DE2517545C2 - Reagenz und Verfahren zur spektrophotometrischen Bestimmung von anorganischem Phosphor - Google Patents
Reagenz und Verfahren zur spektrophotometrischen Bestimmung von anorganischem PhosphorInfo
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Description
B—N-CH2-CH2-(OCH2CH2^-O-CH2-CH2Oh
R„
worin A m ein nicht störendes, nicht mit dem Phosphor
um das Molybdän konkurrierendes und die charakteristische blaue Farbe des Phosphormolybdatklomplexes
nicht beeinträchtigendes Anion ist, m mindestens 1 beträgt, B eine lipophile Gruppe mit
6 bis 28 Kohlenstoffatomen ist, Z Wasserstoff oder
25
CH2-CH2-(OCH2CH2Xr-O-CH2-CH2OH
und R Wasserstoff oder eine lipophile Gruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen bedeutet und X und Y
ganze Zahlen sind, deren 5 bis 30 ist, und π O oder 1
ist
3. Reagenz nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß A"m die Bedeutung Cl", SOJ" oder
CH2—O — SO3 besitzt, B eine lipophile Gruppe
mit 14 bis 22 Kohlenstoffatomen ist, Z die Gruppe
-C H2-C H2-(O C H2C H2)T-O-C H2-C H2O H
bedeutet und X und Y ganze Zahlen mit einer
bedeutet und X und Y ganze Zahlen mit einer
Die Erfindung betrifft ein Reagenz zur spektrophotometrischen Bestimmung von anorganischem Phosphor,
bestehend aus einer wäßrigen Lösung eines Reduktionsmittels zur Reduktion eines Phosphormolybdat-Kompiexes
unter Erzielung seiner charakteristischen blauen Farbe und eines wasserlöslichen Tensids in einer
ausreichenden Menge, um die Ausfällung von Protein aus einer Protein, Molybdänsäure und einen Phosphormolybdat-Komplex
enthaltenden Lösung zu verhindern, sowie ein Verfahren zur spektrophotometrischen
Bestimmung von anorganischem Phosphor nach dem Oberbegriff des Anspruchs 6.
Es ist seit vielen Jahren bekannt, Molybdänsäure zur
spektrophotometrischen Bestimmung der Phosphorkonzentration anzuwenden (siehe Review von R. G.
Henry, Clinical Chemistry, Principals and Techniques, Harper & Row, New York, 1964, Seiten 409-411 und
R. J. Martinek, J. Am. Med. Techno!., 32, 337 [197O]). Das Verfahren umfaßt im allgemeinen die Zugabe eines
Molybdatsalzes wie Ammoniummolybdat, einer Säure wie Schwefelsäure zur Bildung von Molybdänsäure und
eines Reduktionsmittels wie p-Methyl-ammoniumphenolsulfat zu der zu analysierenden Probe. Unter
saueren Bedingungen geht die Molyddänsäure mit anorganischem Phosphat eine komplexe Bindung unter
Bildung von Phosphormolybdat ein, welches anschlie-
t>5 Summe von 5 bis 20 sind.
4. Reagenz nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet daß A"m die Bedeutung Cl" und R die
Bedeutung CH3 besitzt
5. Reagenz nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß X und Y gleich ^roße ganze Zahlen
sind.
6. Verfahren zur spektrophotometrischen Bestimmung von anorganischem Phosphor durch Bildung
eines Phosphormolybdat-Kompiexes, Reduzieren des Komplexes unter Ausbildung seiner charakteristischen
blauen Farbe und spektr&photometrisches Messen der Farbintensität des reduzierten Komplexes
in Gegenwart eines wasserlöslichen Tensids in einer ausreichenden Menge, um die Ausfällung
von Protein in dieser wäßrigen Lösung zu verhindern, dadurch gekennzeichnet, daß als Tensid
ein langkettiges Aminokohlenwasserstoff-Äthylenoxyd-Addukt oder dessen quaternäres Derivat, das
nichtionische lipophile und hydrophile Gruppen enthält, verwendet wird.
ßend unter Erzielung der charakteristischen Molybdänblau-Farbe
reduziert wird (wahrscheinlich Mo [VI] zu Mo [V]). Die Farbintensität kann dazu verwendet werden,
die Konzentration des Phosphormolybdatkomplexes anzuzeigen und damit die Konzentration des Phosphors
in der Probe. Um den Phosphormolybdatkomplex zu erhalten und anschließend das Molybdän zu
reduzieren, sind saure Bedingungen erforderlich.
Ein großer Nachteil dieses Verfahrens besteht jedoch darin, daß unter sauren Bedingungen Molybdänsäure
und'Phüsphormolybdat Protein ausfällen, was eine unerwünschte Trübung der zu analysierenden Probe zur
Folge hat. Dieser Nachteil wird verstärkt, wenn andere Protein ausfällende Reagenzien, wie z. B. Kupfer-II-sulfat,
anwesend sind. Das Kupfer-II-ion fordert nämlich die Bildung des Molybdänblau-Komplexes, weshalb
seine Anwesenheit erwünscht ist (Delsal und Manhouri, Bull. Soc. Chim. Biol. (Paris) 40, 623 [Paris] 40,
[1958], mitgeteilt in Wootton, Micro-Analysis in
Medical Biochemistry, 4th Ed., Churchill Ltd., London, England. 1964, [Seiten 77 bis 78]).
Ein Reagenz der eingangs beschriebenen Art, bei dem keine Ausfällung von in der Probe enthaltenden
Proteinen erfolgt, ist aus der Zeitschrift »Clinica Chimica Acta«, VoI 46, 1973, Seiten 113-117 bekannt. Das
bekannte Reagenz enthält als Reduktionsmittel o-Phe-
nylendiamin, wobei zur Bildung des Phosphormolybdat-Komplexes
aus dem in der Probe enthaltenen anorganischen Phosphor bzw. Phosphat Ammoniummolybdat
und konzentrierte Schwefelsäure verwendet werden. Außerdem werden bei dem bekannten Reagenz
u. a. Tenside verwendet
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ausgehend von diesem Stand der Technik eine weitere
besonders vorteilhafte Möglichkeit zur spektrophotometrischen Bestimmung von anorganischem Phosphor
in Anwesenheit von Protein anzugeben.
Diese Aufgabe wird, was das Reagenz anbelangt, durch ein Reagenz der eingangs beschriebenen Art
!0 gelöst, welches gemäß der Erfindung dadurch gekennzeichnet
ist, daß das Tensid ein langkettiges Aminokohlenwasserstoff-Äthylenoxy-Addukt
oder dessen quaternäres Derivat, das nichtionische lipophile und hydrophile Gruppen aufweist, ist.
Ein besonderer Vorteil besteht bei dem erfindungsgemäßen Reagenz darin, daß die Polyäthergruppen des
Adduktes bzw. seines Derivates, da sie hydrophil sind, die entstandene komplexe Struktur in Lösung halten
und so die Bildung eines Niederschlags verhindern.
Als besonders vorteilhaft haben sich ein Addukt bzw. dessen quat.ernäres Derivat mit folgender allgemeiner
Formel erwiesen:
B-N-CH2-CH2-(OCH2CH2)K-O — CH2-CH2OH
R„
worin A m ein nicht störendes, nicht mit dem Phosphor
um das Molybdän konkurrierendes und die charakteristische blaue Farbe des Phosphormolybdatkiomplexes
nicht beeinträchtigendes Anion ist, m mindestens 1 beträgt, B eine lipophile Gruppe mit 6 bis 28 Kohlenstoffatomen
ist; Z Wasserstoff oder
CH2-CHj-(OCH2CH2)V-O-CH2-CH2OH
und R Wasserstoff eder eine lipophile Gruppe mit 1 bis
10 Kohlenstoffatomen bedeutet und X und Y ganze Zahlen sind, deren 5 bis 3υ ist, us-.d η O oder 1 ist.
Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Ansprüchen 3-5.
Was das Verfahren anbelangt, so wird die gestellte Aufgabe bei einem Verfahren gemäß dem Oberbegriff
des Anspruchs 6 dadurch gelöst, daß als Tensid ein langkettiges Aminokohlenwasserstoff-Äthylenoxyd-Addukt
oder dessen quaternäres Derivat, das nichtionische lipophile und hydrophile Gruppen enthält,
verwendet wird.
Aus der obigen Formel ergibt sich, daß quaternisierte
Verbindungen vorliegen, wenn η = 1 ist. In diesem Fall ist auch das nicht störende Anion A~m vorzugsweise
C17 SO^" oder CH3—O — SOr Es können auch
ähnliche Anionen verwendet werden, wie z. B. andere Halogene d. h. Br^F^oder Alkoxysulfite und Polycarboxylate
mit einem niederen Molekulargewicht. Die Anwendung von Arsenaten, Phosphaten und dergl.,
weiche mit Molybdän reagieren können, soll natürlich vermieden werden.
Was die lipophilen Gruppen B und R betrifft, so können diese nur eine Kettenlänge aufweisen, welche die
Wasserlöslichkeit des Addukts nicht beeinträchtigt. B soll deshalb keinen Kohlenstoffgehalt von über etwa
28 Kohlenstoffatomen aufweisen. Auch soll, wenn das Addukt in quaternärer Form vorliegt, η also 1 ist, der
Kohlenstoffgehalt von R 10 nicht wesentlich überschreiten. Die lipophilen Gruppen sind vorzugsweise
gesättigte Kohlenwasserstoffe, d. h. geradkettige oder verzweigte Alkyle, obwohl Aryl-, Alkylaryl- und cyc'.oaliphatische
Reste enthaltende Gruppen ebenfalls brauchbar sind. Dementsprechend können die Gruppen,
solange sie lipophil bleiben, Substituenten, wie z. B. Halogene, sowie Äther- oderThioäther-Einheiten
aufweisen.
Die Anwesenheit von Äthylenoxyd in der Verbindung ist schließlich von Bedeutung, um die hydrophile
Funktionalität zu gewährleisten. Damit jedoch der kombinierte lipophile und hydrophile Charakter des
Addukts nicht nachteilig beeinflußt wird, soll der Äthylenoxydgehalt den oben angegebenen Wert nicht überschreiten.
Vorzugsweise ist die Gruppe Z in der obigen Formel ein Polyäthylenoxyd, wobei X ungefähr denselben
Wert besitzt wie Y.
Die Menge des verwendeten Addukts ist nicht besonders kritisch, solange eine Menge angewandt wird, die
ausreicht, um die Ausfallung von Protein zu verhindern.
Zur Bestimmung der geeigneten anzuwendenden Menge können einfache Versuche durchgeführt werden.
Im allgemeinen soll das Addukt in einer Menge von mindestens etwa 25 mg anwesend sein und
gewöhnlich nicht mehr als 155 mg, bezogen auf 100 Mikroliter der zu analysierenden Probe. Das folgende
Beispiel soll die Erfindung erläutern. Wenn nicht anders angegeben, sind alle Teile und Prozentangaben
gewichtsbezogen.
Es wurden 4 Liter einer wäßrigen Lösung durch •<5 Zugabe der im folgenden genannten Bestandteile zu
entionisiertem Wasser hergestellt:
15Og Ethoquad 18/25, ein quaternäres Aminokohlenwasserstolf-Äthylenoxyd-Addukt.
In dieser >n Verbindung ist, bezogen auf die obige Formel,
R Methyl, B ist ein linearer, gesättigter, aliphatischer Rest mit etwa 18 Kohlenstoffatomen, Z
ist eine Polyäthylenoxyd-Gruppe aus etwa 15 Molen Äthylenoxyd, A ist Cl, m und /isind 1.
55 100 ml CH3COOH
40g CH3COONa-3H2O
40g CH3COONa-3H2O
Puffer, um einen pH von etwa 3 zu gewährleisten
60
65
20 g CH3NH2
(Reduktionsmittel)
OH
sor2
40 g Na2S2Os (schützt das Reduktionsmittel vor
Zersetzung und wirkt ebenfalls als Reduktionsmittel).
Durch Zugabe der folgenden Bestandteile zu
entionisiertem Wasser wurden 500 ml einer zweiten wäßrigen Lösung hergestellt:
5 g (NH4XiMo7O24-TH2O
3 g CuSO4SH2O
6 ml konz. H2SO4 (verhindert Mo — Cu Niederschlag).
Dann wird durch Vermischen von 10 Volumteilen der ersten der oben angegebenen Lösungen mit 1 Volumteil
der zweiten Lösung ein Arbeitsreagens hergestellt. Das Arbeitsreagens ist bei Zimmertemperatur mindestens
etwa 4 Stunden stabil. Dann werden 3 ml des Arbeitsreagens mit 0,100 ml (iOO Mikroliter) der zu
analysierenden Probe, z. B. Serum, Urin etc. kombiniert.
Die erhaltene Lösung wird etwa 30 Minuten stehengelassen. Nach dieser Zeit hat sich die charakteristische
Molybdänblau-Farbe im wesentlichen voll entwickelt. Die Absorption der Lösung wird dann bei etwa
660 bis 700 nm, vorzugsweise bei 690 nm abgelesen,
unter Verwendung einer Blindprobe aus 100 Mikioliter Wasser und 3 ml Arbeitsreagens.
Unter Verwendung von Proben mil bekannten Phosphorkonzentrationen
kann in üblicher Weise eine geeignete Eichkurve angelegt werden, um die Phosphormenge
in den Proben mit unbekanntem Phosphorgehalt quantitativ zu bestimmen. Dabei sollte bei der Eichung
und bei der zu untersuchenden Probe derselbe Zeitabstand von der Zugabe des Arbeitsreagens bis zur Ablesung
der Absorption angewandt werden, obwohl dies weniger kritisch ist bei Abständen von 30 Minuten odtr
mehr. Das Beer'sche Gesetz hat Gültigkeit in einem Konzentrationsbereich von etwa 0 bis 1& mg P/dl, und
im allgemeinen bis zu 15.
Da ein spezielles Arbeitsreagens beschrieben wurde, wird festgestellt, daß die Konzentrationen der hier in an
sich bekannter Weise angewandten Bestandteile variieren können, z. B. um ± 10%. In ähnlicher Weise können
verschiedene Puffer, Reduktionsmittel, Säuren, Kupfersalze, pH-Wert und dergl. angewandt werden,
solange sie die Bestimmung von Phosphor in der angegebenen Weise nicht nachteilig beeinflussen. Insbesondere
können Mischungen von 3-Buten-l,4-diol und entweder o-Phenylendiamin oder 2,4-Diaminophenoldihydro'.hlorid
in etwa gleichen Gewichtsmengen als Reduktionsmittel anstelle des speziell beschriebenen
p-Methy!-Ammonium-PhenoI-Sulfats verwendet werden.
Claims (2)
1. Reagenz zur spektrophotometrischen Bestimmung
von anorganischem Phosphor, bestehend aus einer wäßrigen Lösung eines Reduktionsmittels zur
Reduktion eines Phosphormolybdat-Kompiexes unter Erzielung seiner charakteristischen blauen
Farbe und eines wasserlöslichen Tensids in einer ausreichenden Menge, um die Ausfallung von
Protein aus einer Protein, Molybdänsäure und einen
Phosphormolybdatkomplex enthaltenden Lösung zu verhindern, dadurch gekennzeichnet,
daß das Tensid ein langkettiges Aminokohlenwasserstoff-Athylenoxyd-Addukt
oder dessen quaternäres Derivat, das nichtionische lipophile und
hydrophile Gruppen aufweist, ist
2. Reagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Addukt oder dessen quaternäres
Derivat der folgenden allgemeinen Formel entspricht:
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