PL107576B1 - Wstepnie barwione szkielka przedmiotowe do badania krwi - Google Patents

Description

Opis patentowy opublikowano: 29.11.1980 107576 Int. Cl.2 GOIN 33/16 G01N 1 30 G02B 21 34 Twórca wynalazku Uprawniony z patentu: Boehringer Mannheim GmbH., Mannheim (Republika Federalna Niemiec) Wstepnie barwione szkielka przedmiotowe do badania krwi Przedmiotem' wynalazku sa, wstepnie barwione szkielka przedmiotowe do badania krwi. Tak zwa¬ ny hemogram nalezy do najczesaiej przeprowadza¬ nych badan mikroskopowych. Poszczególne czastki krwi, jak erytrocyty, leukocyty, trombocyty itd., za¬ barwione sa przy tym przez barwniki selektywnie, co umozliwia mikroskoppwe róznicowanie i rozpo¬ znawanie zmian patologicznych.Stosowane dotychczas sposoby barwienia, na przyklad wedlug Wrighfa, May-Griinwald'a albo Pappenheim'a, skladaja sie z kilku etapów takich, jak na przyklad rozmaz krwi, utrwalenie, po czesci kilkakrotne barwienie, przemywanie oraz suszenie, i dlatego sa bardzo uciazliwe. Poza tym jakosc za¬ barwienia zalezy w duzym stopniu od jakosci barw¬ ników jak równiez od wprawy i doswiadczenia za¬ trudnionego przy tym personelu.Dlatego prowadzono szereg doswiadczen, maja¬ cych na celu uproszczenie tych metod. Pózniej opi¬ sany zostal w opisie patentowym RFN nr 2 153 673 sposób, w którym uzywa si§ wstepnie barwionych szkielek przedmiotowych pokrytych blekitem mety¬ lenowym Ni fioletem krezylowym w postaci octa¬ nu. Jezeli na takie szkielka przedmiotowe naniesie sie krople krwi i przykryje szkielkiem nakrywko¬ wym, to po uplywie okolo 5 minut mozna przepro¬ wadzac badanie mikroskopowe.Obok zróznicowania róznych form leukocytów i trombocytów mozliwe jest tu dodatkowo rozpozna¬ nie mlodych erytrocytów, tak zwanych retykulocy- tów. Poza prostym i pewnym stosowaniem jest to dalszym postepem w porównaniu z tradycyjnym hemogramem. Sposób ten, mimo niezaprzeczalnego postepu, wykazuje równiez kilka niedogodnosci, 5 a mianowicie wybarwienia sa na ogól wzglednie te¬ pe, dyfuzyjne i malo kontrastowe, poza tym z trudnoscia mozna róznicowac trzy rózne formy ziarenkowych leukocytów takich, jak eozynofile, neutrofile i bazofile. ia Niespodziewanie stwierdzono, ze przez stosowanie blekitu metylenowego N i fioletu krezylowego w po¬ staci octanu o bordzo duzym stopniu czystosci, w stosunku wagowym 1 : 1,5—1:5 wytwarza sie wstepnie barwione szkielka przedmiotowe, które 15 daja bardzo kontrastowe i blyszczace wybarwienia i umozliwiaja niezawodne róznicowanie granulocy1 tów. Korzystnie stosuje sie blekit metylenowy N w postaci monochlorowodorku zamiast handlowej podwójnej soli cynkowej. 20 Opis patentowy RFN nr 2 153 673 nie podaje ja¬ kiej jakosci byly stosowane barwniki. Fakt, ze przy wytwarzaniu roztworów barwników nalezalo odsa¬ czac nierozpuszczone pozostalosci, wskazuje na ja¬ kosc handlowa tych barwników. Istotnie przy od- 25 twarzania opisu patentowego z zastosowaniem barw¬ ników handlowych otrzymywano wstepnie barwione szkielka przedmiotowe, wlasciwosci barwienia któ¬ rych odpowiadaly danym opisu patentowego, strona 30 5—6. 107 576107 576 Oczyszczanie barwników mikroskopowych nie jest na ogól proste. Juz od dziesiatek lat stosowano cze¬ sto barwniki o watpliwej czystosci, a mianowicie barwniki, które sa poza tym stosowane do barwie¬ nia materialów wlókienniczych. Do tego, w przy¬ padku wielu barwników nie wiadomo, czy i jakie zanieczyszczenia wplywaja na wynik barwienia. Nie mozna sie wiec na przyklad dziwic, ze amerykanska Biological tain Commission jako najwazniejsze kry¬ terium przy wyszczególnianiu barwników, uwaza uzytecznosc .w okreslonych recepturach barwnikar- skich i dla oznaczania zawartosci wyznacza jedynie metody fotometryczne i reduktometryczne, a nie chromatograficzne (porównaj na przyklad R.D.Lillie „Conn's Biological Stains", 8 wydanie, Wil¬ liams and Wilkins Comp. Baltimore 1969, strony 10—14, 416—417). Te fotometryczne i reduktome¬ tryczne metody daja najwyzej informacje o calko- witej zawartosci barwników, a nie o ewentualnych zanieczyszczeniach barwiacych.Blekit metylenowy N (nowy blekit metylenowy, CI. Basic Blue 24, chlorek 3,7-bis-(N-etyloamino)- -2,8-dwumetylofenotiazoniowy) znajduje sie w han¬ dlu jako produkt okolo 50—70% i wykazuje wedlug naszych stwierdzen w analizie droga chromatografii cienkowarstwowej 3—4 plamki o zmiennych wiel¬ kosciach. Reszte stanowi chlorek cynkowy i chlorek sodowy.Stwierdzono, ze oczyszczanie blekitu 'metylenowe¬ go prowadzi sie doskonale przez rozpuszczenie go w wodzie i wytracenie chlorowodorku kwasem sol¬ nym. W ten sposób otrzymuje sie chromatograficznie czysty produkt w postaci monochlorowodorku, za¬ wierajacy tylko jeszcze okolo 0,5% chlorku cynko¬ wego.Fiolet krezylowy w postaci octanu (fiolet krezylo- wy trwaly, Cresyl Fast Violett Acetate, octan 5,9- -dwuaminobenzo(a) fenoksazoniowy) znajduje sie w handlu jako produkt zanieczyszczony wieksza lub " mniejsza iloscia octanu sodowego. Równiez tu ana¬ liza za pomoca chromatografii cienkowarstwowej wykazuje 3 plamki o zmiennych wielkosciach.Oczyszczanie fioletu krezylowego w postaci octanu prowadzi sie w nastepujacy sposób: najpierw usu¬ wa sie octan sodowy przez ostrozne ekstrahowanie ciepla woda, a nastepnie rozpuszczacie w metanolu i wytraca eterem. Przez powtórzenie tego procesu otrzymuje sie chromatograficznie czysty produkt.Oczyszczone w ten sposób barwniki, w przeciwien¬ stwie do produktów handlowych, rozpuszczaja sie w metanolu nie dajac pozostalosci i mozna je w sposób podany w opisie patentowym RFN nr 2 153 673, wysmarowac na szkielka przedmiotowe.Mozna je równiez wedlug ogloszeniowego opisu pa¬ tentowego RFN nr 2 424 955 rozpuscic w wodzie i naniesc razem z monopalmitynianem polioksyety- lenosorbitanu (Tween 80).Poza tym zaskakujacym jest fakt, ze uzyteczne szkielka przedmiotowe o znakomicie polepszonych wlasciwosciach otrzymuje sie wówczas, gdy uzyje sie dwa barwniki w stosunku 1:1,5—1:5. Wedlug opisu patentowego RFN nr 2 153 673 nalezy stosowac odwrotnie stosunek 3:1, a wedlug opisu patentowego RFN nr 2 424 955 powinien byc stosunek 2,5:1 i na¬ lezy unikac w miare mozliwosci widocznych od¬ chylen.Korzystna forma wykonania omawianego wyna¬ lazku jest naniesienie roztworu barwników na 5 szkielka przedmiotowe metoda natrysku.Calkowita ilosc naniesionych na szkielka przed¬ miotowe oczyszczonych barwników wynosi okolo 0,5-—10 y/cm2. Przy tym stosunek blekitu metyle¬ nowego N do fioletu krezylowego w postaci octanu moze zmieniac sie w granicach 1:1,5—1:5.Wstepnie pokryte szkielka przedmiotowe wedlug wynalazku stosuje sie w sposób opisany w opisie patentowym RFN nr 2 153 673, strona 4—5, to zna- czy smaruje sie krople krwi, przykrywa szkielkiem nakrywkowym i po uplywie okolo 3—5 minut pod¬ daje je badaniu mikroskopowemu z obiektywem im- ersyjnym.Zabarwienia sa nadzwyczaj przejrzyste, kontrasto- 20 we oraz dobrze powtarzalne. Wobec charakterystyki bary podanej w opisie patentowym RFN nr 2153 673, strona 5—6 wystepuja nizej podane odrebnosci: a) Ziarenka eozynofilówrsa zabarwione na blyszcza¬ cy zólty kolor, wobec tam opisanego zabarwienia 25 . pomaranczowego. b) Ziarenka bazofilów zabarwione na kolor poma- ranczowoczerwony w przeciwienstwie do opisanego tam zabarwienia purpurowego: Charakterystyczne zabarwienie pomaranczowe, jako skutecznie iden- 30 tyfikujaca cecha, wystepuje tam tylko na brzegu komórki'przy odpowiednim ogniskowaniu. c) Kontury jader sa wyjatkowo latwo rozpuszczalne, co bardzo ulatwia róznicowanie limfocytów, mo- nocytów i róznych stadiów dojrzalosci granulo- 35 cytów.Dalsza korzyscia srodków wedlug wynalazku jest to, ze wybarwienia nie zaleza od wahan jakosci barwników handlowych. Przy technicznym wytwa¬ rzaniu duzej liczby wstepnie pokrytych szkielek *o przedmiotowych ma bardzo duze znaczenie powta¬ rzalnosc pod wzgledem naniesienia i 'skladu barw¬ ników.Szkielka przedmiotowe mozna wytwarzac ze szkla, lecz mozna równiez stosowac szkielka z tworzyw 45 sztucznych, jezeli barwniki nanoszone sa przez na¬ tryskiwanie, przy czym oczywiscie barwniki mozna równiez nanosic na szkielka nakrywkowe ze szkla lub tworzyw sztucznych.Ponizsze przyklady objasniaja blizej wynalazek, nie ograniczajac jednak jego zakresu odnosnie oczyszczania barwników i stosowania go.Przyklad I. Oczyszczanie fioletu krezylowego w postaci octanu 55 50 g fioletu krezylowego w postaci octanu (Mathe- son Beil) zawiesza sie w 100 ml wody i miesza ener¬ gicznie przez 15 minut. Nastepnie barwnik odsacza sie pod zmniejszonym cisnieniem i przemywa go dwa razy woda lodowata, stosujac po 100 ml. Pozo- 60 stalosc na filtrze rozpuszcza sie podczas ogrzewania w 1,6 litra metanolu i w temperaturze okolo 30° odsacza nie rozpuszczone czesci pod zmniejszonym cisnieniem. Przesacz zadaje sie powoli, podczas mie¬ szania 3,5 litrami eteru, po czym miesza dalej przez, 65 30 minut przy chlodzeniu lodem.107 576 Utworzone krysztaly odsacza sie pod zmniejszo¬ nym cisnieniem, rozpuszcza je przy ogrzewaniu w 620 ml metanolu, roztwór oziebia do temperatury 30°, a nastepnie wytraca barwnik przez dodanie .1,85 litra eteru podczas mieszania i chlodzenia lodem.Po odsaczeniu pod zmniejszonym cisnieniem i trzy¬ krotnym przemyciu 120 ml mieszaniny eteru i me¬ tanolu w stosunku 3:1 otrzymuje sie po wysuszeniu nad pieciotlenkiem fosforu 22 g fioletu krezylowego w postaci octanu jako ciemnozielonych krysztalów.Sklad: okolo 82% fioletu krezylowego w postaci octanu, 8% fioletu krezylowego w postaci chlorku i 10% wody. Przy ogrzaniu do temperatury 150° na¬ stepuje rozklad.Wedlug badania chromatograficznego przy uzyciu gotowych plytek z zelem krzemionkowym 60 F 254 Merck a i jako eluentu mieszaniny butanolu, lodo¬ watego kwasu octowego i wody w stosunku 4:1:5, otrzymana substancja jest praktycznie czysta.Wartosc RF: 0,6.Przyklad II. Oczyszczanie blekitu metyleno¬ wego N W trójszyjnej kolbie o pojemnosci 4 litrów roz¬ puszcza sie podczas mieszania 100 g blekitu mety¬ lenowego N (New Methylene Blue — Matheson Cole- man & Bell) w 1 litrze wody i roztwór ten zadaje sie 1 litrem stezonego kwasu solnego o d=l,18. Ca¬ losc miesza sie w ciagu 4 godzin podczas chlodzenia lodem, nastepnie pozostawia na 8 godzin w szafie chlodniczej w temperaturze +5°, po czym utworzone krysztaly odsacza pod zmniejszonym cisnieniem, przemywa je 400 ml oziebionego lodem 6N kwasu solnego i 500 ml eteru. Otrzymuje sie w ten sposób 36,5 g czarnych krysztalów o metalicznym polysku,' których rozklad nastepuje w temperaturze 253°. Tak oczyszczony barwnik sklada sie z 95-97% N-chloro- wodorku blekitu metylowego i 3—5% wody. Cynk wystepuje tylko jeszcze w sladowych ilosciach.Badanie chromatograficzne przy uzyciu gotowych plytek z zelem krzemionkowym 60 F 254 Merck'a i jako eluentu mieszaniny n-butanolu, lodowatego kwasu octowego i wody w stosunku 4:1:5 wykazalo, ze barwnik jest praktycznie czysty. Wartosc Rf: 0,5.Przyklad III. Wytwarzanie wstepnie barwio¬ nych szkielek przedmiotowych Z barwników oczyszczonych sposobem wedlug przykladu I i II wytwarza sie roztwór o ponizszym skladzie: N-chlorowodorek blekitu metylenowego 130 mg * fiolet krezylowy w postaci octanu 270 mg metanol do 100 ml. 10 50 Roztwór ten wysmarowuje sie w postaci blonki na szkielku przedmiotowym za pomoca waty i su¬ szy albo natryskuje na szkielka przedmiotowe z dy¬ szy szerokostrumieniowej 0,5 mm (SS 60 67228-45 firmy Spraying Systems) przy kacie natrysku oko¬ lo 25° i odleglosci 20 cm przez maske o szerokosci 3 cm, przy czym szkielka przedmiotowe przeprowa¬ dzane sa pod dysza z szybkoscia 1,5 m/minute.Cisnienie natrysku 1,2 atn; natezenie przeplywu cieczy przez dysze: 10 ml/minute.Przy sredniej wielkosci kropelek okolo 20 u na¬ niesienie barwników wynosi okolo 3 j.tg/cm2. Na tak wytworzone wstepnie pokryte szkielka przedmio¬ towe nanosi sie krople krwi okolo 5—10 jil i na¬ krywa szkielkiem nakrywkowym. Po uplywie 3—5 minut zabarwienie ocenia sie pod mikroskopem przy powiekszeniu n okolo 800-krotnym, stosujac obiektyw imersyjny.Nizej podana jest charakterystyka zabarwien po¬ szczególnych czastek krwi. retykulocyty: purpurowa budowa siateczkowa w ob¬ rebie ledwie zabarwionych erytro¬ cytów, neutrofile: purpurowe jadro w obrebie drobno ziarenkowego, prawie bezbarwnego osocza, eozynofile: purpurowe jadro w obrebie grubo zia¬ renkowego zóltego osocza, bazofile: ciemnopurpurowe jadro w obrebie sredniej wielkosci zwartego ziarenko¬ wego osocza, limfocyty: purpurowe jadro z jasnopurpurowym osoczem, monocyty: jak limfocyty, tylko wieksze jadro i z wieksza iloscia osocza, trombocyty: male purpurowe czastki. PL

Claims (2)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Wstepnie barwione blekitem metylenowym N i octanem fioletu krezylowego szkielka przedmioto¬ we do badania krwi, znamienne tym, ze skladaja sie ze zwykle stosowanych szkielek przedmioto¬ wych, oraz naniesionej na nich blonki barwnika, która stanowia wysokiej czystosci blekit metyle¬ nowy N i octon fioletu krezylowego w stosunku wagowym 1:1,5—1:5.
2. 2. Wstepnie barwione szkielka przedmiotowe we¬ dlug zastrz. l; znamienne tym, ze zawieraja blekit metylenowy N w postaci monochlorowodorku. PL