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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Diagnostizierung, insbesondere Früherkennung von malignen Tumoren im menschlichen oder tierischen Organismus, wobei eine dem Organismus entnommene Körperflüssigkeit auf den Gehalt bestimmter Pteridine untersucht wird.
Die Diagnose maligner Tumore erfolgt heute fast ausschliesslich auf Grund von klinischen, radiologischen, endoskopischen, histologischen und zytologischen Untersuchungen. Klinisch chemische oder biochemische Befunde, die für einen malignen Tumor eine sichere Voraussage zulassen, existieren bis heute noch nicht. Speziell bei endokrin wirksamen Geschwülsten, die vermehrt Hormone produzieren, kann zwar die quantitative Bestimmung dieser Hormone im Serum oder im Urin wichtige diagnostische Hinweise liefern. Die erhöhten Hormonwerte lassen jedoch nicht sicher auf maligne Neoplasien schliessen, sondern können auch bei andern Erkrankungen auftreten.
In neuerer Zeit hat auch die Bestimmung einiger tumorassoziierter Antigene, z. B. des carcinoembryonalen Antigens (CEA) oder des c-Fetoproteins eine gewisse Bedeutung erlangt. Da diese Antigene einerseits je nach Tumor im besten Falle nur bei 30 bis 90% der Tumorpatienten erhöht sind, anderseits auch bei Patienten mit andern Erkrankungen erhöhte Werte gefunden werden, bleibt der praktische Wert dieser Untersuchungen sehr begrenzt.
Erfolgversprechender, obwohl bisher in der Praxis noch nicht verwendet, scheint eine Tumordiagnose auf Grund der Bestimmung des Gehaltes bestimmter Pteridine in Körperflüssigkeiten.
Kokolis und Ziegler (Kokolis N. und Ziegler J., Cancer Biochem. Biophys. 1977, Vol. 2, pp. 79-85) fanden im Serum von Tumorpatienten erhöhte Werte von Tetrahydrobiopterin. Untersuchungen von Halpern et al. (Cancer Research 38,2378-2384, 1978), ergaben in Gewebekulturen von malignen Zellen erhöhte Mengen von 6-Hydroxymethylpterin nach vorheriger Gabe von Folsäure.
Aufgabe der Erfindung gemäss dem Stammpatent Nr. 362079 ist es, ein gegenüber den bisherigen Vorschlägen verbessertes klinisch chemisches Verfahren zur Diagnose, insbesondere Früherkennung von malignen Tumoren in menschlichen oder tierischen Organismen zu schaffen, u. zw. durch Bestimmung bestimmter Pteridine in Körperflüssigkeiten.
Dies wird gemäss Stammpatent dadurch erreicht, dass in der Körperflüssigkeit ein 7, 8-Dihy- dropteridin oder sein Oxydationsprodukt qualitativ nachgewiesen und/oder halbquantitativ bzw. quantitativ bestimmt wird.
Das 7,8-Dihydropteridin hat folgende Formel :
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sein Oxydationsprodukt :
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Das Verfahren gemäss Stammpatent beruht auf der im Tierversuch gewonnenen Erkenntnis,
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ist und sehr gut mit dem Tumorwachstum der Modelltiere korreliert. Auch beim Menschen wurde festgestellt, dass das (vermehrte) Auftreten von 7, 8-Dihydropteridinen in Körperflüssigkeiten ein sicherer Hinweis auf malignes Wachstum ist.
Aufgabe der Zusatzerfindung ist es, das Verfahren gemäss Stammpatent auf die speziellen Gegebenheiten beim Menschen besser anzupassen.
Dies wird erfindungsgemäss dadurch erreicht, dass die Körperflüssigkeit, vorzugsweise Harn,
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auf ihren Gehalt an Neopterin (6-Erythro-1, 2, 3- trihydroxypropyl-pterin) bzw. dessen 7, 8-Dihydroderivat qualitativ und/oder halbquantitativ bzw. quantitativ nach an sich bekannten Methoden untersucht wird.
Das erfindungsgemässe Verfahren bezieht sich auf die Bestimmung bzw. den Nachweis von Pteridinen, die ursprünglich als Neopterin oder dessen 7,8-Dihydroderivat in der entnommenen Körperflüssigkeit vorliegen. Im Rahmen des Nachweisverfahrens können diese Verbindungen selbstverständlich oxydiert, substituiert, derivatisiert, aber auch weiter reduziert werden.
Das erfindungsgemäss nachzuweisende Neopterin kann in folgender Weise vorliegen ; als D-Neopterin
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als L-Neopterin
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bzw. als Racemat des Neopterins.
Das erfindungsgemäss nachzuweisende Neopterin kann auf unterschiedliche Art substituiert sein, beispielsweise durch Zucker oder Phosphat. Das Neopterin bzw. sein hydriertes oder sub-
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dass dem Organismus, dem die zu untersuchende Körperflüssigkeit entnommen wird, vorher ein Pteridinderivat bzw. ein in den Pteridinstoffwechsel eingreifendes Präparat verabreicht wird.
Der qualitative Nachweis des Neopterins bzw. seines hydrierten oder substituierten Produktes genügt, wenn der betreffende gesunde Organismus, d. h. ohne Vorhandensein eines malignen Tumors in die zu untersuchende Körperflüssigkeit kein Neopterin abgibt. Andernfalls ist eine quantitative bzw. halbquantitative Bestimmung des Neopterins bzw. seiner hydrierten oder substituierten Produkte nötig, wobei diese Werte mit Normalwerten (von Gesunden) je nach der speziellen Untersuchungsmethode der Körperflüssigkeit zu vergleichen sind.
Zum Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung des erfindungsgemässen Neopterins einschliesslich seiner hydrierten oder substituierten Produkte eignen sich übliche Analyseverfahren, wie : - Niedervolt- oder Hochspannungselektrophorese auf Trägern oder trägerfrei kombiniert mit in-situ-Fluorometrie bzw.
Remissionsmessung im UV- bzw. sichtbaren Bereich nach An- färbung ; - Dünnschichtchromatographie kombiniert mit in-situ Fluorometrie oder Remissionsmessung im UV- bzw. sichtbaren Bereich nach Anfärbung ; - Papierchromatographie kombiniert mit in-situ-Fluorometrie oder Remissionsmessung im UV- bzw. sichtbaren Bereich nach Anfärbung ; - Gaschromatographie ; - Gaschromatographie kombiniert mit Massenspektrometrie ; - Felddesorptionsmassenspektrometrie ;
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- Hochdruckflüssigkeitschromatographie und Fluoreszenzdetektion bzw.
Detektion im UV- bzw. sichtbaren Bereich nach chemischer Reaktion bzw. elektrochemische Detektion ; - Hochdruckflüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie ; - Flüssigchromatographie an Ionenaustauschern ; - Photometrie ; - Fluorometrie ; - Spektroskopie (UV-, IR-, kernmagnetische Resonanz, Massenspektrometrie) ; - Immunologische Methoden (Radio-Immuno-Assay (RIA), Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent- - Assay (ELISA), Enzym-Immuno-Assay (EMIT), Immunelektrophorese u. a.
- Isotopenverdünnung ; - Enzymtest, z. B. mittels Xanthinoxydase ; - Farbtest ; - Biologischer Test (Crithidia-Wachstumstest u. a.) ; - iso-elektrische Fokussierung ; - kinetische Nephelometrie ;
Nachstehend wird das erfindungsgemässe Verfahren an Hand eines Beispiels näher erläutert :
Zum Nachweis eines malignen Wachstums beim Menschen eignet sich z. B. die quantitative Bestimmung des Neopterins im Harn durch hochdruckflüssigchromatographische (HPLC) Trennung des nativen Harnes und Fluoreszenzdetektion. Gegebenenfalls kann der chromatographischen Trennung eine Vortrennung mittels Vorsäule od. dgl. erfolgen.
5 pl Humanharn bzw. die äquivalente Menge nach der Vorreinigung werden in das HPLC-System eingegeben. Am HPLC-System wird isokratisch gefahren. Als Puffer wird Ammonacetat/Essigsäure (30 m mol/1, pi = 6, 0) mit 5% Methanolzusatz verwendet. Benutzt wird eine 30 cm-Säule mit reversed-phased-Material als Füllmittel. Die Durchflussgeschwindigkeit beträgt 2 ml/min.
Durch das HPLC-System erfolgt eine klare Abtrennung des Neopterins von andern Substanzen, so dass das Neopterin mittels Fluoreszenzdetektor und angeschlossenem Schreiber quantitativ erfasst werden kann. Die Anregungswellenlänge beträgt hiebei 380 nm, die Messwellenlänge 450 nm.
Gleichzeitig mit der Bestimmung des Neopterins wird das im Harn ausgeschiedene Kreatinin quantitativ bestimmt, so dass die Angabe in ng Neopterin pro mg Kreatinin erfolgen kann.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Diagnostizierung, insbesondere Früherkennung von malignen Tumoren in menschlichen oder tierischen Organismen, wobei eine dem Organismus entnommene Körperflüssigkeit auf den Gehalt bestimmter Pteridine untersucht wird, derart, dass in der Körperflüssigkeit ein 7, 8-Dihydropteridin oder sein Oxydationsprodukt in bekannter Weise qualitativ nachgewiesen und/oder halbquantitativ bzw. quantitativ bestimmt wird, gemäss Stammpatent AT-PS Nr. 362079, dadurch gekennzeichnet, dass die Körperflüssigkeit, vorzugsweise Harn, auf ihren Gehalt an Neopterin (6-Erythro-1, 2, 3-trihydroxypropyl- pt rin) bzw. dessen 7, 8-Dihydroderivat qualitativ und/oder halbquantitativ bzw. quantitativ nach an sich bekannten Methoden untersucht wird.