DE2424955C3

DE2424955C3 - Verfahren zum Herstellen eines mikroskopischen Objektträgers

Info

Publication number: DE2424955C3
Application number: DE19742424955
Authority: DE
Inventors: John Auten Abington Pa. Geating
Original assignee: General Electric Co
Current assignee: General Electric Co
Priority date: 1973-05-24
Filing date: 1974-05-22
Publication date: 1981-04-23
Also published as: DE2424955B2; IT1012726B; FR2230993A1; JPS5526408B2; JPS5020822A; FR2230993B1; GB1473945A; DE2424955A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen eines mikroskopischen Objektträgers, der eine Beschichtung aus mindestens einem, für das differentielle Anfärben von Blutbestandteilen geeigneten Farbstoff trägt, durch Einbringen eines Überschusses an Farbstoff in ein Lösungsmittel, Auflösen des Farbstoffs, Entfernen des restlichen Farbstoffs aus der erhaltenen Lösung, Aufbringen der Lösung auf die Oberfläche eines Mikroskop-Objektträgers zur Bildung eines dünnen Lösungsmittelfilmes darauf und Trocknenlassen des dünnen Lösungsmittelfilmes.

Ein Verfahren der vorgenannten Art ist in der DE-OS 2J 53 673 beschrieben, wobei der Farbstoff aus einem Gemisch aus Methylenblau N und Kresylviolettazetat besteht und als Lösung in Methanol aufgebracht wird. Bezüglich weiterer Einzelheiten zum Anfärben der einzelnen Komponenten einer Blutprobe und zum Stand der Technik wird auf die genannte OS verwiesen.'

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60

65 Die Herstellung der Farbstofflösung nach der DE-OS 21 53 673 erfolgte durch Rühren des Farbstoffes in Methanol und anschließendes 16 — 24stündiges Stehenlassen. Ein ungelöster Rest wurde danach abfiltriert. Dieses Verfahren erweist sich damit als zeitaufwendig, und es ist auf ein Farbstoffgemisch und Methanol ais Lösungsmittel beschränkt

Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, das eingangs genannte Verfahren dahingehend zu verbessern, daß es schneller durchführbar und auf mehrere Farbstoffe bzw. -gemische sowie Wasser als Lösungsbzw. Dispersionsmittel anwendbar ist.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die Vereinigung folgender Merkmale:

a. der Farbstoff ist ausgewählt aus der Gruppe

(1) Methylenazurblau und Methylenblau NN;

(2) Methylenblau NN;

(3) Kresylviolett-Azetat;

(4) Toluidinblau O.

b. Das Lösungsmittel is! Wasser oder Methanol.

c. Das Auflösen des Farbstoffs erfolgt durch Einwirkenlassen von Schallenergie.

Die Verwendung von Wasser anstelle des teueren und entflammbaren Alkohols weist deutliche wirtschaftliche Vorteile auf und kann daher aus diesem Grunde für eine Produktion in großen Mengen bevorzugt sein. Für die Herstellung weniger Objektträger durch Verfahren von Hand in einer Menge, wie sie in den obigen Beispielen angegeben ist, kann Alkohol wegen seiner rascheren Verdampfung bevorzugt sein. Die Anwendung einer Schalldispersion ist in jedem Falle vorteilhaft, weil sie sowohl eine lange Wartezeit wie nach der obigen DE-OS bis zur ungefähren Sättigung vermeidet als auch, wie oben angegeben, brauchbare Färbemittel-Zubereitungen mit Farbstoffen herzustellen gestattet, die, in konventioneller Weise aufgelöst nur eine schwache Anfärbung ergeben. Für den letztgenannten Effekt ist kein spezifischer Grund bekannt. Da jedoch die verwendeten Farbstoffe, die kommerzielle Standardprodukte und in Begriffen ihrer Färbefähigkeit definiert sind und die wahrscheinlich Mischungen mindestens einiger Verbindungen darstellen, deren Verteilung durch ein einzelnes Farbstoffteilchen von der Oberfläche zum Zentrum variieren kann, ist es erklärbar, daß die durch die Schallvibrationen erzeugte kräftige Rührung zu Lösungen unterschiedlicher Eigenschaften führt, die für den erfindungsgemäßen Zvcck hervorragend geeignet sind. Obwohl in den von Hand ausgeführten Operationen, die in den verschiedenen Beispielen beschrieben sind, die Verwendung einer eintauchbaren Vibratorsonde bequem ist, ist es klar, daß für Herstellungen in größerem Maßstab die Schallenergie auch durch Vibrieren des ganzen Behälters oder in einem kontinuierlichen Verfahren durch Fließenlassen der Flüssigkeit mit dem festen Farbstoff über eine vibrierende Oberfläche angewendet werden kann, die zu groß ist, um als Sonde beschrieben zu werden.

Möglicherweise könnte ein ähnliches Ergebnis weniger bequem und weniger rasch durch Kugelmahlen des Farbstoffes in dem Lösungsmittel erzielt werden. Es wird auch darauf hingewiesen, daß die Verwendung der Bugriffe »Lösungsmittel« und »Lösung« im üblichen Sinne erfolgt, und es ist nicht beabsichtigt, die Möglichkeit auszuschließen, daß die Farbstoffe mindestens teilweise in filtrierbarer Suspension anstelle einer wirklichen Lösung im physikalisch-chemischen Sinne vorliegen.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird irgendeiner der vier verschiedenen Farbstoffe (gleiche Gewichtsteile von Methylenazurblau und Methylenblau, Methylenblau NN Kresylviolettazetat, Toluidinblau O) unter Anwendung einer Ukraschallsonde entweder in Methanol oder in Wasser unter Zugabe eines oberflächenaktiveii Mittels dispelgiert. Die filtrierte Lösung wird in einer dünnen Schicht auf einen sauberen Glasobjektträger aufgebracht und getrocknet

Zur Benutzung des fertigen Objektträgers wird ein Tropfen einer Blutprobe auf den so beschichteten Objektträger aufgebracht und breitet sich unter einem Deckglas gleichmäßig über den getrockneten Farbstoff aus. Nach einiger Minuten tritt ein differentielles Anfärben der verschiedenen Blutkomponenten ein.

Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Patentansprüchen 2 — 7 beschrieben.

Durch die folgenden Beispiele wird dip Erfindung näher erläutert

A Herstellung der Lösungen
durch Einwirkenlassen von Ultraschall

Die Lösung wurde hergestellt durch Zugabe einer bekannten Menge des Farbstoffes zu 5 ml des Lösungsmittels, d. h. Methylalkohol oder Wasser, in einem 22 χ 150-mm-Testrohr. Die Mikrosonde wurde so weit in das Testrohr eingeführt, daß bis zum Boden des Rohres noch etwa 5 mm Raum blieben. Um die erzeugte Wärme abzuführen, wurde das Testrohr in einen Siswasser enthaltenden Becher eingesetzt. Bei emer angegebenen Energieabgabe von etwa 60 Watt wurde 2 Minuten Energie zugeführt. Die erhaltene Lösung wurde durch das geeignete Whatman-Papier filtriert.

In der einzigen Figur der Zeichnung ist die dargestellte Ukraschallsonde 2 mit der Oszillationsenergiequelle 4 durch das Kabel 6 verbunden. Die Sonde ist in das Lösungsmittel 8 in dem Testrohr 10 eingetaucht, an dessen unterem Ende der ungelöste Farbstoff 12 verbleibt.

B Aufbringen des trockenen Filmes
Verwendung von oberflächenaktiven Substanzen

Wäßrige Farbstofflösungen gleichmäßig auf Glasob- « jektträger aufzubringen erwies sich als schwierig, d. h., der erhaltene Farbstoffilm war durchweg gestreift und ungleichmäßig. Ais Hauptursache wurde die relativ hohe Oberflächenspannung, die Wasser normalerweise hat, angenommen. Deshalb gab man ein oberflächenaktives Mittel [Polyoxyäthylen-(80)-Sorbitan-Monopalmilat] zu der Farbstofflösung hinzu, um die Oberflächenspannung zu verringern. Eine 1gew.-%ige wäßrige Lösung wurde hergestellt und zu jeder Lösung in der Menge von 5 Tropfen (0,2 ml) pro 5 ml Volumen hinzugegeben. Diese Behandlung erlaubte die Herstellung durchgehend gleichmäßiger Farbstoffilme.

Vorbereiten der Objektträger

Die auf den Standard-Glas-Mikroskop-Objektträgcr aufzubringende Farbstofflösui¹^ wird entweder in eine 1-ml-Spritze mit einer 26G-^aüci oder eine mit einem Gummibalg versehene Pasteur-Pipette eingebracht. Ein kleiner Tropfen der Farbstofflösung (Erfahrung ist erforderlich, um die genaue Menge zu bestimmen) wird auf ein Ende des Glas-Objektträgers aufgebracht. Die Kante des anderen Glas-Objektträgers wird entlang der flachen Oberfläche des ersten Objektträgers durch den Tropfen gezogen und die Flüssigkeit so zu einem dünnen Film ausgebreitet (diese Technik ist sehr ähnlich der, die beim Ausbreiten eines Bluttropfens entlang dem Objektträger bei der Vorbereitung einer üblichen Wright-Färbung angewendet wird). Mit Alkohol als Lösungsmittel trocknet der Farbstoffilm in 2 bis 3 Sekunden. Bei Wasser erfordert das Trocknen 8 bis 10 Minuten bei Umgebungstemperatur oder 2 bis 3 -Minuten bei 70 bis 80⁰C.

C Aufbringen des Blutes

Bei der Anwendung des Objektträgers für die mikroskopische Untersuchung und Diagnose wird folgendermaßen vorgegangen: Ein kleiner Blutstropfen (3 bis 5 Mikroliter), entweder einer frischen Probe peripheren Blutes oder eines in EDTA (Äthylendiamintetraessigsäure) aufbewahrten, wird in dem Zentrum des Farbstoffilmes angeordnet. Dann legt man ein 22x40-mm-Deckglas über den Tropfen und läßt sich diesen durch Oberflächenanziehung und Kapillarwirkung über die Oberfläche des Objektträgers ausbreiten. Die Flüssigkeit in der Blutprobe wird den Farbstoffilm wieder auflösen upd die dabei entstehende Lösung über die Blutzellen ausbreiten. Der Objektträger ist nach etwa 5 Minuten fertig für die mikroskopische Untersuchung.

Beispiel I

Wäßrige Zubereitung von Azurblau II

Zubereitung des Farbstoffes
Erforderliche Materialien

Azurblau Il (eine Mischung gleicher Gewichtsteile von Methylenazurblau und Methylenblau NN),
destilliertes V/asser,
Ukraschallsonde,

l°/oige wäßrige Lösung des obengenannter, Oberflächenaktiven Mittels.

Vorgehen

Zubereiten einer 8%igen Lösung durch Hinzufügen von 400 mg Azurblau II zu 5 ml destilliertem Wasser und Behandeln mit der Ukraschallsonde für 2 Minuten, wie vorstehend beschrieben,
Filtrieren durch Whatman-Papier Nr. 1,
Herstellen einer 1 :2-Verdünnung durch Zusammenschütten gleicher Volumina Wasser und Farbstoffiösung,

Zugeben von ausreichend oberflächenaktivem Mittel gemäß der obigen Beschreibung,

Anordnen in der Spritze oder Pasteur-Pipette und Verwenden zum Ausbreiten eines Films auf Mikroskop-Objektträgern gemäß der obigen Beschreibung.

Aktivitätsbereich

Brauchbare Anfärbeergebnisse, d. h. Färbungen ausreichend zur Differenzierung von weißen Zellen, können mit Verdünnungen dieser Zubereitung bis zu einschließlich 1 :10 erhalten werden.

Anfärbungseigenschaften

Der Farbstoff scheint metachrome (d. h. verschiedene Zellelemenle verschieden anzufärben) Eigenschaften zu haben, obwohl die Gesamtanfärbung vorwiegend blau oder blau-purpur ist. Das Anfärben ist meist ausschließlich auf das Kernmaterial konzentriert mit den zu vermerkenden Ausnahmen, daß bei dem Eosinophilen

die groben zytoplasmischcn Granuli dunkelblaurot und der Kern schwach blau gefärbt werden und bei dem Basophilen die Granuli gleichmäßig dunkelrot und die Kerne blaßblau anfärben.

Die Segmente aufweisenden Neutrophilen zeigen eine blaue Färbung variabler Intensität im Kern, die zytoplasmischen Granuli sind farblos oder sehr blaßgrün. Es gab jedoch eine Ausnahme: einige der segmentierten Neutrophilen zeigen große glatte, dunkelrot gefärbte Körper im Zyloplasma. Deren Identität konnte bisher nicht endgültig bestimmt werden.

Lymphozyten und Monozylen färben ähnlich wie mit Wrights-Färbemittel. Die Kerne haben alle verschiedene Blau-Schattierungen, sind jedoch andererseits nicht schwierig zu identifizieren.

Die Relikulozyten sind leicht sichtbar mit dunkelblaupurpurfarbigen Fäden, welche in dem sonst blaß gefärbten Erythrozyten hervorstechen. Die Plättchen färben dunkelblau und werden sowohl in Klumpen als auch einzeln gefunden.

Beispiel Il

Alkoholische Azurblau !!-Zubereitung

Zubereitung des Farbstoffes
Erforderliche Materialien

Azurblau Il - wie in Beispiel I,
Methylalkohol, p. a.,
Ultraschallsonde

Vorgehen

Herstellen einer 8%igen Lösung durch Hinzufügen von 400 mg des Farbstoffes zu 5 ml Methylalkohol,
Behandeln mit der Ultraschallsonde für 2 Minuten, während das Testrohr in einem Eiswasserbad gekühlt wird.

Filtrieren durch ein Whatman-Papier Nr. 1 oder Nr. 2,
Anordnen in einer Spritze oder Pipette und Verteilen auf Glas-Objektträgern für die Herstellung des Farbstoffilmes.

Aktivitätsbereich

Brauchbare Färbeergebnisse können mit Verdünnungen dieser Zubereitung bis zu und einschließlich 1 :2 erhalten werden.

Färbecharakteristiken

Das Aussehen unter dem Mikroskop unterscheidet sich von der mit Wasserlösung erhaltenen Färbung in zwei Punkten: Mit dieser Zubereitung sind rotgefärbte Körper in den aus Segmenten bestehenden Neutrophilen nicht zu sehen und die Granuli im Zytoplasma der in Segmente unterteilten Neutrophilen färben merklich dunkler, z. B. blaugrau für die alkoholische Mischung gegenüber einem durchscheinenden refraktiven Blau. Die Kerne in den Lymphozyten färben dunkelblau bis sehr blaßblau, wobei der Grund für diese Variation derzeit noch nicht klar ist. Die Basophilen zeigen \viederum ein definiert dunkelrot gefärbtes Zyloplasma, das meist die Kerne verdeckt. Die Eosinophüen haben tief rotblaue bis dunkle unregelmäßig türkisfarbene Granuli. Die Plättchen färben dunkelblau und die Retikulozyten zeigen dunkelpurpur färbende Fäden und unregelmäßig gestaltete Körper.

Beispiel 111

Methylenblau NN in wäßriger Zubereitung

Zubereitung des Farbstoffes
Erforderliche Materialien

Methylenblau NN, Farbindex-Nr.52030,
destilliertes Wasser,
Ultraschallsonde,

l°/oige Lösung des obengenannten oberflächenaktiven Mittels.

Vorgehen

Herstellen einer 8%igen Lösung von Methylenblau NN durch Zufügen von 400 mg des Farbstoffes zu 5 ml Wasser.

Behandeln für 2 Minuten mit der Ultraschallsonde, wie im einführenden Teil beschrieben.

Filtrieren durch Whatman-Papier Nr. I oder Nr. 2.
Herstellen einer 1 :5-Verdünnung durch Vermischen von 1 Teil Farblösung und 4 Teilen Wasser,

Hinzugeben von 5 Tropfen (0.2 ml) der Lösung des oberflächenaktiven Mittels,

Anordnen in einer Spritze oder Pipette und Verteilen 2) auf Objektträgern zur Herstellung eines Farbstoffilms.

Aktivitätsbereich

Angemessene Anfärbungsergebnisse können mit Verdünnungen dieser Zubereitung zwischen 1 :2 und «ι 1 : 25 einschließlich erhalten werden.

Färbungseigenschaften

Die Gesamt-Anfärbungseigenschaften mit dieser Zubereitung können als einfarbig blau mit verschiedest nen Intensitäten bezeichnet werden. Der Kontrast zwischen dem Kern und den Zytoplasmabcreichcn ist gut. obwohl die Differenzierung vorwiegend über morphologische Kriterien erfolgt. Eosinophile sind jedoch schwierig zu identifizieren, da offensichtliche Kontraste zwischen den sauren Zytoplasma-Granuli auf der einen Seite und den normalerweise dunkeltürkis färbenden Granuli der Neutrophilen nicht unmittelbar augenscheinlich sind. Ein mittleres Ausmaß an Erfahrung mit dem Farbstoff schafft die erforderlichen Kriterien.

Basophile zeigen dunkelblau gleichmäßig gefärbte Granuli, die häufig den Kern verdecken. Die Relikulozyten zeigen die üblichen dunkelblauen Fäden und/oder Körper, die in gutem Kontrast zum Rest des Erythrozyten stehen. Plättchen färben blau und sind gut sichtbar. Lymphozyten und Monozyten sind leicht unterscheidbar und zeigen ausgezeichnete Kontraste zwischen Kern und Zytoplasma.

v) Beispiel IV

Alkoholische Methylenblau NN-Zubereitung

Zubereitung des Farbstoffes
«ι Erforderliche Materialien
Methylenblau NN,
Methylalkohol, p. ?u
Ultraschallsonde.

_b- Vorgehen

Herstellen einer 8%igen Lösung von Methylenblau NN durch Zugeben von 400 mg Farbstoff zu 5 ml Alkohol.

Behandeln mit der Schallsonde für 2 Minuten unter Verwendung eines Eisbades zur Kühlung des Ansatzes während des Betreibens der Schallapparatur,
Filtrieren durch Whatman-Papier Nr. 1 oder Nr. 2,
Herstellen einer 1 :5-Verdünnung durch Vermischen eines Teils der Farbstofflösung mit 4 Teilen Alkohol,
Anordnen der Lösung in einer Spritze oder Pipette und Verteilen auf Glas-Objektträgern zur Herstellung des Farbstoffilms.

Aklivitätsbereich

Eine angemessene Anfärbung kann mit Verdünnungen von 1 :2 bis einschließlich 1:10 erhalten werden.

Färbungscharakteristiken

Die Färbungscharakteristiken sind im wesentlichen identisch mit denen der Wasserzubereitung. Unterschiede, wenn solche vorhanden sind, bestehen in subtilen Verschiebungen der Schattierung und Farbintensitäten und sind daher ihrer Natur nach subjektiv.

Beispiel V

Wäßrige Zubereitung von Kresylviolett-Azetat

Zubereitung des Farbstoffes
Erforderliche Materialien
Kresylviolett-Azetat,
destilliertes Wasser,
Schallsonde,

1 °/oige Lösung des obengenannten oberflächenaktiven MiUeIs.

Verfahren

Herstellen einer 8%igen Lösung durch Zugeben von 400 mg Kresylviolett-Azetat zu 5 ml Wasser,
2minütiges Behandeln mit der Schallsonde,
Filtrieren durch Whatman-Papier Nr. 1 oder Nr. 2 und Sammeln des Filtrats,

Herstellen einer 1 :10-Verdünnung des Filtrats durch Vermischen von einem Teil der Farbstofflösung mit 9 Teilen Wasser,

Zugeben von 5 Tropfen (0.20 ml) des oberflächenaktiven Mittels,

Anordnen in einer Spritze oder Pipette und Verteilen auf Glas-Objektträgern zur Herstellung des Farbstofffilms.

Aktivitätsbereich

Annehmbare Ergebnisse können mit dieser Zubereitung erhalten werden, wenn man Verdünnungen zwischen 1 : 5 und 1 :25 einschließlich verwendet.

Färbungscharakteristiken

Die Wasserzubereitung von Kresylviolett-Acetat zeigt eine allgemein blau färbende Wirkung im Kern, sehr ähnlich zu der mit Methylenblau NN und Azurblau IL Das Zytoplasma der Segmente aufweisenden Neutrophilen färbt blaßgelb, während die zytoplasmischen Granuli der Eosionophilen leuchtend gelbgrün färben mit einem eher blaßblauen Kern. Die Granuli in den kleineren Basophilen sind tief rot.

Retikulozyten werden mit dieser Farbstoffzubereitung nicht angefärbt. Plättchen färben blaßtürkis. Lymphozyten und Monozyten sehen sehr ähnlich der

Farbe aus, die mit den oben genannten Farbstoffen erhalten wird. Monozyten zeigen üblicherweise einen blau gefärbten Kern verschiedener Intensität.

Beispiel Vl

Alkoholische Zubereitung von Kresylviolelt-Acetal

Zubereitung des Farbstoffes
Erforderliche Materialien
Kresylviolett-Acetat,
Methylalkohol, p.a.,
Schallsonde.

Verfahren

Herstellen einer 8%igen Lösung durch Zugeben von 400 mg Kresylviolett-Acetat zu 5 ml Alkohol,
Behandeln mit der Schallsonde für 2 Minuten,
Filtrieren durch Whatman-Papier Nr. 1 oder Nr. 2 und Sammelndes Filtrats,

Herstellen einer 1 :5-Verdünnung durch Vermischen von 1 Teil Farbstofflösung mit 4 Teilen Alkohol,
Anordnen der erhaltenen Lösung in einer Spritze oder Pipette und Verteilen auf Glasobjektträger zur Herstellung des Farbstoffilms.

Aktivitätsbereich

Ein angemessenes Anfärben kann mit Verdünnungen dieser Zubereitung zwischen unverdünnt und 1 :25 einschließlich erhalten werden.

Färbungscharakteristiken

Das mikroskopische Gesamtaussehen der mit der alkoholischen Kresylviolett-Acetat-Zubereitung gefärbten Blutzellen, verglichen mit dem, das erhalten wird, wenn man es mit Methylenblau NN kombiniert oder die Wasserzubereitung von Kresylviolett-Acetat allein benutzt, zeigt einen deutlich röteren Farbton. Die segmentierten Neutrophilen haben scharf definierte rotblaue Kerne und ein blaßgelbes Zytoplasma. Die Eosinophilen zeigen ein leuchtend gelbes Zytoplasma.

Die Basophilen haben ein größenmäßig gleichförmig granuläres Zytoplasma, das dunkelrot färbt. Die Lymphozyten und Monozyten erscheinen wie erwartet, jedoch auch mit den blauroten Färbungscharakteristiken. Die Plättchen sind blaßtürkis. Retikulozyten sind nicht gefärbt.

r* _:._:_ ι a/i ι

η c ι b [; ι c ι vii

Wäßrige Zubereitung vonToluidinblau O

Zubereitung des Farbstoffes
Erforderliche Materialien

Toluidinblau O — Farbindex-Nr. 52040 (Basisblau 17).

destilliertes Wasser.
Schallsonde,

1 %ige Lösung des obengenannten oberflächenaktiven Mittels.

Verfahren

Herstellen einer 2%igen Lösung durch Zugeben von 100 mg Toluidinblau O zu 5 ml Wasser,
2minütiges Behandeln mit der Schallsonde,

IO

Filtrieren durch Whatman-Papier Nr. 1 oder Nr. 2 und Sammeln des Filtrats,

Herstellen einer 1 :2-Verdünnung durch Vermischen von I Teil der Farbstofflösung mit 1 Teil Wasser,

Zugeben von 10 Tropfen der l%igen Lösung des oberflächenaktiven Mittels,

Anordnen der Mischung in einer Spritze oder Pipette und Verteilen auf Glasobjektträger zur Herstellung Ji_o Farbstoffilms.

Aktivitätsbereich

Ein angemessenes Anfärben kann mit Verdünnungen dieser Zubereitung zwischen dem unverdünnten und I : 20 einschließlich erhalten werden.

Färbungscharakteristiken

Tciuidinblau O ergibt eine insgesamt blaue Farbe, die ähnlich der von Methylenblau NN und Azurblau II ist, jedoch einige subtile Unterschiede zeigt, insbesondere in den segmentierten Neutrophilen und den Lymphozyten. Zusätzlich wird die Anfärbungszeit bis zu einem Minimum von 10 Minuten und über 25 Minuten hinausgehend merklich erhöht. Die differentielle Unterscheidung kann jedoch nach 10 Minuten vorgenommen werden.

In dem, was die jüngeren segmentierten Neutrophilen zu sein scheinen, färben die Kerne dunkelblau mit variabler Intensität mit 1 bis 4 großen klaren engefärbten Hohlkörper-ähnlichen Bereichen im Zytoplasma jeder dieser Zellen. Der Rest des Zytoplasmas enthält ungefärbte brechungsfähige Teilchen. Es können auch große, unregelmäßig gestaltete Körper vorhanden sein, die dunkelrotblau färben. Die augenscheinlich älteren segmentierten Neutrophilen enthalten große aufgeblähte Kerne, die gleichmäßig blaßblau färben und Zytoplasma, das viele der großen unregelmäßigen dunkelrotblauen Körper enthält. Die klaren Hohlkörper-artigen Bereiche sind in diesen Zellen nicht zu sehen.

Die Monozyten zeigen blaßblaue Kerne mit nur leicht dunklerem, klarblauem Zytoplasma. Die Lymphozyten dagegen zeigen bestimmte Unterschiede in der Farbaufnahme durch den Kern: einige zeigen dunkelblau färbende Kerne mit klaren, leicht blauen Zytoplasmabereichen. Andere zeigen ausgeprägte, leicht blau färbende Kerne mit einem dunkelblau kontrastierenden gleichmäßigen Zytoplasma. Gelegentlich sind blaßtürkis gefärbte Teilchen im Zytoplasma beider Lymphozyien-Arten zu sehen.

Retikulozyten sind leicht identifizierbar durch die dunkelblauen Fäden oder Körper, die innerhalb der Erythrozyten sichtbar sind. Plättchen zeigen eine blaue bis dunkelblaue Anfärbung.

Eosinophile entha'ten große Granuli, die nach dem Fokussieren entweder dunkelblau oder dunkeltürkis erscheinen. Die Kerne färben sehr blaß gleichmäßig blau. Die kleineren Basophilen enthalten sehr dunkelpurpur färbende Granuli, die häufig den Kern überdecken.

Beispiel VIII

Wäßrige Zubereitung von
Methylenblau NN und Kresylviolett-Azetat

Zubereitung des Farbstoffes
Erforderliche Materialien

Methylenblau NN (Farbindex-Nr.52030),

Kresylviolett-Azetat oder Kresylechtviolett,

Polyoxyäthylen-(80)-Sorbitan-Monopalmitat,

l°/oige wäßrige Lösung,

destilliertes Wasser,

Schallsonde,

vorgewaschene Standard-Mikroskop-Objektträger (25 χ 75 mm),

Testrohre — 22 χ 150 mm,

Spritze mit 2&G-Nadcl oder Pastcurpipette mit Gummibalg.

Verfahren

Herstellen einer 6,4%igen Lösung von Methylenblau NN durch Auflösen von 320 mg des Farbstoffes in 5 ml destilliertem Wasser in dem 22 χ 150-mm-Testrohr,
Anordnen des Testrohres in einem geeigneten Halter und Einführen der Spitze der Schallsonde, so daß sie gerade den Boden des Rohres freiläßt.
Anschalten der Energie und Herstellen einer Lösung aus der Farbstoff-Wasser-Mischung durch Behandeln mit der Schallenergi? für 2 Minuten bei einer angegebenen Leistungsabgabe von etwa 60 Watt,
Filtrieren durch Whatman-Papier Nr. 1 oder Nr. 2.
Herstellen einer 8°/oigen Lösung von Kresylviolett-Azetat durch Auflösen von 400 mg des Farbstoffes in 5 ml destilliertem Wasser in dem 22 χ 150-mm-Rohr,
wie vorstehend beschrieben mit der Schallsonde behandeln und filtrieren.

Abmessen von 0,5 ml der filtrierten Methylenblau NN-Lösung in ein Testrohr und Hinzugeben von 4 Tropfen (0,16 ml) der Kresylviolett-Azetatlösung und 5 Tropfen (0,20 ml) der l%igen Lösung des oberflächenaktiven Mittels. Man erhält eine Arbeitslösung, die ausreicht, etwa 325 Objektträger vorzubereiten.

Anordnen der Arbeitslösung in der Spritze oder Pasteur-Pipette und einzelne kleine Tropfen auf ein Ende eines Glasobjektträgers aufbringen.

Einen anderen Glasobjektträger, der an einer Kante gehalten wird, zieht man durch den Tropfen entlang der flachen Oberfläche des ersten Objektträgers und verteilt auf diese Weise die Farbstofflösung.

Man läßt den Objektträger trocknen. Dies erfordert 8 bis 10 Minuten bei Umgebungstemperatur und -feuchtigkeit. Ein Trocknen in einem Warmluftofen (70 bis 8O⁰C) beschleunigt den Trockenvorgang, so daß dieser etwa 2 bis 3 Minuten erfordert

Färbungscharaktcristiken

Die Färbungscharakteristiken, die mit diesem Verfahren erhalten werden, sind ähnlich denen, die in der obengenannten DE-OS beschrieben sind.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Herstellen eines mikroskopischen Objektträgers, der eine Beschichtung aus mindestens einem, für das differentielle Anfärben von Blutbestandteilen geeigneten Farbstoff trägt, durch Einbringen eines Überschusses an Farbstoff in ein Lösungsmittel, Auflösen des Farbstoffs, Entfernen des restlichen Farbstoffs aus der erhaltenen Lösung, Aufbringen der Lösung auf die Oberfläche eines Mikroskop-Objektträgers zur Bildung eines dünnen Lösungsmittelfilmes darauf und Trocknenlassen des dünnen Lösungsmittelfilmes, gekennzeichnet durch die Vereinigung folgender Merkmale:

a. der Farbstoff ist ausgewählt aus der C ruppe

(1) Methylenazurblau und Methylenblau NN;

(2) Methylenblau NN:

(3) Kresylviolett-Azetat;

(4) Toluidinblau 0.

b. Das Lösungsmittel ist Wasser oder Methanol.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gektnnzeichnet, daß bei Verwendung von Wasser als Lösungsmittel ein oberflächenaktives Mittel zu der Lösung zugegeben wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der ausgewählte Farbstoff im wesentlichen aus gleichen Gewichtsteilen von Methylenazurblau und Methylenblau NN besteht.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der ausgewählte Farbstoff im wesentlichen aus Methylenblau NN besteht.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der ausgewählte Farbstoff im wesentlichen aus Kresylviolett-Azetat besteht.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der ausgewählte Farbstoff im wesentlichen aus Toluidinblau O besteht.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Schallenergie in der Weise einwirken läßt, daß man eine Vibrationssonde in das den ausgewählten Farbstoff enthaltende Wasser eintaucht.