DE2447326C2

DE2447326C2 - Reagenz zum Nachweis und zur Bestimmung von Cystin

Info

Publication number: DE2447326C2
Application number: DE19742447326
Authority: DE
Inventors: Takehisa Amagasaki Hyogo Chiba; Tadashi Sakai Osaka Fujita; Masato Toyonaka Osaka Horiuchi
Original assignee: Santen Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Santen Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1973-10-08
Filing date: 1974-10-03
Publication date: 1982-09-16
Also published as: DE2447326A1; ES430767A1; CA1023649A; FR2246872A1; NL176976C; NL7412630A; JPS5063988A; GB1468297A; NL176976B; JPS5236029B2; FR2246872B1

Description

30

Die Erfindung betrifft ein Reagenz und ein Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Cystin oder Cystein in Lösung.

Es ist bekannt, daß sowohl Cystin als auch Cystein Schwefel enthaltende Aminosäuren sind, die leicht durch Oxydation bzw. Reduktion ineinander überführbar sind. Es sind verschiedene Verfahren zum Nachweis von Cystin oder Cystein bekannt so z. B. ein polarographisches Verfahren, das Cyanid-Nitroprussid-Verfahren, das Jod-Nitrid-Verfahren, das Sullivan-Verfahren, das Fleming-Vassel-Verfahren usw. (vgl. N. L Allport und J. W. Keyser, Colorimetric Analysis, Vol. I, London 1957, S. 116-120). Die bekannten Verfahren bedürfen für den Nachweis einer langen Zeit und benötigen auch Reagentien, die zum Zeitpunkt der Verwendung hergestellt werden sollten und die giftig sind, wodurch ein vorsichtiges und beschwerliches Handhaben notwendig wird. Es ist im allgemeinen bekannt, daß organische Thiolverbindungen durch Komplexbildung mit verschiedenen Arten von Schwermetallionen eine Farbe entwickeln, jedoch ist ein Nschweisverfahren für Cystein oder Cystin unter Anwendung dieser Reaktion nicht praktisch, da die Farbreaktion nicht empfindlich genug ist

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Reagenz und Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Cystin oder Cystein zu entwickeln.

Die Lösung dieser Aufgabe ergibt sich aus den Ansprüchen 1 bzw. 4, Das Prinzip der erfindungsgemäßen Lösung ist wie folgt:

Cystein selbst oder Cystein, das durch Reduktion von Cystin gebildet wird, bildet in Gegenwart bestimmter Arten von Schwermelallionen und reduzierenden Mitteln einen Komplex.

Zusätzlich zu dieser Reaktion werden Sulfidionen (S²-) vom Reduktionsmittel selbst öder durch Reaktion zwischen dem Reduktionsmittel und dem Cystein freigesetzt

Das Sulfiidion verbindet sich mit dem Komplex und bildet somit einen Komplex mit gemischten Liganden. Es wurde gefunden, daß durch die Bildung des Komplexes mit gemischten Liganden eine bemerkenswerte bzw. beachtliche Farbentwicklung auftritt und die Färbung innerhalb einer kurzen Zeit erfolgt

Metallverbindungen von Nickel- oder Kobalto-Ionen, die erfindungsgemäß verwendet werden können, sind Salze organischer Säuren, wie Acetate oder Salze anorganischer Säuren, wie Sulfate, Nitrate, Chloride, Hydroxyde usw.

Reduktionsmittel, die erfindungsgemäß verwendet werden, sind z.B. Alkalidithiontte, Alkaliborhydride usw.

Sie reduzieren Cystin zu Cystein und setzen ferner durch Reaktion mit Cystein S²- frei.

Es ist auch möglich, Alkalisulfide oder Alkalihydrosulfide als Reduktionsmittel zu verwenden.

Das Alkalisulfid oder Alkalihydrosulfid bildet durch S²-, das bereits anwesend war, einen Komplex mit gemischten Liganden, jedoch reagiert es gleichzeitig mit dem Kobalto- oder Nickel-Ion unter Bildung des Metallsulfids, welches manchmal die Farbe nicht klar erscheinen läßt In einem solchen Fall ist es jedoch möglich, durch Abtrennung des Metallsulfids die Farbe klar erscheinen zu lassen.

Das Reduktionsmittel ist in solcher Menge zu verwenden, daß genug Cystein aus Cystin zur Bildung des gefäri-ien Komplexes mit gemischten Liganden geliefert *ird. Zur Bildung des Komplexes ist es erwünscht, daß das Reduktionsmittel und die Metallverbindung in etwa äquimolaren Mengen verwendet werden.

Bei der Zugabe eines erfindungsgemäßen Reagenzes zu einer Cystin oder Cystein enthaltenden Lösung entwickelt sich eine braune Farbe.

Die Abwesenheit von Cystin oder Cystein in der Lösung ist leicht feststellbar, wenn die Farbe der Lösung eine andere als Braun ist Zu diesem Zweck ist es erwünscht, ein Chelat-bildendes Mittel dem Reagenz zuzugeben, welches durch Reaktion mit dem Nickeloder Kobalto-Ion eine wasserlösliche Chelatverbindung z. B. von blauer, grüner oder roter Farbe ergibt, wenn die Lösung kein Cystin oder Cystein enthält

Als Chelat-bildendes Mittel kommen z. B. EDTA, N itrilotriacetat, Tartrat, Citrat usw. in Frage.

Es ist wünschenswert, die Lösune bei einem pH-Wert von 6,0 bis 8,5 zu halten, da die Faroreaktion bei diesem pH-Wert leicht fortschreitet Es ist daher vorteilhaft, eine Puffersubstanz, wie Tris-{hydroxymethyl)-aminomethanphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat-Natriumdihydrogenphosphat, Borsäure-Natriumborat oder eine Mischung davon, zuzugeben.

Das erfindungsgemäße Reagenz kann in Form einer Lösung oder, was für die Verwendung vorteilhafter und praktischer ist, auch in Form eines Pulvers, eines Granulats, von Pellets und Tabletten vorliegen. Bei einem Reagenz in fester Form ist es empfehlenswert wasserlösliche Füllstoffe, Wie lösliche Stärke, Glucose, Sorbit, Sucrose,, Mannit usw., zuzugeben, da dies für die Verwendung recht vorteilhaft ist und ferner* das Auswiegen des Reagenz erleichtert

Es ist ferner möglich, das Ausmaß der Färbung zu verändern oder die Färbung zu beschränken, indem man die Menge der Komponenten in der färbenden Zusammensetzung ändert Erfindungsgemäß ist es!

möglich, den Cystin- oder Cystein-Gehalt entweder absorptionsfotometrisch zu bestimmen oder mit dem Auge abzuschätzen.

Auf Grund des möglichen schnellen Nachweise;! kann das erfindungsgemäße Reagenz auf vielen Gebieten ϊ Anwendung finden, so z.B. bei der medizinsichen Diagnose, z.B. von Cystinurie, wo eine abnorme Cystinzunahme im Urin auftritt Es ist lediglich notwendig, Urin zu dem Reagenz zu geben; falls er abnorm viel Cystin (cystinurischer Urin) enthält, wird es bei Raumtemperatur innerhalb einiger Minuten braun.

Somit eignet sich das erfindungsgemäße Reagenz nicht nur zur Diagnose von Cystinurie, sondern auch zur Bestimmung einer latenten Cystinurie im Anfangsstadium bei der medizinischen Gruppenuntersuchung. ι >

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

1) Es wurden 9,0 ml eines 5°/oigen Borat-Puffers (pH 7,2), enthaltend 1OG μg Cystin pro ml, hergestellt Dazu wurden 1,0 ml, 3,44 mmolar, der nachstehend aufgeführten Metallverbindungen und 15 mg Natriumdithionit zugegeben. Nach dem Stehenlassen während 5 Minuten wurde die Farbe dieser Probenlösung mit dem Auge beobachtet und ihre Absorption wurde bei 400 n»i im Vergleich zu einer Kon troll-Lösung bestimmt Die Kontroll-Lösung wurde in derselben Weise wie die Probenlösung hergestellt, wobei jedoch der 5%ige Borat-Puffer kein Cystin enthielt Wie aus dem Nachstehenden hervorgeht eignen sich Kobalto- und Nickel-Verbindungen unter den Metallverbindungen zur Bestimmung von Cystin am besten.

Metallverb indung

Absorption Mit dem Auge wahrgenommene Farbe Probenlösung Kontroll-Lösung

Kobalto-acetat

Kobalto-sulfat

Kobalto-nitrat

Kobalto-hydroxyd

Kobalto-chlorid

Nickel-nitrat

Nickel-sulfat

Nickel-hydroxyd

Nickel-carbonat

Kupfer-dD-sulfat

Kupfer-(II)-chlorid

Kupfer-(II)-nitrat

Kupfer-(II)-acetat

Eisen-(III)-sulfat

Eisen-(II)-sulfat

Eisen-(III)-cl2lorid

Ammoniumferrosulfat

(4 H₂O)
(7 H₂O)
(6 H₂O)

(6 H₂O)
(6 H₂O)
(6 H₂O)
(1 H₂O)
(4 H₂O)
(5 H,O)
(2 H₂O)
(3 H₂O)
(1 H₂O)
(6 H₂O)
(7 H₂O)
(3 H₂O)
(6 H₂O)
(24 H₂O)

1,360 1,365 1,364 0,323 1,310 0,358 0,286 0,307 0,154 0,062 0,060 0,060 0.059 0,015 0,010 0,017 0,036 0.015 braun

braun

hellblau

hellgelblichbraun

hellrosa

hellgrün

hellblau

hellgelblichbraun

ΐ-eügelblichbraun

2) Der unter 1) beschriebene Versuch wurde hinsichtlich der Konzentration der Metallverbindung abgewandelt um den Effekt auf die Färbung zu untersuchen. Als Metallverbindung wurde Nickelnitrat verwendet.

Wie aus dem Nachstehenden hervorgeht, nimmt das Ausmaß der Färbung mit der Nickelion-Konzentration zu.

Konzentration des	Absorption
NickelnitraLs. mMol	nach 1 Minute
1,13	1.503
0,85	0,455
0,71	0,252
0,57	0.043
0,43	0,003
0.28	0.000

3) IÖml eines 5°/oigen Borat'Puffers (pH 7,1) enthaltend 100 μg Cystin pro ml, und 2,0 ml mit 100 μg Nickeinitrat pro ml wurden miteinander vermischt, und es wurden die nachstehend angegebenen verschiedenen Reduktionsmittel zugegeben. Nach 5 Minuten wurden die Absorption und die Farbe der Probenlösung mit einer Kontroll^Lösuhg verglichen. Wie aus dem Nachstehenden hervorgeht, verliehen alle Reduktionsmittel der Probenlösung eine sichtbare braune Farbe, obwohl manche eine tiefere Und andere eine hellere Färbe ergäbet!·

Reduktionsmittel

Absorption Mil dem Auge wahrgenommene Farbe Probenlösung Kontroil-I.ösung

Natriumdithionit (15 mg)
Kaliumborhydrid (5 mg)
Natriumsulfid (9 H₃O) (5 mg)
Natriumhydrosulfid" (5 mg)

0,337 0,552 0,955*j 0,894*)

braun	hellgrün
braun	farblos
braun	farblos
braun	farblos

*) Absorption der Oberstehenden Flüssigkeit nach dem Zentrifugieren.

4) Der vorstehende Versuch) wurde hinsichtlich der Menge des Reduktionsmittels modifiziert, um dessen EfTekt auf die Färbung zu untersuchen. Es wurde Natriumdithionit als Reduktionsmittel verwendet. Die nachstehenden Ergebnisse zeigen, daß das Ausmaß der Färbung mit der Menge an Natriumdithionit zustimmt.

Gewicht des	Absorption	nach 5 Minuten	Mit dem Auge wahr
Reduktionsmittels, mg		0.143	genommene Farbe
	nach 1 Minute	0,324	nach 5 Minuten
7,5	ü.140	0,525	braun
\5J0	0,328	0.537	lie fb raun
30.0	0,470
45.0	0,504

5) Es wurde der Effekt des Chelat-bildenden Mittels auf die Farbe untersucht. 1 ml verschiedener 0,35molarer Chelat-bildender Mittel, 1 ml 0,4molarer Metailverbindung und 10 mg Natriumdithionit wurden zu einem 5°/oigen Borat-Puffer, enthaltend 100 μg Cystin pro ml, zugegeben. Nach dem Stehenlassen während 3 Minuten wurde die Farbe der Probe im Vergleich zu einer Kontroll-Lösung beobachtet Die Kontroll-Lösung wurde in derselben Weise hergestellt, mit dem Unterschied, daß der 5°/oige Borat-Puffer kein Cystin enthielt

Wie aus dem Nachstehenden hervorgeht, weisen alle Probelösungen eine braune Farbe auf, während die Kontroll-Lösungen verschiedene tiefere Farben aufweisen als bei Nichtzugabe eines Chelat-bildenden Mittels. Es ergibt sich somit, daß das Chelat-büdende Mittel die Unterscheidung zwischen einer Probelösung und einer Kontroll-Lösung erleichtert

Metallverbindung
Chelat-bildendes Mittel

Nickelnitrat

Probelösun::

Kontroll-Lösung

Kobaltosulfat
Probelösung

Kontroll- \ösung

keine Zugabe braun

Dinatriumedetat (EDTA) braun

Nitrilotriacetat braun

Natriumeitrat braun

Natriumtartrat braun

6) Ls wurde der Zusammenhang zwischen dem Ausmaß der Färbung und dem pH-Wert untersucht. 1 ml einer 40millimol?ren Nickelsulfatlösung wurde zu hellgrün

bidU

grün grün grün braun
braun
braun
braun
braun

Beispiel 2

hellrosa

rosa

In einer Reihe von Versuchen 1) bis 4) wurde die

9 ml verschiedener 0,1 molarer Puffer zugegeben, die 50 Farbe der Lösung, hergestellt durch Mischen von

100 μg Cystin pro ml enthielten. Wie aus der nachstehenden Tabelle hervorgeht, ist es erwünscht, die Lösung bei einem pH-Wert von 6.0 bis 8.5 zu halten.

Lösungen der nachstehend aufgeführten Chemikalien, untersucht.

	Pn	Absorption	.'.ncmikalien	Konzentration	Bemerkungen
	5.0	0,037		(Gew.-%)
Pu ITe r	6.0	0,185	Schwermetallverbindung
0.1-molare Boratlösung	η.5	0.352 60	Nickelnitrat	4OmM
0.1-molare Boratlösung	7.2	0,481	Nickelsulfaf	4OmM
0.1-molare Boratlösung	7,5	0,736	Kobaltonitrat	4OmM
0.1-molare Boratlösung	8,5	0,148	Kobaltosulfat	4OmM
0,1-molare Boratlösürtg	9,2	0,037	Ghelat'bildendes Mittel
Öjl-molare BöratlösUng	7,5	0,118 es	EDTA	1OmM
O.Umoiare Boratlösüng			Reduktionsmittel
0,1-rnöläre Phosphatlösung			Natriumdithirnit	5 mg	Pulver
Ö.umolare TriHhydfoxy'methyi)^	7,5	0,243	Puffer
aminomethan-Natrium-dihydrogen-		Borat	5%	Pll 7,2
phosphat'Lösung

Chemikalien

Cystinlösung

Cysteinlösung Konzentration Bemerkungen
(Gew-%)

100//g/m I

100//g/mI

der Puffer
wurde als
Lösungsmittel
verwendet
der Puffer
wurde als
Lösungsmittel
verwendet

I) Einfluß von Natriumdithionit auf die Cysfeinfiirbung

Nickelnilrat-Iösung

Niekelsulfatlösung

Cysteinlösung Natriumdilhionit

Farbe nach
Minuten

1 ml I ml

I ml 1 ml

10 ml 10 ml 10 ml IO ml mg

mg

hellrötlichbraiin tiefbraun
hellrötlichbraun tiefbraun

Die hellrötlichbraunen Lösungen Nr. 1 und 3 erhalten ihre Farbe vom gefärbten Komplex, den die Nickelionen mit Cystein bilden. Diese Farbe ist nicht empfindlich gegenüber Cystein, da sie schwach ist. Wie sich auf Grund der Lösungen Nr. 2 und 4 ergibt, führt die Zugabe von Natriumdithionit zu tiefbraun gefarSten Lösungen.

2) Einfluß von Natriumdithionit auf die Cystirifärbung

Nickelnitrat- Nickelsulfatlösung lösung

Cystinlösung

Natriumdithionit

Farbe nach 5 Minuten

ImI
ImI

ImI ImI ml
ml
ml
ml

mg
mg

tiefbraun wassenveiß tiefbraun wassenveiß

Die Lösungen Nr. 5 und 7 weisen dieselbe tiefbraune Farbe auf wie die Lösungen Nr. 2 und 4, während die Lösungen 6 und 8 auf Grund der Abwesenheit des Reduktionsmittels keine Färbung aufweisen.

3) Färbung in Gegenwart oder Abwesenheit von Cystin

Nickelnitrat- Nickelsulfat- Cystinlösung lösung lösung

Puffer

Natrium	EDT
dithionit
5 mg
5 mg	1 ml
5 mg	I ml
5 mg	-
3 mg	ImI
D mg	ImI

Farbe nach 5 Minuten

9	ImI	—
10	ImI	-
H	ImI	-
12	-	1 ml
13	-	ImI
14		ImI

10 ml

10 ml ml
ml

11ml
ml

hellgrün

blau

tiefbraun

hellgrün

blau

liefbraun

Die Lösungen Nr. 9 und 12 weisen keine braune Farbe auf, da sie kein Cystin enthalten, sie weisen jedoch die hellgrüne Farbe des Nickelions auf. Die Lösungen Nr. 10 und 13, die durch Zugabe von EDTA zu den Lösungen 9 bzw. 12 hergestellt wurden, weisen eine blaue Farbe auf. die auf den gefärbten Komplex aus dem NicJcelinn und EDTA zurückzuführen ist Die Lösungen 11 und 14, die Cystin enthalten, sind tiefbraun gefärbt

4) Färbung unter Verwendung von Köballoionen stall Nickelionen

Nr.

Koballosulfat- Koballonitr.it- Pulter
lösung lösung

Cyslinlosting

Nairiumdilhionit

EDTA

Farbe nach
5 Minuten

15
16
Vf
18

1 ml
1 ml

IO ml
10 ml

10 ml
10 ml

5 mg
5 mg
5 mg
5 mg

1 ml
1 ml
1 ml
1 ml

hellrosa
braun
rosa
braun

Bei der Verwendung von Köballoionen anstelle von Nickelionen waren die Ergebnisse hinsichtlich der Farbreaktion ähnlich denjenigen unter 3).

Beis piel 3

1) 1,0 ml einer 41millimolaren Nickelnitratlösung, 15 mg Nalriumdithionit und 1,0 ml einer 3millimolaren EttTA-1 .fisiing wurden zn 2 ml eines 5%igen Boratpuffers, der Cystin in verschiedenen Konzentrationen enthielt, zugegeben. Nach dem Stehenlassen während 5 Minuten wurden ihre Absorptionen gemessen. Aus den Ergebnissen wurde, wie nachstehend beschrieben, eine Kalibrierungslinie bzw. eine Eichkurve erhalten, die dem Beerschen Gesetz folgte.

Das Ergebnis zeigte, daß nach diesem Verfahren auf Cystin geprüft bzw. analysiert werden kann.

30 Cystinkonzentration (;/g/ml)

Cystinkonzentration (//g/ml) Absorption

50

100

150

200

0,009
0,198
0,407
0,611
0.805

35

■to

2) In derselben Weise wie unter 1), jedoch unter Verwendung von Kobaltosulfat anstelle von Nickelnitrat, wurde der Zusammenhang zwischen Cystinkonzentration und Absorption untersucht Auch in diesem Fall wurde eine Eichkurve erhalten.

Absorption
bei 400;/m

0
50

mn

151}
2C0

0.000
0.102
0,260
0,442
(X608

Beispiel 4

60 mg y-Globulin, gelöst in 1,0 ml Wasser und 4,0 ml 1 n-HCl, wurden durch Erwärmen in einem siedenden Wasserbad hydrolysiert. Nach 1 Stunde wurde die Lösung durch Zugabe einer 1 n-NaOH-Lösung neutralisiert und mit Wasser auf 8,0 ml verdünnt. Zu 1,0 ml (enthaltend 7,5 mg y-Globulin) dieser Lösung wurden die in Beispiel 3 verwendeten Reagentien zugegeben. Die Absorption bei 400 ηιμ betrug 0,587 (140 μg) nach 5 Minuten. Dieser Wert, errechnet auf Grund der Eichkurve des Beispiels 3, entspricht 20,0 μg Cystin pro 1 mg y-Globulin. Dies ist in etwa 20,8 μg Cystin/mg y-GIobulin, gleich dem aus der Literatur bekannten Wert.

Der Cyslingehalt von Rinderserum-Albumin wurde ebenfalls in ähnlicher Weise bestimmt, und der erhaltene V/ert, 22,0 μg/mg_I war ebenfalls dem aus der Literatur bekannten Wert von 22,6 μg/mg annähernd gleich.

Beispiel 5

Es wurden die nachstehenden Reagentien A, B, C und D hergestellt.

Reagens

Nickelnitrat

Kobaltosulfat Natriumüithionit EDTA

Puffer*)

A
B
C
D

11,0
15,0
20,0

20,0

2,2
2,2
2,2
22

8,8 38,0

8,8 34,0

8,8 29,0

8,8 29,0
(Einheit = mg)

*) Pulver, bestehend aus 5,2 g Natriumhydrogencarbonat und 0,4g NatriumdihydrogenphosphaL

2 ml Cystin in verschiedenen Konzentrationen enthaltenden Urins wurden dem Reagens zugegeben. Nach dem Stehenlassen während 1 Minute wurde die Farbe des Urins mit dem Auge untersucht. Vier Teilnehmer würden mit der Untersuchung beauftragt, und jeder Teiinehiner untersuchte das Reagens fünfmal bezüglich einer zufälligen (beliebigen) Probe. Die Ergebnisse der Untersuchung wurden nach der folgenden Methode durch Punkte bewertet: Wenn der Teilnehmer den Urin positiv bewertet, erhält die Bewertung 1 Punkt, bei pseudopösi fiver Bewertung werden 0,5 Punkte vergeben und bei negativer Bewertung 0 Punkte. Die Ergebnisse waren wie folgt:

Cystingchalt (/ig/ml) Reagens Λ

Reagens Reagens Γ

Reagens D

IO

20

30

40

50

60

85

100

200

4,5

9.5

¹⁶ 20

20 20 20

4,5 10.5 18 20 20 20 20 20 20 16
20
20
20
20
20
20
20
20
20

9,5 16 20 20 20

Bemerkung:

Wenn alle Teilnehmer eine Urinprobe in 5 Untersuchungen positiv bewerten, erhalt die l'rnhe 20 Funkte.

d.h. 1 Punkt X 5 X 4 Teilrehmer - 20

Wie aus den vorstehenden Ergebnissen hervorgeht, kann Urin, enthaltend mehr als 60 ng/ml, 40 μg/ml und 10μ§/ΐτι1 Cystin, unter Verwendung der Reagentien A bzw. B bzw. C mit einer Genauigkeit von 100% nachgewiesen werden.

Urin, enthaltend mehr als 50 μg/ml. 30 μg/ml und 5 μΗ/ηι1 Cystin, kann ebenfalls unter Verwendung der Reagentien A bzw. B bzw. C mit einer Genauigkeit von 10 bis 90% nachgewiesen werden.

Bei Verwendung des Reagens D, welches 20 mg ttobaltosulfat anstelle von Nickelnitrat enthält, kann Urin, enthaltend 60 μg/mI Cystin, mit einer Genauigkeit von 80% und, enthaltend 85 μ§/πι1 Cystin, mit einer Genauigkeit von 100% nachgewiesen werden.

Beispiel 6

Es wurden Pellets hergestellt, bestehend aus 16,5 mg Nickelsulfat, 4,0 mg Natriumdithionit, 50,0 mg Natriumhydrogencarbonat, 4 mg Natriumdihydrogenphosphat und Sucrose. Das Pellet wiegt durch Zugabe einer entsprechenden Menge Sucrose 400 mg.

Es wurden ferner Urinproben, enthaltend 30 μg/ml, 50μg/mI, 100μg/ml, 150μg/π1l und 200 μg/ml Cystin, durch Auflösen von Cystin in normalem Urin (Cystingehalt ^ig/ml) hergestellt. Unter Verwendung des Pellets untersuchten zehn Teilnehmer (A-J) die Urinprobe.in ähnlicher Weise wie in Beispiel 5, wobei jedoch 4 ml der Urinprobe zugegeben wurden. Wie aus der nachstehenden Tabelle hervorgeht, verlief der Test für alle Teilnehmer negativ bei normalem Urin, pseudopositiv bei Urin, enthaltend 30 μg/ml, und positiv bei Urin, der mehr als 50 μg/ml Cystin enthielt. Die Cyanid-Nitroprussid-Methode, die für den Nachweis von Cystin bekannt ist, wurde mit der erfindungsgemäßen Methode verglichen. Die Ergebnisse ergaben, daß die erfindungsgemäße Methode der Cyanid-Nitroprussid-Methode in der praktischen Anwendung überlegen ist, da letztere frischer Lösungen aus Natriumcyanid und Natriumnitroprussid und mehr als 10 Minuten für den Nachweis des Cystins bedurfte. Nach der erfindungsgemäßen Methode andererseits wurden lediglich 2 oder 3 Minuten zürn Nachweis des Cystins benötigt, und sie erwies sich als sehr zuverlässig.

Empfindlichkeitstest für das pefletisierte Reagens zum Nachweis von Cystin

Teilnehmer Cystingehalt (^g/ml)
10 30

Testprobe
!. 2.

1.

50 1.

150
1.

200 I.

-ί

-5-4-

Bewertung: —: negativ, db pseiido-positiv, +: positiv.

Claims

Patentansprüche:

1. Reagenz zum Nachweis und zur Bestimmung von Cystin oder Cystein in Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß es

a) ein Reduktionsmittel, das Cystin zu Cystein reduziert und Sulfidionen selbst oder durch Reaktion mit Cystein freisetzt und

b) eine Metallverbindung, die Nickelionen oder Kobaltoionen freisetzt, umfaßt.

2. Reagenz gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es ferner ein Chelat-bildendes Mittel enthält, welches durch Reaktion mit den Nickelionen oder Kobaltoionen lösliche Chelatverbindungen bildet.

3. Reagenz gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es ferner ein Puffermittel enthält, wodurch der pH-Wert der Lösung bei 6,0 bis 8,5 gehalten wird.

4. Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Cystin oder Cystein in Lösung durch Zugabe eines Reagenz zu der Lösung und Auswertung der eintretenden Farbreaktion, die dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Reagenz gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche zugegeben wird.