmmungen durchgeführt werden, kann schon nach einer Wartezeit von 5 bis 10 Minuten mikroskopiert v/erden.

Die Spermatozoen weisen die folgenden Farbdifferenzierungen auf:

Innerhalb der Köpfe wird der Kern dunkelpurpur angefärbt. Das Plasma erscheint je nach Fokussierung orange bis hellviolett. Die Mitte erscheint bei pathologischer Vergrößerung ebenfalls hellviolett, während der Schwanz nur schwach angefärbt wird, aber deutlich zu sehen ist. Diese Art der Färbung gestattet eine hervorragende Differenzierung der verschiedenen normalen und pathologischen Spermatozoenformen.

Von den Rundzellen werden die Leukozyten so angefärbt, wie es in der Deutschen Offenlegungsschrift 25 15 966 beschrieben ist: Purpurfarbener Kern und je nach Art der Leukozyten fast farbloses, gelbes oder orangerotes Plasma.

Bei den Zellen der Spermiogenese (Spermatogonien, Spermatocyten und Spermiden) werden, wie bei den Spermatozoen, die Kerne dunkelpurpur und das Plasma hellviolett angefärbt, so daß sie aufgrund ihrer Morphologie leicht von den Leukozyten zu unterscheiden sind.

Dieses erfindungsgemäße Verfahren weist demnach gegenüber den herkömmlichen Anfärbemethoden die folgenden wesentlichen, technisch fortschrittlichen Merkmale auf:

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- Die bisher übliche 24-stündige Lufttrocknung entfällt, so daß die differential-diagnostische Spermauntersuchung am selben Tage möglich ist.

- Für die Entwicklung der Anfärbung sind im allgemeinen lediglich 3O bis 120 Minuten Wartezeit erforderlich und nicht eine ca. einstündige, zahlreiche Manipulationen erfordernde Tätigkeit.

- Die Anfärbung selbst ist extrem einfach durchführbar und auch von ungeschultem Personal zu bewerkstelligen. Die Differenzierung durch den Arzt ist ebenfalls einfach und problemlos.

Im Vergleich mit der herkömmlichen Papanicolaou-Färbung wurde überraschenderweise festgestellt, daß die erfindungsgemäße Methode

- eine bessere oder zumindest ebenso gute Differenzierung zwischen normalen und pathologischen Spermien

- eine Verminderung der Gefahr der Deformation und damit der Zahl der fälschlich als pathologisch einzuordnenden Formen

bewirkt.

In folgenden Beispielen soll die Erfindung näher erläutert werden:

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Beispiel 1

Erfindungsgemäß verwendbare, vorgefärbte Objektträger können beispielsweise nach dem in der Deutschen Offenlegungsschrift 25 15 966 beschriebenen Verfahren hergestellt werden.

Hierzu wird unter Verwendung entsprechend gereinigter Farbstoffe die folgende Lösung hergestellt:

Methylenblau N-Hydrochlorid 130 mg Kresylviolettacetat 270 mg

Methanol ad 100 ml

Diese Lösung wird aus einer 0,5 mm Breitstrahldüse (SS 60 67228-45 der Fa. Spraying Systems) mit einem Sprühwinkel von ca. 25° im Abstand von 20 cm durch eine Maske in einer Breite von 3 cm auf Objektträger gesprüht, die mit einer Geschwindigkeit von 1,5 m/min unter der Düse vorbeigeführt werden.

Sprühdruck: 1,2 atü; Flüssigkeitsdurchsatz durch die Düse: 10 ml/min.

Bei einer mittleren Tröpfchengröße von ca. 20 /u beträgt

die aufgebrachte Farbstoffmenge ca. 3 /ug/cm .

Auf einen so hergestellten vorgefärbten Objektträger wird ein Tropfen verflüssigtes Ejakulat mittels einer Platinöse von 3 mm Durchmesser aufgebracht und mit einem Deckglas bedeckt. Nach ca. 30 bis 120 Minuten wird die Anfärbung' unter dem Mikroskop bei ca. 1000-facher Vergrößerung unter Verwendung eines Ölimmersionsobjektives beurteilt.

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Zehnmalige Untersuchung eines Ejaculates mit einem hohen Anteil normaler Formen ergab gute Übereinstimmung mit der Papanicolaou-Färbung:

74 + 3 % (Is-Streuung) normale Spermatozoen nach dem erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahren gegenüber 73 + 2 % nach der Papanicolaou-Methode.

Beispiel 2

In gleicher Weise/ wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde ein Ejakulat mit relativ wenig Normalformen untersucht. Hierbei zeigte sich, daß bei der Papanicolaou-Methode die Normalformen unterschätzt werden. Dies ist offenbar auf eine Deformation der Zellen durch das Färbeverfahren nach Papanicolaou zurückzuführen, die bei niedrigem Anteil an Normalformen stärker ins Gewicht fällt als bei hohem:

40 + 3 % normale Spermien nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gegenüber
33 + 5 % nach der Papanicolaou-Methode.

Beispiel

20 Ejakulate mit unterschiedlichen Normalformenanteilen an Spermatozoen wurden sowohl nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, wie in Beispiel 1 beschrieben, als auch nach der Papanicolaou-Methode untersucht. In Übereinstimmung^ mit dem in den Beispielen 1 und 2 erhaltenen Ergebnis wurde bei hohem Anteil an Normalformen mit beiden Methoden übereinstimmende Werte, bei niedrigen Anteilen an Normalformen mit der erfindungsgemäßen Methode höhere Werte als mit der Papanicolaou-Methode gefunden. Die Ergebnisse sind in Abb. 1 zusammengestellt.

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Claims

' 26S1060 Patentansprüche

1. Verbessertes Verfahren zur differential-diagnostischen Spermauntersuchung, dadurch gekennzeichnet, daß man die zu bestimmende Probe auf einen vorgefärbten Blutbild-Objektträger gibt und nach Entwicklung der Anfärbung mikroskopisch untersucht.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein vorgefärbter Blutbild-Objektträqer verwendet wird, der als Farbkomponente Methylenblau N und Kresylviolettacetat enthält.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein vorgefärbter Objektträger verwendet wird, der als Farbkoniponente chromatographisch reines Methylenblau N und Kresylviolettacetat im Verhältnis 1 ι 1,5 bis 1:5 enthält. '

4. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 dadurch gekennzeichnet, daß nach einer Entwicklungszeit für die Anfärbung von 5 bis 120 Minuten mikroskopiert wird.

5. Verwendung vorgefärbter Blutbild-Objektträger zur differential-diagnostischen Spermauntersuchung.

6·» Verwendung vorgefärbter Objektträger, die als Farbkomponente Methylenblau N und Kresylviolettacetat enthalten, zur differential-diagnostischen Spermauntersuchung.

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ORIG!MAL

7. Verwendung vorgefärbter Objektträger, die als Farbkomponente chromatographisch reines Methylenblau Ή und Kresylviolettacetat im Verhältnis 1 : 1,5 bis 1:5 enthalten, zur differential-diagnostischen Spermauntersuchung.