HU176928B - Zarannee okrashennoe predmetnoe steklo dlja issledovanija krovi - Google Patents

Zarannee okrashennoe predmetnoe steklo dlja issledovanija krovi Download PDF

Info

Publication number
HU176928B
HU176928B HU76BO1607A HUBO001460A HU176928B HU 176928 B HU176928 B HU 176928B HU 76BO1607 A HU76BO1607 A HU 76BO1607A HU BO001460 A HUBO001460 A HU BO001460A HU 176928 B HU176928 B HU 176928B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
slide
methylene blue
blood
dyes
cresyl violet
Prior art date
Application number
HU76BO1607A
Other languages
English (en)
Inventor
Dieter Berger
Werner Guethlein
Wolfgang Werner
Peter Rieckmann
Original Assignee
Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Mannheim Gmbh filed Critical Boehringer Mannheim Gmbh
Publication of HU176928B publication Critical patent/HU176928B/hu

Links

Classifications

    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)
  • Microscoopes, Condenser (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

egyes véralkotórészeket (eritrociták, leukociták, trombociták, stb.) festékekkel szelektíven színezik, miáltal a mikroszkóppal
Az említett okok miatt számos próbálkozás történt az eljárás egyszerűsítésére, Legutóbb a 2 153 673- sz- NSZK-beli nyilvánosságrahoza- li iratban olyan eljárást ismertettek, amely meti1énkék. N-nel való differenciálás és a patalógiás elváltozások felismerése lehetővé válik. Ez eddig szokásos festési eljárások (pl. Wright-.
Llay-Grünwald- vagy Pappenheim-féle módszerek) tobu „késből állottak, mint például a vér felkenése, fixálása, több lépésben való megfestése, mosása és szárítása, ezért ezek bonyolultak. Azonkívül a színezés minősege erősen függ « festek minőségétől, vala mint az azzal foglalkozó személyek gyakorlottságától és tapasztaltságától.
és krczilibolya-acetáttal bevont, úgynevezett előre színezett tárgylemezeket alkalmaz. Ha ezekre a tárgylemezekre egy csepp vért visznek fel, majd egy fedőlemezzel lefedik, akkor kb. 5 perc múlva mikroszkópon vizsgálható. Ennél a megoldásnál a különböző leukocitaforrnak és trombocitaformák megkülönböztetésén kivül a fiatal eritrociták, az un. retikulociták is felismerhetők. Ez a biztosabb és egyszerűbb kezelhetőségen kivül további előrelépést jelent a szokásos differenciálvérképhez képest.
A vitathatatlan haladás ellenére, amit ez az eljárás hozott, alkalmazása néhány súlyos hátránnyal.jár.
így a festések általában viszonylag tompáit, diffúzai: és kontrasztszegények, és a szemcsézett leukoziták három formája (eozinofil, neutrofil és bazofil) csak nehezen különböztethető meg.
Ueglepő módon azt találtuk, hogy kontrasztdus és élénk színezést, valamint a granulociták biztosabb megkülönböztetését eredményező előre festett tárgylemezeket kapunk, ha a színező anyagokat, a metilénkék N-ot és a krezilibolya-acetátot nagy tisztaságban, kromatográfiásan tiszta alakban, 1:1,5 - 1:5 súlyarányban alkalmazzuk. A metilénkék Ιΐ-t előnyösen monohidroklorid alakjában alkalmazzuk, a kereskedelemben kapható cink-kettőssó helyett
A 2 153 673 számú ITSZK-beli nyilvánosságrahozatali iratból nem tűnik ki, hogy milyen volt az alkalmazott fes ték minősége.
Az a tény, hogy a festékoldatok készítésénél a fel nem oldott maradékot szűréssel el kell távolítani, arra mutat, hogy kereskedelmi ninőségről volt szó. Az említett nyilvánosságrahozatali irat szerinti eljárást a iícrcskedeiemben kapható festékkel reprodukálva, olyan előre színezett tárgylemezeket kaptunk, amelyek ι /ΟΜ28 festési tulajdonságai az említett nyilvánosságrahosatali iratban közöltöknek (5·-6· oldal) felelnek meg.
A mikroszkópiás vizsgálatokhoz alkalmazott festékeket általában nem tisztítják. Évtizedek óta gyakran alkalmaznak olyan, kétes tisztaságú festékeket, amelyeket különben a textilfestésnél használnak. Ezon túlmenően sok festék esetében nem ismert, hogy mely szennyeződések és milyen mértékben befolyásolják a festés eredményét. így nem meglepő, hogy az amerikai Biolőgical Stain Comission sgy festék specifikációjának legfontosabb kritériumaként annak egy meghatározott recepturában való alkalmazhatóságát tekinti és a tartalom meghatározására csupán fotometriás és reduktometriás módszert ir elő, kromatográfiás eljárást azonban nem, (v.ö. pl. R.ü.Lillie Conn’s Biological Stains”, 8. Aufl. ffilliams and Wilkins Comp. Baltimore 1969, 10-14·és 416-417· oldalak) *
Ezek a fotometriás és reduktometriás mddszerek azonban legfeljebb csak a teljes festéktartalomra vonatkozóan adnak felvilágosítást, de az esetleges színező szennyezésekre nem.
A metilénkék N (Neumethylönblau, C.I. Besic Blue 24, 3,7-bisz-(N-etil-amino/-2,8-dimetil-fenotiazonium-klorid a kereskedelmi forgalomban körülbelül 50-70 %-os tisztaságban kapható és vizsgálataink szerint a vékonyréte gkromato grata jában
3-4, változó mennyiségű szennyezőnek tulajdonítható folt található. A maradék cink-klorid és nátrium-klorid. Azt találtuk, hogy az említett anyag kitünően tisztítható vízben való oldással, majd a hidroklorid sósavas leválasztásával. Ily módon kromatográfiásan tiszta anyagot kapunk, amely már csak kb. 0,5 % cink-kloridot tartalmaz és monoklorid formájában van jelen.
A krezilibolya-aoetát (Oresylechtviolett,
Cresyl Fást Violett Acetate, 5,9-diamino-benzo(a)fenoxazonium-acetát) a kereskedelmi forgalomban több-kevesebb nátrium-acetáttal szennyezve kapható. A vékonyrétegkromatográfiás analízis során itt is 3 különböző mennyiségű szennyezőnek megfelelő foltot találtunk. A tisztítás a következőképpen végezhető:
Először vízben óvatosan digerálva eltávolítjuk a nátrium-acetátot. Ezután metanolban olajuk, majd éteri-el kicsapatjuk. Az eljárás ismétlésével kromatográfiásan tiszta anyagot kapunk.
Az igy tisztított festékek a kére 311C u-213. X ti ITluΘ — kekkel ellentétben maradék nélkül oldhatók metanolban és a 2 453 673 számú TI3ZK-beli nyilvánosöágrahoastali irat szerint (4. oldal) tárgylemezre felkenhetők* Oldhatók továbbá vízben a DOS 2 424 955 számú NSZK-beli nyilvánosságrahozatali irat szerint is és polioxietilén-szorbitán-monopalmitáttal (Tvsreen 80) együtt vihetők.fel.
Nagyon meglepő továbbá, hogy csak akkor kapunk jobb tulajdonságokkal rendelkező, használható tárgylemezeket, ha a két festék arányát 1:1,5 és 1:5 között választjuk meg. A
153 673 NSZK-beli nyilvánosságrahozatali iratban ugyanis éppen ellenkező útmutatást' adnak és a 3:1 arányt, illetve a 2 424 955 *
számú NSZK-beli nyilvánosságrahozatali irat szerint 2,5:1 arányt igényelnek és utalnak arra, hogy kerülni kell a megadottól való jelentősebb eltéréseket.
• A jelen találmány egyik előnyös kiviteli alakja szerint a festékoldatot a tárgylemezre szórással VÍSSZÜk fel, az általunk egyidejűleg benyújtott P 25 15 8694 számú NSZK-beli bejein ntésben leírtaknak 'st«^tel«.lőea<·5
Ennek során a tisztított festéket körülbelül
0,5--10 ^7cm2 mennyiségben visszük fel a tárgylemezre. A metilénkék II és a krezilibolya-acetát aránya 1:1,5 és 1:5 között változtatható.
A találmányunk szerinti előre bevont tárgylemezekre a 2 153 673 számú. NSZK-beli nyilvánosságrahozatali irat szerinti (4-5· oldal) módon vércseppet viaszunk fel, majd fedőlemezzel lefedve azokat, kb. 3-5 perc elteltével olajimmerziós objektives mikroszkóppal vizsgálhatjuk.
A festés rendkívül világos, kontrasztdus és jól reprodukálható. A 2 153 673 számú NSZK-beli nyilvánosságrahozáali irat 5-6. oldalán leírt szinjellemzőkkel szemben a következő különlegességek lepnek fel:
a) Az eozinofilek granulája élénk sárgára szineződik, az ott leírt narancsszínűéi szemben.
b) A bazofilok granulája narancsszínű, ellentétben az ott leirt biborszinüvel. A hatásos azonosító ismertetőjegyként jellemzett narancsszíneződés ott csak a sejt szélén lép fel, megfelelő fókuszálás esetén.
c) A magok kontúrjai rendkívül élesen felismerhetők, ami nagyon megkönnyíti a limfociták, monociták és a granulociták különböző érettségi fokának megkülönböztetését.
A találmányunk szerinti diagnosztikum további előnye, hogy a festések nem függenek többé a kereskedelmi forgalomban kapható festékek minőségének ingadozásaitól. A nagy darabszámban történő ipari előállítás során a festékfelvitelre és az. összetételre vonatkozó reprodukálhatóság rendkívül jelentős. <
A tái-gylemezch anyagául üveget alkalmazhatunk. Amennyi ben. a festékeket P 25 45 Q69.4 számú NSZK-beli szabadalmi bejelentésünk szerint felpermetezzük, műanyagok is alkalmazhatók, a festék természetesen az üveg vagy műanyag fedőlemezre is felvihetők·
A következő példákban közelebbről megvilágítjuk találmányunkat, anélkül, hogy ezt a festékek tisztítására és alkalmazásukra korlátoznánk.
1, példa
A krezilibolya-acetát tisztítása g krezilibolya—acetát (Matheson Coleman and Bell) 100 ml vízben szuszpendálunk, és 15 percig erősen keverjük· Ezután a festéket leszivatjuk és luu-100 ψΐ jéghideg vízzel kétszer mossuk. A szűrt anyagot 1.6 liter metanolban oldjuk melegítés közben, és kb. 30 °C-on az oldhatatlan maradékot szűréssel elválasztjuk. A szürletet lassú keverés közben
3,5 liter éterrel vesszük fel és jéghütés mellett még 30 percig keverjük. A képződött kristályokat leszivatjuk, majd 620 ml metanolban melegítés közben oldjuk őket, az oldatot 30 °C-ra lehűtjük, majd a festéket 1,85 liter éter hozzáadásával keverés és je- *
ges hűtés mellett leválasztjuk. Leszivatás és háromszori 120-120 ml éter-metanol (3:1) eleggyel való mosás után difoszfonpentaoxidon szárítva 22 g krezilibolya-acetátot kapunk sötétzöld kristályok formájában. összetétel: 82 % krezilibolya-acetát, 8% krezilibolya-klorid, 10% viz. Az anyag 150 °C-ra való melegítéskor elbomlik. A festék a kromatográfiás elem7 176928 zés szerint gyakorlatilag tiszta (DC-készlemez szilikagél 60 F 254 Merek, futtató rendszer: butanol-jégecet-viz 4:1:5), az Rp értéke 0,6,
2. példa
A metilénkék N tisztítása
Egy 4 literes háromnyakú lombikban 100 g metilénkék-N-t (New Methylene Blue Matheson Colémán and Bell) 1 liter vizben oldunk keverés közben, majd az oldathoz 1 liter tömény sósavat; d = 1,18, adunk.
órás, jéghütés közben végzett keverés után ezt követő órás 5 °C-os Jégszekrényben való állás végeztével a képződött kristályokat leszivatjuk, 400 ml Jéghideg 6N sósavval és 500 ml éterrel mossuk. 36,5 g fekete, fémesen csillogó kristályokat kapunk, az anyag bomláspontja 253 °C. A tisztított festék 95-97 % metilénkék N-klorid-hidrokloridot és 3-5% vizet tartalmaz. Cink csak nyomokban van jelen. Kromatográfiásan i (DC-készlemez-szilikagél 60 F 254 Merek, a futtató rendszer n-butanol-Jégecet-viz 4:1:S) az anyag gyakorlatilag tiszta, Rp B 0,5.
3, példa
Előre színezett tárgylemez
A következő összetételű oldatot készítjük el az 1. és 2. példák szerint előállított festékekből:
metilénkék N-hidroklorid 130 mg krezilibolya—acetát 270 mg metanol 100 ml
Az oldatot vattacsomó segítségével tárgylemezre kenjük fel mint filmet vagy 0,5 mm-es széles sávú fúrókából (SS 60 67 228-45, Fa. Spraying Systems) kb. 25° szórási szög alatt 20 cm távolságból maszkon keresztül 3 cm szélességben a tárgylemezekre permetezzük, amelyeket 1,5 m/perc sebességgel továbbítunk a fuvóka alatt.
Szórási nyomás: 1,2 att, folyadékáteresztés a fúvókén keresztül: 10 ml/perc.
Közepes, kb. 20yu-os cseppméret esetén a felvitt
cm2.
Az igy előállított tárgylemezre egy kb. 5-10^ul-es vércseppet viszünk fel, majd fedőlemezzel lefedjük.
Idintegy 3-5 perc nnilva a megfestődést mikroszkóp alatt, 800-szoros nagyításban figyelhetjük meg ólajimmerziós objektív alkalmazásával.
A vér egyes részecskéi a következőképpen festődnek:
retikulociták: biborszinü háló az alig festődött eritrocitákon belül, neutrofilek: biborszinü mag a finoman granulált csaknem szintéiért plazmában, eozinofilek: biborszinü mag a Őurván granulált sárga plaz* mában, bazofilok. sötétbiborszinü mag egy közepes nagyságú tömören granulált narancsszínű plazma belsejében, limfocitán: biborszinü mag, világos biborszinü plazmával, monociták: mint a limfociták, csak nagyobbak és több plazmáv al, trombociták: kis biborszinü részecskék.
SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (2)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Előre színezett, metilénkék N-nel és krezil- ibolya-acetattal bevont tárgylemez vérvizsgálathoz, azzal jellemezve, hogy a tárgylemez az említett két festéket kromatográfiásan tiszta alakban és 1 : 1,5 ” 1 : 5 súlyarányban tartalmazza, emellett a metilénkék N előnyösen monokiorid alakjában van jelen.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti előre színezett tárgylemez kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy a festékeket a tárgylemezre felszórva tartalmazza.
    A meghatalmazott
    Kiadja az Országos Találmányi Hivatal, Budapest A kiadásért felel: Kimer Zoltán osztályvezető
    70 - OTH - 81 209
HU76BO1607A 1975-04-11 1976-04-05 Zarannee okrashennoe predmetnoe steklo dlja issledovanija krovi HU176928B (hu)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE2515966A DE2515966C3 (de) 1975-04-11 1975-04-11 Vorgefärbte Objektträger für die Blutunte rsuchung

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU176928B true HU176928B (hu) 1981-06-28

Family

ID=5943661

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU76BO1607A HU176928B (hu) 1975-04-11 1976-04-05 Zarannee okrashennoe predmetnoe steklo dlja issledovanija krovi

Country Status (23)

Country Link
US (1) US4070495A (hu)
JP (1) JPS51126893A (hu)
AR (1) AR210757A1 (hu)
AT (1) AT350190B (hu)
BE (1) BE840454A (hu)
CA (1) CA1052675A (hu)
CH (1) CH621629A5 (hu)
CS (1) CS205019B2 (hu)
DD (1) DD123628A5 (hu)
DE (1) DE2515966C3 (hu)
DK (1) DK145318C (hu)
ES (1) ES446836A1 (hu)
FI (1) FI59677C (hu)
FR (1) FR2307271A1 (hu)
GB (1) GB1480576A (hu)
HU (1) HU176928B (hu)
IE (1) IE42552B1 (hu)
IT (1) IT1059617B (hu)
LU (1) LU74738A1 (hu)
NL (1) NL7603628A (hu)
PL (1) PL107576B1 (hu)
SE (1) SE420355B (hu)
SU (1) SU904536A3 (hu)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2651060C3 (de) * 1976-11-09 1980-06-26 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Differential-diagnostische Spermauntersuchung
US4193980A (en) * 1978-01-05 1980-03-18 Corning Glass Works Dry preparation for reticulocyte staining
US4248821A (en) * 1979-07-25 1981-02-03 Dellen Adrian F Van Method and device for embedding a specimen for microscopic examination
US4400370A (en) * 1980-03-12 1983-08-23 Lawrence Kass Metachromatic dye sorption means for differential determination of leukocytes
US4581223A (en) * 1980-03-12 1986-04-08 Lawrence Kass Individual leukocyte determination by means of differential metachromatic dye sorption
CA1155041A (en) * 1980-04-21 1983-10-11 Michael E. Jolley Fluorescent nucleic acid stains
US4500509A (en) * 1981-03-11 1985-02-19 Lawrence Kass Metachromatic dye sorption and fluorescent light emmisive means for differential determination of developmental stages of neutrophilic granulocytic cells and other leukocytes
US4606950A (en) * 1984-08-31 1986-08-19 Ellen M. Corbet Method for assembling a floral arrangement
US5106744A (en) * 1990-11-01 1992-04-21 Cytocolor Inc. Method of staining monocytes and compositions thereof
ES2736160T3 (es) 2004-09-23 2019-12-26 Wista Lab Ltd Procedimientos de síntesis química y purificación de compuestos de diaminofenotiazinio que incluyen cloruro de metiltioninio (CMT)
PL2057136T3 (pl) 2006-07-11 2013-10-31 Wista Lab Ltd Sposoby syntezy i/lub oczyszczania związków diaminofenotiazynowych
WO2019084513A1 (en) * 2017-10-26 2019-05-02 Essenlix Corporation QUICK MEASUREMENT OF PLATELETS

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT966513B (it) * 1970-10-30 1974-02-20 Gen Electric Vetrini precolorati per esami del sangue
US3796594A (en) * 1970-10-30 1974-03-12 Gen Electric Stain coated slides for differentially staining blood
US3906120A (en) * 1970-10-30 1975-09-16 Gen Electric Method for preparing slides for blood evaluation
GB1473945A (en) * 1973-05-24 1977-05-18 Gen Electric Method for preparing slides for blood evaluation

Also Published As

Publication number Publication date
NL7603628A (nl) 1976-10-13
AT350190B (de) 1979-05-10
DE2515966C3 (de) 1979-11-22
LU74738A1 (hu) 1976-11-11
AR210757A1 (es) 1977-09-15
AU1267776A (en) 1977-10-13
DK145318C (da) 1983-04-05
DE2515966A1 (de) 1976-10-21
PL107576B1 (pl) 1980-02-29
ES446836A1 (es) 1977-06-01
CS205019B2 (en) 1981-04-30
GB1480576A (en) 1977-07-20
FR2307271B1 (hu) 1980-03-28
DE2515966B2 (de) 1979-03-22
FI760911A (hu) 1976-10-12
FI59677B (fi) 1981-05-29
FI59677C (fi) 1981-09-10
SU904536A3 (ru) 1982-02-07
DK145318B (da) 1982-10-25
DD123628A5 (hu) 1977-01-05
ATA262076A (de) 1978-10-15
CH621629A5 (hu) 1981-02-13
BE840454A (fr) 1976-10-07
CA1052675A (en) 1979-04-17
FR2307271A1 (fr) 1976-11-05
DK149876A (da) 1976-10-12
IT1059617B (it) 1982-06-21
IE42552L (en) 1976-10-11
US4070495A (en) 1978-01-24
SE420355B (sv) 1981-09-28
SE7602728L (sv) 1976-10-12
JPS51126893A (en) 1976-11-05
IE42552B1 (en) 1980-08-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69330818T2 (de) Fluoreszenzfarbstoff, Pyryliumsalze oder ähnhliche Salze enthaltend, Nachweisverfahren von Nukleinsäure durch Verwendung desselben
Schweizer et al. Chromosome banding: stain combinations for specific regions
Latt Microfluorometric detection of deoxyribonucleic acid replication in human metaphase chromosomes
HU176928B (hu) Zarannee okrashennoe predmetnoe steklo dlja issledovanija krovi
EP0461392B1 (de) Testträger zur Bestimmung von Ionen
CA1191079A (en) Metachromatic dye sorption means for differential determination of developmental stages of neutrophilic granulocytic cells and other leukocytes
DE3109252C2 (de) Verfahren und Zusammensetzung zur Bestimmung einzelner Leukozyten durch metachromatische Farbstoffdifferentialabsorption
CA1115724A (en) Diagnostic agent for the detection of occult blood in faeces
Majone et al. Persistence of micronuclei in the marine mussel, Mytilus galloprovincialis, after treatment with mitomycin C
CN101723874B (zh) 花菁类化合物及其在生物样品染色中的用途
JPH07110328A (ja) 染色試薬とその調整方法およびその使用方法
DE68912462T2 (de) Xanthenfarbstoffe.
JPS6361622B2 (hu)
DE29915165U1 (de) Energy Transfer Dyes
EP0183717B1 (en) Single dye replacement for romanowsky plural dye variable compositions in human biopsy specimen constituent identifications
EP0112552B1 (en) Use of pyrylium or thiapyrylium compounds as biological stains
EP0004061B1 (de) Verfahren zur Bestimmung leukämischer Zellen
JP2001506686A (ja) ハロレピジンから誘導できるヘリウム−ネオン励起性網状赤血球染色用色素
DE3883652T2 (de) Verfahren zum sortieren von zellen.
HU181949B (en) High-speed diagnosticum with improved parameters and method for producing thereof
JP2000125854A (ja) 皮膚角質細胞の染色方法
US8609365B2 (en) System for staining fungi and protozoa
EP0191850A1 (en) Differentiation, identification and enumeration of neuthrophils, erythroblast and sub-populations of lymphopcytes with basic blue 141
US7745168B2 (en) Method for selectively staining chitin-containing organisms
EP0037905A1 (de) Verfahren zur Bestimmung leukämischer Zellen