DE2341061C3

DE2341061C3 - Verfahren zur laufenden Klassierung von krankheitsverdachtigen Zellproben für Diagnostikprüfungen

Info

Publication number: DE2341061C3
Application number: DE2341061A
Authority: DE
Inventors: Martin J. Belle Mead Fletcher; John H. Wayne Pa. Nodine; Herbert Waite; John H. Waite
Original assignee: Bio-Digital Sciences Inc Princeton Nj (vsta)
Current assignee: Bio-Digital Sciences Inc Princeton Nj (vsta)
Priority date: 1972-08-16
Filing date: 1973-08-14
Publication date: 1980-02-14
Also published as: CA1011468A; BR7306249D0; US3856930A; GB1447060A; JPS4965891A; FR2196719A5; DE2341061A1; IL42967A; DE2341061B2; IL42967A0

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur laufenden Klassierung von krankheitsverdächtigen Zellproben für Diagnostikprüfungen zwtcks Ausscheidung von solcher: Proben, die unzweideutig krankheitsfrei sind, durch Behandeln der Zellproben mit einem radioaktiv markierten Stoff, der selektiv von kranken Zellen absorbiert wird, Entfernen des überschüssigen Stoffes, Messung der Radioaktivität der so behandelten Zellprobe und Vergleich der von der unbekannten Zellprobe emittierten Radioaktivität mit einer Standardprobe, welche durch Messen des Niveaus der Radioaktivität erhalten wird, die von einer ähnlichen normalen Zellprobenart emittiert wird.

Nach der US-Patentschrift 36 73 410, der die deutsche Offenlegungsschrift 20 31 447 entspricht, ist es bekann», zur Diagnositizierung von Zellproben auf Krankheiten eine Zellprobe mit einem radioaktiv gekennzeichneten Farbstoff anzufärben, überschüssiges Farbstoffmaterial durch Spülen der Zellprobe zu beseitigen, die Radioaktivität der so behandelten Zellprobe zu messen sowie das

ίο Radioaktivitälsniveau zu vergleichen mit demjenigen von in gleicher Weise behandelten Proben gesunder Zellen. Dieses bekannte Verfahren bezieht sich nicht nur auf die Untersuchung von auf Objektträgern aufgebrachten Zellproben, sondern auch auf die Untersuchung von Proben in flüssiger Form, d.h. also von Zellsuspensionen. Das Zentrifugieren der Zellprobe wird bei diesem Verfahren vor der Radioaktivitätsmessung durchgeführt.

Aus der US-Patentschrift 34 76 514 ist es bereits bekannt, bei einem Verfahren zur Feststellung von Krebszellen durch Anfärben einer Zellsuspension mit einem Farbstoff, der von Krebszellen stärker absorbiert wird als von normalen Zellen, eine bestimmte Anzahl von Zellen aus der zu untersuchenden Probe auszuzählen und die Farbstoffmenge der Anzahl der ausgezählten Zellen anzupassen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, das Verfahren zur laufenden Klassierung von krankheitsverdächtigen Zellproben für Diagnostikprüfungen zu verbeisern.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß als radioaktiv markierter Stoff ³H-Pyronin B verwendet wird und daß vor dem Behandeln der Zellen mit ³H-Pyronin B die Konzentration der Zellen aus der zu klassifizierenden Probe bestimmt wird, das Radioaktivitätsniveau beider Proben an die Konzentration der Zellen angepaßt wird, daß vor der Messung der Radioaktivität von der zu messenden bestimmten Menge Zellen die zellulären Fremdstoffe, die bei der Behandlung mit ³H-Pyronin B zugegen waren, unter Verwendung einer äthanolhaltigen Waschflüssigkeit entfernt werden, und daß dann das Verhältnis der gemessenen spezifischen Radioaktivitäten zueinander gebildet werden.

Nach einer weiteren Ausbildung der Erfindung wird vor dem Bestimmen der Zellenkonzentration die Zellensuspension homogenisiert.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht darin, daß das zelluläre Fremdmaterial, welches Protein und Nucleoprotein aufweisen kann, von der Probe entfernt wird.

Vor der Abtastung der Radioaktivität werden in weiterer Ausgestaltung der Erfindung die Zellen gelöst. Eine weitere Ausbildung der Erfindung sieht vor, daß bei der Löslichmachung ein Fließmittel, welches Photonen zu emittieren vermag, verwendet wird.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht darin, daß die Probe von menschlichen weiblichen reprodukten Organen stammt.

Im Folgenden wird die Erfindung durch die Beschreibung von Beispielen in Zusammenhang mit den Zeichnungen näher erläutert.

Fig. 1 ist ein Blockdiagramm eines Verfahrens zur laufenden Klassierung von krankheitsverdächtigen Zellproben für Diagnostikprüfungen;

Fig. 2 ist eine graphische Darstellung, die zeigt, daß eine lineare Beziehungen zwischen der Zahl der Zellen und den Zahlungen pro Minute besteht.

Bevor die Zellen gezählt werden, wird die übersiehende Schutzpräparai- oder Präservativlösnng, in der die Probe enthalten ist, in eine Lösung überführt, die einen elektrischen Standard-Widerstand hat. Die Probe kann von ihrer überstehenden Flüssigkeit in einer Zentrifuge getrennt werden. Das durch das Zentrifugieren erhaltene Sediment wird in geeigneter Ionenstärke wieder so verdünnt, daß die Leitfähigkeit und/oder die optischen Eigenschaften der Kombination der Zeillösung standardisiert sind.

Die Art der verwendeten Standardlösung hängt von der Zellzähleinrichlung ab. Die Viskosität der Lösung muß genau kontrolliert werden, um eine konstante Durchflußgeschwindigkeit durch die Zählöffnung zu gewährleisten. Wenn eine optische Interferenznachweiseinrichtung verwendet wird, muß eine Farbinterferenz, wie sie durch eine Hämoglobinverunreinigung hervorgerufen sein kann, vermieden werden. Die Hämoglobinverunreinigung sollte vor der Suspension der Probe in der Zählflüssigkeit entfernt sein. Bei einem Widerstandsnachweisgerät muß die Jonenslärke genau kontrolliert werden. Ionenfreie Lösungen können auch verwendet werden. Wenn jedoch eine ionische Lösung, wie z. B. Isoton® verwendet wird, muß die lonenstärke genau titriert oder dadurch geprüft werden, daß man ihre Gefrierpunktserniedrigung mit einem herkömmlichen Osmometer bestimmt.

Nachdem eine vorbestimme Menge von Zellen gezählt und von der Probe getrennt ist, werden die verbleibenden Zellen beiseitegestellt und gegebenenfalls für eine spätere diagnostische Untersuchung aufbewahrt. Falls die Probe keine ausreichende Zahl von Zellen enthält, um eine Klassierung sowie eine nachfolgende Prüfung vorzunehmen, kann das Verfahren nicht fortgesetzt werden, und man muß eine andere Probe nehmen.

Der Grund für das Auszählen einer vorbestimmten Menge von Zellen besteht darin, daß man die geeignete Menge radioaktiver Flüssigkeit auffindet, die der Zellmenge zuzugeben ist. Erfindungsgemäß ist festgestellt worden, daß ein lineares Verhältnis zwischen der Zellenkonzentration und der Aufnahme an Farbstoff und radioaktivem Material besteht. Das lineare Verhältnis ist in F i g. 2 dargestellt. Nachdem die Anzahl der Zellen bestimmt worden ist, kann die Menge des zuzugebenden Feststoffes leicht bestimmt werden.

Eine ausreichende Menge radioaktiven Materials wird den Zellen zugegeben, um die stöchiometrische Bindung des Farbstoffes an die Zellen zu erreichen. Das radioaktive Material wird den Zellen bei einem geeigneten pH-Wert und bei einer genau bestimmten Temperatur ausreichend lange zugegeben. Erfindungsgemäß wird ³H-Pyronin B, das eine spezifische Aktivität von 0,8 bis 3,0 mc/mg hat, als radioaktives Material in einer Konzentration von 1 bis 3 mg/1001 der Lösung verwendet. Die Lösung ist bei einem pH-Wert gepuffert, der im Bereich zwischen 5,0 bis 7,0 liegt findet. Die Temperatur wird in einem Bereich zwischen 20⁰C bis37°Cbis 10 Minuten lang gehalten.

Nachdem der radioaktive Farbstoff der gezählten Zellmenge zugegeben ist, wird der überschüssige Farbstoff entfernt, und die Zellen werden erfindungsgemäß gespült. Das Trennen der Zellen vom Farbstoff kann leicht mit einer Zentrifuge erfolgen. Nach dem Spülen der Zellen wird die überstehende Spülflüssigkeit ebenfalls mit der Zentrifuge abgetrennt. Das Trennen der radioaktiven überstehenden Flüssigkeit von den Zellen gestattet es, das radioaktive Material in der überstehenden FarbstofflüssigkeiJ wieder zu gewinnen, wodurch Abfallprobleme minimal gehalten werden, die normalerweise bei der Verwendung von radioaktiven Materialien auftreten.

Es gibt im Handel erhältliche automatische Zentrifugen, die beim anfänglichen Entfernen des zellulären Fremdstoffes verwendet werden können, ferner bei den dem Zählen und/oder dem Messen der Zellen vorausgehenden Schritten, sowie bei dem nachfolgenden Färben und Spülen. So wurde eine von der Firma Ivan Sorvall, Ine Norwalk, Connecticut, hergestellte Zentrifuge mit Erfolg eingesetzt. Vorzugsweise werden die in der Sorvali-Zentrifuge verwendeten Küvetten etwas abgewandelt, um ein verbessertes Trennen zu erreichen. Beim Sorvall-Trenner kann bei den zu trennenden Schritten das Entfernen von Spüllösungen u. dg!, unter Zugabe von überstehenden Flüssigkeiten nacheinander und vollständig automatisch erfolgen. Beispielsweise können derartige Flüssigkeiten, wie destilliertes Wasser, Äthylalkohol und/oder Beizmittel oder Bleichmittel sowie das radioaktive Farbstoffmaterial in Speicherfässer des Separators bei der betreffenden Verfahrensstufe abgegeben werden. Ferner können diese Flüssigkeiten in Sümpfe zum Rückführen eingeleitet werden. Auf diese Weise wird ein erheblicher Arbeitsaufwand vermieden.

Nachdem die Probe homogenisiert ist und die Zellen dispergiert sind, wird eine vorbestimmte Zellmenge gezählt und aus der Zellmasse entfernt. Zu diesem Zweck wird eine übliche optische oder elektrische Zeilzähleinrichtung verwendet.

Das erfindungsgemäße Waschen oder Spülen kann in drei bis fünf unterschiedlichen Zyklen mit einer oder mehreren unterschiedlichen Wasch- oder Spüllösungen erfolgen. Eine bevorzugte Wasch- und Spüllösung ist deionisiertes, destilliertes Wasser allein oder in Kombination mit Äthylalkohol. Es ist erwünscht, die Zellen solange zu waschen und/oder zu spülen, bis die zelluläre Bindekomponente der Aufnahme konstant bleibt. Auf diese Weise können gut übereinstimmende Resultate erzielt werden.

Nachdem die Zellprobe die Strahlungsabtastphase des Verfahrens durchlaufen hat, wird nun zwischen

• »normalen« und »abnormalen« Zellen dadurch unterschieden, daß das Slrahlungsniveau der Probezellen mit dem Strahlungsniveau der Zellen verglichen wird, die von einer Standardprobe stammen, und mit der krankheitsverdächtigen Zellprobe entweder gleichzeitig oder innerhalb einer relativ kurzen Zeit hergestellt worden ist.

Die erreichbare Genauigkeit der Unterscheidung wird an folgendem Beispiel erläutert. Eine Reihe von 106 krankheitsverdächtigen Proben wurde von einem Pathologen geprüft. Jede Probe wurde durch eine Zahl entsprechend dem standardpathologischen Klassifikationssystem klassifiziert. Die Proben wurden dem erfindungsgemäßen Verfahren unterworfen, und das Niveau der Radioaktivität jeder Probe wurde mit dem entsprechenden Niveau einer krankheitsfreien Standardprobe verglichen. Das Radioaktivitätsniveau der Probe wurde durch das entsprechende Niveau der Standardprobe zur Bildung eines Verhältnisses geteilt. Wie die Tabelle I zeigt, hatten alle krankheitsverdächtigen Proben, d. h. die eine Klassifikation von 4 oder höh°r aufwiesen, ein Strahlungsniveauverhältnis über 1,4. Alle Proben mit einem darunter liegenden Strahiungsniveauverhältnis hatten niedrigere Klassifikationszahlen, d. h. sie waren krankheitsfrei und

konnten somit von der diagnostischen Untersuchung ausgenommen werden. So zeigt Tabelle II, daß 75% der täglich zu untersuchenden Zellproben nicht mehr einer weiteren ausführlichen Prüfung unterzogen werden mußten, da sie unter dem kritischen Strahlungsniveau lagen. Somit brauchten nur 25% der Proben auf Objektträger für eine ausführliche pathologische oder zylologische Prüfung gebracht zu werden.

Nachdem das Fremdmaterial entfernt ist, wird gemäß einer Ausführungsform der Erfindung die Probe homogenisiert, um größere Massen des Gewebes aufzubrechen. Standard-Zellhomogenisatoren mit Glasmörsern und Stößeln aus Glas und/oder Teflon können zu diesem Zweck verwendet werden. Mit der Homogenisation ist die Dispersion der Zellen gemeint. Zelluläre Zerstörung ist zu vermeiden.

Das Verfahren nach der Erfindung erfordert eine Probe, die frei von zellulärem Fremdmaterial ist. Die Probe kann zu diesem Zweck einer enzymatischen Behandlung unterworfen werden, um das Fremdmaterial, wie z. B. Protein, Nucleoprotein und Schleim, zu entfernen. Die Behandlung trennt auch die Zellen durch Auflösung des interzellularen Zements. Verschiedene herkömmliche enzymatische Behandlungen stehen zu diesem Zweck zur Verfügung. Beispielsweise können Peosin, Trypsin und Hyaluronidase zufriedenstellend gleichzeitig oder nacheinander benutzt werden. Die Inkubationszeit, die Temperatur und der pH-Wert der Behandlungslösungen werden genau kontrolliert, um eine übermäßige Zellzerstörung zu verhindern. Die optimale bei diesen Enzymen zu verwendende Temperatur beträgt 37°C; bei gewissen anderen Enzymen kann es jedoch notwendig sein, die Temperatur sowie auch den pH-Wert der Behandlungslösung zu verändern. Wie bekannt, reagiert Pepsin nur in sauren Lösungen, Trypsin dagegen in neutralen oder alkalischen Lösungen. Für den Fall, daß der optimale pH-Wert für ein spezielles Enzym nicht angegeben ist. kann ein solcher pH-Wert experimentell bestimmt werden. Beispielsweise kann eine Standard-Hämoglobinlösung kalorimetrisch für Tyrosin-Freigabe bei verschiedenen Niveaus des pH-Wertes gemessen werden. Der pH-Wert, bei dem die größte Menge von Tyrosin erzeugt wird, ist das Optimum. Nachdem so der optimale pH-Wert ermittelt ist, können die optimale Temperatur und Zeit in ähnlicher Weise aus der Tyrosin-Freisetzungskurve bestimmt werden, wobei die Zeit auf das Hochtasten der Auflösekurve eingestellt ist, während das Plateau derselben vermieden werden muß.

Die Farbstofflösung kann durch Kühlung für die tägliche Benutzung erhalten bleiben. Die Zugabe von Phenol udci benzucsaurem Natnurn ist jedoch zu empfehlen, um die Lösung bei der Inkubationstemperatur für die Zellenkennzeichnung, die etwa 37°C beträgt, zu übertragen und zu stabilisieren. Als zuletzt verwendetes Aufschlußmitte] kann ein übliches kaustisches Lösungsmittel dienen, wie z. B. Liquosol®. Das Aufschlußmittel sollte in einer ausreichenden Menge aufgebracht werden, um die Zellzerstörung sicherzustellen, das überschüssige Mengen zu erhöhten Abkühlverlusten bei schnellem Abkühlen und einer Verminderung in der Zählleistung führen, was wirtschaftlich gesehen nicht tragbar ist. Falls gewünscht, können größere Lösungsmengen wie z. B. Liquaphor, beim Aufschließen vor der Endübertragung zum Strahlungsnachweis mit Hilfe des Szintillationszählers verwendet werden.

Das radioaktive Farbstoffmaterial wird in der Zentrifuge getrennt, um Probleme bei der radioaktiven Müllablagerung zu vermeiden. Somit ist das durchschnittliche Laboratorium in der Lage, das erfindungsgemäße Verfahren anzuwenden, ohne daß spezielle Ablagerungsauflagen der Atom-Energiebehörde zu erfüllen sind. Nachdem einmal die überschüssigen radioaktiven Stoffe nach der Farbstoffaufnahme getrennt sind, kann die Anwendung weiterer Spüllösungen durch die üblichen Abgabekanäle entfallen, da nur relativ geringe Mengen radioaktiven Materials ausge-

H) schieden werden.

Nachdem die Zellproben mit radioaktivem Farbstoff behandelt und in geeigneter Weise gespült sind, werden sie für die Strahlungsabtasiung vorbereitet. Zu diesem Zweck ist das Aufschlußmittel mit geeigneten Flußspaten versehen, so daß auch kleinste Strahlungsmengen durch die Strahlungsnachweiseinrichtung erfaßt werden können. Die Radioaktivität der Zellproben wird dadurch bestimmt, daß die Zellproben in eine Ampulle gegeben werden, die zur direkten Analyse auf einer kontinuierlichen Kette durch einen Szintillationszähler gelragen wird. Die Probe kann auch auf einem Szintillationszähler mit Flüssigkeitsfluß analysiert werden. Obwohl große, kettengetriebene Gamma-Detektoren mit strahlungsdurchlässigen Fenstern bei dem letzten Ablasischritt verwendet werden können, ist jedoch gefunden worden, daß die üblichen Flüssigkeitsszintillationsdetektoren empfindlicher und daher geeigneter sind. Die Firmen Nuclear Chicago, Packard und Beckman Instrument Companies stellen geeignete Detektoren her.

Das Verfahren ist besonders vorteilhaft anwendbar beim Diagnostizieren von Gewebeproben, die man durch Ausschaben von weiblichen Fortpflanzungsorganen erhält, wie z. B. der Cervix, dem Uterus oder der Vagina. Bei der herkömmlichen Praxis werden solche Proben in ein Schutzpräparat eingebettet, dessen Prüfung bei einem Cytologen oder Pathologen vorgenommen wird, obwohl ein Schutzpräparat nicht notwendig ist, wenn die Proben sofort, d. h. innerhalb von drei Stunden, geprüft werden. Eine bevorzugte Flüssigkeit zum Erhalten einer Gewebeprobe, die nach dem Sammeln einer sofortigen Prüfung unterzogen werden soll, ist eine physiologische Kochsalzlösung (0,85% Salz in destilliertem Wasser) oder Ringer-Lösung. Andere bevorzugte Schutzpräparate weisen Papette® und sepziell vorbereitete Lösungen aus Benzol, Methanol, Äthanol Phenylameisensäure, benzoesaures Natrium, Äther oder destilliertes Wasser auf. Kombinationen dieser Lösungen können in entsprechend gemessenen Konzentrationen verwendet werden. Es wurde festgestellt, daß Proben, die 18 Monate lang in einem Schutzpräparai gehalten wurden ausreichend klassiert waren.
Obwohl das Verfahren besonders zum Bestimmen krebsverdächtiger Zellen in weiblichen Fortpflanzungsorganen geeignet ist kann das Verfahren auch zur Feststellung anderer Krankheiten benutzt werden. Trotz einiger »Fehlergebnisse«, die darauf beruhten, daß sich krankheitsverdächtige Proben später als tatsächlich krankheitsfrei erwiesen, erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren eine »wirkliche Negativaussage« von 75%, der zu untersuchenden Proben. Die Verwendung einer »normalen« Zellstandardprobe bei jedem Tagesdurchlauf vermindert die Möglichkeit, daß Veränderungen, z. B. Änderungen der Umgebungstemperatur, des pH-Wertes der benutzten Lösungen oder der Vorbereitungszeit der Proben, die Zuverlässigkeit der Ergebnisse nachteilig beeinflussen können.

Tabelle I

Frequenzverteilung normalisierter zervikaier Zellquellen

	1 1	1	1	1	1	1	3	5	2	1	5
	1	1	1	1	2	1	2	2	2	4	4
	2	1	1	3	1	3	4	2	3	2 2 5	4
	2	3	1	1	2	2	2	4	3	5 5 2 5 2	5
	2	1	]	1	1	3	4		5		5
	2	1		2	1	1	1		5		5
	1	1		2	2	2	1				5
	1	1	2	2	1
	1	1	2	1	1
	2	1	1	1	1
	2	1	2
3	1		2
1	1		2
1 1	1
1 1 1	1

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8 2,0

2,2 2,4 >2,5

Verhältnis

(spezifische Aktivität der Unbekannten spezifische Aktivität normaler Kontrolle)

Tabelle II

Statistische Summe aufgewerteter zervikaJer Zellen

1.

Gesamte ausgewertete Fälle

a) # l's

b) # 2's

c) # 3's

d)
e)

# 4's

# 5's

2. Gesamte # 4's und # 5's

a) über 1,4

b) unter 1,4

3. Gesamt über 1,4

a) # 5's über 1,4

b) # 4's über 1,4

c) # 3's über 1,4

d) # 2's über 1,4

e) # l's über 1,4

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

•30 207/197

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur laufenden Klassierung von krankheitsverdächtigen Zellproben für Diagnostikprüfungen zwecks Ausscheidung von solchen Proben, die unzweideutig krankheitsfrei sind, durch Behandeln der Zellproben mit einem radioaktiv markierten Stoff, der selektiv von kranken Zellen absorbiert wird, Entfernen des überschüssigen Stoffes, Messung der Radioaktivität der so behandelten Zellprobe und Vergleich der von der unbekannten Zellprobe emittierten Radioaktivität mit einer Standardprobe, welche durch Messen des Niveaus der Radioaktivität erhalten wird, die von einer ähnlichen normalen Zeilprobenart emittiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß als radioaktiv markierter Stoff ³H-Pyronin B vei wendet wird und daß vor dem Behandeln der Zellen mit ³H-Pyronin B die Konzentration der Zellen aus der zu klassifizierenden Probe bestimmt wird, das Radioaktivitätsniveau beider Proben an die Konzentration der Zellen angepaßt wird, daß vor der Messung der Radioaktivität von der zu messenden bestimmten Menge Zellen die zellulären Fremdstoffe, die bei der Behandlung mit ³H-Pyronin B zugegeben waren, unter Verwendung einer äthanolhaltigen Waschflüssigkeit entfernt werden, und daß dann das Verhältnis der gemessenen spezifischen Radioaktivitäten zueinander gebildet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß vor dem Bestimmen der Zellenkonzentration die Zellensuspension homogenisiert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß zelluläres Fremdmaterial, welches Protein und Nucleoprotein aufweisen kann, von der Probe entfernt wird.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß vor der Abtastung der Radioaktivität die Zellen gelöst werden.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Löslichmachung ein Fließmittel, welches Photonen zu emittieren vermag, verwendet wird.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe von menschlichen weiblichen reprodukten Organen stammt.