AT372192B

AT372192B - Verfahren zur diagnostizierung von abstossungsreaktionen nach transplantationen

Info

Publication number: AT372192B
Application number: AT12482A
Authority: AT
Inventors: Helmut Dr Wachter; Arnulf Dr Hausen
Original assignee: Helmut Dr Wachter
Priority date: 1982-01-15
Filing date: 1982-01-15
Publication date: 1983-09-12
Also published as: ATA12482A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Diagnostizierung von Abstossungsreaktionen nach Transplantationen, wobei ein dem Organismus entnommenes Untersuchungsmaterial, insbeson- dere eine Körperflüssigkeit untersucht wird.

Der Erfolg einer Transplantation beruht auf der Frühzeitigkeit und Richtigkeit der Diagnose einer akuten Abstossung. Der Erfolg einer notwendigen Abstossungsbehandlung hängt mit vom Zeitpunkt des Therapiebeginnes ab ; die Risiken dieser Behandlung erfordern eine möglichst sichere Diagnose bzw. Differenzierung gegenüber andern Störungen. Die generellen Risiken der erhöhten Immunsuppression steigen bei Applikation unter einer Fehldiagnose erheblich an. Einem Therapieentscheid zur Abstossungsbehandlung sollte somit möglichst eine positive Diagnose, nicht eine Ausschlussdiagnose (z. B. unklares Fieber ohne andere Erklärung) zugrunde liegen.

Entsprechend der Vielzahl der Organfunktionen und der Auswirkungen ihrer Störungen einerseits und der komplexen, erst teilweise bekannten immunologischen Vorgänge nach Transplantation mit ihren Auswirkungen auf das Transplantat und auf den Gesamtorganismus anderseits stehen zahlreiche Untersuchungsmöglichkeiten zur Verfügung. Eine Reihe von Untersuchungsverfahren, speziell die immunologischen und solche mit längerer Bestimmungszeit, sind heute vor allem für wissenschaftliche Fragen sowie zu Verlaufsstudien geeignet. Festzuhalten bleibt dabei, dass heute eine Aussage über den wesentlichen immunologischen Vorgang, nämlich den der Abstossungsreaktion, für die klinischen Belange nur nach den funktionellen und morphologischen Auswirkungen dieses Vorganges, nicht aber durch eine Bestimmung der Immunreaktion selbst möglich ist.

Die wichtigsten der zahlreichen Untersuchungsmöglichkeiten und Parameter zur Beurteilung der Transplantatfunktion und des Transplantationserfolges können daher in zwei Gruppen dargestellt werden :
1. Routineuntersuchungen
2. spezielle Untersuchungen
Für die klinische Sicherheit ist es derzeit immer notwendig, neben den verhältnismässig einfachen Routineuntersuchungen aufwendige, mit erheblichem personellen und apparativen Einsatz verbundene spezielle Untersuchungen durchzuführen.

Zu den Routineuntersuchungen zur Überwachung der Transplantationsfunktion zählen beispielsweise : 1. 1. Allgemeine Parameter :
Subjektives Befinden
Temperatur, Puls
Blutdruck
Gewicht
Hb, Hk, Leukozyten
Diff. Blutbild, Thrombozyten
Gerinnungstest
1. 2. Lokale klinische Parameter :
Spontane Empfindung im Transplantatbereich
Palpationsempfindlichkeit
Transplantatgrösse (Palpation)
Transplantatkonsistenz (Palpation)
Transplantatumgebung (Inspektion, Palpation)

1. 3.

Funktions-Parameter :
Urinmenge Serumkreatinin, Serumharnstoff
Kreatininausscheidung
Kreatinin-Clearance
Urinanalyse (Sediment, Protein, Glucose, PH) (eventuell Urinelektrolyte und-osmolalität)
Urinbakteriologie (MSU)
Zu den speziellen Untersuchungen zur überwachung der Transplantationsfunktion zählen z. B. bei Nierentransplantationen :
2. 1. Urincytologie
2. 2. Nuklearmedizinische Durchblutungs- und Funktionsuntersuchungen 2. 3. i. v. Urogramm (retrogr. Urographie, Angiographie,
Punktions- oder Excisionsbiopsie)
2. 4.

Serumparathormon
Immunologische Untersuchungen
Sowohl die Routineuntersuchungen als auch die speziellen Untersuchungen sind ausserordentlich zeitaufwendig und kostspielig und lassen trotz dieses Aufwandes eine Abstossungsreaktion nicht mit der gewünschten Frühzeitigkeit erkennen.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein gegenüber den bisherigen Vorschlägen verbessertes, einfaches klinisch-chemisches Verfahren zur frühzeitigen Erkennung einer Abstossungsreaktion und zur Verlaufskontrolle sowie zu einer prognostischen Voraussage über eine durchgeführte Transplantation zu schaffen.

Dies wird erfindungsgemäss dadurch erreicht, dass im Untersuchungsmaterial ein konjugiertes oder unkonjugiertes, gegebenenfalls derivatisiertes Pteridin oder sein Abbauprodukt, sein Oxydationsprodukt bzw. sein Reduktionsprodukt qualitativ nachgewiesen und/oder halbquantitativ bzw. quantitativ bestimmt wird.

Der Nachweis bzw. die Bestimmung bestimmter Pteridine in Körperflüssigkeiten wurde bereits für ein Verfahren zur Diagnostizierung von malignen Tumoren vorgeschlagen (AT-PS 362079). Die herkömmlichen Verfahren zur Diagnostizierung von Abstossungsreaktionen erfolgten jedoch bisher nach Methoden, die sich von den üblichen Methoden zur Diagnostizierung von malignen Tumoren grundsätzlich unterscheiden.

Mit dem erfindungsgemässen Verfahren ist es erstmals möglich, eine Bestimmung der nach einer Transplantation auftretenden Immunreaktion selbst durchzuführen. Dies beruht auf der Erkenntnis, dass bei Zellkulturen von Lymphozyten (die für die Immunreaktion verantwortlich sind) die T-Lymphozyten-Aktivität durch die Pteridinausscheidung der Zellen streng proportional angezeigt wird. Auch beim Menschen wurde nach einer Transplantation festgestellt, dass das vermehrte Auftreten von Pteridinen (z. B. von Neopterin) in Körperflüssigkeiten ein sicherer Hinweis auf eine Abstossungsreaktion ist.

Das Pteridin hat folgende Formel :
EMI2.1

EMI3.1

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EMI4.1

EMI4.2

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Transplantation in die zu untersuchende Körperflüssigkeit kein Pteridin abgibt bzw. im Organ, aus dem das Biopsiematerial entnommen wird, kein Pteridin vorhanden ist. Andernfalls ist eine quantitative bzw. halbquantitative Bestimmung des konjugierten oder unkonjugierten Pteridins bzw. seiner Abbauprodukte, seiner Oxydationsprodukte oder Reduktionsprodukte nötig, wobei diese Werte mit Normalwerten (von Gesunden) je nach der speziellen Untersuchungsmethode der Körperflüssigkeit bzw. des Biopsiematerials zu vergleichen sind.

Zum Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung der erfindungsgemässen Pteridinderivate einschliesslich ihrer Abbauprodukte, Oxydations- oder Reduktionsprodukte eignen sich übliche Analyseverfahren wie : - Niedervolt- oder Hochspannungselektrophorese auf Trägern oder trägerfrei, kombiniert mit in-situ-Fluorometrie bzw.

Remissionsmessung im UV- bzw. sichtbaren Bereich nach An- färbung ; - Dünnschichtchromatographie kombiniert mit in-situ-Fluorometrie oder Remissionsmessung im UV- bzw. sichtbaren Bereich nach Anfärbung ; - Papierchromatographie kombiniert mit in-situ-Fluorometrie oder Remissionsmessung im UV- bzw. sichtbaren Bereich nach Anfärbung ; - Gaschromatographie ; - Gaschromatographie kombiniert mit Massenspektrometrie ; - Felddesorptionsmassenspektrometrie ; - Hochdruckflüssigkeitschromatographie und Fluoreszenzdetektion bzw.

Detektion im UV- bzw. sichtbaren Bereich nach chemischer Reaktion bzw. elektrochemische Detektion ; - Hochdruckflüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie ; - Flüssigahromatographie an Ionenaustauschern ; - Photometrie ; - Fluorometrie ; - Spektroskopie (UV-, IR-, kernmagnetische Resonanz, Massenspektrometrie) ; - immunologische Methoden (Radio-Immuno-Assay (RIA), Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay (ELISA), Enzym-Immuno-Assay (EMIT), Immunoelektrophorese u. a. ; - Isotopenverdünnung ;
EMI5.1
- Farbtest ; - Biologischer Test (Crithidia-Wachstumstest u. a.) ; - iso-elektrische Fokussierung ; - kinetische Nephelometrie.

Nachstehend wird das erfindungsgemässe Verfahren an Hand von Beispielen näher erläutert :
Beispiel 1 : Zum Nachweis einer Abstossungsreaktion nach einer Transplantation beim Menschen eignet sich z. B. die quantitative Bestimmung des Neopterins im Harn durch hochdruckflüssigchromatographische (HPLC) Trennung des nativen Harnes und Fluoreszenzdetektion. Gegebenenfalls kann vor der chromatographischen Trennung eine Vortrennung mittels Vorsäule od. dgl. erfolgen.

5 pl Humanharn bzw. die äquivalente Menge nach der Vorreinigung werden in das HPLC- -System eingegeben. Am HPLC-System wird isokratisch gefahren. Als Puffer wird Ammonacetat/Essigsäure (30 mMol/l, PH = 6, 0) mit 5% Methanolzusatz verwendet. Benutzt wird eine 30 cm-Säule mit reversed-phase-Material als Füllmittel. Die Durchflussgeschwindigkeit beträgt 2 ml/min.

Durch das HPLC-System erfolgt eine klare Abtrennung des Neopterins von andern Substanzen,

so dass das Neopterin mittels Fluoreszenzdetektor und angeschlossenem Schreiber quantitativ erfasst werden kann. Die Anregungswellenlänge beträgt hiebei 380 nm, die Messwellenlänge 450 nm.

Gleichzeitig mit der Bestimmung des Neopterins wird das im Harn ausgeschiedene Kreatinin quantitativ bestimmt, so dass die Angabe in ng Neopterin pro mg Kreatinin erfolgen kann.

Beispiel 2 : Ein weiteres mögliches Analysenverfahren zur Bestimmung des Neopterins besteht in Dünnschichtchromatographie auf Cellulose mit dem Laufmittel 5%ige Essigsäure. Der hRf-Wert des Neopterins liegt in diesem System bei 65. Die quantitative Bestimmung des Neopterins erfolgt durch Direktfluorometrie bei 364 nm Anregung und 456 nm Messung mit einem Chromatogrammspektralfluorometer.

Beispiel 3 : Ein weiteres mögliches Analysenverfahren zur Bestimmung des Neopterins besteht in Dünnschichtchromatographie auf Cellulose mit dem Laufmittel n-Butanol/Eisessig/Wasser (20/3/7).

Der hRf-Wert des Neopterins liegt in diesem System bei 37. Auch hier erfolgt die quantitative Bestimmung des Neopterins durch Direkt-Fluorometrie bei 356 nm Anregung und 440 nm Messung mit einem Chromatogrammspektralfluorometer.
EMI6.1
:hochdruckflüssigchromatographische (HPLC) Auftrennung des nativen Harnes und durch Messung mittels UV-Absorption. Gegebenenfalls kann vor der chromatographischen Trennung eine Vortrennung mittels Vorsäule od. dgl. erfolgen.

5 pl Humanharn bzw. die äquivalente Menge nach der Vorreinigung werden in das HPLC- - System eingegeben. Am HPLC-System wird isokratisch gefahren. Als Puffer wird Ammonacetat/Essig-
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0)andern Substanzen, so dass das 2-Amino-4-hydroxy-pyrimidin mittels UV-Absorption und angeschlossenem Schreiber quantitativ erfasst werden kann. Die Absorption wird bei 240 nm gemessen.

In gleicher Weise kann Guanosin-triphosphat (GTP) quantitativ bestimmt werden. Gemessen wird in diesem Fall bei 260 nm.
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änderte UV-Absorption unterscheidet. Die Lichtabsorption wird bei 339 nm photometrisch gemessen. Die Menge des entstandenen NADPH : ist der Konzentration des 7, 8-Dihydroxanthopterins direkt proportional.
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Eine nach den vorstehenden Beispielen und generell nach dem erfindungsgemässen Verfahren durchgeführte Untersuchung beansprucht nur einen geringen Zeitaufwand. So kann eine Untersuchung etwa nach Beispiel 1 in 6 min durchgeführt werden. Die Untersuchungen nach dem erfindungsgemässen Verfahren können auch beliebig oft wiederholt werden und ermöglichen so auch eine Verlaufskontrolle der Abstossungsreaktion nach einer Transplantation.

Von dem in der Körperflüssigkeit befindlichen Pteridin bzw. von dem angewendeten Bestim-

mungsverfahren hängt es ab, ob das ursprüngliche Pteridin selbst erfasst wird oder dessen z. B. durch Licht-und/oder Lufteinfluss entstehendes Abbauprodukt, Oxydationsprodukt bzw. Reduktions- produkt.

PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Diagnöstizierung von Abstossungsreaktionen nach Transplantationen, wobei ein dem Organismus entnommenes Untersuchungsmaterial, insbesondere eine Körperflüssigkeit, un- tersucht wird, dadurch gekennzeichnet, dass im Untersuchungsmaterial ein konjugiertes oder un- konjugiertes, gegebenenfalls derivatisiertes Pteridin oder sein Abbauprodukt, sein Oxydationspro- dukt bzw. sein Reduktionsprodukt qualitativ nachgewiesen und/oder halbquantitativ bzw. quanti- tativ bestimmt wird.

Claims

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass vorzugsweise im Harn Neopterin qualitativ nachgewiesen und/oder halbquantitativ bzw. quantitativ bestimmt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass vorzugsweise im Harn D-7, 8-Di- hydro-neopterin qualitativ nachgewiesen und/oder halbquantitativ bzw. quantitativ bestimmt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass vorzugsweise im Harn das Racemat des 7, 8-Dihydroneopterins qualitativ nachgewiesen und/oder halbquantitativ bzw. quanti- tativ bestimmt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass vorzugsweise im Harn Xanthopterin qualitativ nachgewiesen und/oder halbquantitativ bzw. quantitativ bestimmt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass vorzugsweise im Harn 7, 8-Di- hydroxanthopterin qualitativ nachgewiesen und/oder halbquantitativ bzw. quantitativ bestimmt wird.

7. Verfahren'nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass vorzugsweise im Harn Biopterin qualitativ nachgewiesen und/oder halbquantitativ bzw. quantitativ bestimmt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass vorzugsweise im Harn 7, 8-Di- hydro-biopterin qualitativ nachgewiesen und/oder halbquantitativ bzw. quantitativ bestimmt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass vorzugsweise im Harn 5, Iì, 7, 8-Tetrahydro-biopterin qualitativ nachgewiesen und/oder halbquantitativ bzw. quantitativ bestimmt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass vorzugsweise im Harn 6-Pterincarbonsäure qualitativ nachgewiesen und/oder halbquantitativ bzw. quantitativ bestimmt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass vorzugsweise im Harn 6-Hydroxymethylpterin qualitativ nachgewiesen und/oder halbquantitativ bzw. quantitativ bestimmt wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis bzw. die Bestimmung des Pteridins bzw. seiner Abbauprodukte, seiner Oxydations- oder Reduktionsprodukte unter Bestrahlung und Messung der dabei entstehenden Fluoreszenzstrahlung erfolgt.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die quantitative Bestimmung des Pteridins bzw. seiner Abbauprodukte, seiner Oxydations- oder Reduktionsprodukte durch Dünnschichtchromatographie und anschliessender fluorometrischer Direktauswertung erfolgt.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Pteridin bzw. seine Abbauprodukte, seine Oxydations- oder Reduktionsprodukte quantitativ flüssigkeitschromatographisch, insbesondere hochdruckflüssigkeitschromatographisch bestimmt und fluorometrisch und/oder durch deren UV-Absorption detektiert werden.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Pteridin bzw. seine Abbauprodukte, seine Oxydations- oder Reduktionsprodukte enzymatisch bestimmt werden. <Desc/Clms Page number 8> EMI8.1