DE1648852B2 - Verfahren zur anfaerbung einer biologischen probe zur mikroskopischen untersuchung - Google Patents
Verfahren zur anfaerbung einer biologischen probe zur mikroskopischen untersuchungInfo
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- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Anfärbung einer biologischen Probe zur mikroskopischen Untersuchung.
Im Labor und für die klinische Diagnose verschiedener Krankheiten wird häufig eine mikroskopische Gewebeuntersuchung
durchgeführt. Im Zusammenhang mit solchen Untersuchungen werden Färbemittel für biologische Materialien verwendet, um die mikroskopischen
Objekte deutlicher sichtbar zu machen. Zu diesem Zweck sind verschiedene Farbstoffe als Färbemittel
für biologische Materialien geeignet. Carmin, Indigo und die Anilinfarbstoffe sind Beispiele für Farbstoffe,
die als Färbemittel für biologische Materialien brauchbar sind.
In der Praxis der Hämatologie ist eines der meist angewendeten Färbemittel Wrights Färbemittel.
Wrights Färbemittel ist eines einer Reihe von Färbemitteln, die von der Biological Staining Commission
eingetragen worden sind; seine Zusammensetzung und das Verfahren zu seiner Herstellung sind in National
Formulary XIl, S. 555 (1965) erschienen. Die Originalarbeit von Wright über ein »Schnellverfahren zur differenzierten
Anfärbung von Blutfilmen und Malariaparasiten« ist in J. Med. Res. Vol. 7,138-44 (1902) veröffentlicht.
Die hauptsächlichen Farbstoffkomponenten von Wrights Färbemittel sind Methylenblau und Eosin Y.
Methylenblau ist Tetramethylthionin: C16H18N3SCI;
Eosin Y ist Natriumtetrabromfluorescein:
C2oH60sBrtNa2. In der Praxis enthält das Methylenblau
außerdem normalerweise verschiedene Mengen niederer Homologe, hauptsächlich Azur A und Azur B, aber
auch Azur C, Methylenviolett und Teluidinblau. Die Bildung dieser Oxydationsprodukte von Methylenblau
tritt auf, wenn man eine Methylenblaulösung eine Zeit lang stehen läßt, und wird durch Kochen der Methylenblaulösung
mit Alkali beschleunigt. Eine Methylenblaulösung, welche wesentliche Mengen dieser Oxydationsprodukte enthält, wird als »polychromes Methylenblau«
bezeichnet.
Bei der Herstellung von Wrights Färbemittel wird eine Natriumbicarbonat enthaltende Methylenblaulösung
unter Bildung von polychromen Methylenblau erhitzt, dann wird Eosin Y hinzugefügt. Eosin Y setzt sich
chemisch mit den polychromen Methylenblaufarbstoffbestandteilen um unter Bildung eines wasserunlöslichen
Niederschlages. Dieser Niederschlag ist als Wrights Färbemittel bekannt. In der Praxis wird der Farbstoff
vor der Verwendung in eine alkoholische, gewöhnliche methanolische. Lösung übergeführt.
Die übliche Anwendung des herkömmlichen Wrightschen Färbemittels unterliegt verschiedenen Nachtei
len, unter anderem den folgenden:
1. Die handelsüblichen Abfüllungen von Wrights Färbemittel, sowohl als Flüssigkeit als auch als Pulver,
variieren hinsichtlich ihrer Konsistenz von Lieferung zu Lieferung. Die bei der Verwendung erhaltenen
Ergebnisse sind demzufolge nicht reproduzierbar, und jede Farbstofflieferung erfordert zunächst
umfangreiche Versuche zur Standardeinstellung.
2. Das Methanol in der Wrightschen Färbemittellösung verdampft mit der Zeit und das Färbemittel
konzentriert sich. Dementsprechend stimmen die Ergebnisse nicht überein und verändern sich von
Versuch zu Versuch.
3. Es ist eine unerwünschte lange Zeitdauer, etwa 8 bis 15 Minuten, für die Färbung mit Wrights Färbemittel
notwendig.
4. Bei dem üblichen Färbeverfahren mit Wrights Färbemittel wird eine getrennte Lösung eines Phosphatpuffers
vom Verbraucher hergestellt oder zur Verwendung bei dem Färbeverfahren fertig gekauft.
Der Phosphatpuffer muß sorgfältig zubereitet werden, so daß er einen pH-Wert von genau
6,4 aufweist, um Blut-Ausstriche angemessen zu färben. Bei höheren pH-Werten wird der Fleck zu
blau, während der Fleck bei niedrigeren pH-Werten zu rot zur Erzielung geeigneter Anfärbungsergebnisse
wird.
5. Wrights Färbemittel in Lösung verschlechtert sich am Licht.
6. Eine große Menge an Färbemitteln wird bei der üblichen Anwendungsform von Wrights Färbemittel
verschwendet, da es notwendig ist, die Probe auf dem Objektträger zunächst mit der Färbelösung
(normalerweise erfordert dies etwa 20 Tropfen) und dann mit einer gleichen Menge Pufferlösung
zu überfluten.
7. Die Verwendung von Wrights Färbemittel ist gewöhnlich ein unsauberer Vorgang und häufig werden
dabei die Laborausgüsse und andere Einrichtungen verfärbt.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein neuartiges Färbeverfahren für biologische Materialien zu entwickeln,
das auf dem Grundprinzip des Wrightschen Färbeverfahrens beruht, welches im Vergleich zu dem üblichen
Wrightschen Färbeverfahren jedoch bequemer in der praktischen Durchführung ist und bei dem die obengenannten
Schwierigkeiten nicht auftreten.
Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß die biologische Probe nacheinander in eine polychrome Methylenblaulösung
eingetaucht, gespült, in eine Eosinlösung eingetaucht und gespült wird, mit der Maßgabe, daß die
verwendete polychrome Methylenblaulösung bei Verdünnung mit destilliertem Wasser bis zu einer Konzentration
von einem Teil polychromer Methylenblaulösung in 2000 Teilen Gesamtlösung eine solche spektrophotometrisch
bestimmte optische Dichte besitzt, daß das Verhältnis der Dichte bei einer Wellenlänge von
660 ΐημ zur Dichte bei einer Wellenlänge von 620 πιμ
zwischen etwa 0,8 und etwa 1,5 liegt, und daß die Eosin lösung bei Verdünnung mit Wasser bis zu einer Konzentration
von einem Teil Eosin in 100 Teilen Lösung eine spektropho tome irisch bestimmte optische Dichte
bei einer Wellenlänge von 520 ιημ von etwa 0,3 bis
etwa 0.7 besitzt. -
Vorteilhafte Weiterbildungen des Verfahrens sind in den Ansprüchen 2 bis 4 beschrieben. Bei der spektrophotometrischen
Bestimmung der Endpunkte können die Werte der optischen Dichte (O.D.) der entsprechenden
Farbstofflösung bei verschiedenen Wellenlängen mit einem geeigneten Spektrophotometer, z. B. einem
selbstregistrierenden Beckmann-DB-(Doppelstrahl)-Spe'urophotometer
mit einer Licht-Durchgangszelle von einem Zentimeter, gemessen werden. Weitere geeignete
Spektrophotometer sind das Coleman-Autoset-Spektrophotometer und das Beckmann-B-Spektrophotometer.
Zur bequemeren Messung der optischen Dichten der entsprechenden Farbstofflösungen können Proben der
Endlösungen zunächst mit destilliertem Wasser bis zu j.s
geeigneten Konzentrationen verdünnt werden. Im Falle der polychromen Methylenblaulösung wird der Endpunkt
an Hand einer Probe der Endlösung gemessen, welche mit destilliertem Wasser bis zu einer Konzentration
von einem Teil polychromer Methylenblauendlösung in 2000 Teilen Gesamtlösung verdünnt wird. Im
Falle der Eosinlösung wird der Endpunkt an Hand einer Probe der Endlösung gemessen, welche mit destilliertem
Wasser bis zu einer Konzentration von einem Teil Eosinendlösung in 100 Teilen Gesamtlösung
verdünnt wird.
Es wird darauf hingewiesen, daß bei Verwendung anderer spektrophotometrischer Vorrichtungen die erforderlichen
optischen Dichte-Werte diejenigen sind, welche den oben angegebenen Ablesungswerten auf dem
Beckmann-DB-Spektrophotometer äquivalent sind.
Die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete polychrome Methylenblaulösung kann hergestellt werden
durch Oxydation einer wäßrigen Lösung von Methylenblau-Farbstoff, bis der vorstehend angegebene
spektrophotometrisch bestimmte Endpunkt für die polychrome Methylenblaulösung erhalten wird. Das Erwärmen
einer leicht alkalischen, wäßrigen Lösung von etwa 1% Methylenblau mehrere Stunden lang auf etwa
92 bis 100°C ergibt im allgemeinen den erwünschten f>o
Endpunkt.
Auch andere Verfahren zur Herstellung der polychromen Methylenblaulösung können verwendet werden.
Zum Beispiel kann eine wäßrige Lösung aus einem geeigneten Gemisch der Bestandteile des polychromen (\s
Methylenblaus (Azur A, Azur B, Azur C, Methylenviolett und Toluidinblau) mit einem Reduktionsmittel behanHpit
werden, um den vorstehend angegebenen spektrophotometrisch bestimmten Endpunkt für die polychrome
Methylenblaulösung zu erreichen.
Die Eosinlösung kann hergestellt werden, indem man eine geeignete Menge Eosin-Farbstoff in Wasser löst,
und zwar eine solche Menge, daß der vorstehend angegebene spektrophotometrisch bestimmte Endpunkt für
die Eosinlösung erzieh wird. Es wird bevorzugt, daß das Eosin eine Kombination von Eosin Y (vorstehend
beschrieben) und Eosin B (4', 5'-Dibrom-2', 7'-dinitrofluorescein)
enthält, vorzugsweise in etwa gleichen Anteilen. Etwa 0,05% Eosin ergeben im allgemeinen den
erwünschten Endpunkt Weitere Eosinarten, die bei der praktischen Ausführung der Erfindung anwendbar sind,
sind z. B. Eosin G, Äthyleosin und dergleichen Eosin-Farbstoffe, wie die von Conn et aL in Biological
Stains, herausgegeben von Williams and Wilkins, Baltimore, Md. (6. Ausgabe, 1961) erwähnten.
Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung. Alle Prozentangaben sind Gewichtsprozente.
Eine Lösung von polychromen Methylenblau wird wie folgt hergestellt:
1. 1501 destilliertes Wasser werden abgemessen und in ein Faß von 2081 (55 gallon) Inhalt eingefüllt,
welches in einen Dampfmantel gebracht wird.
2. 375 g Natriumbicarbonat werden zur Erzielung einer 0,25%igen Lösung hinzugegeben.
3. Das Natriumbicarbonat wird durch Rühren des Gemisches
mit einem elektrischen Rührer gelöst.
4. 1,5 kg Methylenblau werden zur Erzielung einer l°/oigen Lösung hinzugegeben. Das Rühren wird
fortgesetzt.
5. Dampf wird eingelassen, um die Farbstofflösung auf 95°C zu bringen. Die Farbstofflösung wird 4
Stunden lang auf 95° C erhitzt.
6. Nach Beendigung der 4 Stunden wird die Dampfzufuhr beendet und kaltes Wasser in den Dampfmantel
eingelassen, Natriumbicarbonat um die Lösung auf 28° C zu kühlen. Wenn die Temperatur
280C erreicht hat, wird der elektrische Rührer abgestellt.
7. Die Farbstofflösung wird unter Verwendung von 2 Selas-Kerzen X.F. (extra fein) in einem Tank aus
rostfreiem Stahl filtriert.
8. Die Farbstofflösung wird bei Raumtemperatur 2 Wochen lang oder länger gealtert.
9. Die Farbstofflösung wird unter Verwendung von 1 η Schwefelsäure auf pH 6,85 eingestellt.
10. Unter Verwendung des nach dem Filtrieren erhaltenen Volumens als Berechnungsgrundlage wird
die l%ige Methylenblaulösung mit 1 m Kaliumphosphat-Puffer (pH = 6,9) auf 0,8% verdünnt.
11. Es wird 30 Minuten lang gerührt und der pH-Wert
nachgeprüft (der pH sollte 6,9 ± 0,1 betragen.
12. Das Farbstofflösungsvolumen wird in einem sauberen
Tank aus rostfreiem Stahl filtriert unter Verwendung einer Selas-Kerze 0,2.
13. Eine Probe der obigen Farbstoffendlösung wird mit destilliertem Wasser bis zu einer Konzentration
von einem Teil Farbstofflösung in 2000 Teilen Gesamllösung zum Zwecke der Untersuchung
verdünnt. Die optische Dichte (O.D) der verdünnten Farbstofflösung wird bei Wellenlängen von
660, 650 und 620 ιτιμ mit einem selbstregistrierenden
Beckmann-DB-Spektrophotometer mit einer
Lichtdurchgangs-Zelle von einem Zentimeter gemessen.
Die O.D bei 650 πιμ beträgt 0,4 und das Verhältnis der O.D. bei 660 ΐημ zur O.D. bei
620 πιμ beträgt 1,0.
14. Die endgültigen Behälter werden mit dem Färbstofflösungsvolumen
gefüllt und bei Raumtemperatur aufbewahrt
Sodann wird eine Lösung von gepuffertem Eosin wie folgt hergestellt:
1. 1441 destilliertes Wasser werden abgemessen u^d
in einen großen Tank aus rostfreiem Stahl eingefüllt
2. 1135,7 g (8MoI) Na2HPO4 und 883,3 g (7.35 Mol)
Nal-hPO4 werden abgewogen.
3. Die obigen Salze werden in den 144 I destilliertem Wasser gelöst und mit einem elektrischen Rührer
gemischt.
4. Eine Probe der gründlich gemischten Pufferflüssigkeit
wird herausgenommen und der pH-Wert kontrolliert (er sollte 6,9 ± 0,5 betragen).
5. 36 g Eosin Y und 36 g Eosin B werden zur Erzielung
einer 0,05%igen Lösung von Eosin hinzugesetzt.
6. Es wird 10 Minuten lang gerührt, um die vollständige Auflösung der beiden Farbstoffe in der Pufferlösung
sicherzustellen.
7. Das Farbstofflösungsvolumen wird bei Raumtemperatur nicht unter 2 Wochen gelagert.
8. Am Tage vor der Abfüllung des Farbstofflösungsvolumens in endgültige Behälter kann erwünschtenfalls
0,1% Natriumazid in der Farbstofflösung gelöst werden, um ein Bakterienwachstum zu verhindern.
9. Das Volumen der Farbstofflösung wird durch ein nichtsteriles Millipore-Filter unter Verwendung
eines Glas-Vorfüters mit Membranen von 1,2, 0,45 und 0,22 μ filtriert.
10. Eine Probe der obigen Farbstoffendlösung wird
mit destilliertem Wasser bis zu einer Konzentra tion von einem Teil Farbstofflösung ;n 100 Teilen
Gesamtlösung zum Zwecke der Untersuchung verdünnt. Die optische Dichte (O.D.) wird bei einer
Wellenlänge von 520 πιμ mit einem selbstregistrierenden
Beckmann-DB-Spektrophotomeier mit einer Lichtdurchgangs-Zelle von einem Zentimeter
gemessen. Die optische Dichte bei dieser Wellenlänge beträgt 0,5.
11. Die endgültigen Behälter weden mit dem Volumen der Farbstofflösung gefüllt und bei Raumtemperatur
aufbewahrt.
Die obigen unverdünnten Farbstoffendlösungen von polychromem Methylenblau und Eosin können in verschiedenen
Arten von endgültigen Behältern gelagert und in den Handel gebracht werden, z. B. in 150- oder
500-ml-Reagensflaschen. Die Lösungen sind 3 Jahre lang stabil, wenn sie bei Raumtemperatur gelagert werden.
Bei der Herstellung der polychromen Methylenblau
lösung gemäß dem obigen Beispiel erfordert eine Oxydation bei Temperaturen unterhalb etwa 92°C im allgemeinen
längere Erhitzungszeilen als die gemäß dem Beispiel angewendeten 4 Stunden. Es wird auch darauf
hingewiesen, daß andere Oxydationsverfahren an Stelle des Erhitzens mittels eines Dampfmantels angewendet
werden können, z. B. ein Erhitzen in einem Autoklav. Verwendet man die Arbeitsbedingungen des obigen
Beispiels, so ergibt die Oxydation von im allgemeinen eiwa 1 bis 2 kg Methylenblau in 1501 Lösung den erwünschten
Bereich der optischen Dichte. Höhere oder niedrigere Konzentrationen an Methylenblau erfordern
Veränderungen bei der Verdünnung der polychromen Methylenblauendlösung in den entsprechenden Verhältnissen.
Ein frisch hergestellter Film von Blutzellen auf einem Objektträger wird durch Eintauchen in absolutes Methanol
10 Sekunden lang fixiert. Der Objektträger wird dann 10 bis 20 Sekunden lang in die gemäß Beispiel 1
hergestellte polychrome Methylenblaulösung eingetaucht. Der Objektträger wird durch wiederholtes Eintauchen
in destilliertes Wasser oder durch Spülen in einem Strom von destilliertem Wasser gründlich von
Farbstoff freigespült. Der Objektträger wird sodann 10 bis 20 Sekunden lang in die gemäß Beispiel 1 hergestellte
Eosinlösung eingetaucht. Der Objektträger wird wiederum durch wiederholtes Tauchen in destilliertes
Wasser oder durch Spülen in einem Strom von destilliertem Wasser gründlich gespült. Der Objektträger
wird an der Luft getrocknet und ist für die mikroskopische Untersuchung bereit.
Das oben angegebene Verfahren erwies sich als ein schnelles und bequemes Färbeverfahren, mit welchem
ausgezeichnete Ergebnisse für Blutfilme, Kochenmark- und L.E.-(Lupus-erythematodes)-Zellpräparate erhalten
werden. Das Verfahren zeigte beschleunigte Zeildurchdringungseigenschaften und ergab hämatologische
Merkmaie, die der üblichen Wrightschen Anfärbung vergleichbar sind.
Es wird darauf hingewiesen, daß die Eintauchzeit in die Farbstofflösung variiert werden kann, abhängig von
der erwünschten Dichte. Zum Beispiel kann es auf Grund der dichteren Chromatinstruktur einiger pathologischer
Zellen und der sich daraus ergebenden Aufnahme größerer Farbstoffmengen erwünscht sein, die
oben angegebene Färbezeit mit der polychromen Metyhlenblaulösung herabzusetzen. Eine Verminderung
der oben angegebenen Färbezeit mit der Eosinlösung führt im allgemeinen zu einer Steigerung der Intensität
der Platelet- und Leucocyten-Färbung.
Das beschriebene Verfahren kann für jedes zur Anfärbung geeignete biologische Material verwendet
werden, und kann außerdem auch mit automatischen oder halbautomatischen Färbevorrichtungen durchgeführt
werden.
Claims (4)
1. Verfahren zur Anfärbung einer biologischen Probe zur mikroskopischen Untersuchung, dadurch
gekennzeichnet, daß die biologische Probe nacheinander in eine polychrome Methylenblaulösung
eingetaucht, gespült, in eine Eosinlösung eingetaucht und gespült wird, mit der Maßgabe, daß
die verwendete polychrome Methylenblaulösung bei Verdünnung mit destilliertem Wasser bis zu
einer Konzentration von einem Teil polychromer Methylenblaulösung in 2000 Teilen Gesamtlösung
eine solche spektrophotometrisch bestimmte optische Dichtung besitzt, daß das Verhältnis der Dichte
bei einer Wellenlänge von 660 ιημ zur Dichte bei einer Wellenlänge von 620 ΐημ zwischen etwa 0,8
und etwa J,5 liegt, und daß die Eosinlösung bei Verdünnung
mit Wasser bis zu einer Konzentration von einem Teil Eosin in 100 Teilen Lösung, eine
spektrophotometrisch bestimmte optische Dichte bei einer Wellenlänge von 520 ιτιμ von etwa 0,3 bis
etwa 0,7 besitzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Eosin ein Gemisch von Eosin Y ?>
und Eosin B in etwa gleichen Anteilen ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis der optischen
Dichte der verdünnten polychromen Methylenblaulösung bei 660 ηιμ zu ihrer optischen Dichte bei
620 ιημ etwa 1,0 beträgt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die optische Dichte
der verdünnten Eosinlösung bei einer Wellenlänge von 520 πιμ etwa 0,45 bis etwa 0,56 beträgt.
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|---|---|---|---|
| C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
| E77 | Valid patent as to the heymanns-index 1977 | ||
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