DE2515966B2 - Vorgefärbte Objektträger für die Blutuntersuchung - Google Patents
Vorgefärbte Objektträger für die BlutuntersuchungInfo
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Description
2r>
Die Erfindung bezieht sich auf einen vorgefärbten Objektträger für die Blutuntersuchung, enthaltend
Methylenblau NN und Kresylviolettacetat.
Das sogenannte Differential-Blutbild gehört zu den am häufigsten durchgeführten mikroskopischen Methoden.
Hierbei werden die einzelnen Blutpartikel (Erythrozyten, Leukozyten und Thrombozyten etc.) mit
Farbstoffen selektiv angefärbt, wodurch die mikroskopische Differenzierung und die Erkennung von pathologischen
Veränderungen ermöglicht wird. Die bisher üblichen Färbeverfahren (z. B. nach Wright, May-G
r ü η w a I d und Pappenheim) beinhalten mehrere Arbeitsschritte wie z. B. Blutausstrich, Fixieren, z.T.
mehrfaches Färben, Waschen und Trocknen und sind daher recht umständlich. Außerdem ist die Qualität der
Anfärbung stark von der Qualität der Farbstoffe, sowie von Übung und Erfahrung der damit befaßten Personen
abhängig.
Es hat daher nicht an Versuchen gefehlt, diese Verfahren zu vereinfachen. In jüngerer Zeit ist in der
DE-OS 21 53 673 ein Verfahren beschrieben, welches sich sogenannter vorgefärbter Objektträger bedient, die
mit Methylenblau NN und Kresylviolettacetat beschichtet sind. Wird auf diese Objektträger ein Tropfen Blut
aufgebracht und mit einem Deckgläschen bedeckt, so kann nach ca. 5 Min. mikroskopiert werden. Hierbei ist
neben der Differenzierung der verschiedenen l.eukozytenformen
und der Thrombozyten, zusätzlich die Erkennung von jugendlichen Erythrozyten, der sogenannten
Retikulozyten möglich. Dies ist neben der einfachen und sicheren Handhabung, ein weiterer
Fortschritt gegenüber dem herkömmlichen Differentialblutbild.
Trotz des unbestreitbaren Fortschritts, den dieses Verfahren erbrachte, weist es aber auch einige
gravierende Nachteile auf.
So sind die Färbungen allgemein relativ stumpf, diffus
und kontrastarm, ferner lassen sich die drei verschiedenen Formen der granulierten Leukozyten (Eosinophile,
Neutrophile und Basophile) nur schwierig differenzieren.
y, Es wurde überraschenderweise nun gefunden, daß
man vorgefärbte Objektträger der eingangs beschriebenen Art erhält, die kontrastreiche und leuchtende
Färbungen ergeben und die eine sichere Differenzierung der Granulozyten ermöglichen, wenn die Farbstoffe
in chromatographisch reiner Form im Gewichtsverhältnis von 1 :1,5 bis 1 :5 enthalten sind.
Aus der DE-OS 21 53 673 geht nicht hervor, von welcher Qualität die verwendeten Farbstoffe waren. Die
Tatsache, daß bei der Herstellung der Farbstoff-Lösungen von ungelösten Rückständen abfiltriert werden soll,
läßt auf handelsübliche Qualitäten schließen. In der Tat wurden bei der Nacharbeitung der DE-OS mit
handelsüblichen Farbstoffen vorgefärbte Objektträger erhalten, deren Färbeeigenschaften denen in der DE-OS
(S. 5—6) entsprachen.
Die Reinigung von Mikroskopierfarbi'.iffen ist im
allgemeinen nicht üblich. So werden oftmals schon seit Jahrzehnten Farbstoffe von zweifelhafter Reinheit
benutzt, die sonst zur Textilfärbung verwendet werden. Bei vielen Farbstoffen ist zudem nicht bekannt, ob und
welche Verunreinigungen das Färbeergebnis beeinflussen. So ist es z. B. nicht verwunderlich, daß die
amerikanische Biological Stain Commission als wichtigstes Kriterium bei der Spezifikation eines Farbstoffs die
Brauchbarkeit in bestimmten Färberezepturen ansieht und für die Gehaltsbestimmung lediglich photometrische
und reduktometrische, aber keine chromatographischen Methoden vorschreibt (vgl. z. B. R. D. Li 11 ie
»Conn's Biological Stains«, 8. Aufl, Williams and Wilkins Comp. Baltimore 1969, S. 10-14,416-417).
Diese photometrischen und reduktometrischen Methoden gehen aber höchstens Aufschlüsse über den
Gesamtfarbstoffgehalt und nicht über etwaige färbende Verunreinigungen.
Methylenblau NN (Neumethylenblau, C. I. Basic Blue 24, 3,7-Bis-(r\-äthylamino)-2,8-dimethylphenothiazoniumchlorid)
ist als ca. 50—7O°/oige Ware im Handel erhältlich und weist nach unteren Befunden bei der
dünnschichtchromatographischen Analyse 3—4 Nebenflecken in wechselnder Menge auf. Der Rest ist
Zinkchlorid und Natriumchlorid. Es wurde von uns gefunden, daß eine ausgezeichnete Reinigung durch
Lösen in Wasser und Ausfällen des Hydrochlorides mit Salzsäure erfolgen kann. Man erhält so ein chromatographisch
reines Produkt, das nur noch ca. 0,5% Zinkchlorid enthält und in Form des Monohydrochlorids
vorliegt.
Somit ist eine bevorzugte AuiTührungsform des erfindungsgemäßen Objektträgers dadurch gekennzexhnet,
daß das Methylenblau NN als Monohydrochlorid vorlieg'..
Kresylvioleltacetat (Cresylcchtviolett, Cresyl Fast Violett Acetate, 5,l.'-Diaminobenzo{a)phenoxazoniumacetat)
ist im Handel mit mehr oder weniger großen Mengen Natriumacetat verunreinigt erhältlich. Auch
hier weist die dünnschichtchromatographische Analyse
3 Nebenflecken in wechselnder Menge auf. Die Reinigung kann wie folgt vorgenommen werden:
Zuerst wird durch vorsichtiges Digerieren in Wasser das Natriumacetat entfernt. Danach wird in Methanol
gelöst und mit Äther ausgefällt. Die Wiederholung dieser Prozedur liefert ein chromatographisch reines
Produkt.
Die so gereinigten Farbstoffe lösen sich im Gegensatz zu den Handelsprodukten rückstandsfrei in Methanol
und können in der in der DE-OS 21 53 673 (Seite 4) beschriebenen Weise auf Objektträger ausgestrichen
io
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werden. Sie können auch gemäß DE-OS 24 24 955 in Wasser gelöst und zusammen mit Polyoxyäthylen-sorbitan-monopalmitat
(Tween 80) aufgebracht werden.
Es ist weiterhin sehr erstaunlich, dal! man nur dann
brauchbare Objektträger mit den überraschend verbesserten Eigenschaften erhält, wenn man das Verhältnis
der zwei Farbstoffe zwischen 1 :1,5 und 1 :5 wählt. In
der DE-OS21 53 673 wird nämlich umgekehrt behauptet und beansprucht, daß das Verhältnis 3 : 1 bzw. gemäß
DE-OS 24 24 955 2,5:1 sein soll und merkliche Abweichungen tunlichst zu vermeiden sind.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erhält man, wenn man die
Farbstofflösung gemäß unserer am gleichen Tage eingereichten Patentanmeldung P 25 15 869.4 auf die
Objektträger aufsprüht.
Die gereinigten Farbstoffe werden dabei in Gesamtmengen von ca. 0,5 bis lOjVcm2 auf die Objektträger
aufgebracht Dp« Verhältnis von Methylenblau NN zu Kresvlviolettacetat darf dabei zwischen den Werten
von 1 :1,5 bis 1 :5 variieren.
Die erfindungsgemäßen vorbeschichteten Objektträger können wie die in der DE-OS 21 53 673 (Seite 4-5)
beschriebenen, mit einem Blutstropfen und danach mit einem Deckgläschen versehen und nach ca. 3—5
Minuten mit einem Ölimmersionsobjektiv mikroskopiert werden.
Die Färbungen sind außerordentlich klar, kontrastreich und gut reproduzierbar. Gegenüber den in der
DE-OS 21 53 673 (Seiten 5—6) beschriebenen Färbecharakteristiken treten folgende Besonderheiten aus:
a) Die Granula der Eosinophilen sind leuchtend gelb gefärbt, gegenüber eine* dort beschriebenen
Orangefärbung.
b) Üie Granula der Basophilen sind orangerot gefärbt
im Gegensatz zur dort beschriebenen Purpurfärbung. Die als wirksames identifizierendes Merkmal
bezeichnete Orangefärbung tritt dort nur am Rand der Zelle bei geeigneter Fokussierung auf.
c) Die Konturen der Kerne sind außerordentlich klar erkennbar, was die Differenzierung von Lymphozyten,
Monozyten und den verschiedenen Reifestadien der Granulozyten sehr erleichtert.
Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen diagno- *'■
stischen Mittel besteht darin, daß die Färbungen nicht mehr von den Qualitätsschwankungen der handelsüblichen
Farbstoffe abhängen. Bei der technischen Herstellung großer Stückzahlen ist die Reproduzierbarkeit
bezüglich Farbstoffauftrag und -zusammensetzung von w größter Bedeutung.
Als Material für die Objektträger kann Glas verwendet werden. Sofern die Farbstoffe gemäß
unserer Anmeldung P 25 15 869.4 aufgesprüht werden, können auch Kunststoffe verwendet werden, wobei die 5*>
Farbstoffe natürlich auch auf Deckgläschen aus Glas oder Kunststoff aufgebracht sein können.
In den folgenden Beispielen soll die Erfindung näher
erläutert werden.
40
60
Beispiel I
Reinigung von Kresylviolettacetat
Reinigung von Kresylviolettacetat
50 g Kresylvioletlacetat (Metheson Coleman & Bell) werden in 100 ml Wasser suspendiert und 15 Min.
kräftig gerührt. Danach wird der Farbstoff abgesaugt und zweimal mit je 100 ml eiskaltem Wasser gewaschen.
Der Filterrücks'and wird in 1,6 Itr. Methanol unter
Erwärmen gelöst und bei ca. 30° von den unlöslichen Anteilen abgesaugt. Das Filtrat wird langsam unter
Rühren mit 3,5 Itr. Äther versetzt und unter Eiskühlung
30 Min. nachgerührt. Die gebildeten Kristalle werden abgesaugt, in 620 ml Methanol unter Erwärmen gelöst,
die Lösung auf 30°Cabgekühlt und der Farbstoff durch Zugabe vor 1,85 Itr. Äther unter Rühren und Eiskühlung
abgeschieden. Nach Absaugen und Waschen mit dreimal 120 ml Äther-Methanol (3:1) erhält man nach
Trocknen über Diphosphorpentoxid 22 g Kresylviolettacetat in Form dunkelgrüner Kristalle. Zusammensetzung:
ca. 82% Kresylviolettacetat, 8% Kresylviolettchlorid
und 10% Wasser. Beim Erwärmen auf 1500C tritt Zersetzung ein. Die Substanz ist nach chromatographischer
Untersuchung (DC-Fertigplatte Kieselgel 60 F 254 Merck, Laufmittelsystem Butanol-Eisessig-Wasser
4:1:5) praktisch rein. RF-Wert: 0,6.
Beispiel 2
Reinigung von Methylblau NN
Reinigung von Methylblau NN
In einem 4 Itr.-Dreihalskolben werden 100 g Methylenblau
NN (New Methylene Blue — Matheson Coleman & Bell) in 1 Itr. Wasser unter Rühren gelöst
und mit 1 Itr. konzentrierter Salzsäure, d = 1,18, versetzt. Nach 4 Std Rühren unter Eiskühlung, 8 Std.
Stehen im Kühlschrank bei +5° saugt man die gebildeten Kristalle ab, wäscht mit 400 ml eisgekühlter
6 N Salzsäure und 500 ml Äther. Man erhält 36,5 g schwarze, metallisch glänzende Kristalle, Zersetzung ab
253°. Der gereinigte Farbstoff besteht aus 95—97% Methylenblau NN-chlorid-Hydroch!orid und enthält
3—5% Wasser, Zink ist nur noch in Spuren vorhanden. Der Farbstoff ist nach chromatographischer Untersuchung
(DC-Fertigplatte Kieselgel 60 F 254 Merck, Laufmittelsystem n-Butanol-Eisessig-Wasser 4:1 : 5)
praktisch rein Rk-Wert: 0,5.
Beispiel 3
Vorgefärbte Objektträger
Vorgefärbte Objektträger
Es wird eine Lösung folgender Zusammensetzung unter Verwendung der gemäß Beispiel 1 und 2
gereinigten Farbstoffe hergestellt:
Methylenblau NN-Hydrochlorid 130 mg
Kresylvioleitacetat 270 mg
Methanol ad 100 ml
Diese Lösung wird mit einem Wattebausch auf Objektträger als Film verstrichen und getrocknet oder
aus einer 0,5 mm Breitstrahldüse (SS 60 67228—45 der Fa. Spraying Systems) mit einem Sprühwinkel von ca.
25°C im Abstand von 20 cm durch eine Maske in einer Breite von 3 cm auf Objektträger gesprüht, die mit einer
Geschwindigkeit von 1,5 m/min unter der Düse vorbeigeführt werden.
Sprühdruck: 1,2 atü; Flüssigkeitsdurchsatz durch die
Düse: 10 ml/min.
Bei einer mittleren Tröpfchengröße von ca. 20 μ beträgt die aufgebrachle Farbstoffmenge ca. 3 μg/cm^.
Auf so hergestellte vorgefärble Objektträger wird ein Blutstropfen von ca. 5—10 μΙ aufgebracht und mit einem
Deckglas bedeckt. Nach ca. 3—5 Min. wird die Anfärbung unter dem Mikroskop bei ca. 800facher
Vergrößerung unter Verwendung eines ölimmersionsobjektivs beurteilt.
Die einzelnen Partikel des Blutes stellen sich in folgender Anfärbung dar:
5
kulozyten: groß kompakt granulierten orangerolfarbenen
purpurfarbenes Netzwerk innerhalb der kaum Plasmas,
angefärbten Erythrozyten. Lymphozyien:
trophile: purpurfarbener Kern mit hellpurpurfarbenem Piaspurpurfarbener Kern innerhalb eines fein granu- *>
ma. lierten fast farblosen Plasmas. Monozyten:
nophile: wie Lymphozyten, nur größer und mit mehr
purpurfarbener Kern innerhalb eines grob granu- Plasma,
lierten gelben Plasma. Thrombozyten:
jphile: ίο kleine purpurfarbene Partikel,
dunkelpurpurfarbener Kern innerhalb eines mittel-
Claims (5)
1. Vorgefärbter Objektträger fur die Blutuntersuchung,
enthaltend Methylenblau NN und Kresylviolenacetat, dadurch gekennzeichnet, daß
die Farbstoffe in chrcrnatcgraphisch reiner Form
und im Gewichtsverhältnis 1 :1,5 bis I :5 enthalten sind.
2. Objektträger gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Methyknblau NN als
Monohydrochlorid vorliegt
3. Objektträger gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Farbstoffe aufgesprüht
sind.
4. Verwendung von chromatographisch reinem >5 Methylenblau NN und Kresylviolettacetat im
Verhältnis 1 :1,5 bis 1 :5 zur Herstellung vorgefärbter
Objektträger für die Blutuntersuchung.
5. Verfahren zur Blutuntersuchung mit vorgefertigten Objektträgern, enthaltend Methylenblau NN >o
und Kresyivioieuaceiai, dadurch gekennzeichnet,
daß man einen Objektträger nach einem der Ansprüche 1 bis 3 verwendet.
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