DE69022819T2

DE69022819T2 - Verbindungen und Reagenzien zur Bestimmung von Retikulozyten.

Info

Publication number: DE69022819T2
Application number: DE69022819T
Authority: DE
Inventors: Sophie S Fan; Gena Fischer
Original assignee: Miles Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1989-12-01
Filing date: 1990-12-03
Publication date: 1996-03-14
Anticipated expiration: 2010-12-04
Also published as: US5075556A; DK285390A; EP0430719B1; IL95485A; EP0430719A2; JPH03182562A; EP0430719A3; ES2080127T3; AU6260890A; CA2024166C; IL95485A0; DE69022819D1; DK285390D0; CA2024166A1; JPH0822967B2; AU626508B2

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf den Einsatz gewisser quaternisierter Derivate von Acridinorange zur quantitativen Bestimmungen der Retikulozytenwerte in Vollblut, zum Färben von Verbindungen, die für derartige Bestimmungen nützlich sind und auf gewisse quaternisierte Acridinorange-Derivate an sich.
Bei allen höheren Tieren besteht das Blut aus einem wäßrigen flüssigen Teil (dem Plasma), in dem Körperchen verschiedener Art suspendiert sind: rote Blutkörperchen (Erythrozyten), weiße Blutkörperchen (Leukozyten) und Blutplättchen. Plasma besteht grob gesagt aus 90% Wasser, 9% Eiweiß, 0,9% Salzen und Spuren anderer Stoffe wie Zucker, Harnstoff, Harnsäure und dergleichen.
Die Zellen oder Körperchen des peripheren Blutes (d.h. von Blut außerhalb des Knochemnarks) werden in zwei Hauptgruppen unterteilt: rote Blutkörperchen (Erythrozyten), deren vorrangiges Ziel es ist, Sauerstoff zu transportieren und weiße Blutkörperchen (Leukozyten), deren vorrangige Funktionen sich auf das Immunsystem und die Zerstörung von Stoffen beziehen, die dem Körper fremd sind. Abgesehen von diesen beiden Hauptgruppen enthält Blut ferner sogenannte Blutplätchen, die für die Hämostase von Bedeutung sind.
Die Endphasen der Erythrozytenreifung treten nach Verlassen des Knochenmarks auf, während diese Zellen im peripheren Blut zirkulieren. Diese jungen roten Blutkörperchen oder "Retikulozyten" haben ihren Kern verloren und damit die Fähigkeit, sich zu teilen oder RNS zu synthetisieren. Obgleich diese Funktionen aufgehört haben, sind Retikulozyten im Hinblick auf den Stoffwechsel weiterhin aktiv und können Eiweiß synthetisieren, Eisen aus der Blutsynthese absorbieren und die notwendigen Stoffwechselreaktionen ausführen, die zur Aufrechterhaltung eines energiereichen Zustandes erforderlich sind. Diese Zellen unterscheiden sich normalerweise von reifen Erythrozyten durch das Retikulum, das ihnen ihren Namen verleiht. Dieses Retikulum kann durch Mittel wie brilliantes Cresylblau, nilblaues Sulphat oder Neumethylenblau gefärbt werden, worauf die quantitative Bestimmung der Retikulozyten durch manuelle Beobachtung unter dem Mikroskop durchgeführt werden kann.
Obgleich die Retikulozytenzahl normalerweise etwa 0,5 bis 2% der gesamten roten Blutkörperchenmenge beträgt, kann sich dieser Prozentsatz unter abnormen Bedingungen drastisch ändern. Retikulozytenzählungen wurden zum Beispiel seit Jahren als Hilfsmittel für die Diagnose bei der Untersuchung von Blutdyskrasien und als Index für die rote Blutkörperchenregenerierung nach Blutungen benutzt sowie zur Kontrolle der Frühtoxizität in der Chemotherapie bei bestimmten malignen Krankheiten.
Der Einsatz von fluoreszierenden Färbemitteln oder Farbstoffen zur Analyse von Blutkörperchen ist seit Jahren bekannt. Insbesondere ist die Verwendung von Acridinorange als fluorezenter Farbstoff zum Färben von Nukleinsäure seit über 40 Jahren bekannt. S. Strugger, Fluorescence Microscope In Examination Of Bacteria In Soil (Das Fluoreszenzmikroskop bei der Untersuchung von Bodenbakterien) Canad. J. Res. C 26:188-193 (1948) J. B. Vander, et al., J. Lab. Clin. Med 62, 132 (1963) beschrieb den Einsatz von Acridinorange zur Bestimmung von Retikulozyten durch Fluoreszensmikroskopie. Diese Technik beruhte jedoch auf der visuellen Prüfung der Probe und besaß damit den damit verbundenen Nachteil derartiger manueller optischer Prüfverfahren.
Ein quaternisiertes Acridinorange-Derivat und seine Wechselwirkung mit DNS werden in In Vitro Effects Of Acridine Interaction On RNA Polymerase Interactions With Supercoiled DNA (In-Vitro-Wirkungen von Acridin-Wechselwirkungen auf RNS-Polymerasewechselwirkungen mit superknäueliger DNS), Robert S. Greene, et al., Int. J. Biochem., Vol. 15, Nr. 10, S. 1231-1239 (1983) besprochen. Eine Untersuchung der Wechselwirkungen von homologer E. Coli RNS-Polymerase mit einem rekombinanten Plasmid, das die Ursprungssequenz des E. Coli Chromosoms enthält, wurde durchgeführt. Diese Wechselwirkungen wurden durch Störung der DNS-Schablone analysiert, z.B. von intrazellulärer DNS und durch ihre superknäuelige Übereinstimmung mit dem interkalierenden Farbstoff Acridinorange und einem N-10-Benzylderivat von Acridinorange. Die Charakterisierung der durch das Mittel hervorgerufenen Störungen der Enzym-DNS-Wechselwirkungen erfolgte durch kinetische, elektrophoretische und autoradiographische Verfahren unter Bedingungen, die für die Bindung, Einleitung und Transkription der RNS- Polymeraseschablone spezifisch sind. Beruhend auf diesen Untersuchungen schlossen die Verfasser, daß Acridinorange die Wechselwirkungen der RNS-Polymerase-DNS- Schablone weitaus leistungsfähiger stört als durch N-10-Benzyl substitutiertes Acridinorange. Die Autoren stellten übrigens fest, daß Acridinorange ein wirksamerer DNS-Interkalator als Acridinorange-Derivat war. Es besteht kein Zweifel darüber, daß das spezifische Acridinorange-Derivat als Farbstoff für die Zellanalyse unter Verwendung von Fluoreszenzdurchfluß-Cytometrie oder als intrazellulärer RNS- Marker allgemein eingesetzt werden sollte.
Ferner wurden viele verschiedene automatische Geräte zur Feststellung und quantitativen Bestimmung von Blutkörperchen beschrieben. Für derartige Verfahren (von denen einige Acridinorange oder andere fluoreszente Farbstoffe benutzen) sind die US Patente 3,497,690, 3,916,205, 3,864,571 und 4,027,971 repräsentativ. Obgleich diese Entgegenhaltungen allgemein den Einsatz von fluoreszenten Farbstoffen in verschiedenen Geräten beschreiben, einschließlich Durchflußcytometrie, bieten sie keine Verfahren oder Zusammensetzung für die quantitative Bestimmung von Retikulozyten durch Fluoreszenz.
Von besonderem Interesse sind die US Patente 3,684,377 von Adams und Kamentsky und 3,883,247 von Adams. Diese Patente beziehen sich auf Verfahren und Farbstoffzusammensetzungen zur quantitativen Bestimmung von Zellen (insbesondere weißen Blutkörperchen) unter Verwendung eines metachromatischen Fluorochrom- Farbstoffes wie Acridinorange.
Das Patent von Adams und Kamentsky beschreibt den Einsatz einer wichtigen Farbstoffzusammensetzung für die Differential-Blutanalyse von lebenden weißen Blutkörperchen, die im wesentlichen aus Acridinorgange in einer Konzentration von 10&supmin;&sup7; bis 10&supmin;&sup5; g/ml besteht, wobei die Acridinorange-Lösung einen pH-Wert und eine Osmolalität in den normalen physiologischen Bereichen von menschlichem Blutplasma aufweist. Obgleich das Patent lehrt, daß diese Zusammensetzung zur Erkennung verschiedener weißer Blutkörperchenarten nützlich ist und zur Unterscheidung derselben von anderen Körperchen im Blut, enthält es keine Lehre dahingehend, daß diese Zusammensetzung bei der Zählung von Retikulozyten von Nutzen ist.
Das Patent von Adams stellt eine Modifizierung der Lehre von Adams und Kamentsky in der Hinsicht dar, daß die weißen Blutkörperchen unter Bedingungen behandelt werden, bei denen die Zellen durch Kontakt mit einem nicht physiologischen Mittel während der Färbung "geschockt" werden. Das heißt, daß die im Patent von Adams benutzte Farbzusammensetzung hypotonisch gemacht wird, wobei die Osmolalität derselben allgemein unter der normalerweise in menschlichem Blut festgestellten liegt. Die Lehre des Patentes von Adams besteht daraus, daß dieser hypnotische Zustand zu einer unterschiedlichen Absorption des Acridinorange- Farbstoffes durch die verschiedenen weißen Blutkörperchenarten führt, so daß sie sich klarer voneinander unterscheiden als bei früheren Verfahren. Obgleich das Patent von Adams nicht die Absicht hat, ein Verfahren zur Feststellung von Retikulozyten zu beschreiben, wurde das in diesem beschriebene Verfahren als praktisch nutzlos für die quantitative Bestimmung von Retikulozyten laut US Patent 4,336,029 von Natale kritisiert.
Im Gegensatz zu den Patenten von Adams und Kamentsky und dem Patent von Adams, bei dem die Unterscheidung von roten Blutkörperchen-Untertypen von der Absorptionsgeschwindigkeit des Acridinorange-Farbstoffes abhängt, hängt die Erfindung des Patentes von Natale davon ab, daß die kinetischen Faktoren beseitigt werden und der Grad der Farbstoffabsorption so gesteigert wird, daß die Retikulozyten maximal Acridinorange-Farbstoff absorbieren. Bei Einsatz von Färbereagensien laut dem Stand der Technik absorbieren Retikulozyten nur kleine Farbstoffmengen, so daß sich bei Fluoreszenz-Nachweisverfahren nur eine geringe Fluoreszenz ergibt. Diese geringe Fluoreszenz könnte allgemein nicht gut von der Hintergrundfluoreszenz unterschieden werden, so daß nur ein Teil der Retikulozyten in der Probe nachgewiesen werden könnte.
Die Farbstoffzusammensetzung im Patent von Natale besteht im Wesentlichen aus einer wäßrigen Lösung des methachromatischen Fluorochromfarbstoffes Acridinorange, einem Chelatbildner (Citrat), einem mit der Aminogruppe reagierenden Reagens und (falls erforderlich) einer Pufferlösung, um den endgültigen pH-Wert dieser Lösung auf etwa 7,4 zu halten. Die Osmolalität der Lösung wird auf etwa 0,26 Osmolalitätseinheiten gehalten, das normale physiologische Niveau, nach Bedarf entweder durch den Chelatbildner oder durch Zusatz von Natriumchlorid. Der Hauptzweck der Lehre von Natale ist die gleichzeitige Erkennung von Retikulozyten und Blutplättchen. Das Reagens nach Natale enthält übrigens Citrationen, um die Färbung der Blutplättchen zu optimieren.
Das Reagens nach Natale enthält sehr hohe Konzentrationen Acridinorange- Farbstoff (10&supmin;² g/l), von dem festgestellt wurde, daß die Flüssigkeitskanäle im Instrument, einschließlich den Durchflußzellen, gefärbt werden, wodurch sich falsche positive Meßwerte für weiße Blutkörperchen ergeben. Diese Färbung führt ferner zu Austragsproblemen, so daß die Systeme einer gründlichen Spülung zu unterziehen sind, wodurch zeitraubende Schritte im Analysenprotokolll entstehen.
Ferner wendet sich die Lehre früherer Beschreibungen nach dem Stand der Technik hinsichtlich Acridinorange spezifisch gegen eine maximale Acridinorange- Absorption, da eine derartige maximale Absorption die Unterscheidung zwischen den verschiedenen Unterklassen von weißen Blutkörperchen verhindert, die das Hauptziel dieser Verfahren nach dem Stand der Technik sind.
Wir haben jetzt verbesserte Farbstoffzusammensetzungen zur quantitativen Bestimmung von Retikulozyten in Vollblut erfunden.
Die vorliegende Erfindung beschreibt eine Farbstoffzusammensetzung zur quantitativen Bestimmung von Retikulozyten in Vollblutproben, wobei die Zusammensetzung aus einer wäßrigen Lösung eines quaternisierten Derivats von Acridinorange mit folgender Formel besteht:
wobei X eine Benzylgruppe der folgenden Formel ist
wobei R&sub1; ein Wasserstoff oder Fluorin und R&sub2; Fluorin, Trifluoromethyl oder Wasserstoff oder X eine Hydroxyethylengruppe ist und Y&supmin; ein Bromid oder Jodid.
Die Erfindung schließt ferner ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Retikulozyten in einer Vollblutprobe durch Durchflußcytometrie ein, die aus folgenden Schritten besteht:
(a) Mischen einer zu prüfenden Blutprobe mit einer Farbstoffzusammensetzung der Erfindung;
(b) nach Ablauf einer ausreichenden Zeit zur wirksamen Absorption des Acridinorange-Derivats durch die Retikulozyten Bestrahlung der Mischung mit einer blauen Laserlichtquelle;
(c) Messen der Intensität der Orangefluoreszenz von der Mischung; und
(d) quantitive Bestimmung der Retikulozyten anhand der genannten Messung.
Gewisse Acridinorange-Derivate, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, sind neu. Diese Verbindungen beruhen auf Formel I, wie vorstehend beschrieben, jedoch sind R&sub1; und R&sub2; nicht beide Wasserstoff.
In Formel I vorstehend kann X eine Benzylgruppe der folgenden Formel sein:
wobei R&sub1; ein Wasserstoff oder Fluorin und R&sub2; ein Trifluoromethyl (CF&sub3;) oder Wasserstoff ist, um eine Verbindung der folgenden allgemeinen Formel (II) zu bilden:
wobei Y&supmin; vorzugsweise ein Bromid ist.
Alternativ kann X eine Hydroxyethylengruppe ((CH&sub2;2OH) sein, um eine Verbindung der folgenden allgemeinen Formel (III) zu bilden
wobei Y&supmin; vorzugsweise ein Jodid ist.
Die Farbstoff-Zusammensetzungen (manchmal auch Reagenszusammensetzungen genannt) der Erfindung bestehen vorzugshalber aus einer Pufferlösung, um den pH-Wert in etwa neutral (7,0) zu halten. Eine bevorzugte Pufferlösung besteht aus Paraformaldehyd und Kaliumoxalat, jedoch können auch andere benutzt werden. Bei einer stark bevorzugten Zusammensetzung der Erfindung befinden sich in einer Pufferlösung, die aus 1,25 g/l Paraformaldehyd und 9 g/l Kaliumoxalat besteht, 3 bis 9 ug/ml Acridinorange-Derivat.
Bei dem Verfahren der Erfindung wird Durchflußcytometrie benutzt, um die Retikulozyten in Vollblutproben zu messen. Das Grundkonzept der Durchflußcytometrie besteht im Wesentlichen daraus, daß die Körperchen einzeln einen spezifischen Meßbereich passieren. Durch hydrodynamische Fokussierung passieren Einzelkörperchen die Meßzone, die aus einer fokussierten Laserlichtquelle und einem Meßsystem zur Messung von gestreutem und fluoreszentem Licht besteht.
Das Verfahren ist dem Fachmann bekannt.
Bei dem Verfahren der Erfindung wird die Blutprobe mit einer Zusammensetzung der Erfindung gemischt, und die Mischung (bei der es sich im Allgemeinen um eine Suspension handelt) bleibt kurze Zeit bei Zimmertemperatur stehen, z.B. drei Minuten oder weniger, so daß der Acridinorange-Farbstoff optimal von den Retikulozyten absorbiert werden kann. Dann wird die Rot- oder Orangefluoreszenz gemessen.
Zum genaueren Verständnis der Erfindung wird Bezug auf die anliegenden Zeichnungen genommen, wobei:
Fig. 1a und 1b die ¹H NMR Spektren von zwei Derivat-Farbstoffen (IIa und III) der vorliegenden Erfindung sind;
Fig. 2a und 2b die Fluoreszenzspektren des Derivats (IIa) der vorliegenden Erfindung bzw. von Acridinorange sind;
Fig. 3a und 3b die Absorptionsspektren des Derivats (IIa) der vorliegenden Erfindung bzw. von Acridinorange sind;
Fig. 4a und 4b pH-Titrationskurven für die Derivate (IIa) (IIb) und (III) sind;
Fig. 5a und 5b eine Darstellung der Reagensstabilität (Absorptionsintensität bzw. Fluoreszenzintensität des Derivats (IIa) der vorliegenden Erfindung sind;
Fig. 6a und 6b Korrelationsdaten für die Analyse unter Verwendung des Derivats (IIa) sind, mit verschiedenen Konzentrationen in einem kommerziell automatisierten Verfahren im Vergleich zum von NCCL zugelassenen manuellen Verfahren;
Fig. 7 die Korrelationsdaten für das Derivat (III) sind;
Fig. 8a und 8b die Korrelationsdaten der Derivate (IIa) und (III) sind, bei einem kommerziell automatisierten Verfahren im Vergleich zu einem anderen kommerziell automatisierten Verfahren unter Verwendung von Thiazolorange; und
Fig. 9 ein Cytogramm zur Darstellung von Vorwärtsstreuung im Vergleich zur Fluoreszenz von Retikulozyten sind, die mit dem Derivat (III) gefärbt wurden.
Wir haben festgestellt, daß die spezifischen quaternisierten Derivate von Acridinorange, wenn sie in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, chemisch stabiler sind und eine höhere Reproduzierbarkeit der Retikulozytenzählung im Vergleich zu früher eingesetzten Methoden und Farbstoffen bieten. Weil sie ferner polar sind, durchdringen diese Derivate die Zellmembrane von Erythrozyten schnell und binden sich an die intrazelluläre RNS in einem Maße, daß geringere Farbstoffkonzentrationen für die Färbung von Retikulozyten erforderlich sind und Probleme mit der Färbung der Kanäle wesentlich gemindert werden.
Die folgenden Beispiele erklären nur anhand von Darstellungen die synthetisch quarternisierten Derivate von Acridinorange laut der Erfindung sowie Zusammensetzungen und Verfahren, die diese zur quantitativen Bestimmung von Retikulozyten unter Verwendung von Fluoreszenz-Durchflußcytometrieverfahren enthalten. Stoffe in handelsüblicher Standardreagensgüte wurden, wo möglich, eingesetzt.

Beispiel 1: Synthese von 3,6-bis(Dimethylamino)-10-Benzylakridinbromid

In eine Zweihalsflasche von 100 ml mit rundem Boden, die mit einem Rührstab und Rückflußkondensator versehen wurde, wurden 0,514 g (oder 1,4 x 10&supmin;³ Mol) Acridinorange-Basis gegeben.
In diese Flasche wurden ferner 10 ml Trockentoluol (frisch geöffnetes Toluol, das über Natriumkugeln getrocknet wurde) gegeben. Ein Alkyliermittel, reines Benzylbromid mit einem Gesamtvolumen von 0,173 ml (oder 1,45 x 10&supmin;³ Mol) wurde der gerührten Mischung in der Flasche langsam zugegeben, während die Mischung allmählich über Nacht auf 100 - 110ºC erhitzt wurde. Es wurde darauf geachtet, daß die Temperatur unter dem Siedepunkt von Toluol, nämlich 111ºC, gehalten wurde. Die Mischung wurde auf Zimmertemperatur abgekühlt, und der feste Niederschlag wurde mit einem angebrachten Scheibentrichter aufgefangen. Der feste Kuchen wurde gründlich mit Toluol gespült und im Vakuum luftgetrocknet. Es entstand ein ziegelroter Feststoff (etwa 0,381 g). Ein Teil des Rohproduktes (etwa 0,27 g) wurde mit Entspannungschromatographie gereinigt (18,5 g Silizium mit Chloroform/Methanol/Wasser bei einem Mol-Verhältnis von 7,5/2,5/0,3 Mol als verdünnendes Lösungsmittel). Es entstanden etwa 0,18 g der gereinigten Mischung mit folgender Formel:

Beispiel 2: Synthese von 3,6-bis(Dimethylamino)-10-N-Benzylakridin-Derivaten

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde angewandt, jedoch wurden andere Alkyliermittel der gleichen Molkonzentration eingesetzt. Die fluorhaltigen Benzylgruppen wurden entweder in Position 2 oder 4 des Benzolringes ersetzt. Die Alkyliermittel schlossen ein:
2-Fluorobenzylbromid
4-Fluorobenzylbromid
4-Trifluoromethylbenzylbromid
Es wurden Verbindungen der folgenden allgemeinen Formel (II) erhalten:
wobei R&sub1; Fluorin oder Wasserstoff und R2 Fluorin, Trifluoromethyl (CF3) oder Wasserstoff war. Laut den vorliegenden technischen Daten werden Verbindungen dieser allgemeinen Formel als Derivatfamilie (II) wie folgt bezeichnet und spezifische Derivate einzeln als Derivat (IIa), (IIb), (IIc) oder (IId):
Derivat (IIa), A0-10-Benzyl, wobei R&sub1; = R&sub2; = H
Derivat (IIb), AO-10-(2F)-Benzyl, wobei R&sub1; = F; R&sub2; = H
Derivat (IIc), AO-10-(4F)-Benzyl, wobei R&sub1; = H; R2 = F
Derivat (IId), AO-10-(4CF3)-Benzyl, wobei R&sub1; = H; R&sub2; = CF&sub3;

Beispiel 3: Synthese von 3,6-bis(Dimethylamino)-10-Ethanolacridin-Derivat.

In eine Zweihalsflasche von 100 ml mit rundem Boden wurden 0,508 g Acridinorange-Basis gegeben. Der Flasche wurden Trockentoluol (5 ml) und Dimethylformamid (2 ml) zugegeben. Die Flasche war mit einem Rückflußkondensator und einem Druckausgleichstrichter versehen. Dann wurde 2-Jodethanol (0,261 g, in 5 ml Toluol aufgelöst) tropfenweise der Mischung zugegeben, die ständig gerührt und auf etwa 110ºC erhitzt wurde. Die Zugabe von 2-Jodethanol fand im Verlaufe von etwa einer Stunde statt. Die Reaktion konnte mit Rückfluß über Nacht stattfinden. Die Mischung wurde dann auf Zimmertemperatur abgekühlt. Ein organgefarbiger Feststoff wurde niedergeschlagen. Der Mischung wurden weitere 10 ml Toluol zugegeben und gemischt. Der feste Niederschlag wurde mit einem angebrachten Scheibentrichter aufgefangen. Der feste Kuchen wurde gründlich mit Toluol gespült und der Feststoff im Vakuum luftgetrocknet.
Es wurden etwa 0,555 g der festen Verbindung von Formel III erhalten.
In den nachstehenden Beispielen werden Verbindungen dieser allgemeinen Formel als Derivate (III) AO-10-CH&sub2;CH&sub2;OH bezeichnet.

Beispiel 4: Charakterisierung von Derivatfamilie (II) und von Derivat (III)

A. Dünnschicht-Chromatographie - Siliziumgel-TLC wurde benutzt, um die Verbindungen zu identifizieren. Ein gemischtes Lösungsmittelsystem, bestehend aus Chloroform/Methanol/Wasser mit einem Mol-Verhältnis von 7,5/2,5/0,3 wurde benutzt. Acridinorange erschien mit einem Rf-Wert von etwa 0,50, während die gesamte Derivatfamilie (II) mit einem Rf-Wert von 0,57 erschien. Derivat (III) zeigte einen ähnlichen Rf-Wert von 0,57.
B. Die ¹H NMR Spektren von Derivat (IIa) und Derivat (III) wurden, beruhend auf etablierten Protokollen, mit einem NMR-Spektrometer vom Typ Varian EM-360 MHZ bestimmt. Die Spektrum sind in Fig. 1a (60 MHz) bzw. Fig. 1b (60 MHZ) dargestellt. Charakteristische Benzylprotonen- und Ethylenprotonen-Bänder sind dabei deutlich sichtbar.
Ähnliche Spektren der Derivate (IIb), (IIc) und (IId) wurden ebenfalls erhalten.
C. Die optischen Absorptionsspektren wurden mit einem Spektrometer vom Typ Perkin-Elmer Lambda 3B UV/VIS bestimmt. Es wurde ein Volumen von 3 ml einer Konzentration von 3 ug/ml des Farbstoffderivats (Derivat (IIa)) in PBS-Pufferlösung (Sigma Kat. 1000-3) gemessen, und die Absorptionsspektren der Farbstoff- Zusammensetzungen wurden mit denen von Acridinorange verglichen. Beide Mischungen zeigten eine Dimer-Spitze um 470 nm. Die Monomerspitze von Derivat (IIa) liegt bei 496 mn und die von Acridinorange bei 490 nm. Die Absorptionspektren von Derivat (III) und der anderen Benzylderivate sind denen von Derivat (IIa) sehr ähnlich. Tabelle 1 enthält eine Zusammenfassung der Absorptionsmaxima der Derivate im Vergleich zu denen von Acridinorange. TABELLE 1 Absorptionsmaxima verschiedener Farbstoffe in PBS-Pufferlösung Verbindung Monomer abs. (nm) Dimer abs. (nm) Acridinorange Derivat
D. Das Fluoreszenzspektrum von Derivat (IIa) (siehe Fig. 2a) zeigte eine Emissionspitze von 527 nm im Vergleich zu der von Acridinorange (Fig. 2b) von 533 nm, bei Erregung von 488 mm. Ein Fluoreszenzspektrophotometer vom Typ Hitachi F-4010 wurde mit 3 ml von 1 ug/ml des Acridin-Farbstoffderivats in PBS- Pufferlösung verwendet.

Beispiel 5: pH-Titration von Derivatfamilie (II) und Derivat (III).

Die optischen Absorptions- und Fluoreszenzspektren der Verbindungen wurden bei verschiedenen pH-Werten gemessen. Eine neue Pufferlösung wurde für den Einsatz mit den Derivaten entwickelt und enthielt 1,25 mg/ml Paraformaldehyd und 9 g/l Kaliumoxalat. Der pH-Wert dieser Pufferlösung wurde angeglichen, indem entweder kleine Mengen 1,0 N HCl Lösung oder 1,0 N NaOH-Lösung zugegeben wurden, bis pH-Werte von 3,0, 5,0, 7,0, 9,0 und 12,0 entstanden. Wie in Fig. 4a dargestellt, bleibt das Absorptionsspektrum von Derivat (IIa) ab pH-Wert 3,0 bis pH-Wert 9,0 konstant, bei einem kleinen Anstieg bei pH-Wert 12,0, wogegen sich das Absorptionsspektrum von Acridinorange (Fig. 3b) deutlich wesentlich ab pH-Wert 12,0 ändert, wie dies anhand der Differenz zwischen tertiären und quaternären Aminen zuerwarten ist. Ähnliche Ergebnisse wurden ferner hinsichtlich der Fluoreszenzspektren beider Verbindungen beobachtet (siehe Fig. 2a bzw. 2b). Fig. 4b enthält die pH- Titrationskurven der Derivate (IIb) und (III). Sie weist auch auf die bessere Stabilität der Derivatfamilie (II) und von Derivat (III) bei hohen pH-Werten im Vergleich zu Acridinorange hin.

Beispiel 6: Fluoreszenzbindung der Derivatfamilie (II) und von Derivat (III) an RNS (gesättigte Lösung).

Verschiedene RNS-Lösungsvolumen (Calbiochem Kat. 557112) mit Konzentrationen von 100 mg/ml in einer PBS-Pufferlösung wurden zugegeben und mit 3 ml Acridinfarbstoff-Derivatlösung der Erfindung (Farbstoffkonzentration 1 ug/ml) gemischt. Das Fluoreszenzspektrum wurde jeweils registriert, bis die Farbstofflösung mit RNS gesättigt war. Es wurde festgestellt, daß diese Sättigung auftrat, wenn der Farbstofflösung ein Volumen von 40 ul RNS-Lösung oder mehr zugegeben worden war.
Die nachstehende Tabelle 2 zeigt die metachromatische Fluoreszenzverlagerung und den Fluoreszenz-Beschleunigungsfaktor für die Farbstoffzusammensetzungen der Erfindung im Vergleich zu Acridinorange. Die Daten beweisen eine größere Verlagerung für die Verbindungen der Erfindung als bei Acridinorange und die gleiche oder eine größere Zunahme im Fluoreszenzsignal bei Bindung an RNS. Das Verhältnis des Fluoreszenzsignals des gebundenen Farbstoffes im Vergleich zu freiem Farbstoff in der Lösung wird mit Fluoreszenz-Verstärkungsfaktor bezeichnet. TABELLE 2 Farbstofff Metachromatische Verlagerung (nm) Fluoreszenz-Verstärkungsfaktor Acridinorange Derivat

Beispiel 7: Mikroskopische Untersuchung der Retikulocytenfärbung mit Derivatfamilie II und Derivat III.

Protokoll für die Probenvorbereitung:

Etwa 20 ul einer Acridinderivat-Farbstofflösung (Stammlösung 0,3 mg/ml bis 0,9 mg/ml der Mischung in 100% Methanol) wurden 2 ml einer Pufferlösung zugegeben, die 0,9% Kaliumoxalat und 1,25 mg/ml Paraformaldehyd enthielt und gründlich gemischt wurde. Dieser lösung wurden 20 ul einer Normal- oder Patientenblutprobe zugebenen, verwirbelt und bei Zimmertemperatur drei Minuten lang stehen gelassen. Die Proben waren dann für die Retikulozyten-Bestimmung bereit. Bei angereicherten Retikulozytenproben wurden 10 ul Blut in 2 ml Reagens suspendiert. Bei der Acridinorange-Färbelösung (die zu Vergleichszwecken benutzt wurde) enthielt die Stammlösung 3 mg/ml Acridinorange.
Bei den mit NMB (Neumethylblau) gefärbten Proben wurde das Protokoll des US National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) befolgt.
Die Wirkung von Schwankungen in der Benzylringstruktur und die Art der Benzylring-Substituenten wurde geprüft. Für jede Mischung wurde die prozentuale Retikulocytenzählung unter Verwendung eines Durchflußcytometers vom Typ Spektrum III von der Firma Ortho Diagnostics Systems, Inc. nach dem Protokoll des Herstellers mit den prozentualen Retikulozytenzählungen laut der mikroskopischen Untersuchung verglichen. Die nachstehende Tabelle 3 enthält eine Zusammenfassung der Ergebnisse. TABELLE 3 Retikulozytenfärbung und quantitative Bestimmung mit verschiedenen Farbstoffen Spektrum III (% Verhältnis) Farbstoff Konz. (um) Mikroskopische Färbung Normalblut Patientenblut Derivat AO-2-NO2-Benzyl AO-2-Chlorobenzyl NM = Nicht gemessen ND = Nicht feststellbar
Weitere Experimente haben bewiesen, daß die Derivate der vorliegenden Erfindung bei einer Konzentration von ganzen 2 uM wirksam sind, obgleich stärkere Färbungen bei einer Konzentration von 7 uM festgestellt wurden.
Unter dem Mikroskop wurden Retikulozyten, die sich als rote RNS- Niederschläge zeigten, klar bei Blutproben beobachtet, die mit den Derivaten (IIa), (IIb), (IIc), (IId) und (III) gefärbt wurden. Acridinorange-10-2-Nitrobenzyl und Acridinorange-10-2-Chlorobenzyl färbten jedoch die Retikulozyten nicht spezifisch. Bei dieser Untersuchung wurde Acridinorange als Vergleichsprobe eingesetzt um zu beweisen, daß nicht alle Substituenten von Benzylwasserstoff Retikulozyten färben können. Es wurde festgestellt, daß die Acridinorange-Menge, die zum guten Färben von Retikulozyten erforderlich ist, etwa 10 bis 14 mal höher lag als die erforderliche Menge von Derivat (II) oder (III).

Beispiel 8: Stabilität der Reagensleistung innerhalb von Tagen nach Einsatz von Derivat (IIa).

Um ein cytometrisches Verfahren für die Retikulozytenzählung zu entwickeln, ist es wünschenswert, daß das Reagens, das zur Messung eingesetzt wird, während eines Arbeitstages ein reproduzierbares Ergebnis erzielt. Zur Auswertung wurde ein Reagens, das Derivat (IIa) enthielt, mit einem verglichen, das Acridinorange enthielt. Eine Blutprobe (normal) wurde getrennt mit den Farbstofflösungen gefärbt. Das Protokoll für die Zubereitung der Probe entspricht dem in Beispiel 7 beschriebenen. Ein Durchflußcytometer vom Typ Spektrum III wurde für diese Auswertung benutzt. Nachdem den Farbstofflösungen Blut zugegeben wurde, wurden die beiden verschiedenen Mischungen bei Zimmertemperatur belassen und Umgebungslicht ausgesetzt. Die Retikulozytenzählung der beiden Mischungen wurde in verschiedenen Zeitintervallen bei einer Dauer von bis zu acht Stunden durchgeführt. Bei jedem Intervall wurde die Messung verdoppelt. In der nachstehenden Tabelle 4 sind die Ergebnisse zusammengefaßt. TABELLE 4 Reproduzierbarkeit des Reagens bei Zimmertemperatur Retikulozytenzählungen % Verstrichene Zeit Derivat Mittel
Es liegt auf der Hand, daß sich bei Derivat (IIa) mehr reproduzierbare Zählungen innerhalb von acht Stunden ergeben. Der CV-Wert von 10,7% für Derivat (IIa) ist mit einem CV-Wert von 16% für Acridinorange zu vergleichen.
Unter Berücksichtigung der Ähnlichkeiten in der chemischen Struktur bei der anderen Derivatfamilie (II) und Derivat (III) können ähnliche Stabilitätsergebnisse erwartet werden.

Beispiel 9: Stabilität des Reagens (Lagerfähigkeit).

Die Stabilität der beiden Reagensien wurde untersucht und verglichen. Konzentrationen von 3 ug/ml von Derivat (IIa) und 30 ug/ml von Acridinorange, die je in Pufferlösung von Beispiel 7 gegeben wurden, wurden eine Woche lang gegen Umgebungslicht ungeschützt bei Raumtemperatur belassen. Die Absorptions- und Fluoreszenzspektren der Farbstofflösungen wurden täglich registriert. Die Intensitäten bei Absorptionsmaxima für Acridinorange (λ 490 nm) und Derivat (IIa) (λ 495 nm) und die Fluoreszenzmaxima für Acridinorange (λ 533 nm) und für Derivat (IIa) (λ 527 mn) wurden gemessen und mit denen für frisch zubereitete Farbstofflösungen verglichen, die Derivat (IIa) bzw. Acridinorange am Tag 0 enthielten. Die prozentuale Abnahme in der Intensität pro Tag wurde im Vergleich zur Zeit (d.h. Tagen) aufgezeichnet. Fig. 5a und 5b zeigen die getrennten Veränderungen in Absorption und Fluoreszenz. Es liegt auf der Hand, daß das Reagens, das Derivat (IIa) enthielt, nach sechs Tagen den geringsten Abfall in der Fluoreszenz- und Absorptionsintensität aufweist. Beim Benzylderivat wurde eine Abnahme in der Fluoreszenz und Absorption von etwa 30% beobachtet und bei Acridinorange von 70%. Derivat (IIa) ist daher stabiler und erzielt eine reproduzierbarere Retikulozytenzählung als mit Acridinorange.
In Anbetracht der Ähnlichkeiten in der chemischen Struktur der anderen Derivatfamilie (II) und von Derivat (III) dürften ähnliche Stabilitätsergebnisse für diese Derivate erwartet werden.

Beispiel 10: Korrelationsuntersuchung mit dem manuellen NCCL-Referenzverfahren.

Eine Untersuchung zum Vergleich der Ergebnisse von Derivat (IIa) und Derivat (III) bei Einsatz in einem Farbstoffreagens bei einem automatisierten Verfahren, beruhend auf dem manuellen NCCL Verfahren, wurde durchgeführt. Das Spektrum III Gerät wurde für diese Untersuchung benutzt, und das Probenprotokoll entsprach dem in Beispiel 7 für das Spektrum III Gerät beschriebenen. Dreiundvierzig Blutproben, einschließlich 31 Normalproben, 8 anomalen Proben und 4 mit Retikulozyten angereicherten Proben wurden mit einem Reagens gefärbt, das das genannte Farbstoffderivat enthielt und auf ihren Retikulozytengehalt analysiert. Retikulozyten im gleichen Satz Blutproben wurden ferner unter Verwendung des von NCCL zugelassenen manuellen Verfahrens gezählt. Die prozentuale Retikulozytenzählung, die anhand dieser beiden Verfahren entstand, wurde in Fig. 6a und 6b verglichen. Bei einer Konzentration von Derivat (IIa) von ganzen 3 ug/ml (oder 7 uM) im Reagens wurden gute Korrelationsdaten erhalten, d.h. ein Korrelationskoeffizient von 0,96, eine Steilheit von 0,71 und ein Schnittpunkt von 0% sind mit den Werten von 3 ug/ml vergleichbar (siehe Abb. 6a). Bei einer Konzentration von 9 ug/ml (oder 21 uM) ist die Korrelation des Reagens der Erfindung im Vergleich zur Vergleichsprobe ebenfalls sehr gut (siehe Abb. 6b). Ein Korrelationskoeffizient von 0,97, eine Steilheit von 0,87 und ein Schnittpunkt von 0% sind mit den Werten für 3 ug/ml vergleichbar.
Fig. 7 zeigt für Derivat (III) einen Korrelationskoeffizienten von 0,99, eine Steilheit von 1,06 und einen Schnittpunkt von 0,13%, beruhend auf neun Patientenproben.

Beispiel 11: Korrelation zum kommerziellen automatisierten Cytometrieverfahren.

Bei allen Probenmessungen unter Verwendung des Spektrum III Geräts wurden die Protokolle von Beispiel 8 befolgt.
Zwölf Patientenproben von verschiedenen Patienten wurden hinsichtlich ihrer Retikulozytenzählungen gemessen, wobei gleichzeitig zwei verschiedene Durchflußcytometrieverfahren Anwendung fanden. Das vorgenannte Reagens mit einer Konzentration von Derivat (IIa) von 6 ug/ml unter Verwendung des Spektrum III und des Becton Dickinson B-D FACScan Verfahrens unter Verwendung von Thiazolorange (siehe Lee, L. G., Chen, C-H, und Chlu, L.A., Thiazole Orange: A New Dye for Reticulocyte Analyses, Cytometry 7, 508 (1986)) (Thiazolorange: Ein neuer Farbstoff für die Retikulozytenanalyse). Bei der B-D Methode wird die Blutprobe mit dem Thiazolorange-Reagens mindestens 30 Minuten im Dunkeln bebrütet. Zum Vergleich kann das Reagens der vorliegenden Erfindung genaue Retikulozytenzählungen innerhalb von drei Minuten bei Zimmerbeleuchtung liefern. Jede Messung wurde doppelt ausgeführt. Es wurde eine gute Korrelation erzielt. Fig. 8a zeigt das Ergebnis: Korrelationskoeffizient 0,88, Steilheit 1,45 und Schnittpunkt -1,4%. Da das BD-D FACScan ein kommerzialisiertes cytometrisches Verfahren ist, weisen die Ergebnisse darauf hin, daß das beanspruchte Reagens mit der anerkannten cytrometischen Zählmethode vergleichbar ist.
Zwölf Patientenproben wurden mit 6 ug/ml einer Konzentration eines Reagens, das Derivat (III) enthielt, gemischt. Dabei wurde das vorgenannte Protokoll befolgt, und die Daten sind in Fig. 8b dargestellt.

Beispiel 12:

Figur 9 zeigt den hohen Unterscheidungsgrad zwischen der Retikulozyten- und Erythrozytenzahl, wenn die Körperchen mit Derivat (III) gefärbt und mit dem Spektrum III gemessen wurden. Das Protokoll für die Probenvorbereitung entspricht dem vorstehend beschriebenen. Spezifische Zellenzahlen wurden deutlich beobachtet, beruhend auf ihren spezifischen Streu- und Fluoreszenzsignalen. Die Erythrozytenzahl fällt in Version A zwischen der senkrechten Achse und der senkrechten Linie X. Diese Zellen zeigen höhere Streusignale und niedrige Zellen-Fluoreszenzsignale. Die Retikulozytenzahl fällt im Bereich B (rechts von X). Diese Zellen sind von den Erythrozyten wegen der hohen Fluoreszenzsignale von ihrer mit Derivat (III) gefärbten RNS unterscheidbar. Die Plättchenzahl liegt im Bereich C unter Linie Y. Diese Plättchen weisen relativ schwache Streu- und Fluoreszenzsignale im Vergleich zu den Retikulozyten auf. Die parabolartige Grenzlinie Z im Bereich B stellt das Ausmaß des Fluoreszenzsignals dar, das man erhalten würde, wenn Acridinorange anstelle von Derivat (III) als Farbstoff benutzt würde. Es liegt daher ohne weiteres auf der Hand, daß eine größere Empfindlichkeit durch Einsatz von Derivat (III) erzielt wird, da das Verhältnis des Fluoreszenzsignals der Retikulozyten zum Fluoreszenzsignal der Erythrozyten für die mit Derivat (III) gefärbten Zellen im Vergleich zu den mit Acridinorange gefärbten hoch ist.
Beruhend auf der Fluoreszenztrennung zwischen Erythrozyten und Retikulozyten wurde die Retikulozytenzahl einer Patientenprobe mit 2,2% gemessen. Die gleiche Blutprobe wurde auch mit dem NCCLS Verfahren analysiert. Das Ergebnis war eine Retikulozytenzählung von 2,6%.

Claims

1. Quaternisiertes Derivat von Acridinorange, wobei das Derivat folgende Formel aufweist:

wobei X eine Benzylgruppe der folgenden Formel ist:

wobei R&sub1; Wasserstoff oder Fluorin ist und R&sub2; Fluorin, Trifluormethyl oder Wasserstoff, vorausgesetzt, daß R&sub1; und R&sub2; nicht beide Wasserstoff sind oder X eine Hydroxyethylengruppe ist, wobei Y&supmin; Bromid oder Iodid ist.

2. Farbstoffmischung für den Einsatz in der quantitativen Bestimmung von Retikulozyten in einer Vollblutprobe, wobei die Mischung aus einer wäßrigen Lösung eines quaternisierten Derivats von Acridinorange folgender Formel besteht:

wobei X eine Benzylgruppe der folgenden Formel ist:

wobei R1 Wasserstoff oder Fluorin ist und R&sub2; Fluorin, Trifluormethyl oder Wasserstoff ist oder X eine Hydroxyethylengruppe und Y&supmin; ein Bromid oder Iodid.

3. Farbstoffmischung nach Anspruch 2, ferner mit einem Puffersystem.

4. Farbstoffmischung nach Anspruch 3, wobei das Puffersystem einen pH- Wert von etwa 7,0 beibehält.

5. Farbstoffmischung nach Anspruch 3, wobei das Puffersystem ein Paraformaldehyd und Kaliumoxalat enthält.

6. Farbstoffmischung nach Anspruch 4, wobei das Paraformaldehyd in einer Konzentration von 1,25 g/l vorhanden ist und das genannte Kaliumoxalat in einer Konzentration von 9 g/l.

7. Farbstoffmischung nach Anspruch 2 bis 6, in der das quaternisierte Derivat von Acridinorange in einer Konzentration von 2 uM bis 20 uM enthalten ist.

8. Farbstoffmischung nach Anspruch 2 bis 7, in der das genannte quaternisierte Derivat von Acridinorange mit einer Konzentration von etwa 7 uM enthalten ist.

9. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Retikulozyten in einer Vollblutprobe anhand von Strömungszytometrie, bestehend aus folgenden Schritten:

(a) Mischen einer zu prüfenden Blutprobe mit einer Farbmischung, wie in Anspruch 2 bis 8 beschrieben,

(b) Nach Ablauf einer ausreichenden Zeit zur wirksamen Absorption des Acridinorange-Derivats durch die Retikulozyten Bestrahlung der Mischung mit einer blauen Laserlichtquelle;

(c) Messen der Stärke der orangen Fluoreszenz der Mischung und

(d) quantititive Bestimmung der Retikulozyten in der Probe anhand der genannten Messung.