CS205019B2 - Preliminary dyed supporting glass for the blood analysis - Google Patents

Description

Předmětem vynálezu je předběžně nabarvené podložní sklíčko.

Tak zvaný diferenciální krevní obraz patří k nejčastěji prováděným mikroskopickým metodám. Při nich se jednotlivé krevní částice (erytrocyty, leukocyty, trombocyty atd.) selektivně barví barvivý, čímž je umožněna mikroskopická diferenciace a rozpoznání patologických změn. Až dosud obvyklé způsoby barvení (například podle Wrighta, May-Grůnwalda nebo Pappenheima) obsahují větší počet pracovních kroků, jako například roztírání krve, fixování, zčásti vícenásobné barvení, praní, sušení, a jsou proto značně zdlouhavé. Kromě toho je kvalita barvení značně závislá na kvalitě barviv, jakož i na zručnosti a zkušenostech osob tím se zabývajících.

Nechyběly proto pokusy tyto způsoby zjednodušit. V dřívější době byl popsán v DOS 2 153 673 způsob, který používá tak zvaná předběžně nabarvená podložní sklíčka, která jsou povlečena vrstvou metylén-ové modři N a octanem kresolové violeti. Jestliže se na toto podložní sklíčko nanese kapka krve a přikryje krycím sklíčkem, může se asi po 5 minutách mikroskopovat. Při tom je vedle rozlišení různých forem leukocytů a trombocytů možné dodatečné rozpoznání mladých erytrocytů, tak zvaných retikulocytů. Toto je vedle jednoduché a bezpečné manipulace další pokrok proti tradičnímu diferenciálnímu krevnímu obrazu.

Přes nesporný pokrok, který tento způsob přináší, vykazuje také několik výrazných nedostatků.

Tak jsou zbarvení všeobecně relativně nejasná, difúzní a málo kontrastní, dále se dají jen obtížně rozlišit tri druhy granulovat ných leukocytů (.eosinophily, neutrophily a basophily).

Nyní bylo s překvapením zjištěno, že se předběžně nabarvená podložní sklíčka, která poskytují vysoce kontrastní a jasná zbarvení a umožňují bezpečné rozlišení granulocytů, získají, jestliže se barviva metylénová modř N a octan kresolové violeti použije ve vysoce čisté formě v hmotnostním poměru 1 : 1 až 1 : 5,

Podle tohoto je tedy předmětem vynálezu předběžně nabarvené podložní sklíčko pro rozbor krve, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje chromatograficky čistou metylénpvou modř N a octan kresolové violeti v hmotnost ním poměru 1 : 1,5 až 1 : 5, Metylénová modř N je § výhodou přítomna jako monohydrochlorid a barviva jsou na podložní sklíčko nastříkána.

Z DOS 2 153 673 nevyplývá, jakou kvalitu měla použitá barviva. Skutečnost, že pri vý205019 robě .roztoků barviv se mají odfiltrovat nerozpuštěné zbytky, lze odvodit z obvykle prodávaných kvalit.

Skutečně byla při dodatečném zpracování podložních sklíček podle DOS obvykle prodávanými barvivý získána předběžně nabarvená podložní -sklíčka, jejichž vlastností barviv odpovídaly vlastnostem uvedeným v DOS

Čištění barviv pro mikroskopii není obecně obvyklé. Tak se často používají již celá desetiletí barviva pochybné čistoty, která se jinak používají k - barvení textilií. U mnoha barviv není kromě toho známo, zda a které nečistoty ovlivňují barevný výsledek.

Tak není například podivné, že americký Biological Stain -Commission považuje za nejdůležitější kritérium pro specifikaci barviva použitelnost v určitých recepturách barviv a předpisuje pro- stanovení obsahu pouze fotometrické a -reduktometrické metody, ale žádné chroimatografické metody (srovn. - například R. D. Lillie „Conn‘s Biological Stains“, .8. vyd., Williams and Wilkins Comp., Baltimore 1969, str. 10 až 14, 416 až 417).

Tyto fo-tometrické -a -reduktometrické metody poskytují však maximálně informace ocelkovém obsahu barviva, a ne o možných barvicích nečistotách.

Me-tylénovou -modř N-[ novou metylénovou modř, C. - I. Basic Blue 24,3,7-bii-(N-etylamino)-2,8-dimetylfe.nothiazoniumchlorid] lze v obchodě koupit jako asi 50 až 70% zboží a vykazuje podle našich zjištění pomocí chromatografie na tenké vrstvě 3 až 4 vedlejší skvrny v měnícím se množství. Zbytek je chlorid zinečnatý a chlorid sodný. Zjistili jsme, že vynikající čištění lze provést rozpuštěním ve vodě a vysrážením hydrochloridu kyselinou - solnou. Získá -se chromatograficky čistý produkt, který obsahuje ještě asi 0,5 % chloridu zinečnatého a je přítomen ve formě -mon-ohydrochloridu.

O-ctan kresolové violeti [pravá kresolová violeť, Cresyl Fast Vio-lett Acetate, octan 5,9-diaminobenzojajfenoxazonia] lze získat v obchodě - znečištěný - větším nebo menším množstvím octanu sodného. Také zde vykazuje analysa pomocí chromatografie na tenké vrstvě - 3 vedlejší skvrny v proměnném množství. Čištění se -opatrným -digerováním ve vodě odstraní octan -sodný. - Potom se rozpustí - v metanolu -a vys-ráží éterem. Opakování tohoto - postupu poskytne chromátograficky - čistý produkt.

Takto vyčištěná barviva se rozpustí v protikladu - k prodávaným produktům beze zbytku v metanolu. - a mohou -se roztírat způsobem popsaným - v DOS - 2 - 153 673 na podložní sklíčko. - Mohou - se - - také rozpustit podle DOS 2 424 955 ve- vodě a nanášet spolu s polyoxyetylénsorbitanmonopalmitanem (Tween 80).

Dále je - velmi- udivující, že se použitelná podložní -sklíčka s překvapivě -zlepšenými vlastnostmi získají jen tehdy, když se poměr -dvou barviv volí mezi 1: 1,5 až - 1: 5. V

DOS 2 153 673 -se totiž naopak - tvrdí a náro4 kuje, že poměr má být 3 : 1, popřípadě podle DOS 2 424 955 2,5 :1 a znatelným odchylkám je nutné -se co možná vyhnout.

Výhodná forma provedení vynálezu se získá, jestliže -se roztok -barviv nastříká na podložní sklíčka podle -naší ve stejný den podané přihlášky vynálezu P 25 15 869.4.

Vyčištěná barviva -se při tom nanášejí na podložní sklíčka v celkových množstvích asi 0,5 až 10 y/cnč. Poměr metylénové modři N k octanu kresolové violeti se smí při tom měnítl v rozmezí hodnot 1 :1,5 -až -1 : 5.

Podložní sklíčka, opatřená předběžně podle vynálezu vrstvou, se - pokapou, jak bylopopsáno v - DOS 2 153 673 (strana - 4—5) krví a potom se pokryjí krycím sklíčkem a asi po3 -až 5 minutách se mikroskopují objektivem s olejovou imersí.

Zbarvení jsou mimořádně jasná, s mohutným kontrastem a dobře reprodukovatelná. Oproti charakteristikám barviv -popsaným- v DOS -2 153 -673 (strany -5 až 6) vystupují následující zvláštnosti.

a) Granule -eossnophllů jsou svítivě -žlutě zbarveny oproti tam popsanému oranžovému - zbarvení.

b) Granule basophllů - jsou zbarveny oranžově červeně v protikladu k tam popsanému purpurovému zbarvení. Oranžové zbarvení, •označované jako účinný identifikující znak, vystupuje tam pouze při vhodné fokuzaci na okraji buňky.

c) Kontury jader jsou mimořádně jasně rozeznatelné, což velmi usnadňuje rozlišování lymphocytů, monocytů -a různých stadií zrání granulocytů.

Další přednost diagnostického prostředku podle vynálezu spočívá v tom, že barvení není již - závislé na - kolísání kvality prodávaných -barviv. Při technické výrobě velkého počtu - kusů má reprodukovatelnost s - -ohledem na nanášení barviv a složení barviv největší význam.

Jako materiál se pro podložní ' sklíčka může použít sklo. Pokud se barviva - nastříkávají podle - naší přihlášky vynálezu P - 25 15 869.4, mohou se - také používat syntetické hmoty, - přičemž barviva mohou - být přirozeně nanášena i - na krycí sklíčka ze -skla nebo syntetické hmoty.

V následujících příkladech má být vynález blíže vysvětlen, aniž- by - však byl -omezen, s ohledem na čištění barviv a jejich - použití, pouze na ně.

Přikladl

Čištění -octanu kresolové violeti g octanu kresolové violeti - (Matheson

Coleman a Bell) se - suspenduje ve 100 - m'l vody - a 15 minut se mohutně míchá. Potom· se barvivo odsaje a dvakrát se promyje vždy 100 ml ledově studené vody. Filtrační zbytek se při zahřívání rozpustí v 1,6 litrech metanolu -a asi při 30- °C se odsaje od nerozpustných podílů. Filtrát se pomalu za míchání doplní 3,5 litru éteru a dodatečně míchá za chlazení ledem 30 minut. Vzniklé krystaly se odsají, při zahřívání -se rozpustí v 620 ml metanolu, roztok se ochladí na 30 ^C|C a barvivo se vyloučí přídavkem 1,85 litru éteru za míchání a chlazení ledem. Po odsátí a trojnásobném promytí 120 ml směsi éteru s metanolem (3:1) se získá po sušení nad kysličníkem fosforečným 22 g octanu kresolové violeti ve formě tmavě zelených krystalů. Složení: asi 82 % octanu kresolové violeti, 8 % chloridu kresolové violeti a 10 % vody. Při zahřívání na 150 °C dochází k rozkladu. Látka je podle chromatografického rozboru (deska pro chromatografii na tenké vrstvě silikagel 60 F 254 Morek, eluční systém butanol-ledová kyselina octová-voda 4:1:5), prakticky čistá. Rf — hodnota: 0,6.

Příklad 2

Čištění metylénové modře N

Ve 411trové tříhrdlé baňce se za míchání rozpustí 100 g metylénové modři N (New Methylene Blue — Matheson Co^!leman a Bell) v 1 litru vody a doplní 3e 1 litrem koncentrované kyseliny solné, d = 1,18. Po 4 hodinách míchání za chlazení ledem, 8 hodinách stání v ledničce při + 5 °C se odsají vzniklé .krystaly, promyje se 400 ml ledově chladné 6 N kyseliny solné a 500 ml éteru. Získá se 36,5 g černých, kovově lesklých krystalů, rozklad od 253 °C. Vyčištěné barvivo sestává z 95 až 97 % chloridu metylénové modři N hydrochloridu a obsahuje 3 až 5 % vody. Zinek je přítomen již ' jen ve stopách. Barvivo je podle chromatografické analysy desky pro chromatografií na tenké vrstvě — silikagel 60 F 254 Měrek, eluční systém n-butanol-ledová kyselina octová — — voda 4:1:5 prakticky čisté. Rf hodnota: 0,5.

příklad 3

Předběžně nabarvená podložní sklíčka

Vyrobí se roztok následujícího složení za použití -barviv vyčištěných podle příkladu 1 a 2:

Hydr-ochlorid metylénové modři N 130 mg octan kresolové violeti 270 mg metanol ad 100 ml

Tento roztok se rozetře pomocí vatovéhotampónu .na . podložní sklíčko a usuší nebo se stříká z 0,5 mm - široké proudové trysky (SS 60 67228 — 45 fa. Spraying Systems) -s úhlem rozstřikování asi 25° ve vzdálenosti 20 cm -maskou o- šíři 3 cm na podložní sklíčko, která se vedou rychlostí 1,5 m/min pod tryskou·. Stříkací tlak: 1,2 ata : prosazení kapaliny tryskou : 10 ml/min.

Při střední velikosti -kapek -asi 20 μ činí nanesené množství barviva asi 3 ^g/cm².

Na takto- vyrobené předběžně nabarvené podložní -sklo se nanese kapka krve· asi 5 až 10 μΐ a přikryje krycím sklem. Asi po 3 až 5 minutách -se nabarvení určuje pod mikroskopem při asi 800násobném zvětšení za použití objektivu s olejovou -imersí.

Jednotlivé částice krve jsou znázorněny následujícím nabarvením:

Retikulocyty:

purpurově zbarvená síť uvnitř sotva zbarvených erythrocytů.

Neutrophily:

purpurově zbarvené jádro uvnitř jemně granulované téměř bezbarvé plazmy.

Eosinophily:

purpurově zbarvené jádro uvnitř hrubě granulované žluté plazmy.

Basophily:

tmavě purpurově zbarvené jádro uvnitř středně velké kompaktně granulované oranžověčerveně zbarvené plazmy.

Lymphocyty:

purpurově zbarvené jádro -se světle purpurově zbarvenou plazmou.

Monocyty:

jako lymphocyty, pouze větší -a s větším množstvím plazmy.

Throm-bocyty:

malé purpurově zbarvené částice.

Claims (3)

1. PŘEDMĚT VYNALEZU

   1. Předběžně nabarvené podložní sklíčko pro rozbor krve, vyznačující se tím, že vrstva barviva uspořádaná na sklíčku obsahuje chromatograficky čistou metylénovou modř N a o.ctam kresolové violeti ve hmotnostním poměru 1 : 1,5 až 1:5.
2. 2. Předběžně nabarvené podložní sklíčko podle bodu 1, vyznačující se tím, že metylénová modř N je přítomna jako monohydrnchlorld.
3. 3. Předběžně nabarvené podložní sklíčko podle bodů 1 a 2, vyznačující se tím, že barviva jsou na něj nastříkána.