DE2459432A1 - Verfahren zum anfaerben biologischer proben und farbstoffbad zur durchfuehrung des verfahrens - Google Patents
Verfahren zum anfaerben biologischer proben und farbstoffbad zur durchfuehrung des verfahrensInfo
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Description
Block Engineering, Ine*, 19 Blackstone Street, Cambridge,
Massachusetts, USA
Verfahren zum Anfärben biologischer Proben und Farbstoffbad zur Durchführung des Verfahrens
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Anfärben biologischer
Proben und ein Farbstoffbad zur Durchführung des Verfahrens, Die Erfindung ist insbesondere darauf gerichtet, die Auswahl von
brauchbaren Farbstoffen und Farbstoffmischungen zu vergrößern, die beim Anfärben biologischer Proben verwendbar sind.
Es ist bekannt, daß die Struktur biologischer Proben oft besser
sichtbar gemacht werden kann, wenn die Probe mit mehreren verschiedenen Farbstoffen statt mit einem einzigen Farbstoff angefärbt
worden ist. Die Verwendung von Wright»scher Farblösung ist ein Beispiel einer kombinierten Farblösung, die in großem Umfang
Verwendung gefunden hat. Wegen der Unverträglichkeit der verwendeten
Farbstoffe muß man jedoch oft darauf zurückgreifen, die
Probe nacheinander mit je einem von verschiedenen Farbstoffen
anzufärben. Dieses Verfahren, die Farbstoffe nacheinander zu verwenden, ist in vielen Fällen nicht brauchbar, wenn es erwünscht
ist, die Probe gleichzeitig mit mehreren Farbstoffen anzufärben, beispielsweise beim Anfärben zum Zwecke der Durchflußphotometrie.
Man hat daher nach Farbstoffmischungen gesucht, die miteinander
verträglich sind, das heißt die im wesentlichen nicht miteinander reagieren oder gegenseitig das Anfärben der Probe behindern.
Gewöhnlich reagieren zwei oder mehr Farbstoffe in einem gemein-
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samen Lösungsmittel und bilden dabei einen unlöslichen Niederschlag,
so daß die Farbstoffkonzentration unter ein Niveau reduziert wird, welches zur ausreichenden Anfärbung der Probe erforderlich
ist. Auch kann die Probe durch das Produkt der Reaktion schwer verunreinigt werden. Das Reaktionsvermögen zwischen
unverträglichen Farbstoffen kann dadurch reduziert werden, daß man die Konzentration der Farbstoffe in der Lösung begrenzt. Um
eine befriedigende Anfärbung zu erreichen, wird dabei jedoch die Imbibierungszeit der Probe in der Farbstofflösung von einem
praktischen Standpunkt aus viel zu lang. Die Begrenzung der Konzentration der Farbstoffe ist insbesondere kein praktisches Verfahren
bei Anfärbung in Suspension, wie sie in Durchflußphotometersystemen verwendet wird.
Es gibt auch eine große Zahl von Farbstoffen, die in Wasser "unlöslich11
oder schwer löslich sind. Es ist bekannt, daß selbst die "unlöslichen·1 Farbstoffe eine endliche Löslichkeit haben,
die jedoch sehr klein sein kann. Da die flüssige Phase in biologischen
Proben wässrig ist, haben diese Farbstoffe keine oder nur eine geringe Anwendung bei der Anfärbung von biologischen
Proben gefunden, hauptsächlich deshalb, weil die geringe Menge an Farbstoff, die sich in Wasser löst, schnell dadurch verbraucht
wird, daß er eine Bindung mit der Probe eingeht. Wegen der Unlöslichkeit des Farbstoffes sind mit anderen Worten die
Konzentrationen in dem Färbstoffbad weitaus zu gering, um eine
ordentliche Anfärbung zu erreichen.
Daher liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Anfärben von einer biologischen Probe anzugeben, bei dem
gleichzeitig mit einer Vielzahl von Farbstoffen, die unter gewöhnlichen Umständen unverträglich oder inkompatibel sind, angefärbt
wird. Ferner soll eine Färbstoff mischung zur Verwendung
bei diesem Verfahren angegeben werden. Dabei sollen insbesondere die oben erwähnten Schwierigkeiten beim Anfärben biologischer
Proben behoben werden, die bei der Verwendung von Farbstoffen auftreten, die unter gewöhnlichen Umständen inkompatibel miteinander
oder wasserunlöslich sind.
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Erfindungsgemäß werden im wesentlichen Flüssig-Flüssig-Suspensionen
(Emulsionen) eines im wesentlichen nicht mischbaren Lösungsmittels in Wasser hergestellt, wobei wenigstens in dem Lösungsmittel ein Farbstoff gelöst ist. Wie noch gezeigt wird,
kann eine biologische Probe durch die Emulsion angefärbt werden, weil die Konzentrationen des Farbstoffes in dem Lösungsmittel
auf einem genügend hohen Niveau, gehalten werden können, um konstant
Farbstoff an das Wasser nachzuliefern, so daß eine ausreichende Anfärbung erreicht wird. Wenn sowohl in dem Lösungsmittel,
als auch in dem die Suspension bildenden Wasser Farbstoffe gelöst sind, können die Farbstoffe gleichzeitig aufgebracht
werden, und das Verfahren gestattet die Verwendung von Farbstoffen, die miteinander inkompatibel wären, wenn sie in
einem gemeinsamen Lösungsmittel gelöst wären. Daraus wird deutlich, daß durch die Erfindung die Auswahl an brauchbaren Farbstoffen
und Farbstoffmischungen für biologisches, und insbesondere histochemisches Anfärben erheblich vergrößert wird.
Eine spezielle Ausführung der Erfindung kann wie folgt zusammengefaßt
werden. Es wird ein Verfahren zum Anfärben biologischer Proben mit Farbstoffen, die verhältnismäßig unlöslich in Wasser
sind, oder mit Kombinationen von Farbstoffen angegeben, die inkompatibel sind. Bei dem Verfahren wird eine Emulsion aus einem
unvermis chbaren Lösungsmittel als disperse Phase in Wasser hergestellt.
Das Lösungsmittel kann eine sehr hohe Konzentration eines Farbstoffes enthalten, der in Wasser verhältnismäßig unlöslich
ist, so daß dadurch ein Vorrat gebildet wird, der durch Diffusion von Farbstoff aus der eine hohe Konzentration aufweisenden,
dispersen Phase durch das Wasser zu den Anfärbestellen gelangt. Nach einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung bilden
eine oder mehrere disperse Phasen von Farbstoffen in unvermischbaren Lösungsmitteln, die in Wasser suspendiert sind, ein Färbst
off sys tem, um eine Vielzahl von Farbstoffen zu verwenden, deren
Mischung man normalerweise vermeiden würde, weil sie inkompatibel sind. Ein weiterer Farbstoff kann in der wässrigen Phase
der Emulsion gelöst sein. Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung in Zu-
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sammenhang mit den Patentansprüchen.
In den meisten Fällen biologischer Anfärbung ist es erwünscht, bis zur Sättigung anzufärben, das heißt die Probe mit einer maximalen
Menge damit abbindendem Farbstoff zu versehen. Dieses Erfordernis ergibt sich aus der Tatsache, daß die Bestandteile
biologischer Proben, die mikroskopisch untersucht werden sollen, gewöhnlich in äußerst geringen Mengen vorhanden sind. Die Bestandteile,
die man durch die Farbe des Farbstoffes unterscheiden will, binden daher im besten Falle nur einen sehr kleinen
Prozentsatz des Farbstoffes. Um ein Optimum an Farbunterscheidbarkeit
zu erreichen, ist daher die Anwendung einer maximalen Menge an Farbstoff, die abgebunden werden kann, erwünscht. Um
dies zu erreichen, sollte die Konzentration der Färbstoffmolekü-Ie
in der Nähe jedes zu färbenden Elementes hoch genug sein, um die Sättigung aller Anfärbesteilen zu erreichen. Der Gradient
der Farbstoffkonzentration in der Lösung sollte hoch genug sein, um den Transport des Farbstoffes an die Anfärbesteilen zu gestatten.
Selbst nach einer Farbstoff-Verarmung nach einer teilweise abgeschlossenen Anfärbung sollte die Farbstoffkonzentration
immer noch hoch genug sein, um eine gesättigte Anfärbung zu erreichen.
Die Konzentration des Farbstoffes in jeder der unvermischbaren,
flüssigen Phasen des Farbstoffbades sollte daher hoch genug sein, um die genannten Erfordernisse zu erfüllen. Dies kann einfach
dadurch erreicht werden, daß eine erheblich größere Menge an Farbstoff in jeder der unvermischbaren Phasen vorgesehen wird
als es erforderlich ist, um eine vollständig gesättigte Anfärbung der erwünschten Probe durch diesen Farbstoff allein von
einer einfachen Lösung dieses Farbstoffes zu erreichen.
Die Erfindung kann am einfachsten in Zusammenhang mit einer Emulsion aus zwei Flüssigkeiten beschrieben werden, von denen
die erste Flüssigkeit als Trägerlösungsmittel (unter der Annahme, daß es sich um die disperse Phase in der Emulsion handelt)
und die zweite Flüssigkeit als suspendierendes Medium (unter
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der Annahme, daß es das Dispersionsmedium in der Emulsion ist) betrachtet werden. Vorzugsweise sind sowohl die Lösungsmittel,
als auch das Medium im wesentlichen unvermischbar miteinander
und, wie bereits erwähnt wurde, ist für biologische Proben das suspendierende Lösungsmittel oder Medium Wasser, Um Hintergrundbildung
zu verhindern, ist bevorzugt, daß das Lösungsmittel und das suspendierende Medium optisch bezüglich ihrer Brechungsindizes
aufeinander abgestimmt sind. Das Lösungsmittel sollte eine
große Aufnahmefähigkeit für den Farbstoff haben, das heißt der spezielle Farbstoff, der in dem Lösungsmittel enthalten ist,
sollte eine hohe Löslichkeit in diesem Lösungsmittel haben.
Es ist zu beachten, daß jeder kleine Tropfen der dispersen Phase
eines unvermischbaren Lösungsmittels in einer Wassersuspension
eine Lösungsmittel/Wasser-Grenzflache bildet. Nach dem Berthelot
»sehen Verteilungsgesetz verteilt sich die gelöste Substanz durch diese Grenzfläche proportional zu ihrer Löslichkeit in den
beiden Flüssigkeiten, Wenn die Tröpfchen eine hohe Konzentration an Farbstoff enthalten, der in Wasser schwer löslich ist, ergibt
sich daher eine konstante Übertragung von Farbstoff in das Wasser, wie der Farbstoff von dem Wasser durch Abbinden einer Probe
verbraucht wird. Folglich dient jedes Tröpfchen als Farbstoffvorrat hoher Konzentration,.um den Farbstoff kontinuierlich zu
ersetzen, der in geringer Konzentration im Wasser vorhanden ist. Da in einer Emulsion eine große Zahl von Farbstofftröpfchen vorhanden
sind, kann man erwarten, daß die Anfärbestellen an der Probe in nächster Nähe von einer ausreichenden Zahl von Färbst
off tropf chen umgeben sind, so daß der Diffusionsweg für den
Farbstoff zwischen dem angrenzenden Tröpfchen und den Anfärbestellen auf ein Minimum herabgesetzt wird.
Die Emulsion kann durch mechanisches Umrühren, beispielsweise
durch einen Ultraschallmischer, hergestellt werden, der das Trägerlösungsmittel in winzige Tröpfchen aufbricht, die in dem
ganzen suspendierenden Medium dispergiert sind, -Allein auf mechanischem Wege hergestellte Emulsionen ,neigen jedoch dazu, unstabil
zu sein. Daher sollten diese Emulsionen unmittelbar oder
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kurz nach ihrer Herstellung verwendet werden. Die Emulsionen
können in an sich bekannter Weise unter Verwendung eines Emulgierungsmittels
hergestellt werden, das so ausgewählt wird, daß es weder mit den gelösten Farbstoffen, noch mit der biologischen
Probe eine Reaktion eingeht. Beispielsweise können geringe Mengen bekannter nichtionischer Detergentien als Emulgierungsmittel
verwendet werden.
Alternativ kann jeder Farbstoff in miteinander unvermischbaren
Lösungsmitteln gelöst werden, und alle Lösungsmittel können dann in einer dritten, flüssigen Phase, wie beispielsweise Wasser,
suspendiert werden, mit der keines der Lösungsmittel im wesentlichen
unvermischbar ist. Alternativ können zwei oder mehr inkompatible Farbstoffe respektive in entsprechenden, getrennten
Teilen eines ersten Lösungsmittels gelöst werden, die dann mit getrennten Teilen eines zweiten Mediums emulgiert werden, welches
mit dem ersten Lösungsmittel unvermischbar ist. Sodann werden die beiden Emulsionen miteinander vermischt.
Die Farbstoffe, die bei der Erfindung verwendet werden können, schließen eine außerordentlich große Vielzahl von Farbstoffen
ein, wobei die einzigen grundlegenden Kriterien für die Auswahl der Färbstoffpaare oder Färbstoffkombinationen darin bestehen,
daß jeder der ausgewählten Farbstoffe einer Kombination in einem flüssigen Träger lösbar ist, um ein Farbstoffbad mit einer genügend
hohen Konzentration zu schaffen, damit eine gesättigte Anfärbung der gewünschten Probe erreicht wird. Ferner ist erforderlich,
daß die verschiedenen Trägerstoffe, in denen die jeweiligen Farbstoffe gelöst sind, im wesentlichen unvermischbar miteinander
oder mit einem Dispersionsmedium sind, in dem die entsprechenden Färbstoffbäder als disperse Phase suspendiert sind.
Die Erfindung wird noch anhand der folgenden Beispiele erläutert:
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— Ί? -
BEISTIEL
Zwei Farbstofflösungen werden hergestellt, von denen eine
8-p-Toluidino-i-naphthalin-sulfonsäure (TNS) in Benzylalkohol
mit einer etwa 10 molaren Konzentration und die andere
2,7-Diamino-1O-äthy1-9-phenyl-phenanthridiniumbromid, welches
auch als Äthidiumbromid (EB) "bekannt ist und das in Wasser mit
einer etwa 10 molaren Konzentration gelöst ist, ist. Die Struktur von EB wird wie folgt angenommen:
1IIH.
Br'
Es ist bekannt, daß sowohl EB, als auch TNS, wenn diese in einer
—5
gemeinsamen, wässrigen Lösung mit einer etwa 1.0 molaren Konzentration
gelöst sind, miteinander reagieren und einen unlöslichen Niederschlag an Äthidium-8-p-toluidino-i-naphthalinsulfonat-Salz
bilden, · .
Eine Emulsion wird dadurch hergestellt, daß man 10 ml einer TNS-Benzylalkohollösung in etwa 20 ml einer wässrigen Lösung
von EB durch mechanisches Umrühren herstellt. Die Emulsion wird an eine biologische Probe (Blutausstrich) während einer Dauer
von etwa 3 Minuten bei Zimmertemperatur appliziert. EB färbt
normalerweise die Nukleinsäuren von Leukozyten an, so daß sich eine starke Rotfluoreszenz bei etwa 580 - 650 mu ergibt, wenn
man mit 480 - 550 mp. bestrahlt. TNS färbt normalerweise die eosinophilen Körner und liefert eine grünliche Fluoreszenz bei
440 - 550 mu, wenn man mit Licht bei etwa 320 - 410 mu anregt.
Die Leukozyten und Eosinophilen des BlutausStriches sind, wie
sich gezeigt hat, durch die entsprechenden Farbstoffe angefärbt, und es war im wesentlichen kein Niederschlag aufgrund einer
Reaktion zwischen den Farbstoffen zu beobachten.
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Methylgrün wird als inkompatibel mit dem Tetranatriumsalz der 4,4'-Bis-4-(3-sulfoanilino)-6-/5is-(2-hydroxy-athyl )-amino7--1,3,5,triazin-2yl-amino-stirben-2,2'-disulfonsäure
(im folgenden als LN bezeichnet) betrachtet, wenn beide gemeinsam in Wasser mit einer 10 molaren Konzentration oder höher gelöst sind,
worauf sie einen Niederschlag bilden. LN soll folgende Struktur haben:
N=C
N-C
(GH2CH2OH)
NaSO.
In dem vorliegenden Beispiel wird Methylgrün mit einer bis zu 1 χ 10 molaren Konzentration in Methylbenzoat gelöst und als
disperse Phase in einer Emulsion verwendet, in der das Suspensionsmedium eine wässrige Lösung von 1 χ 10 molarer LN ist,
die auf einen pH von 8,5 mit O,1molarem 2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol-Hydrochlorid
gepuffert ist. Nach einer Anfärbezeit von 10 Minuten in der Emulsion wird der Blutausstrich auf
einem Schauglas ausgewaschen und mit Licht im Bereich von 320 — 390 mp. bestrahlt. Das Protein der Leukozyten und der neutrophilen
Kerne zeigt dann eine starke Fluoreszenz im blauen Bereich aufgrund der LN-Anfärbung, während basophile Kerne eine starke
grüne Farbe bei Überprüfung durch Augenschein zeigen, die auf der Anfärbung durch Methylgrün beruht. Es wurde kein sichtbarer
Niederschlag festgestellt.
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Getrennte Lösungen wurden durch Lösen von EB in Methylbenzoat und TNS in Benzylalkoliol hergestellt. Jede Lösung wird als disperse
Phase in Wasser eingebracht, und die zwei Emulsionen werden dann vorsichtig miteinander gemischt. Man wird dann feststellen,
daß diese kombinierte Emulsion eine Blutprobe mit im wesentlichen demselben Effekt anfärbt wie die Emulsion von Beispiel
I.
509827/0833
Claims (15)
- Patent ans P 1 rücheVerfahren zum Anfärben "biologischer Proben, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens ein Farbstoff in einem ersten Lö-■ sungsmittel gelöst wird, welches in Wasser im wesentlichen unvermischbar. ist, daß mit einer wässrigen Lösung eine erste Emulsion hergestellt wird, in der der in dem Lösungsmittel gelöste Farbstoff die disperse Phase bildet, und daß die Emulsion an die Probe appliziert wird.
- 2. Verfahren nach Anspruch Ί, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel und der Farbstoff so ausgewählt werden, daß der Farbstoff in dem Lösungsmittel in einer größeren Konzentration vorhanden ist als durch Lösung des Farbstoffes in Wasser erreichbar ist.
- 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein zweiter Farbstoff in der wässrigen Phase der Emulsion gelöst wird, bevor die Emulsion an die Probe appliziert wird.
- 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein zweiter Farbstoff in einem zweiten Lösungsmittel gelöst wird, der im wesentlichen mit Wasser unvermischbar ist, daß mit einer wässrigen Lösung eine zweite Emulsion hergestellt wird, in der der zweite in dem zweiten Lösungsmittel gelöste Farbstoff die disperse Phase bildet, und daß die erste Emulsion und die zweite Emulsion miteinander vermischt werden, bevor sie an die Probe appliziert werden.
- 5. Farbstoffbad für die Anfärbung biologischer Proben, gekennzeichnet durch eine Emulsion mit einer dispersen Phase in einem suspendierenden Medium, wobei die disperse Phase wenigstens einen Farbstoff aufweist, der in einem Lösungsmittel gelöst ist, das mit dem Medium im wesentlichen unvermischbar ist.
- 6. Farbstoffbad nach Anspruch 5, gekennzeichnet durch einen509827/083 3zweiten Farbstoff, der in dem suspendierenden Medium gelöst ist.
- 7. Färbst off bad nach Anspruch 6, dadiirch gekennzeichnet, daß der erste Farbstoff und der zweite Farbstoff unterschiedliche Löslichkeiten mit Bezug auf wenigstens eines der Lösungsmittel und das suspendierende Medium haben,
- 8. Farbstoffbad nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Farbstoff und der zweite Farbstoff miteinander inkompatibel sind, wenn sie in einem gemeinsamen Lösungsmittel gelöst sind.
- 9. Farbstoffbad nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die disperse Phase Tröpfchen eines zweiten Farbstoffes aufweist, der in einem zweiten Lösungsmittel gelöst ist, welches mit dem suspendierenden Medium im wesentlichen unvermischbar ist.
- 10. Farbstoffbad nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die optischen Brechungsindizes des Mediums und des Lösungsmittels im wesentlichen aufeinander abgestimmt sind.
- 11. Farbstoffbad nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das suspendierende Medium ein wässriges Medium ist.
- 12. Färbstoffbad nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Farbstoff im wesentlichen in dem Medium unlöslich ist.
- 13. Farbstoffbad nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Farbstoff in dem Medium schwer löslich ist.
- 14. Färbstoffbad nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel Methylbenzoat ist,
- 15. Farbstoffbad nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel Benzylalkohol ist.t 509 8 2 7/0833
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