DE3001264A1 - Waessriges reagenzsystem zur quantitativen bestimmung von protein und dessen verwendung - Google Patents
Waessriges reagenzsystem zur quantitativen bestimmung von protein und dessen verwendungInfo
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Description
Sherwood Medical Industries Inc. Case No.: IP-5071
BESCHREIBUNG
Die Erfindung betrifft ein Reagenzsystem und ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Proteinen in biologischen
Flüssigkeiten und insbesondere ein verbessertes Reagenzsystem und ein verbessertes Verfahren unter Verwendung des Farbstoffs
Coomassie Brilliant Blue G-250.
Derzeit werden verschiedene Methoden zur Bestimmung der Proteinmenge im Serum, in der Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit
(Liquor) und im Urin angewandt. Eine dieser Methoden ist die Biuret-Methode (Mokrasch und McGilvery, J. Biol. Chem. 221,
S. 909). Bei dieser Methode reagieren Peptidstrukturen, die mindestens zwei Peptidbindungen aufweisen, in alkalischer
Lösung mit Cu -Jonen unter Bildung eines violett gefärbten Chelatkomplexes. Die tatsächliche Struktur dieses Komplexes
ist unbekannt. Es ist jedoch bekannt, daß die Carbony!gruppen
und die Imingruppen der Peptidbindungen an dieser Reaktion beteiligt sind.
Lowry et al (J. Lab. Clin. Med. 39, 663) wenden eine
Vorbehandlung der Proteine mit einer alkalischen Kupferlösung ähnlich der oben eingesetzten an, gefolgt von einer
Zugabe des Polin-Ciocalteu-Reagenz (das Lithiumsalze der
Tetrakistriwolframatophosphorsäure und der Tetrakistrimolybdatophosphorsäure enthält). Die gebildete Färbung ist
das Ergebnis der Reduktion der Tetrakistrimolybdatophosphorsäure und der Tetrakistriwolframatophosphorsäure zu
Molybdänblau und Wolframblau unter Einwirkung des Kupfer-Protein-Komplexes und des Tryptophans und des Tyrosins des Proteins.
Lowry verwandte diese Methode als eine empfindliche Nachweismethode für die Proteine des Liquors. Es hat sich seitdem
gezeigt, daß als Folge der Anwesenheit von Nichtproteinsubstanzen die unter den Nachweisbedingungen reagieren,
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Sherwood Medical Industries Inc. Case Ko.: ID-5071
die Lowry-Methode einen Fehler von 6 ί 3 mg Protein pro 100 ml Liquor aufweist (Svensmark, Scand. J. Clin. Lab.
Invest. (10:50).
Zur Bestimmung der Proteine wurden während einiger Jahre auch Farbstoffbindemethoden angewandt. Diese Technik umfaßt
eine Reaktion mit einem Farbstoff, bei der der Farbstoff an das Protein gebunden wird. Die Bildung dieses Farbstoff-Protein-Komplexes
führt zu einer Veränderung der optischen Eigenschaften des Farbstoffs. Dieses Phänomen ist als
sogenannter "Proteinfehler von Indikatoren" bekannt geworden, da ein Farbstoffreagenz, das einen geeigneten Puffer enthält,
sich so verhalten kann, daß es bei der Bindung an das Protein ohne eine Änderung des pH-Wertes die normalerweise
pH-abhängige Farbänderung zeigt. Der derzeit überwiegend für diagnostische in vitro-Untersuchungen angewandte Farbstoff
ist Bromkresolgrün (siehe Gindler US-PS 3 884 637). HABA und Methylorange sind zwei weniger verwendete Farbstoffe.
Die Farbstoff/Protein-Komplexbildung unter Verwendung von
Coomassie Brilliantblau G-250 als Farbstoff ist ebenfalls beschrieben worden (siehe Bradford US-PS 4 023 933).
Während die Farbstoffe Bromkresolgrün, HABA und Methylorange praktisch ausschließlich an Albumin gebunden werden,
vrird Coomassie Brilliantblau an eine große Vielzahl von Proteinen gebunden, die sich im Serum, im Liquor und im
Urin finden.
Die in der US-PS 4 023 933 offenbarte Verfahrensweise besitzt viele Vorteile, einschließlich einer hohen
Enpfindlichkeit, die die Anwendung kleiner Probengrößen
ermöglicht. Die prinzipiellen Nachteile sind der effektive Mangel der Farbstabilität während längerer Zeitdauern,
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was überwiegend eine Folge der Ausfällung des Protein-Farbstoff
-Komplexes ist, die Tatsache, daß das Material nicht die gleiche Reaktivität für verschiedenartige
Proteine besitzt,und die Tatsache, daß das Material nicht dem Beer'schen Gesetz gehorcht.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht nun darin, ein System für die quantitative Bestimmung von Proteinen
auf der Grundlage von Coomassie Brilliantblau G-250 anzugeben,
das die Vorteile dieses Materials wie sie in der US-PS 4 023 933 angegeben sind, besitzt und das zusätzlich
eine verbesserte Protein-Farbstoff-Farbstabilität aufweist,
für verschiedenartige Proteine im wesentlichen gleiche Reaktivität,
besitzt und auch dem Beer'schen Gesetz gehorcht.
Diese Aufgabe wird nun durch das Reagenzsystem gemäß
Hauptanspruch gelöst.
Gegenstand der ünteransprüche sind besonders bevorzugte
Ausführungsformen dieses Reagenzsystems sowie die Verwendung
dieses Reagenzsystems bei einem Verfahren zur Bestimmung von Proteinen.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein wässriges Reagenzsystem
für die quantitative Bestimmung von Protein, das den Farbstoff Coomassie Brilliantblau G-250, eine einbasige
starke Säure mit einem pKa~Wert von.
weniger als 3, eine mehrbasige Phosphonsäure und ein wasserlösliches, nichtionisches oberflächenaktives
Mittel enthält, welches oberflächenaktive Mittel ein Blockcopolymeres ist, das endständige Polyäthylenoxidsegmente
aufweist, die durch ein Polypropylenoxidsegment
getrennt sind.
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BAD ORIGINAL
Shervood Medical Industries Inc. Case No.: ID-5071
Im allgemeinen wird das System in Form von zwei wässrigen Bestandteilen verpackt, von denen der eine den Farbstoff
und die einbasige Säure und der andere das oberflächenaktive Mittel, die mehrbasige Säure und einen Alkohol
enthält. Jeder Bestandteil besitzt eine erhöhte Stabilität (entsprechend einer Lagerstabilität im Kühlschrank von
etwa einem Jahr) und ergibt beim Vermischen mit dem anderen Bestandteil das Reagenzsystem das als solches
in gekühltem Zustand während etwa vier Monaten stabil ist.
Coomassie Brilliantblau G-250 ist ein gut bekannter Farbstoff, der durch die nachstehende Formel wiedergegeben
werden kann:
OC.II, .
In dem erfindungsgemäßen Reagenzsystem ist dieser Farbstoff
in einer Menge von etwa 0,001 bis 0,1 % (Gewicht/-Volumen) vorzugsweise in einer Menge von 0,005 bis 0,05 %
(Gewicht/Volumen) enthalten.
Erfindungsgemäß geeignete einbasige Säuren besitzen einen
pK -Wert von weniger als 3, so daß das Reagenzsystem einen pH-Wert von [-1 bis] weniger als 1 besitzt. Vorzugsweise
weist die Säure einen pKa-Wert von weniger als
2,5 auf, so daß "das System einen pH-Wert von 0 bis 1 besitzt. Viele erfindungsgemäß geeignete einbasige
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Säuren sind in der oben angesprochenen US-PS 4 023 933
beschrieben und erfindungsgemäß sind jedoch die in dieser US-PS 4 023 933 ausgeschlossenen stark ionisierten
Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure, bevorzugt.
Die erfindungsgemäß bevorzugte mehrbasige Phosphonsäure
ist Nitrilotris(methylen)triphosphonsäure (NTP), die
ein Handelsprodukt darstellt. Die kombinierte Menge, in der die mehrbasige Säure und die einbasige Säure
in dem Reagenzsystem der Erfindung enthalten sind, beträgt etwa 1 bis 15 % (Volumen/Volumen), vorzugsweise etwa
2 bis 5 % (Volumen/Volumen), wobei das Verhältnis von mehrbasiger Säure zu einbasiger Säure etwa 2:1 bzw. 3:1
beträgt.
Der Alkohol ist in dem erfindungsgemäßen Reagenzsystem
in einer Menge von bis zu etwa 10 % (Volumen/Volumen),
beispielsweise von 0,1 bis 10 % (Volumen/Volumen)
von etwa 0,1 bis 2 % (Volumen/Volumen) enthalten.
Als oberflächenaktives Mittel sind die unter der Handelsbezeichnung
"Pluronic" erhältlichen Produkte geeignet. Wie in "Non-ionic Surfactants" (von I.R. Schmolka, herausgegeben
von Martin J. Schick, Marcel Decker Inc.,. 1967) angegeben, besitzen die "Pluronic"-Produkte die der
folgenden Formel entsprechende Struktur:
HO (C2H4O) a (C3H6O) b (C2H4O)cH
in der b einen Wert von mindestens 15 besitzt und (C2H4O)
20 bis 90 % des Gesamtgewichts der Verbindung ausmacht.
Erfindungsgemäß ist das Material "Pluronic F-77" bevorzugt; hierbei handelt' es sich um ein Material dessen Polyoxypropylensegment
ein Molekulargewicht von 2050 besitzt und das einen Polyoxyäthylengehalt von 70 % aufweist. Die
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Menge, in der das oberflächenaktive Mittel in dem erfindungsgemäßen
Reagenzsystem enthalten ist, beträgt etwa 0,05 bis 1 % (Gewicht/Volumen), vorzugsweise 0,1 bis
0,25 % (Gewicht/Volumen).
Das folgende Beispiel dient der weiteren Erläuterung der Erfindung.
a) Herstellung des Farbstoffbestandteils
Man beschickt ein Glasgefäß mit etwa 800 ml entionisiertem
Wasser. Dann wiegt man 120 + 1 mg Coomassie Blau G-250 ein
und überführt es in das Gefäß. Dann rührt man heftig bis
sich das Material vollständig gelöst hat. Man mißt 27 ± 0,5 ml konzentrierter Chlorwasserstoffsäure (12m) ab und
trägt sie langsam in das Gefäß ein. Dann bringt man das Volumen mit entionisiertem Wasser-auf 1000 ml, rührt gut
und filtriert durch ein Filterpapier (Whatman Nr. 1).
b) Herstellung des oberflächenaktiven Bestandteils Man beschickt einen 100 ml-Meßkolben mit 2,14 g oben
definierten oberflächenaktiven Mittels "pluronic F-77". Dann mißt man 14 ml entionisiertes Wasser ab und überführt
es in den Kolben. Man rührt bis sich das gesamte Material gelöst hat. Dann mißt man 7,1 ml Methanol ab und gibt
dieses unter ständigem Rühren in den Kolben. Dann mißt man 71,4 ml einer 50 %igen wässrigen Lösung von Nitrilotris"
(methylen)triphosphonsäure (NTP) ab und trägt das Material in den Kolben ein. Dann rührt man bis man eine vollständig
klare Lösung erhalten hat. Man füllt mit entionisiertem
Wasser auf 100 ml auf und rührt gut durch.
c) Herstellung des Reagenzsystems (Arbeitsreagenz)
In einer Polyäthylenflasche vermischt man 100,0 Volumen
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des Farbstoffbestandteils mit 14,0 Volumen des oberflächenaktiven
Bestandteils und inkubiert das Material während 16 bis 24 Stunden bei 37° C. Man verwendet hierzu
einen geschlossenen Inkubatorofen. Das Arbeitsreagenz wird
bei 2 - 8° C gelagert und kann unter Kühlen während mindestens 4 Monaten stabil aufbewahrt werden.
d) Analyse von Proben unter Verwendung des Reagenzsystems
Probengröße: 0,5 ml Urin
0,05 ml Liquor
0,05 ml Serum nach dem Verdünnen mit Salzlösung
im Verhältnis von 100:1.
Verfahrensweise:
1. Man zentrifugiert die Proben während 10 Minuten bei hoher Geschwindigkeit, um Zellen zu entfernen.
2. A)Man beschickt ein Reagenzglas (16 χ 100 ml) als
Blindprobe mit einer iosotonischen Salzlösung in
der gleichen Menge wie die Probe.
B) Man beschickt einzelne Reagenzgläser mit der Probe in dem angegebenen Volumen.
3. Man versetzt jedes Reagenzglas mit 4,0 ml des Reagenz-Systems
und mischt gut mit einer Mischeinrichtung (Vortex Mixer) durch.
4. Man überführt die Reagenzgläser in einen Reagenzglasständer und taucht diesen während 20 Minuten in ein bei
37° C gehaltenes Inkubierungsbad ein.
5. Man entnimmt den Reagenzglasständer aus dem Inkubierungsbad und taucht in während 2-3 Minuten in kaltes Wasser
(20 - 25° C). -
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6. Nach der Einstellung der Wellenlänge des Spektrophotometers
auf 610 nm stellt man die Extinktion des Instruments mit der Blindprobe auf 0 und bestimmt die
Extinktionswerte der Proben. Die gebildete Färbung ist während 90 Minuten stabil. Man kann die Proteinmenge
der Anwendung einer Eichkurve berechnen oder davon ablesen, die man mit Hilfe von Standardproben ermittelt
hat, die bekannte Proteinkonzentrationen aufweisen. Die Eichlösungen werden in gleicher Weise bestimmt,
wie die Probenlösungen.
030034/Q558
Claims (8)
- Patentanwälte Dipl.-Ing. H. We ic km an ν, Dipl.-Phys. Dr. K. FinckeDipl.-Ing. R A.Weickmann, Dipl.-,£1hem. B. HuberDr,-Ing. H. Liska '' /t:"■·,:."8 MÜNCHEN 86, DENPOSTPACH 860820MOHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 39 21/22HtmCase No.: ID"5071SHERWOOD MEDICAL INDUSTRIES INC.Olive StreetSt» Louis, Missouri 63103, V.St.A.Wässriges Reagenzsystem zur quantitativen Bestimmung von Protein und dessen VerwendungPATENTANSPRÜCHE' Ty Wässriges Reagenzsystem zur quantitativen Bestimmung von Protein, dadurch gekennzeichnet,030034/0558Sherwood Medical Industries Inc.daß es einen pH-Wert von £-1 bis^ weniger als 1 aufweist und einen Farbstoff der ,Formel .eine einbasige starke Säure mit einem pK -Wert von weniger als 3, eine mehrbasige Phosphonsäure und ein wasserlösliches nichtionisches oberflächenaktives Mittel in Form eines Blockcopolymeren mit endständigen Polyäthylenoxidsegmenten, die durch ein Pblypropylenoxidsegment getrennt sind, enthält,-wobei diese Bestandteile in einer solchen Menge vorhanden sind, daß das System beim Vermischen mit einer proteinhaltigen Probe einen gefärbten Protein-Farbstoff-Komplex bildet, der eine erhöhte Protein-Farbstoff-Farbstabilität aufweist, gegenüber verschiedenen Proteinen im wesentlichen die gleiche Reaktivität besitzt und dem Beerschen Gesetz gehorcht.
- 2. Reagenzsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß es zusätzlich eine geringe Menge eines Alkohols enthält.
- 3. Reagenzsystem nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es als einbasige Säure Chlorwasserstoffsäure (HCl), als mehrbasige Säure Nitrilotris(methylen)-triphosphonsäure und als Alkohol Methanol enthält und einen pH-Wert von 0 bis etwa 1 aufweist.030034/0558Fherwccd Medical Industries Inc. Case. Ho-..: ID -50 "> ! 300126
- 4.. Reagenzsystem nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet Λ daß es ein oberflächenaktives Mittel der nachstehenden FormelHO (C2H4O) a (C3H6O)13 (C2H4O)0Hwobei b einen Wert von mindestens 15 besitzt und a und c derart' ausgewählt sind, daß dies Bestandteile der Formel (C2H4Qi etwa 2Gf bis etwa 9F0".% des gesamten Gewichts der Verbindung ausmachen, enthält.
- 5. Reagenzsystem nach Anspruch 4, dadurchge k en. ηζ e i c h π e t , daß das Molekulargewicht des Polyoxypropylenbestandteils des oberflächenaktiven Mittels etwa 2050" beträgt und der Polyoxyethy lengehalt des oberflächenaktiven Mittels etwa 70 Gewichtsprozent beträgt.
- 6. Reagenzsystem nach den Ansprüchen 1, 2, 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet , daß die Bestandteile in den folgenden Mengen enthalten sind:a) 0,005 - 0,05 % (Gewicht/Volumen) des Farbstoffsb) 2 - 5 % (Volumen/Volumen) der Kombination aus mehrbasiger und einbasiger Säure, wobei das Verhältnis von mehrbasiger Säure zu einbasiger Säure etwa 2:1 bis 3:1 beträgtc) 0,1 bis 0,25 % (Gewicht/Volumen) oberflächenaktives Mittel-
- 7. Reagenzsystem nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß es den Alkohol in einer Menge zwischen etwa 0,1 und 2 % (Volumen/Volumen) enthält.
- 8. Verfahren zur Bestimmung von Protein, dadurch gekennzeichnet, daß man03003A/0558Sherwood Medical. Industries Inc. e No. : ID-50/1 _ Λa) eine protexnhaltige Probe mit dem wässrigen Reagenzsystem gemäß einem der Ansprüche 1-7 vermischt undb) die sich ergebende Farbänderung der Probe beobachtet»030034/0558 BAD ORIGINAL
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