DE2516310C2

DE2516310C2 - Verfahren und Reagenz zur Bestimmung von Albumin

Info

Publication number: DE2516310C2
Application number: DE19752516310
Authority: DE
Inventors: Melvin Rockford. Ill. Gindler
Original assignee: Sherwood Medical Co Eine Gesellschaft ND Gesetzen Des Staates Delaware St Louis Mo; Sherwood Medical Co
Current assignee: Sherwood Medical Co
Priority date: 1975-04-15
Filing date: 1975-04-15
Publication date: 1984-02-09
Also published as: DE2516310A1

Description

OX

worin bedeuten:

X: Natrium, Kalium, Ammonium oder ein organisches Amin

W: RO(CH₂CH₂O)_n-

Z: W oder XO-

n: 1-30

R: ein, Alkylaryl-Rest mit 10—30 Kohlenstoffatomen im Alkyl-Anteil.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß π einen Wert von 2 bis 10 besitzt und R ein Alkyl-Rest mit 14—22 Kohlenstoffatomen ist.

5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß, bezogen auf das Gewicht der biologischen Flüssigkeit, die anionische grenzflächenaktive Substanz in einer Menge von 40—300%, insbesondere 65—85%, verwendet wird.

6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der anionischen grenzflächenaktiven Substanz um ein partielles Natriumsalz einer Mischung aus Mono- und Diphosphat-Estern handelt, welche ein spezifisches Gewicht (25°C) von 1,05—1,15 aufweist, einen Fließpunkt (ASTM) von 6° C, eine Säurezahl (mg KOH/g) von ungefähr 35 bis zum zweiten Wendepunkt (pH 9—9,5) und einen pH-Wert von 5—6 (10%ige Lösung bei 25° C).

7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Farbstoff in einer Menge zwischen 0,5 und 5% verwendet wird, bezogen auf das Gewicht der biologischen Flüssigkeit.

8. Reagenz zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch

gekennzeichnet, daß es in wäßrige Lösung einen Sulfonphthalein-Farbstoff und eine phosphathaltige anionische grenzflächenaktive Substanz, die aus einem iiydrophoben Alkohol mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen gebildet 1st, enthält

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Albumin in biologischen Flüssigkeiten, bei dem der zu untersuchenden Flüssigkeit ein Reagenz zugesetzt wird, welches in wäßriger Lösung einen Sulfonphthalein-Farbstoff und ein grenzflächenaktive Substanz in einer solchen Menge enthält, daß sie das Ausfallen von Proteinfarbstoffkomplexen verhindert, und mittels eines Puffers auf einen für eine empfindlilche spektralphotometrische Analyse geeigneten pH-Wert eingestellt ist, worauf spektralphotometrisch die Absorption der so erhaltenen Probe gemessen wird, sowie ein Reagenz zur Durchführung dieses Verfahrens.

Ein derartiges Verfahren zur Bestimmung von Albumin ist aus der US-PS 35 33 749 bekannt. Nachteilig an dem bekannten Verfahren bzw. dem Reagenz zu seiner Durchführung ist es, daß eine lineare Abhängigkeit der optischen Absorption von der Albumin-Konzentration nur bis 6 g Albumin je 100 ml der Probe gegeben ist, so daß dem Reagenz nur relativ geringe Serummengen zugesetzt werden können, was dazu führt, daß die mit dem bekannten Verfahren erreichbare Empfindlichkeit begrenzt ist.

Ausgehend von diesem Stand der Technik liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, den Bereich der linearen Abhängigkeit der optischen Absorption von der Albumin-Konzentration zu erweitern.

Diese Aufgabe wird bei dem eingangs angegebenen Verfahren gemäß der Erfindung dadurch gelöst, daß das Reagenz eine wasserlösliche, phosphathaltige anionische grenzflächenaktive Substanz enthält, die aus einem hydrophoben Alkohol mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen gebildet ist.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens hat sich ein Reagenz bewährt, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es in wäßriger Lösung einen Sulfonphthalein-Farbstoff und eine phosphathaltige anionische grenzflächenaktive Substanz, die aus einem hydrophoben Alkohol mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen gebildet ist, enthält.

Der entscheidende Vorteil von Verfahren und Reagenz gemäß der Erfindung besteht darin, daß eine lineare Abhängigkeit der optischen Absorption von der Albumin-Konzentration bis hinauf zu 10 g Albumin je 100 ml der Probe gegeben ist, daß also das Beersche Gesetz bis zu diesem Grenzwert gilt, während diese Linearität bei dem bekannten Verfahren bzw. dem bekannten Reagenz gemäß der eingangs zitierten US-PS 35 33 749 nur bis zu einer Albumin-Konzentration von 6 g Albumin je 100 ml der Probe gegeben ist. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt daher, auch größere Albumin-Mengen in biologischen Flüssigkeiten mit ausreichender Empfindlichkeit zu messen.

Ein weiterer Vorteil von Verfahren und Reagenz gemäß der Erfindung besteht darin, daß sich die Analyse besser mit automatischen Analysegeräten durchführen läßt, weil die gemäß der Erfindung zu verwendende anionische grenzflächenaktive Substanz im Gegensatz zu der bisher verwendeten nicht-ionischen grenzflächenaktiven Substanz keine nachteiligen Einflüsse auf

gewisse Komponenten des automatischen Analysegeräts hat

Das erfindungsgemäße Verfahren sowie die Verwendung des erfindungsgemäßen Reagenzes zeichnen sich vor allem auch dadurch aus, daß keinerlei Trübung der Lösung auftritt

Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens sowie des erfindungsgemäßen Reagenzes wird als SuIfonphthalein-Farbstoff Bromkresolgrün verwendet Weiterhin hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn die anionische, grenzflächenaktive Substanz folgende Strukturformel hat:

15

20

25

Cr p.¹

OX

worin bedeutet:

X: Natrium, Kalium, Ammonium oder ein organisches Amin

W: RO(CH₂CH₂O)_n-Z: W oder ΧΟ-zi: 1-30
R: ein Alkylaryl-Rest mit 10-30 Kohlenstoffatomen im Alkyl-Anteil.

Dabei ist es günstig, wenn Λ einen Wert von 2 bis 10 besitzt und R ein Alkyl-Rest mit 14 bis 22 Kohlenstoffatomen ist.

Weiterhin ist es erfindungsgemäß vorteilhaft, wenn die anionische grenzflächenaktive Substanz, bezogen auf das Gewicht der biologischen Flüssigkeit in einer Menge von 40 bis 300%, insbesondere 65 bis 85%, verwendet wird.

Als vorteilhaft hat es sich auch erwiesen, wenn erfindungsgemß als anionische grenzflächenaktive Substanz ein partielles Natriumsalz einer Mischung aus Mono- und Diphosphat-Estern verwendet wird, welche ein spezifisches Gewicht (25°C) von 1,05-1,15 aufweist, einen Fließpunkt (ASTM) von 6° C, eine Säurezahl (mg KOH/g) von ungefähr 35 bis zum zweiten Wendepunkt (pH 9-9,5) und einen pH-Wert von 5-6 (10%ige Lösung bei 25° C).

Vorteilhaft ist es ferner, wenn der Farbstoff in einer Menge zwischen 0,5 und 5%, bezogen auf das Gewicht der biologischen Flüssigkeit, verwendet wird.

Es versteht sich von selbst, daß es zweckmäßig ist, wenn nicht nur der zu vermessenden Lösung, sondern auch den Eichproben für die Eichung des Spektral-Fotometers ein Reagenz zugesetzt wird, das eine anionische grenzflächenaktive Substanz gemäß der Erfindungsdefinition enthält.

Die verwendeten Alkohole können die Kohlenstoffatome in geradkettiger und/oder verzweigter und/oder in einer Ringanordnung enthalten.

Ganz besonders zweckmäßig sind solche hydrophoben Alkohole zur Herstellung geeigneter Phosphatester, die den folgenden Gruppen angehören: Alkyl-, aryl- und alkylarylabgeschlossene Äthylenoxidaddukte, Alkenoxidpolymere wie Blockpolymere aus Äthylen- und Propylenoxid, aliphatische und aromatische Äther und Thioäther, Alkyl- und Fluoralkyl-Kohlenstoffe.

Es können auch Mischungen der vorstehend angegebenen anionischen grenzflächenaktiven Substanzen verwendet werden. Besonders gute Ergebnisse lassen sich mit einer anionischen grenzflächenaktiven Substanz erzielen, die ein partielles Natriumsalz einer Mischung aus Mono- und Diphosphat-Estern mit einem spezifischen Gewicht (25°C) von 1,05—1,15, einem Fließpunkt (ASTM) von 6⁰C einer Säurezahl (mg KOH/g) von ungefähr 35 bis zum zweiten Wendepunkt oder bis zur zweiten Beugung (pH 9—9,5) und einem pH-Wert von 5—6 (10%ige Lösung bei 25° CX darstellt Eine solche Substanz wird z. B. unter dem Namen Gafac-LO-529 vertrieben.

Als Sulfonphthalein-Farbstoff wurde in Kombination mit den oben angegebenen anionischen grenzflächenaktiven Substanzen Bromkresolgrün bevorzugt Es können jedoch auch andere Sulfonphthalein-Farbstoffe, wie Bromphenolblau, Bromkresolpurpur usw, verwendet werden, die Albumin binden und in gebundener Form zu einer Änderung im Spektrum gegenüber dem freien Farbstoff führen. Bezogen auf das Gewicht der Probe der biologischen Flüssigkeit die es zu untersuchen gilt sind Farbstoffkonzentrationen in der Größenordnung von ungefähr 0,5—5% und insbesondere zwischen 2—2,5% empfohlen. Bei solchen Farbstoffkonzentrationen sollte die anionische grenzflächenaktive Substanz in der Mischung in einer Menge von ungefähr 40—300% und insbesondere von 65—85%, wiederum bezogen auf das Gewicht der Probe, vorhanden sein.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können die üblichen Methoden der spektralphotometrischen Analyse biologischer Flüssigkeiten angewandt werden. Über den Zusatz des Farbstoffs und der grenzflächenaktiven Substanz hinaus sollte die zu untersuchende biologische Flüssigkeit ferner einen geeigneten Puffer enthalten, um den pH-Wert der Probe in einem Bereich zu halten, in dem sich eine optimale Empfindlichkeit ergibt. Der optimale pH-Wert läßt sich durch einfache Versuche leicht ermitteln; wird als Farbstoff Bromkresolgrün verwendet, so stellt man erfindungsgemäß einen pH-Wert ungefähr zwischen 4,6 und 4,8 ein. Bei wesentlich g eringeren pH-Werten, z. B. bei einem pH-Wert von 4,2, ergeben sich beträchtliche Ausfällungen, während bei wesentlich höheren pH-Werten der Einfluß der Albumin-Konzentration auf die Absorption nur schwer ermittelt werden kann.

In Verbindung mit Bromkresolgrün empfiehlt sich ein Zitronensäure-Zitrat-Puffer zur Einstellung eines geeigneten pH-Werts.

Zusätzlich zu einem Puffer können andere Substanzen der zu analysierenden Lösung beigegeben werden, insesondere Substanzen zur Verhinderung des Mikrobenwachstums, ferner Chelatbildner, wie Iminoacetessigsäure-Derivate, die eine durch mehrwertige Metalle verursachte Interferenz verhindern.

Das folgende Beispiel offenbart ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Reagenz sowie eine besonders vorteilhafte Art der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Alle Mengenangaben und Prozentsätze sind auf das Gewicht bezogen, sofern nichts anderes angegeben wurde.

Zu 16 Litern Wasser wurden folgende Bestandteile hinzugefügt, um ein erfindungsgemäßes Reagenz herzustellen:

275 g Trinatriumzitrat-dihydrat
130 g Zitronensäure-Monohydrat
15,5 g EDTA (Dihydrat des äthylendiamintetra-

essigsauren Dinatriumsalzes)
90 g Gafac-LO-529 (ungefähr 88% grenzflächenaktive Substanz und ungefähr 12% Wasser)
2,33 g Bromkresolgrün-Farbstoff

3,00 ml dieser Lösung werden zu 0,020 ml Serum hinzugefügt Die optische Absorption dieser Lösung.wird dann im Wellenlängenbereich zwischen 590 und 660 nm und vorzugsweise bei 630 nm gemessen, und zwar mit Hilfe eines üblichen Spektralphotometers. Entsprechende Messungen wei den an PruLen durchgeführt, die bekannte Albumin-Konzentrationen zwischen 0 g und 6 g Albumin je 100 ml enthalten; aus diesen Vergleichsmessungen wird eine Eichkurve gezeichnet, die in diesem Bereich dem Beerschen Gesetz folgt Von dieser Eichkurve kann dann die Albumin-Konzentration der zu analysierenden Probe der biologischen Flüssigkeit abgelesen werden.

Wie oben dargelegt, kann die Bestimmung von Albumin gemäß der Erfindung einfach mit Hilfe einer einzigen wäßrigen Reagenzlösung durchgeführt werden. Bei der Erfindung kommt es nur darauf an, genügend Wasser zu verwenden, um eine leicht zu handhabende Lösung zu erhalten, dieser einen Sulfonphthalein-Farbstoff in ausreichender Menge beizusetzen, um das in der zu analysierenden Probe vermutete Albumin zu binden, sowie eine anionische grenzflächenaktive Substanz in einer solchen Menge hinzuzufügen, um Trübungseffekte ausreichend zu vermeiden. Darüber hinaus kann ein Puffer beigefügt werden, um den pH-Wert der Lösung in einen solchen Bereich zu bringen, daß sich eine gesteigerte Empfindlichkeit ergibt Schließlich können weitere Bestandteile in der Lösung vorhanden sein, die die Genauigkeit und die Vorteile des erfindungsgemäSen Verfahrens nicht beeinträchtigen.

Bevorzugte erfindungsgemäße Lösungen enthalten, bezogen auf das Gewicht der Lösung, ungefähr 0|2—2% und vorzugsweise 0,4—1,8% einer anionischen grenzflächenaktiven Substanz und ungefähr 0,003—0,044% und insbesondere 0,012—0,022% Sulfonphthalein-Farbstoff.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bestimmung von Albumin in biologischen Flüssigkeiten, bei dem der zu untersuchenden Flüssigkeit ein Reagenz zugesetzt wird, welches in wäßriger Lösung einen Sulfonphthalein-Farbstoff und eine grenzflächenaktive Substanz in einer solchen Menge enthält, daß sie das Ausfallen von Proteinfarbstoffkomplexen verhindert, und mittels eines Puffers auf einen für eine empfindliche spektralphotometrische Analyse geeigneten pH-Wert eingestellt ist, worauf spektralphotometrisch die Absorption der so erhaltenen Probe gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz eine wasserlösliche, phosphathaltige anionische grenzflächenaktive Substanz enthält, die aus einem hydrophoben Alkohol mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen gebildet ist

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Sulfonphthalein-Farbstoff Bromkresolgrün verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die anionische grenzflächenaktive Substanz folgende Strukturformel hat: